CN112779280A - 一种包含pOsOle18启动子的种子特异性干扰载体及其应用 - Google Patents

一种包含pOsOle18启动子的种子特异性干扰载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种包含pOsOle18启动子的种子特异性干扰载体及其应用。具体提供了一种种子特异性干扰载体，所述载体为pOsOle18‑RNAi载体，其DNA序列如SEQ ID NO 9所示。利用所述pOsOle18‑RNAi载体，可以特异性地干扰靶基因在水稻种子中的表达，而不影响靶基因在其他组织器官中的正常表达，从而不仅可以有效研究靶基因对种子发育的直接调控作用，还能达到改良水稻粒型、产量和稻米品质的目的，为水稻产量和稻米品质的分子精准设计育种提供了一种行之有效的技术手段和解决方案。同时还提供了一种基于pOsOle18‑RNAi载体的OsMADS1种子特异性干扰载体pOsOle18::OsMADS1‑RNAi，其DNA序列如SEQ ID NO 10所示；利用该载体可提高稻米中的蛋白质含量，增加稻米的营养价值。本发明具有重要的科研意义和应用价值。

Description

一种包含pOsOle18启动子的种子特异性干扰载体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种包含pOsOle18启动子的种子特异性干扰载体及其应用。
背景技术
稻米是全球超过半数人口的主要口粮，也是人类淀粉和蛋白质的基本来源。水稻种子的生长发育不仅控制水稻产量构成三要素之一的千粒重，同时也是直接决定水稻蛋白质含量等稻米营养品质的重要因素。水稻种子的形态发育和稻米蛋白质含量受一系列的重要基因调控。因此，研究这些重要调控基因的功能及其对种子形态发育和稻米蛋白质含量的调控机理，是利用这些重要基因开展种子精准设计育种与基因工程育种，选育高产优质水稻新品种的基础。
目前，植物组成型RNA干扰(RNAi)技术是研究和利用这些重要基因功能的一种重要的有效手段。这种技术使用在特定植物各个组织器官恒定高表达的组成型启动子，驱动包含靶基因一段正义和反义DNA片段的短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)的表达，进而引发由Dicer核糖核酸内切酶介导的特异性降解靶基因的mRNA，使靶基因在植株各发育阶段、各组织器官的表达沉默或表达量下降，从而通过RNAi植株的表型来研究靶基因的整体功能，和对植物各时期、各个组织器官的发育调控作用。
但是，植物组成型RNA干扰技术在研究和利用水稻种子发育重要调控基因方面也存在明显的缺陷和不足。因为部分基因除了调控水稻种子发育外，还对育性或/和株型等其他农艺性状有重要的调控作用。如果利用组成型RNA干扰技术抑制这类基因在种子中的表达，就同时也会影响靶基因在花或/和根茎叶等其他器官中的正常表达和调控功能，影响育性或/和株型，会对特意研究靶基因对种子发育的调控功能及其后续利用造成不必要的干扰。类似地，现在常用的CRISPR/Cas9等植物基因编辑系统会对受体靶基因的DNA形成碱基插入和缺失等不可逆转的突变，并将突变稳定遗传给受体后代，影响受体所有器官、组织和细胞中靶基因的正常功能。所以，使用CRISPR/Cas9等植物基因编辑系统也会对特意研究靶基因对种子发育的调控功能及其后续利用造成不必要的干扰。因此，植物组成型RNA干扰技术和CRISPR/Cas9等植物基因编辑系统在上述技术领域都存在明显的技术局限和不足。
OsMADS1基因是水稻MADS-Box转录调控因子基因家族中的重要成员，其主要在种子和花中表达。OsMADS1除调控水稻花分生组织的分化、花原基的形成和控制花正常发育外，还通过与OsDEP1、OsGS3等基因互作调控种子粒型，影响稻米外观品质。OsMADS1组成型RNA干扰植株出现花器官变异、结实率极显著下降、谷粒粒长极显著增加且颖壳不闭合的异常表型。利用组成型RNA干扰技术组成型干扰OsMADS1基因的表达，不能特意研究OsMADS1对种子发育和稻米品质的独特调控功能。
另一方面，蛋白质是稻米中的第二大类营养成分。同时，蛋白质含量也是决定稻米营养价值与品质性状的重要指标。培育蛋白质含量适中的优良水稻品种一直是育种家的一项重要的育种目标。但水稻籽粒中的蛋白质含量在禾谷类作物中最低，糙米的蛋白质含量一般占干重的8％～10％。另外，稻米的蛋白质含量受复杂数量性状位点和环境因素的综合调控，使得通过常规育种方法培育蛋白质含量适中的优良水稻品种难度大、周期长。因此，使用基因工程技术定向提高稻米的蛋白质含量不失为一种有效的策略。现有的尝试中，有些虽能提高稻米的蛋白质含量，但也伴随带来了植株育性和产量极显著降低等不利性状。例如，Liao等2018使用组成型RNA干扰技术抑制OsDCL3b基因，使干扰植株的蛋白含量由9.01％提高至10.40％。但是，同时干扰植株的育性和产量极显著下降，难以进行实际应用(Liao PF,Ouyang JX,Zhang JJ,et al.OsDCL3b affects grain yield and quality inrice[J].Plant Molecular Biology,2019,99(3):193-204.)。
同时，虽然OsMADS1基因对水稻花发育具有重要调控功能，但是其对水稻种子发育和稻米品质发育的直接调控作用还并不清楚，同时也未见利用OsMADS1基因在提高稻米蛋白质含量应用方面的研究报道与发明专利。
综上，如果能提供一种种子特异性干扰载体，特异性地干扰水稻种子发育和稻米蛋白质等营养品质调控基因(如OsMADS1等)的表达，则不仅能特意研究OsMADS1等这些基因对水稻种子发育和稻米蛋白质等营养品质的独特调控功能，还能够应用这种种子特异性干扰载体特异性地调控OsMADS1等这些基因的表达，从而达到提高水稻产量、改良稻米蛋白质含量等品质性状的目的，将具有十分重要的科研价值和现实应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种种子特异性干扰载体及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种种子特异性干扰载体，所述载体为pOsOle18-RNAi载体，其DNA序列如SEQ ID NO 9所示。
相应的，所述种子特异性干扰载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)获得双酶切pLHRNAi线性载体；
(2)将所述线性载体与pOsOle18的DNA片段进行同源重组反应，即得所需的种子特异性干扰载体。
优选的，步骤(1)所述双酶切为使用HindIII和KpnI限制性内切酶进行。
相应的，所述pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体在研究种子表达基因的功能中的应用。
相应的，所述pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体在种子中特异性调控种子发育和/或蛋白质含量调节基因的表达，调控种子发育、改良水稻粒型、调控稻米蛋白质含量中的应用。
相应的，一种OsMADS1种子特异性干扰载体，所述载体为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体，其DNA序列如SEQ ID NO 10所示。
相应的，所述OsMADS1种子特异性干扰载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)获得pOsOle18-RNAi载体，其DNA序列如SEQ ID NO 9所示；
(2)获得OsMADS1基因正义干扰片段，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示；
(3)获得OsMADS1基因反义干扰片段，其DNA序列如SEQ ID NO 4所示；
(4)将所述OsMADS1基因正义干扰片段和OsMADS1基因反义干扰片段分别插入所述pOsOle18-RNAi载体中，即得所需的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体；具体按方法1或方法2进行：
方法1：将所述OsMADS1基因正义干扰片段插入所述pOsOle18-RNAi载体，得到含有所述OsMADS1基因正义干扰片段插入的中间载体A，再将所述OsMADS1基因反义干扰片段插入所述中间载体A，即得所需的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体；
方法2：将所述OsMADS1基因反义干扰片段插入所述pOsOle18-RNAi载体，得到含有所述OsMADS1基因反义干扰片段插入的中间载体B，再将所述OsMADS1基因正义干扰片段插入所述中间载体B，即得所需的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体。
优选的，所述步骤(4)的方法1为：
所述OsMADS1基因正义干扰片段插入位点位于所述pOsOle18-RNAi载体的FAD2内含子左侧多克隆位点的KpnI和StuI酶切位点之间；和/或；所述OsMADS1基因反义干扰片段插入位点位于所述pOsOle18-RNAi载体插入了OsMADS1基因正义干扰片段的中间载体A的FAD2启动子右侧多克隆位点的BamHI及MluI酶切位点之间；
所述步骤(4)的方法2为：
所述OsMADS1基因反义干扰片段插入位点位于所述pOsOle18-RNAi载体的FAD2启动子右侧多克隆位点的BamHI及MluI酶切位点之间；和/或；所述OsMADS1基因正义干扰片段插入位点位于所述pOsOle18-RNAi载体插入了OsMADS1基因反义干扰片段的中间载体B的FAD2内含子左侧多克隆位点的KpnI和StuI酶切位点之间。
相应的，所述pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体在研究OsMADS1基因对水稻种子发育、种子形态和稻米蛋白质含量的特定调控功能中的应用。
相应的，所述pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体在改良水稻粒型和蛋白质含量中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明针对现有组成型RNA干扰技术不能特异性地干扰和抑制种子发育进程和组织器官中的靶基因表达，从而导致不能特意研究这些靶基因对种子发育的直接和独特调控功能的技术缺陷，提供了一种利用水稻种子特异性启动子pOsOle18构建的种子特异性干扰载体pOsOle18-RNAi。使用该种子特异性干扰载体，可以特异性地干扰OsMADS1等靶基因在水稻种子中的表达，但不影响OsMADS1等靶基因在花等其他组织器官中的表达，从而能够有效地研究在种子中表达的OsMADS1等靶基因对种子发育的直接调控作用。
2、现有技术中，组成型RNA干扰技术往往会干扰和抑制靶基因在水稻种子之外的根茎叶等营养器官及花器官中的表达，可能会影响水稻营养生长及花器官发育，从而可能会对水稻的育性、产量和稻米品质带来负面影响。针对该技术缺陷，应用本发明提供的种子特异性干扰载体pOsOle18-RNAi，能够精准调控OsMADS1等种子发育和品质性状调控基因在种子中的表达，但不影响这些基因在营养器官和花器官中的正常功能，从而达到提高水稻产量和改良稻米品质的目的，为水稻产量和稻米品质的基因工程育种提供了一种行之有效的技术手段和解决方案。
3、针对利用传统育种技术适当提高稻米蛋白质含量以提高稻米营养品质比较困难的技术难题，本发明提供了一个应用pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体构建的OsMADS1种子特异性干扰载体pOsOle18::OsMADS1-RNAi及制备方法，可以精准调控稻米蛋白调控基因OsMADS1在种子中的表达，从而显著提高稻米蛋白质含量，改良稻米营养品质。
4、本发明提供的技术方案，为水稻MADS-Box转录调控因子基因家族中的基因对水稻种子发育和稻米蛋白质含量的调控作用提供了重要的科学依据，同时也为获得蛋白质含量适中的水稻材料提供了有效的技术解决方案。
附图说明
图1为pOsOle18-RNAi载体构建流程图和载体图谱；
图2为基于基因芯片数据库的OsOle18基因表达谱分析图；
图3为基于转录组数据的OsOle18基因表达谱分析图；
图4为pOsOle18 PCR扩增结果电泳检测图；
图5为使用HindIII和KpnI双酶切pLHRNAi获得的线性载体的电泳检测图；
图6为用菌落PCR筛选带有pOsOle18-RNAi重组载体的阳性单克隆菌落电泳检测图；
图7为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体的构建流程图和结构示意图；
图8为基于基因芯片数据库的OsMADS1表达谱分析图；
图9为OsMADS1在日本晴穗、花器官和种子中的qRT-PCR表达谱分析图；
图10为OsMADS1正义干扰片段和反义干扰片段PCR扩增结果电泳检测图；
图11为使用BamHI和MluI双酶切pOsOle18-RNAi获得的线性载体的电泳检测图；
图12为使用BamHI和MluI双酶切OsMADS1基因反义干扰片段所获产物的电泳检测图；
图13为用菌落PCR筛选带有插入OsMADS1基因反义干扰片段的pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi重组载体的阳性单克隆菌落电泳检测图；
图14为插入OsMADS1基因反义干扰片段的pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi重组载体与SEQ ID NO4的序列比对结果图；
图15为使用KpnI和StuI双酶切pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi载体所获线性载体的电泳检测图；
图16为使用KpnI和StuI双酶切OsMADS1基因正义干扰片段所获产物的电泳检测图；
图17为用菌落PCR筛选带有插入OsMADS1基因正、反义干扰片段的pOsOle18::OsMADS1-RNAi重组载体的阳性单克隆菌落电泳检测图；
图18为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体上包含pOsOle18启动子和OsMADS1正义干扰片段的序列与SEQ ID NO1和SEQ ID NO3合成的序列的比对结果图；
图19为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体的核心结构示意图；
图20为OsMADS1正义干扰片段和反义干扰片段PCR扩增结果电泳检测图；
图21为使用BamHI和MluI双酶切pLHRNAi载体所获产物的电泳检测图；
图22为使用BamHI和MluI双酶切OsMADS1基因反义干扰片段所获产物的电泳检测图；
图23为用菌落PCR筛选带有插入OsMADS1基因反义干扰片段的pUbi:OsMADS1(antisense)-RNAi重组载体的阳性单克隆菌落电泳检测图；
图24为使用KpnI和SacI双酶切pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi载体所获线性载体的电泳检测图；
图25为使用KpnI和SacI双酶切OsMADS1基因正义干扰片段所获产物的电泳检测图；
图26为利用菌落PCR筛选带有插入OsMADS1基因正、反义干扰片段的pUbi::OsMADS1-RNAi重组载体的阳性单克隆菌落电泳检测图；
图27为pUbi::OsMADS1-RNAi载体的核心结构示意图；
图28为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代转基因阳性植株PCR筛选鉴定电泳检测图；
图29为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株所结T1代种子中的OsMADS1表达量分析图；
图30为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株水稻花表型鉴定图；
图31为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株结实率统计分析图；
图32为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株所结T1代种子粒型鉴定图；
图33为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株所结T1代种子稻米蛋白质含量测定结果图；
图34为pUbi::OsMADS1-RNAi载体T0代转基因阳性植株PCR筛选鉴定电泳检测图；
图35为pUbi::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株颖花及所结T1代种子中的OsMADS1表达量分析图；
图36为pUbi::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株花器官表型鉴定图；
图37为pUbi::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株结实率统计分析图；
图38为pUbi::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株所结T1代种子粒型鉴定图；
图39为pUbi::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株所结T1代种子稻米蛋白质含量测定结果图。
具体实施方式
实施例一：pOsOle18-RNAi载体的构建
构建pOsOle18-RNAi载体，具体是利用同源重组定向克隆法，将水稻种子特异性表达基因OsOle18的启动子正向克隆到带潮霉素筛选标记的植物组成型RNA干扰双元载体pLHRNAi中，并替换pLHRNAi载体中原有的Ubiquitin组成型表达启动子pUbi，从而获得pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体。其中，所述pOsOle18即为OsOle18基因的启动子。所述pOsOle18-RNAi载体的构建流程图和载体图谱如图1所示，具体构建方法如下：
一、OsOle18基因表达谱分析
1、基于基因芯片数据库的OsOle18基因表达谱分析
OsOle18基因在日本晴(Nipponbare，水稻品种，粳亚种)中的表达谱分析。先利用RiceXPro水稻基因芯片表达数据库(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/；Sato Y,Takehisa H,Kamatsuki K,et al.RiceXPro Version 3.0:expanding the informaticsresource for rice transcriptome[J].Nucleic Acids Research,2013,41:D1206-D1213.)，分析了OsOle18(基因号为：Os03g0699000)基因在日本晴中的表达谱，如图2所示(按图需要输入网址http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/category-select.php，在网页中的Search options中输入Os03g0699000，之后点击search，再在新的网页中点击FeatureNum下的编号之后，再在新的网页上勾选Spatio-temporal profile，可以查询到此图，并点击网页上Download selected graph，便可获得此图)。如图2所示，OsOle18基因在开花后第5天(5DAF，five days after flowering)的种子发育阶段的心皮中才检测到表达，其表达量平均值在7DAF胚中达到最大值，随后虽然有所回落但始终维持着较高水平的表达量直到种子发育成熟，而在水稻营养生长阶段和花发育阶段均不表达。以上结果说明OsOle18基因只在水稻种子发育阶段和种子组织器官中表达，其启动子pOsOle18为水稻种子特异性启动子。
2、基于转录组数据的OsOle18基因表达谱分析
进一步利用测定的日本晴穗(包括花)和种子各代表性发育时期样品的转录组数据，分析了OsOle18基因在日本晴穗(包括花)和种子中的表达谱，结果如图3所示。图3中，各标号含义具体为：P1:穗长为3～15mm的日本晴幼穗；P2:穗长为15～50mm的日本晴幼穗；P3:穗长为50～100mm的日本晴穗；S1:日本晴开花后第1天(1DAF)的种子；S6:日本晴开花后第6天(6DAF)的种子；S12:日本晴开花后第12天(12DAF)的种子；S18:日本晴开花后第18天(18DAF)的种子；S24:日本晴开花后第24天(24DAF)的种子。
从图3可以看出，OsOle18基因在日本晴穗(包括花)P1、P2和P3这三个时期中都不表达，而在6DAF(S6)的种子中检测到表达，其表达量在12DAF(S12)的种子中达到最大值，并在随后的18DAF(S18)和24DAF(S24)种子中维持着较高水平的表达量。这个表达结果总体上与上述“基于基因芯片数据库的OsOle18基因表达谱分析”结果类似。以上结果进一步说明OsOle18基因只在水稻种子发育阶段和种子组织器官中表达，其启动子pOsOle18为水稻种子特异性启动子。
二、种子特异性启动子pOsOle18 DNA片段的获得
1、日本晴水稻品种基因组DNA的提取
采用CTAB方法从水稻品种日本晴(Oryza sativa ssp.japonica.cv.Nipponbare)(所述日本晴保存于中国科学院成都生物研究所)中提取基因组DNA。所述CTAB方法提取DNA的方法如下：
(1)方法涉及的各试剂配方如下，其中，先按标准量配好各试剂后，再根据需要获得实际用量即可。
1)CTAB提取液：CTAB粉剂2g、1M Tris粉剂1.21g、0.5M EDTA粉剂0.74g、NaCl粉剂8.18g、β-巯基乙醇1ml，加双蒸水定容至100ml。
2)抽提液：氯仿500ml、异戊醇20ml。
3)DNA沉淀液：异丙醇(-20℃预冷)。
4)杂质洗脱液：无水乙醇70ml，加双蒸水定容至100ml。
5)DNA溶解液：超纯水。
(2)所述方法具体为：
1)取0.2g叶片，放入2ml离心管中，并放入1颗钢珠。
2)将离心管放入液氮中冷冻2min，用组织研磨粉碎仪粉碎样品。
3)向离心管中加入600μl的CTAB提取液，涡旋震混匀。
4)将离心管放入65℃水浴锅温浴30min，间或震荡3～5次，随后冷却至室温。
5)向离心管中加入700μl抽提液，上下颠倒混均，静置10min。然后12000rpm离心10min。
6)吸取500μl上清液，转移到1.5ml离心管中。向离心管中加入800μl DNA沉淀液，上下颠倒混匀(切勿震荡)，放入-20℃冰箱，沉淀DNA。
7)待出现絮状DNA沉淀后，12000rpm离心10min。再加入700μl杂质洗脱液，静置5min，然后12000rpm离心10min。随后倒掉杂质洗脱液，室温晾干或置于超净工作台中吹干。
8)待DNA晾干或吹干后，用50～100μlDNA溶解液(即超纯水)溶解DNA，分光光度计检测DNA质量和浓度。测得所提的DNA的浓度为2046μg/μl,A260/A280为2.03。
2、设计用于扩增OsOle18基因启动子pOsOle18的引物序列。
pOsOle18-pLHRNAi-HindIII-F:
5’-TGGGCCCGGCGCGCCAAGCTTATGTCTGCCAGCATTGTGAAG-3’。
其中，“AAGCTT”序列为HindIII限制性内切酶识别序列，所述限制性内切酶的切割位点位于该序列的“AA”之间；所述“TGGGCCCGGCGCGCCAAGCTT”序列为pLHRNAi载体上HindIII酶切位点处及其左侧的同源重组序列；所述“ATGTCTGCCAGCATTGTGAAG”序列为水稻OsOle18基因的启动子5’起始端正义序列。
pOsOle18-pLHRNAi-KpnI-R:
5’-ATAGAGCTCAGGCCTGGTACCTGCTAAGCTAGCTAGCAAGATGA-3’。
其中，所述“GGTACC”序列为KpnI限制性内切酶识别序列，所述限制性内切酶切割位点位于该序列的“CC”之间；所述“ATAGAGCTCAGGCCTGGTACC”序列为pLHRNAi载体上KpnI酶切位点处及其右侧的同源重组序列；所述“TGCTAAGCTAGCTAGCAAGATGA”序列为水稻OsOle18基因的启动子3’末端反义序列。
利用所述引物和日本晴DNA模板进行PCR扩增，即得所需的DNA片段。
设计pOsOle18-pLHRNAi-HindIII-F时，同时包含了HindIII限制性内切酶识别序列，及与pLHRNAi载体上该处序列(5’-TGGGCCCGGCGCGCCAAGCTT-3’)相同的21bp同源重组序列；同时，设计pOsOle18-pLHRNAi-KpnI-R时，同时包含了KpnI限制性内切酶识别序列，及与pLHRNAi载体上该处序列(5’-ATAGAGCTCAGGCCTGGTACC-3’)相同的21bp同源重组序列。因此，PCR扩增片段的5’同时带有HindIII限制性内切酶识别序列以及与pLHRNAi载体上该处序列(5’-TGGGCCCGGCGCGCCAAGCTT-3’)相同的21bp同源重组序列，同时PCR扩增片段的3’带有KpnI限制性内切酶识别序列以及与pLHRNAi载体上该处序列(5’-ATAGAGCTCAGGCCTGGTACC-3’)相同的21bp同源重组序列。
因此，随后用HindIII和KpnI双酶切线性化pLHRNAi原始载体后，可根据实验条件采用以下两种方法构建所需的种子特异性干扰载体：(1)采用同源重组的方法将包含pOsOle18启动子的PCR扩增产物定向克隆到线性化的pLHRNAi原始载体上，构建得到pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体。(2)获得包含pOsOle18启动子的PCR扩增产物后，再用HindIII和KpnI双酶切包含pOsOle18启动子的PCR扩增产物，然后再将此双酶切后的PCR扩增产物连接到线性化的pLHRNAi载体上，构建得到pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体。
使用本发明提供的方法，增加了将pOsOle18启动子克隆到pLHRNAi原始载体上的选择性和灵活性，可降低技术难度，提高成功率和效率。
3、pOsOle18启动子DNA片段的PCR扩增
以所述日本晴基因组DNA为模板，利用步骤2的pOsOle18启动子PCR扩增引物序列pOsOle18-pLHRNAi-HindIII-F和pOsOle18-pLHRNAi-HindIII-R，合成得到对应的PCR扩增引物，使用北京全式金生物技术有限公司的Pfu高保真DNA聚合酶(Fastfu DNAPolymerase)，采用如下PCR反应体系和扩增程序，扩增水稻种子特异性启动子pOsOle18。
(1)PCR反应体系(50μl)：水稻基因组DNA模板2μl，pOsOle18-pLHRNAi-HindIII-F引物(10μM)1μl，pOsOle18-pLHRNAi-HindIII-R引物(10μM)1μl，10×FastPfu Buffer 10μl，2.5mM dNTPs 4μl，FastPfu DNA Polymerase 1μl，灭菌超纯水31μl。
(2)PCR扩增程序：94℃预变性5min；再94℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，36个循环；最后72℃终延伸5min。
4、pOsOle18启动子DNA片段的检测、回收与测序分析
对水稻种子特异性启动子pOsOle18的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，结果如图4的第3泳道所示(第1泳道为BM5000+DNA Marker(博迈德生物)，第2泳道为未点样的空白对照)。从图4可以看出，经PCR扩增得到一段约2kb大小的PCR片段，即为所需的pOsOle18的DNA片段。
使用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)，按照试剂盒方法步骤回收部分PCR扩增产物备用。同时将部分PCR扩增产物送到成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。结果表明该PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。该PCR扩增产物由含有pLHRNAi载体上HindIII酶切位点(6bp)及其左侧15bp的共21bp同源重组序列、pOsOle18启动子、KpnI酶切位点(6bp)及其右侧15bp的共21bp同源重组序列组成。SEQID NO 1的自5’端第1-15位核苷酸序列为pLHRNAi载体上HindIII限制性内切酶识别位点左侧的同源序列；SEQ ID NO 1的自3’末端第2091-2105位核苷酸序列为pLHRNAi载体KpnI限制性内切酶识别位点右侧同源序列。
上述步骤只是为获得pOsOle18的DNA片段而提供的一种实施方式，在已知序列组成的情况下，也可以人工合成pOsOle18的DNA片段。
三、种子特异性干扰载体pOsOle18-RNAi的构建
1、HindIII和KpnI双酶切pLHRNAi载体
使用Fermentas中国有限公司的FastDigest HindIII和KpnI限制性内切酶，按照产品说明书步骤操作，双酶切pLHRNAi载体，获得所需的pLHRNAi线性载体。对所述pLHRNAi线性载体进行凝胶电泳检测，结果如图5的第2泳道所示(第1泳道为BM5000+DNA Marker(博迈德生物))。
2、pOsOle18-RNAi载体同源重组定向克隆
使用北京博迈德基因技术有限公司的BM无缝克隆试剂盒(CL116-01)将上述“步骤二、4”获得的经测序表明序列正确的PCR扩增产物(即为pOsOle18的DNA片段)与本步骤1获得的pLHRNAi线性载体进行同源重组反应，反应体系为：PCR扩增产物(≈200ng/μl)0.5μl、pLHRNAi线性化载体(≈65ng/μl)2μl、2×Smealess Cloning Mix 5μl，再补水至总体积为10μl。
所述同源重组定向克隆的具体操作步骤如下：
(1)在一个200μl的PCR管中依次加入上述反应体系中的各组分，轻轻混匀，离心数秒；
(2)在PCR仪上50℃保温30min进行反应；
(3)反应结束后，获得所需的同源重组产物(即为所需的pOsOle18-RNAi载体)，将离心管置于冰上备用；
(4)将步骤(3)得到的所述同源重组产物转入Trans5α感受态细胞。
所述Trans5α感受态细胞(CD201-01)购自北京全式金生物技术有限公司，所述转入的具体操作步骤如下：
(5)取50μl冰浴上融化的Trans5α感受态细胞，加入步骤(3)得到的同源重组产物，轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟；
(6)42℃水浴中热激45sec，然后将离心管快速转移到冰浴中2min，该过程中不要摇动离心管；
(7)向离心管中加入500μl的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm培养1h，使细菌复苏；
(8)吸取经转化的感受态细胞均匀涂布到含50mg/L卡那霉素的LB琼脂糖培养皿上，待液体被吸收后，倒置平板，37℃过夜培养，获得单克隆菌落。所述LB液体培养基(不含抗生素)的配方为：100ml水中加入1g NaCl、1g Peptone和0.5g yeast extract，120℃高温灭菌，放于常温下保存。
所述含50mg/L卡那霉素的LB琼脂糖培养皿的配方为：在100ml LB液体培养基的基础上，再加入2g琼脂，120℃高温灭菌，待温度降到60～70℃时加入浓度为50μg/μl的卡那霉素抗生素100μl,混匀后迅速倒入灭过菌的培养皿中，凝固即得。
2、鉴定pOsOle18-RNAi载体
待上述步骤(8)中的LB琼脂糖培养皿上长出菌落后，挑选12个单克隆菌落并用记号笔分别标记。分别蘸取适量单克隆菌落细胞作为PCR扩增模板，利用pOsOle18启动子5’端序列设计的pOsOle18-F引物和pLHRNAi原始载体上AtFAD2内含子序列设计的引物AtFAD2-R，使用北京康为世纪生物科技有限公司的2×Taq Plus MasterMix(Dye)PCR酶(CW2849M)，进行单克隆菌落PCR扩增，以筛选鉴定包含水稻种子特异性启动子pOsOle18的新的重组载体pOsOle18-RNAi。
所述pOsOle18-F引物序列为5’-ATGTCTGCCAGCATTGTGAAG-3’(即前文所述水稻OsOle18基因的启动子5’起始端正义序列)，所述AtFAD2-R引物序列为5’-GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3’。
所述单克隆菌落PCR反应体系为：2×Taq Mix 10μl、pOsOle18-F引物(10μM)1μl、AtFAD2-R引物(10μM)1μl、单克隆菌落细胞适量(用灭菌牙签沾取单细胞菌落的边缘)，补充灭菌超纯水至总体积为20μl。
所述单克隆菌落PCR扩增程序：95℃预变性2min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，34个循环，72℃终延伸2min。
对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，结果如图6所示。第1泳道：BM5000+DNA marker(博迈德生物)；第2、4、6、8、9、12-13泳道：作为PCR模板的单克隆菌落含有带pOsOle18启动子的pOsOle18-RNAi重组载体；第3、5、7和10泳道：作为PCR模板的单克隆菌落不含带pOsOle18启动子的pOsOle18-RNAi重组载体；第14泳道：模板为无菌水对照。从图中看出，得到2.1kb左右的DNA条带的(2、4、6、8、9、12-13)即为含有带pOsOle18启动子的pOsOle18-RNAi重组载体阳性克隆。挑选阳性克隆质粒送去成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，起始测序引物为AtFAD2-R，公司进一步设计测序引物进行加测并将序列测通后，测序结果如SEQ ID NO 5所示，即为pOsOle18启动子序列。
测序结果表明该质粒为将序列表中的SEQ ID NO 1(包含pOsOle18启动子)克隆到pLHRNAi载体上的HindIII和KpnI限制性内切酶识别位点之间的重组载体，并且取代了这两个限制性内切酶切割位点之间的pLHRNAi载体的对应原始序列(包含pUbi启动子)，同时保留了HindIII和KpnI的限制性内切酶识别序列，将该重组载体(即上文的同源重组产物)命名为种子特异性干扰载体pOsOle18-RNAi；所述pOsOle18-RNAi载体的DNA序列如SEQ ID NO9所示。
pOsOle18-RNAi为植物双元载体，其载体图谱如图1所示。所述pOsOle18-RNAi载体的核心功能元件包括能在种子发育阶段和种子中特异性启动的种子特异性启动子pOsOle18、拟南芥AtFAD2(脂肪酸去饱和酶2)基因内含子(用以形成shRNA中的环状结构)、AtFAD2基因内含子左右两侧的多克隆位点(用于克隆靶基因的正义和反义片段)、NOS终止子、卡那霉素和潮霉素筛选标记基因等。
实施例二：pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体的构建
pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体的结构示意图和主要构建流程如图7所示。具体操作方法如下：
一、OsMADS1基因表达谱分析
1、基于基因芯片数据库的OsMADS1基因的转录谱分析
首先利用RiceXPro水稻基因芯片表达数据库，分析了OsMADS1(基因号为：Os03g0215400)基因在日本晴中的表达谱，如图8所示(按图需要输入网址http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/category-select.php，在网页中的Search options中输入Os03g0215400，之后点击search，再在新的网页中点击FeatureNum下的编号之后，再在新的网页上勾选Spatio-temporal profile，可以查询到此图，并点击网页上Downloadselected graph，便可获得此图)。OsMADS1主要在穗(包括花器官)和种子中表达量较高，而在叶片等营养器官中的表达量极低或是不表达。
2、OsMADS1基因表达谱分析
利用Real-Time PCR技术，分析了OsMADS1基因在日本晴穗、花器官和种子各代表性发育时期样品的相对表达量，具体如图9所示。图中标号含义分别为：P1:穗长为0～3mm的日本晴幼穗,P2:穗长为3～15mm的日本晴幼穗,P3:穗长为15～50mm的日本晴幼穗,P4:穗长为50～100mm的日本晴穗,P5:穗长为100～150mm的日本晴穗,P6:穗长为150～200mm的日本晴穗,P7:穗长＞200mm的日本晴穗,L1:穗长为100～150mm稻穗上小花的外稃，L2:穗长为150～200mm稻穗上小花的外稃，L3:穗长＞200mm稻穗上小花的外稃，Pa1:穗长为100～150mm稻穗上小花的内稃，Pa2:穗长为150～200mm稻穗上小花的内稃，Pa3:穗长＞200mm稻穗上小花的内稃，St:穗长＞200mm稻穗上小花的雄蕊，Pi:穗长＞200mm稻穗上小花的雌蕊，S1：日本晴开花后第1天(1DAF)的种子，S3：日本晴开花后第3天(3DAF)的种子，S6：日本晴开花后第6天(6DAF)的种子，S9：日本晴开花后第9天(9DAF)的种子，S12：日本晴开花后第12天(12DAF)的种子，S15：日本晴开花后第15天(15DAF)的种子，S18：日本晴开花后第18天(18DAF)的种子，S21：日本晴开花后第21天(21DAF)的种子。
如图9所示，整体上OsMADS1基因在日本晴种子中的表达量要高于穗和花器官中的表达量，说明OsMADS1基因除了能调控花发育外，可能还对水稻种子发育和稻米营养品质具有重要的调控作用。
二、pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体的构建
1、获得OsMADS1基因干扰片段
(1)引物设计
1)扩增OsMADS1基因正义干扰片段所用的引物序列如下:
OsMADS1-RNAi-KpnI-F:
5’-TAGCTTAGCAGGTACCAACAAATCAGGTCAAGAAAG-3’。
其中，“GGTACC”为KpnI限制性内切酶识别序列，该序列中的“CC”中间为限制性内切酶切割位点；“TAGCTTAGCAGGTACC”序列为KpnI限制性内切酶切割位及其点左侧16bp的同源重组序列；“AACAAATCAGGTCAAGAAAG”为水稻OsMADS1基因(cDNA)干扰片段5’起始端正义序列。
OsMADS1-RNAi-StuI-R:
5’-TGGAGATGGAGCTGACGAGGCCTTGTTTGCATTGGCTTCT-3’。
其中，所述“AGGCCT”为StuI限制性内切酶识别序列，该序列中的“GC”之间为限制性内切酶切割位点；所述“TGGAGATGGAGCTGACGAGGCCT”为StuI限制性内切酶识别位点(6bp)及其右侧17bp共计23bp的同源重组序列；“TGTTTGCATTGGCTTCT”表示水稻OsMADS1基因(cDNA)干扰片段3’末端反义序列。
以上的引物中既包括同源重组序列又包括限制性内切酶识别序列，后期扩增的PCR片段末端同时包含pOsOle18-RNAi载体AtFAD2内含子左侧多克隆位点上KpnI限制性内切酶切割位点两侧的同源重组序列、StuI限制性内切酶识别位点及其右侧的同源重组序列和Kpn I及Stu I双酶切位点，因此后续可将OsMADS1基因正义干扰片段用同源重组或双酶切连接的方法克隆到pOsOle18-RNAi载体AtFAD2内含子左侧多克隆位点，得到包含OsMADS1基因正义干扰片段的中间重组载体。
2)扩增OsMADS1基因反义干扰片段所用的引物序列如下:
OsMADS1-RNAi-BamHI-F:
5’-CGGGGATCCGTCGACTACAACAAATCAGGTCAAGAAAG-3’。
其中，“GGATCC”序列为BamHI限制性内切酶识别序列，该序列中的“GG”之间为限制性内切酶切割位点；“CGGGGATCCGTCGACTAC”序列为pOsOle18-RNAi载体上SnaBI限制性内切酶切割位点右侧18bp的同源重组序列；“AACAAATCAGGTCAAGAAAG”为水稻OsMADS1基因(cDNA)干扰片段5’起始端正义序列。
OsMADS1-RNAi-MluI-R:
5’-AGGTGGAAGACGCGTTACTGTTTGCATTGGCTTCT-3’。
其中，“ACGCGT”为MluI限制性内切酶识别序列，该序列中的“AC”之间为限制性内切酶切割位点；“AGGTGGAAGACGCGTTAC”为pOsOle18-RNAi载体上SnaBI限制性内切酶切割位点左侧18bp的同源重组序列；“TGTTTGCATTGGCTTCT”为水稻OsMADS1基因(cDNA)干扰片段3’末端反义序列。
以上的引物中既包括同源重组序列又包括限制性内切酶识别序列，后期扩增的PCR片段末端同时包含pOsOle18-RNAi载体AtFAD2内含子右侧多克隆位点上SnaBI限制性内切酶切割位点右侧和左侧的同源重组序列和BamHI及MluI双酶切位点，因此后续可将OsMADS1基因反义干扰片段用同源重组或双酶切连接的方法克隆到载体AtFAD2内含子右侧多克隆位点，得到包含OsMADS1基因反义干扰片段的重组载体。
(2)水稻品种日本晴的叶片RNA的提取及cDNA的制备
使用TRIzolTM Reagent(货号：15596026，购自Thermo Fisher Scientific中国有限责任公司)，按照说明书步骤提取30天日本晴幼苗叶片中的RNA。接着利用上述RNA为模板，使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反转录试剂盒(货号：AT341-01，购自北京全式金生物技术有限公司)，按照说明书步骤操作，反转录得到日本晴叶片cDNA。
(3)PCR扩增OsMADS1基因干扰片段
以步骤(2)中所得到的cDNA为模板，利用OsMADS1-RNAi-KpnI-F及OsMADS1-RNAi-StuI-R引物，使用北京全式金生物技术有限公司的Pfu高保真DNA聚合酶(FastPfu DNAPolymerase，货号：AP221-01)，进行PCR扩增，得到产物a。
以步骤(2)中所得到的cDNA为模板，用OsMADS1-RNAi-BamHI-F及OsMADS1-RNAi-MluI-R引物，使用北京全式金生物技术有限公司的Pfu高保真DNA聚合酶，进行PCR扩增，得到产物b。
其中，所述产物a的PCR反应体系(50μl)：水稻cDNA模板2μl，OsMADS1-RNAi-KpnI-F引物(10μM)1μl，OsMADS1-RNAi-StuI-R引物(10μM)1μl，5×FastPfu Buffer 10μl，2.5mMdNTPs 4μl，FastPfu DNA Polymerase 1μl，灭菌超纯水31μl。
所述产物b的PCR反应体系(50μl)：水稻cDNA模板2μl，OsMADS1-RNAi-BamHI-F引物(10μM)1μl，OsMADS1-RNAi-MluI-R引物(10μM)1μl，5×FastPfu Buffer 10μl，2.5mM dNTPs4μl，FastPfu DNA Polymerase 1μl，灭菌超纯水31μl。
所所述产物a和b的PCR扩增程序均为：94℃预变性5min；再94℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，36个循环；最后72℃终延伸5min。
对上述产物a和产物b分别进行电泳检测，结果如图10所示。OsMADS1基因干扰片段PCR扩增电泳检测，第1泳道:BM2000 DNA Marker(博迈德生物)；第2泳道:OsMADS1基因正义干扰片段(产物a)；第3泳道:OsMADS1基因反义干扰片段(产物b)。
从图中看出，产物a和产物b片段大小接近500bp。将产物a和产物b分别送去测序，产物a的序列如SEQ ID NO 3所示。所述SEQ ID NO 3除序列两端所加的克隆片段所需的序列，以及载体pOsOle18-RNAi上游多克隆位点上KpnI限制性内切酶切割位点两侧的同源重组序列、StuI限制性内切酶识别位点及其右侧的同源重组序列，以及KpnI、StuI酶切位点外，其余序列均为OsMADS1基因cDNA(即SEQ ID NO 2)的一部分；具体为：所述SEQ ID NO 3自5’末端第17-439位核苷酸为SEQ ID NO 2的自5’末端第492～914位核苷酸的序列。因此，产物a即为OsMADS1基因正义干扰片段。
产物b的序列如SEQ ID NO 4所示。所述SEQ ID NO 4除序列两端所加的克隆片段所需的序列，以及载体pOsOle18-RNAi下游多克隆位点的SnaBI限制性内切酶切割位点左右两侧的同源重组序列，以及MluI、BamHI酶切位点外，其余序列均为SEQ ID NO 3反向互补序列的一部分。具体为：SEQ ID NO 4的自5’末端第19～441位核苷酸为SEQ ID NO 3的自5’末端第17～439位反向互补的核苷酸片段。因此，产物b即为OsMADS1基因反义干扰片段。
2、构建插入OsMADS1基因反义干扰片段的pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi载体
(1)OsMADS1基因反义干扰片段双酶切连接克隆
用BamHI和MluI双酶切实施例一构建得到的所述pOsOle18-RNAi载体，结果如图11所示，BamHI和MluI双酶切pOsOle18-RNAi载体电泳检测，第1泳道:BM2000 DNA Marker(博迈德生物)第2泳道:经BamHI和MluI双酶切的pOsOle18-RNAi线性化载体。
用BamHI和MluI双酶切所述OsMADS1基因反义干扰片段(即产物b)，结果如图12所示,BamHI和MluI双酶切OsMADS1基因反义干扰片段b电泳检测,第1泳道：BM2000 DNAMarker(博迈德生物)；第2泳道：经BamHI和MluI双酶切的OsMADS1基因反义干扰片段。
使用北京全式金生物有限公司的T4 DNA连接酶(货号：FL101-01)，按照说明书步骤操作，将上述双酶切的OsMADS1基因反义干扰片段连接到双酶切的线性化载体上AtFAD2内含子右侧多克隆位点的BamHI和MluI酶切位点之间，获得连接产物，即为所需的pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi载体(插入反义干扰片段)。再按照实施例一中的方法，将所述连接产物转化到Trans5α感受态细胞中，然后将转化细胞均匀涂布到带有含卡那霉素的LB琼脂糖培养皿上，37℃过夜培养，得到转化菌落。
(2)鉴定pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi重组载体(插入反义干扰片段)
挑选上述(1)中数个转化菌落单克隆并用记号笔分别标记，分别蘸取适量单克隆菌落细胞作为PCR扩增模板，利用pOsOle18-RNAi载体AtFAD2内含子末尾的AtFAD2-F引物，和AtFAD2内含子右侧多克隆位点右边的1390RNAi-R引物，使用北京康为世纪生物科技有限公司的2×Taq Plus MasterMix(Dye)PCR酶进行菌落PCR扩增，以筛选鉴定带有OsMADS1基因反义干扰片段插入的pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi载体(插入反义干扰片段)。PCR反应体系和扩增程序与实施例一中扩增单克隆菌落细胞时的PCR反应体系和扩增程序相同。所述AtFAD2-F和1390RNAi-R引物序列如下所示：
AtFAD2-F:5’-CCTTTCACAACCTGATTTCCCA-3’；
1390RNAi-R:5’-TAATCATCGCAAGACCGGCAACAGG-3’。
对PCR产物进行凝胶电泳检测，结果如图13所示，第1泳道：BM2000 DNA Marker(博迈德生物)第2泳道：模板为无菌水对照；第3-11泳道：作为PCR模板的单克隆菌落含有或不含有pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi重组载体(插入反义干扰片段)。图中可以看出，得到800bp左右DNA条带的(第4-11泳道)即为带有pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi重组载体的阳性克隆。
挑选阳性克隆送去成都擎科梓熙生物技术有限公司测序测序，测序引物为AtFAD2-F及1390RANi-R，序列如SEQ ID NO 6所示，将SEQ ID NO 6与SEQ ID NO4用NADMAN5.0序列比对软件进行比对，比对结果如图14所示。从图中可以看出，已将SEQ ID NO4(即OsMADS1基因反义序列)干扰片段成功克隆到pOsOle18-RNAi载体的AtFAD2启动子右侧多克隆位点的BamHI及MluI酶切位点之间，因此，将该载体命名为pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi载体(插入反义干扰片段)。
3、获得同时插入OsMADS1基因正反干扰片段的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体
(1)OsMADS1基因正义干扰片段的双酶切连接克隆
用KpnI和StuI双酶切上述步骤2中得到的pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi载体(插入反义干扰片段)，得到pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi线性化载体(插入反义干扰片段)。结果如图15所示，第1泳道：BM2000 DNA Marker(博迈德生物)；第2泳道：经KpnI和StuI双酶切的pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi线性化载体(插入反义干扰片段)检测。
用KpnI和StuI双酶切上述OsMADS1基因正义干扰片段(即产物a)，结果如图16所示,第1泳道：BM2000 DNA Marker(博迈德生物)；第3泳道：经KpnI和StuI双酶切的OsMADS1基因正义干扰片段。
使用北京全式金生物有限公司的T4 DNA连接酶，按照说明书步骤操作，将上述双酶切后的OsMADS1基因正义干扰片段连接到pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi线性化载体(插入反义干扰片段)上的AtFAD2内含子左侧多克隆位点的KpnI和StuI酶切位点之间，获得连接产物，即为同时插入OsMADS1基因正、反干扰片段的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体。再将连接产物以相同方法转化到Trans5α感受态细胞中，然后将转化细胞均匀涂布到带有含卡那霉素的LB琼脂糖培养皿上，37℃过夜培养，得到转化菌落。
(2)鉴定同时插入OsMADS1基因正反干扰片段的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体
挑选上述步骤(1)中数个转化菌落单克隆并用记号笔分别标记，分别蘸取适量单克隆菌落细胞作为PCR扩增模板，利用位于pOsOle18-RNAi载体pOsOle18启动子末尾的pOsOle18-F1引物，和位于AtFAD2内含子前端的AtFAD2-R引物，使用北京康为世纪生物科技有限公司的2×Taq Plus MasterMix(Dye)PCR酶进行菌落PCR扩增，以筛选鉴定同时插入OsMADS1基因正反干扰片段的pOsOle18::OsMADS1-RNAi重组载体。PCR反应体系和扩增程序与实施例一中扩增单克隆菌落细胞时的PCR反应体系和扩增程序相同。所述pOsOle18-F1和AtFAD2-R引物序列如下所示：
pOsOle18-F1:5’-ATGTCTGCCAGCATTGTGAAG-3’；
AtFAD2-R:5’-GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3’。
结果如图17所示，第1泳道：BM2000 DNA Marker(博迈德生物)第2-17泳道：作为PCR模板的单克隆菌落含有带OsMADS1基因正义干扰片段插入的pOsOle18::OsMADS1-RNAi重组载体克隆。从图中可以看出，得到700bp左右DNA条带的(第2-17泳道)即为带有pOsOle18::OsMADS1-RNAi重组载体的阳性克隆。
挑选阳性克隆送去测序，起始测序引物为pOsOle18-F1及AtFAD2-R引物，公司进一步设计测序引物进行加测并将序列测通后，测序结果序列如SEQ ID NO 7，即为pOsOle18启动子和OsMADS1正义干扰片段的组合序列，将SEQ ID NO 7与SEQ ID NO 1(除去其3’末端第2085-2105位核苷酸序列)和SEQ ID NO 3(除去其5’末端第1-16核苷酸序列)合成的序列用NADMAN5.0序列比对软件进行比对，比对结果如图18所示。从图中可以看出，已成功将序列表中的SEQ ID NO 3(即OsMADS1基因正义干扰片段)正向克隆到pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi载体(插入反义干扰片段)的AtFAD2内含子左侧多克隆位点的Kpn I和StuI酶切位点之间，至此，已成功获得同时插入OsMADS1正、反义干扰片段的RNAi载体，将该载体命名为pOsOle18::OsMADS1-RNAi；其DNA序列为SEQ ID NO 10所示。
pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体的具体构建流程如图7所示，其核心结构示意图如图19所示，为植物双元载体。所述pOsOle18::OsMADS1-RNAi的主要功能元件包括能在种子发育阶段和种子中特异性启动包含OsMADS1正义和反义干扰片段的shRNA表达的种子特异性启动子pOsOle18、拟南芥AtFAD2(脂肪酸去饱和酶2)基因内含子(用以形成shRNA中的环状结构)、AtFAD2基因内含子左侧多克隆位点Kpn I和StuI酶切位点之间的OsMADS1正义干扰片段、AtFAD2基因内含子右侧多克隆位点BamHI和MluI之间的OsMADS1反义干扰片段、NOS终止子、卡那霉素和潮霉素筛选标记基因等。
上述实施例只是给出一种构建所述pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体的方法，在已知pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体的核心结构的情况下，本领域技术人员也可以采用其它等效方法进行载体构建，这些等效方法获得的具有相同作用的、结构相同或相似的载体，也应当落入本发明的保护范围内。
例如，可以采用双切连接方法，先将OsMADS1基因正义干扰片段和pOsOle18-RNAi载体进行双酶切连接构建得到中间载体，再将OsMADS1基因反义干扰片段和上述中间载体进行双酶切连接，也可以得到pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体。
再例如，也可以进行同源重组定向克隆，具体如下：先将pOsOle18-RNAi载体用KpnI和StuI双酶切得到线性化的pOsOle18-RNAi载体；再用实施例一中的同源重组定向克隆的方法，将产物a(OsMADS1基因正义干扰)克隆到pOsOle18-RNAi载体FAD2基因内含子左侧多克隆位点，得到pOsOle18::OsMADS1(sense)-RNAi(插入正义干扰片段)中间载体；然后再用BamHI和MluI酶切pOsOle18::OsMADS1(sense)-RNAi(插入正义干扰片段)中间载体得到线性化的pOsOle18::OsMADS1(sense)-RNAi(插入正义干扰片段)中间载体，用实施例一中的同源重组定向克隆的方法，将产物b(OsMADS1基因反义干扰片段)克隆到pOsOle18::OsMADS1(sense)-RNAi(插入正义干扰片段)中间载体AtFAD2基因内含子右侧多克隆位点，也可以得到pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体。
对比例：pUbi::OsMADS1-RNAi载体的构建
1、组成型对比RNA干扰载体的的选择
源自玉米中的泛素启动子pUbi是公认使用范围最广的组成型启动子之一。使用像pLHRNAi等这类采用pUbi等组成型启动子的RNAi载体可以有效地抑制靶基因在水稻中的表达(Li H,Jiang L,Youn JH,et al.A comprehensive genetic study reveals a crucialrole of CYP90D2/D2 in regulating plant architecture in rice(Oryza sativa)[J].New Phytologist,2013,200(4):1076-1088.)，但却不能特异性地干扰靶基因在种子中的表达，反而可能会影响这些靶基因在营养器官和花中的正常功能，从而可能会影响水稻的正常生长发育，最终降低产量和稻米品质。
2、参照实施例一、二的方法，构建pUbi::OsMADS1-RNAi载体。具体包括如下步骤：
(1)获得pLHRNAi载体，所述pLHRNAi载体序列如SEQ ID NO 11所示。
(2)按实施例二的方法，获得OsMADS1基因正、反义干扰片段。OsMADS1基因正、反义干扰片段的PCR扩增结果电泳检测如图20所示，第1泳道：BM2000 DNA Marker(博迈德生物))；第2泳道：OsMADS1基因正义干扰片段；第3泳道：OsMADS1基因反义干扰片段。
(3)按实施例二的方法，将OsMADS1基因反义干扰片段插入pLHRNAi载体中，获得插入OsMADS1基因反义干扰片段的pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi载体。
具体步骤如下：
1)OsMADS1基因反义干扰片段双酶切连接克隆
用BamHI和MluI双酶切pLHRNAi载体，结果如图21所示，第1泳道：BM5000+DNAMarker(博迈德生物)第2泳道：经BamHI和MluI双酶切的pLHRNAi线性化载体。
用BamHI和MluI双酶切OsMADS1基因反义干扰片段，结果如图22所示，第1泳道：BM2000 DNA Marker(博迈德生物)；第3泳道：经BamHI和MluI双酶切的OsMADS1基因反义干扰片段。
使用北京全式金生物有限公司的T4 DNA连接酶，按照说明书步骤操作，将上述经BamHI和MluI双酶切的OsMADS1基因反义干扰片段连接到pLHRNAi线性化载体上AtFAD2内含子右侧多克隆位点的BamHI和MluI酶切位点之间，获得连接产物即为所需的插入OsMADS1基因反义干扰片段的pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi载体。
再将连接产物转化到Trans5α感受态细胞中，然后将转化细胞均匀涂布到带有含卡那霉素的LB琼脂糖培养皿上，37℃过夜培养，得到转化菌落。
2)按实施例二的方法，鉴定插入OsMADS1基因反义干扰片段的pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi重组载体
挑选步骤1)中数个转化菌落单克隆并用记号笔分别标记，分别蘸取适量单克隆菌落细胞作为PCR扩增模板，利用pLHRNAi载体AtFAD2内含子末尾的AtFAD2-F引物，和AtFAD2内含子右侧多克隆位点右边的1390RNAi-R引物，使用北京康为世纪生物科技有限公司的2×Taq Plus MasterMix(Dye)PCR酶进行菌落PCR扩增，以筛选鉴定带有OsMADS1基因反义干扰片段插入的pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi(插入反义干扰片段)重组载体。PCR反应体系和PCR扩增程序如实施例一、二所示。AtFAD2-F和1390RNAi-R引物序列如下所示：
AtFAD2-F:5’-CCTTTCACAACCTGATTTCCCA-3’；
1390RNAi-R:5’-TAATCATCGCAAGACCGGCAACAGG-3’。
结果如图23所示，第1泳道：BM2000 DNA Marker(博迈德生物)；第2-7、9-13泳道：作为PCR模板的单克隆菌落含有带OsMADS1基因反义干扰片段插入的pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi(插入反义干扰片段)重组载体。从图中可以看出，得到750bp左右DNA条带的即为带有pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi(插入反义干扰片段)重组载体的阳性克隆。
挑选阳性克隆送去成都擎科梓熙生物技术有限公司测序测序，测序引物为AtFAD2-F及1390RANi-R，序列如SEQ ID NO 6所示，与插入OsMADS1基因反义干扰片段的pOsOle18::OsMADS1(antisense)-RNAi载体对应片段序列相同。将SEQ ID NO 6与SEQ IDNO 4用NADMAN5.0序列比对软件进行比对，结果表示已将序列表中的SEQ ID NO 4(即OsMADS1基因反义序列)干扰片段克隆到pLHRNAi载体的AtFAD2启动子右侧多克隆位点的BamHI及MluI酶切位点之间的重组载体。
(4)按实施例二的方法，将OsMADS1基因正义干扰片段插入步骤(3)获得的已经插入OsMADS1基因反义干扰片段的pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi载体中，获得同时插入OsMADS1基因正、反义干扰片段的pUbi::OsMADS1-RNAi载体。具体方法如下：
1)OsMADS1基因正义干扰片段的双酶切连接克隆
用KpnI和SacI双酶切步骤(3)获得的插入OsMADS1基因反义干扰片段的pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi载体，结果如图24所示，第1泳道：BM2000 DNA Marker(博迈德生物)第2泳道：经KpnI和SacI双酶切的pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi(插入反义干扰片段)载体。
用KpnI和SacI双酶切所述OsMADS1基因正义干扰片段，结果如图25所示,KpnI和SacI双酶切的OsMADS1基因正义干扰片段a,第1泳道：BM2000 DNA Marker(博迈德生物)第3泳道：经KpnI和SacI双酶切的OsMADS1基因正义干扰片段。
使用北京全式金生物有限公司的T4 DNA连接酶，按照说明书步骤操作，将上述经KpnI和SacI双酶切的OsMADS1基因正义干扰片段连接到pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi(反义干扰片段)线性化载体上AtFAD2内含子左侧多克隆位点的KpnI和SacI酶切位点之间，得到连接产物，即为所需的同时插入OsMADS1基因正、反义干扰片段的pUbi::OsMADS1-RNAi载体，命名为pUbi::OsMADS1-RNAi载体。
再将连接产物转化到Trans5α感受态细胞中，然后将转化细胞均匀涂布到带有含卡那霉素的LB琼脂糖培养皿上，37℃过夜培养，得到转化菌落。
2)筛选鉴定pUbi::OsMADS1-RNAi重组载体
挑选步骤1)中数个转化菌落单克隆并用记号笔分别标记，分别蘸取适量单克隆菌落细胞作为PCR扩增模板，利用位于pLHRNAi载体pUbi启动子末尾的pUbi-F引物，和位于AtFAD2内含子前端的AtFAD2-R引物，使用北京康为世纪生物科技有限公司的2×Taq PlusMasterMix(Dye)PCR酶进行菌落PCR扩增，以筛选鉴定带有OsMADS1基因正义干扰片段插入的pUbi::OsMADS1-RNAi重组载体。菌落PCR反应体系和PCR扩增程序如实施例一所示。pUbi-F和AtFAD2-R引物序列如下所示：
pUbi-F:5’-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3’；
AtFAD2-R:5’-GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3’。
结果如图26所示，PCR鉴定pUbi::OsMADS1-RNAi重组载体，第1泳道：BM2000DNAMarker(博迈德生物)第2-11泳道：作为PCR模板的单克隆菌落含有带OsMADS1基因正义干扰片段的pUbi::OsMADS1-RNAi重组载体克隆。从图中可以看出，得到750bp左右DNA条带的即为带有pUbi::OsMADS1-RNAi重组载体阳性克隆。挑选阳性克隆送去测序，测序引物为pUbi-F及AtFAD2-R引物，序列如SEQ ID NO 8所示，将测序结果与SEQ ID NO 3比对，比对结果显示已将序列表中的SEQ ID NO 3(OsMADS1基因正义干扰片段)正向克隆到pUbi::OsMADS1(antisense)-RNAi(插入反义干扰片段)载体AtFAD2内含子左侧多克隆位点的Kpn I和SacI酶切位点之间。
pUbi::OsMADS1-RNAi植物双元载体的核心结构示意图如图27所示，其主要功能元件包括能在植物整个发育阶段启动包含OsMADS1正义和反义干扰片段的shRNA表达的组成型启动子pUbi、拟南芥AtFAD2(脂肪酸去饱和酶2)基因内含子(用以形成shRNA中的环状结构)、AtFAD2基因内含子左侧多克隆位点Kpn I和SacI酶切位点之间的OsMADS1正义干扰片段、AtFAD2基因内含子右侧多克隆位点BamHI和MluI之间的OsMADS1反义干扰片段、NOS终止子、卡那霉素和潮霉素筛选标记基因等。
实施例三：pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体的具体应用和效果展示
一、将实施例二和对比例构建的pOsOle18::OsMADS1-RNAi、pUbi::OsMADS1-RNAi质粒送到杭州百格生物技术有限公司，分别转化水稻品种日本晴。转化流程如下：
1、水稻成熟种子愈伤诱导与继代培养
挑选成熟水稻种子，剥离颖壳，倒入50ml离心管中，加入75％乙醇消毒1min，倒掉乙醇，无菌水冲洗一遍，倒掉，再加入30％次氯酸钠消毒20min，倒掉次氯酸钠后，用无菌水冲洗5～6遍。移液枪吸去多余的水份，将种子转移到诱导培养基上，每皿20～25颗种子。愈伤长出后，可以用原胚直接做转化；原胚旁边长出的小颗粒可挑取到新的诱导培养基上进行继代培养，长到适宜的大小时同样可以进行转化。
所述诱导培养基(1L)的配方为：在1L N6基本培养基(CHU’S N6 basal medium，购自美国phytotechnology laboratories公司)中加入20000×微量微量元素母液50μl，200×EDTA-Fe2+母液5ml，200×B5有机盐母液5ml，浓度为2mg/ml的2,4-D母液1ml，CaCl20.22g，脯氨酸0.5g，水解蛋白0.3g，蔗糖30g，植物凝胶3g，调节pH值为5.8。
所述20000×微量微量元素母液(100ml)配方为：H3BO3 0.62g，KI 0.083g，MnSO4·4H2O 2.23g，ZnSO4·7H2O 0.86g，Na2MoO4·2H2O 0.025g，CuSO4·5H2O 0.0025g，CoCl2·6H2O 0.0025g。
所述200×EDTA-Fe2+母液(500ml)配方为：C10H14N2Na2O8(乙二胺四乙酸钠)3.73g，FeSO4·7H20 2.78g。
所述200×B5有机盐母液(100ml)配方为：维生素B1 0.2g，维生素B6 0.02g，烟酸0.02g，肌醇2g。
2、农杆菌培养
将pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体、pUbi::OsMADS1-RNAi载体用冻融法分别转入农杆菌EHA105菌株中，得到单克隆菌落。经鉴定分别得到含有pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体、pUbi::OsMADS1-RNAi载体的转化农杆菌EHA105后，蘸取适量单克隆菌体至含有卡那霉素和利福平抗生素的液体培养基中28℃黑暗条件下过夜培养，然后加甘油于-80℃冰箱保存备用。使用时分别将农杆菌EHA105在含有卡那霉素和利福平抗生素的培养基划线,28℃黑暗培养2d至出现单菌落。
所述冻融法转入载体的步骤如下：
(1)在冰上融化农杆菌EH105(所述农杆菌EH105保存于中国科学院成都生物研究所)感受态细胞；分别加入1～2μl所述各载体，冰浴30min,液氮中冷冻1min,之后37℃水浴3min。
(2)加入500μl YEB液体培养基(无抗性)，28℃，200rpm/min,复苏3h，获得菌液。
(3)取所述菌液涂布于含有卡那霉素和利福平抗生素的固体培养基上，28℃黑暗培养2d至出现单菌落，挑选进行单克隆鉴定。
所述YEB液体培养基为：5g/L Beef extract(牛肉浸膏)，1g/L Yeast extract(酵母膏)，5g/L Peptone(蛋白胨)，5g/L Sucrose(蔗糖)，0.4g/100ml MgSO4.7H2O，调节pH值至7.0，120℃高温高压灭菌。
所述含有卡那霉素和利福平抗生素的培养基为：在100ml所述YEB液体培养基中加入1.5g Agar(琼脂)，120℃高温高压灭菌，待60～70℃时再分别加入浓度为50mg/ml的卡那霉素抗生素母液100μl和浓度为20mg/ml的利福平抗生素母液125μl，混匀后倒入灭菌的培养皿中，使培养基中的卡那霉素和利福平的终浓度分别为50mg/L和25mg/L，待用。
3、农杆菌侵染愈伤组织
先配制高渗培养溶液(AAM)，然后用移液器吸取高渗培养液，将平板上的农杆菌冲洗下来，调整菌体浓度至OD600为0.3～0.5，即为侵染转化水稻用的农杆菌悬浮液。
所述高渗培养液(1L)配方为：20×AAM大量盐母液50ml，200×NBO B3微量盐母液5ml，上述200×B5有机盐母液5ml，上述200×EDTA-Fe2+母液5ml，乙酰丁香酮母液1ml(现配)，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，水解酪蛋白0.5g，谷氨酰胺0.876g，天门冬氨酸0.266g，精氨酸0.1740.266g，甘氨酸0.0075g，调节pH值为5.8。
所述20×AAM大量盐母液(1L)配方为：KCl 59g，CaCl2·H20 3g，MgSO4·7H20 10g，NaH2P04·H20 3g。
所述200×NBO B3微量盐母液(1L)配方为：MnSO4·4H2O 2.64 3g，ZnSO4·7H200.4g，H3BO3 0.6g，KI 0.15g，Na2MoO4·2H20 0.05g，CuSO4·5H2O 0.005g，CoCl2·6H2O0.005g。
所述乙酰丁香酮母液(1ml)配方为：称取0.03925g乙酰丁香酮溶于1ml DMSO(二甲基亚砜)内。
挑选步骤1获得的足够数量的愈伤组织(愈伤状态良好，颜色鲜黄，质地圆润坚硬，颗粒直径在3mm左右为宜)放入100ml无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液，保证所述农杆菌悬浮液可以与愈伤组织充分接触。室温放置侵染20分钟,并不时晃动。随后倒掉农杆菌悬浮液,将各愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余农杆菌悬浮液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的共培养基上，26℃黑暗培养3天。
所述共培养基(1L)配方为：在1L MS基本培养基(Murashige&Skoog BasalMedium，购自美国phytotechnology laboratories公司)中加入上述200×EDTA-Fe2+母液5ml，2mg/ml 2,4-D母液1ml，脯氨酸0.5g，水解蛋白0.3g，蔗糖30g，葡萄糖10g，植物凝胶3g，调节pH值为5.8，灭菌后临近倒胶时加入上述乙酰丁香酮母液1ml。
4、浸染愈伤组织筛选培养
共培养3天后的愈伤组织要进行清洗步骤，具体为：用1ml的灭菌蓝枪头将共培养基上的愈伤组织转移到已灭菌的三角瓶中，加入无菌水冲洗两遍，第三遍用含有500μl/L羧苄青霉素的无菌水再冲洗一遍。用移液枪吸掉多余水分后将愈伤组织转移到无菌滤纸上，利用超净台的风吹干愈伤上的水，吹风时间30min左右，待愈伤组织吹干后，转移到筛选培养基上进行筛选培养，培养条件为28～30℃，暗培养。筛选时长3～4周。
筛选培养基配方(1L)为：在1L MS基本培养基中加入200×NBO B3微量盐母液5ml，200×L3铁盐母液5ml，200×L3有机盐母液5ml，2mg/ml 2,4-D母液1.25ml，脯氨酸0.5g，谷氨酰胺0.5g，水解蛋白0.3g，麦芽糖30g，植物凝胶3g，调节pH值为5.8，灭菌后临近倒胶时加入上述浓度为50mg/ml的G418筛选抗生素母液1ml，浓度为50mg/ml的潮霉素母液0.8ml，浓度为200mg/ml的青霉素母液2ml。
所述200×L3铁盐母液(1L)配方为：C10H14N2Na2O8(乙二胺四乙酸钠)14.90g，FeSO4.7H20 11.18g。
5、抗性愈伤组织分化再生
培养至颜色鲜黄，直径1～2mm的抗性愈伤长出。此时可将具有潮霉素抗性的抗性愈伤组织挑取到分化培养基上进行分化再生。每个分化皿上放16颗阳性愈伤，置于28～30℃温室中光照培养。培养10天左右，愈伤组织冒出绿点，再经过10天左右，分化出幼苗。
所述分化培养基(1L)配方为：在1L N6基本培养基中加入200×NBO B3微量盐母液5ml，200×L3铁盐母液5ml，200×L3有机盐母液5ml，浓度为0.5mg/ml的KT母液4ml，浓度为0.5mg/ml的KT母液4ml，浓度为0.1mg/ml的IAA母液2ml，脯氨酸0.5g，谷氨酰胺0.5g，水解蛋白0.8g，麦芽糖30g，植物凝胶3g，调节pH值为5.8，灭菌后临近倒胶时加入浓度为50mg/ml的潮霉素母液0.6ml，浓度为200mg/ml的青霉素母液2ml。
6、幼苗生根
待分化出的幼苗长到2～3cm左右，有明显根系的时候，将幼苗转移到装有生根培养基的生根管中让幼苗长大，生根培养条件为28～30℃，无菌光照培养。
所述生根培养基(1L)配方为：在1L MS基本培养基中加入200×MS微量元素母液2.5ml，上述200×EDTA-Fe2+母液2.5ml，200×MS有机元素母液2.5ml，浓度为0.4mg/ml的IBA母液1ml，蔗糖20g，植物凝胶3g，调节pH值为5.8，灭菌后临近倒胶时加入浓度为200mg/ml的青霉素母液2ml。
所述200×MS有机元素母液(1L)的配方为：MnSO4·4H2O 4.46g，ZnSO4·7H2O1.72g，H3BO3 1.24g，KI 0.166g，Na2MoO4·2H2O 0.05g，CuSO4·5H2O 0.005g，CoCl2·6H2O0.005g。
所述200×有机盐母液(250ml)配方为：甘氨酸0.1g，维生素B1 0.005g，维生素B60.025g，肌醇5g，烟酸0.025g。
二、pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体转基因水稻的效果展示
1、pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体转基因水稻的基因型鉴定。
(1)pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体转基因水稻T0代植株基因型鉴定
步骤一共获得pOsOle18::OsMADS1-RNAi转基因水稻T0代幼苗23株。分别采取CTAB法提取这些幼苗叶片中的DNA，并分别以HYG-F9及HYG-R为引物，进行PCR扩增。所述的HYG-F9和HYG-R9引物序列如下：
HYG-F9：5’-GGGTGTCACGTTGCAAGACC-3’；
HYG-R9:5’-ATGCCTCCGCTCGAAGTAGC-3’。
设计的目标条带为472bp，鉴定结果如图28所示。pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代转基因阳性植株PCR筛选鉴定电泳检测，M：BM2000 DNA Marker(博迈德生物)；1～5，7～24：模板为来自pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代转基因植株叶片的DNA；6：模板为无菌水对照。从图中可以看出，得到500bp左右DNA条带的(第1-5、7-12、15、16和18-23泳道)即为pOsOle18::OsMADS1-RNAi转基因阳性水稻植株。共得到19株经PCR鉴定为阳性的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代转基因水稻植株，将这19株转基因阳性植株组成的T0代株系命名为pOsOle18::OsMADS1-Ri。将所述pOsOle18::OsMADS1-Ri植株在水稻种植正季移栽种植于转基因隔离圃中，全生育期观察鉴定表型。
(2)pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体转基因水稻T1代种子OsMADS1表达量分析。
待pOsOle18::OsMADS1-Ri植株开花结实后，选取第1#、5#和9#号T0代植株的12DAF种子(T1代种子)进行OsMADS1基因表达量分析。以野生型转基因受体水稻品种日本晴作为对照，取这3个植株开花后12DAF的种子样品，液氮速冻后放于-80℃冰箱保存。随后用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(货号：DP441，购自天根生化科技(北京)有限公司)提取样品总RNA，并用样品总RNA为模板反转录得到cDNA。用这些cDNA作为模板，以水稻OsActin基因的表达量作为内参，用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪检测这些12DAF种子样品中OsMADS1基因的表达量，引物为OsMADS1-F和OsMADS1-R，引物序列如下：
OsMADS1-F:5’-CTACATGGACCATCTGAGCAATGA-3’；
OsMADS1-R:5’-AAGAGAGCACGCACGTACTTAG-3’。
OsActin基因引物序列为：
OsActin-F:5’-TGGAACTGGTATGGTCAAGGC-3’；
OsActin-R:5’-AGTCTCATGGATACCCGCAG-3’。
结果如图29所示，NIP：野生型(日本晴，Nipponbare)对照种子；1#，5#，9#:pOsOle18::OsMADS1-Ri种子特异性干扰转基因水稻植株T1代种子。从图中可以看出，pOsOle18::OsMADS1-Ri种子特异性干扰转基因水稻T1代种子中的OsMADS1基因表达量极低，相比野生型显著降低。结果说明：使用pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体显著有效地降低了转基因水稻种子中的OsMADS1基因表达量。
2、pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰转基因水稻种子表型鉴定
(1)pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰转基因水稻花表型鉴定
在pOsOle18::OsMADS1-Ri的T0代转基因阳性植株花发育成熟期，对1#、5#和9#号植株的花和花器官进行表型鉴定。结果如图30所示，pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体T0代阳性植株花器官表型鉴定。图中比例尺为1mm。从图中可以看出，与野生型受体对照水稻品种日本晴相比，1#、5#和9#号T0代植株花的颖壳正常闭合，雌雄蕊等花器官的形态和数目均无明显异常。结果说明：用pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体干扰日本晴水稻种子发育阶段和种子中OsMADS1基因的表达，并不影响转基因水稻花的发育以及花器官的发育、数目、形态和结构。
(2)pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰转基因水稻结实率统计分析
在pOsOle18::OsMADS1-Ri的T0代转基因阳性植株种子成熟收获后，对1#、5#和9#号植株的结实率进行统计分析。结果如31所示，pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株结实率统计分析。从图中可以看出，1#、5#和9#号T0代植株结实率均接近85％，虽然与野生型受体对照水稻品种日本晴相比稍有降低，但却在正常范围之内。
(3)pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰转基因水稻粒型鉴定
在pOsOle18::OsMADS1-Ri的T0代转基因阳性植株种子成熟收获后，对1#、5#和9#号植株谷粒的表型进行鉴定。结果如图32所示，pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体T0代阳性植株所结T1代种子粒型鉴定。从图中可以看出，相比野生型受体对照水稻品种日本晴，1#、5#和9#号植株种子的内外颖壳不完全闭合，种子略微变细长。在水稻外观品质中，粒型细长在中国南方和东南亚等稻米消费市场中是一个普遍的有利性状。
结果表明，使用基于pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体而针对OsMADS1靶基因的pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体，显著有效地降低了转基因水稻种子中的OsMADS1基因表达量，但并未明显影响转基因水稻花的发育以及花器官的发育、数目、形态和结构，同时使转基因水稻获得了粒型细长这一影响水稻外观品质的有利性状。因此，使用pOsOle18-RNAi和pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体不仅能有效地特意研究OsMADS1对种子形态等发育的特定调控功能，还说明OsMADS1基因对水稻种子形态发育具有重要的调控作用，而且pOsOle18-RNAi和pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体在水稻粒型基因工程育种中还具有一定的应用潜力和价值。
3、pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰转基因水稻稻米蛋白质含量测定
取pOsOle18::OsMADS1-Ri的T0代转基因阳性植株1#、5#和9#号植株的谷粒，用糙米机去除颖壳得到糙米，再用磨粉机将糙米磨成粉末，用杜马斯燃烧定氮法测定样品总氮含量，最后乘以水稻总氮含量与总蛋白含量的换算系数5.95，得到糙米总蛋白含量。结果如图33所示，该1#、5#和9#号这3个转基因水稻植株的糙米总蛋白含量均极显著高于日本晴，特别是9#号植株糙米的蛋白含量高达12.41％，相比日本晴提高29.40％。
结果表明，使用基于pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体而针对OsMADS1靶基因的pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体，显著有效地降低了种子中OsMADS1基因的表达，得到了花及花器官与结实率正常同时蛋白质含量极显著提高的转基因水稻，不仅能有效地特意研究OsMADS1对稻米蛋白质含量的特定调控功能，还说明OsMADS1基因对稻米蛋白质含量具有重要的调控作用，而且pOsOle18-RNAi和pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体在稻米蛋白质基因工程育种中还具有重要的应用潜力和价值。
4、pOsOle18-RNAi和pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体的有益效果展示
上述步骤2和3中的结果表明，使用基于pOsOle18-RNAi干扰载体而针对OsMADS1靶基因的pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体，显著有效地降低了转基因水稻种子中的OsMADS1基因表达量，但并未明显影响转基因水稻花的发育以及花器官的发育、数目、形态和结构，同时获得结实率正常、粒型细长同时稻米蛋白质含量极显著提高的转基因水稻。
因此，使用pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体和pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体可以有效地特意研究OsMADS1对种子形态发育和稻米蛋白质含量的特定调控功能，说明OsMADS1基因对水稻种子形态发育和稻米蛋白质含量具有重要的调控作用。另外，使用pOsOle18-RNAi种子特异性干扰载体也能特意研究除OsMADS1以外的其他种子中表达基因对种子形态发育和稻米品质的特定调控功能。所以，种子特异性干扰载体pOsOle18-RNAi和OsMADS1种子特异性干扰载体pOsOle18::OsMADS1-RNAi在水稻粒型和稻米品质基因工程育种中具有重要的应用潜力和价值。
三、对照载体pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰载体转基因水稻的效果展示
1、pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰载体转基因水稻基因型鉴定
(1)pUbi::OsMADS1-RNAi转基因水稻T0代植株基因型鉴定
步骤一共获得pUbi::OsMADS1-RNAi转基因水稻T0代幼苗23株，分别采用CTAB法提取这些幼苗的叶片中DNA，以HYG-F9及HYG-R为引物，进行PCR扩增。所述的HYG-F9和HYG-R9引物序列如下：
HYG-F9:5’-GGGTGTCACGTTGCAAGACC-3’；
HYG-R9:5’-TGCCTCCGCTCGAAGTAGC-3’。
设计的目标条带为472bp，鉴定结果如图34所示，pUbi::OsMADS1-RNAi载体T0代转化植株转基因鉴定，M:BM2000 DNA Marker(博迈德生物)1-19，21-24：模板为来自pUbi::OsMADS1-RNAi载体T0代转基因植株叶片的DNA；20：模板为无菌水对照。从图中可以看出，得到500bp左右DNA条带的即为pUbi::OsMADS1-RNAi转基因阳性水稻植株。共得到23株经PCR鉴定为阳性的pUbi::OsMADS1-RNAi转基因水稻T0代植株，并将这23株阳性转基因植株组成的T0代株系命名为pUbi:OsMADS1-Ri。使用与步骤二相同的方法将pUbi::OsMADS1-Ri植株移栽种植，全生育期观察鉴定表型。
(2)pUbi::OsMADS1-RNAi转基因水稻T1代种子OsMADS1表达量分析
待pUbi::OsMADS1-Ri植株开花结实后，选取第2#、4#和12#号T0代植株成熟期的穗(包括花)和12DAF种子(T1代种子)进行OsMADS1基因表达量分析。以野生型转基因受体水稻品种日本晴作为对照，取这3个植株成熟的花(和开花后12DAF的种子样品，液氮速冻后放于-80℃冰箱保存。随后花样品采用Plant Total RNA Isolation Kit(货号：RE-05011，购自成都福际生物技术有限公司)提取样品总RNA，而12DAF的种子样品采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(货号：DP441，购自天根生化科技(北京)有限公司)提取样品总RNA，并用成熟的花和12DAF的种子样品总RNA分别为模板反转录得到为cDNA。用这些cDNA作为模板，以水稻OsActin基因的表达量作为内参，用实时荧光定量PCR(进行qRT-PCR)仪检测这些成熟的花和12DAF种子样品中OsMADS1基因的表达量，引物为OsMADS1-F和OsMADS1-R，引物序列如下：
OsMADS1-F:5’-CTACATGGACCATCTGAGCAATGA-3’；
OsMADS1-R:5’-AAGAGAGCACGCACGTACTTAG-3’。
以水稻OsActin基因作为内参，引物序列为：
OsActin-F:5’-TGGAACTGGTATGGTCAAGGC-3’；
OsActin-R:5’-AGTCTCATGGATACCCGCAG-3’。
结果如图35所示，NIP：野生型(日本晴，(Nipponbare))对照种子植株；2#，4#，12#:pUbi::OsMADS1-Ri组成型干扰转基因水稻植株T1代种子。与野生型水稻相比，pUbi::OsMADS1-Ri组成型干扰转基因水稻植株T0代的花和T1代种子中的OsMADS1基因表达量都极低，相比野生型显著降低。结果说明使用pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰载体有效抑制了OsMADS1基因在种子中表达量的但同时也干扰了OsMADS1在花中的正常表达。因此，基于组成型干扰载体pLHRNAi的pUbi::OsMADS1-Ri组成型干扰载体不能特异性地抑制OsMADS1基因在种子中的表达量，可能会影响OsMADS1基因对花发育的正常调控作用。
2、pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰转基因水稻表型鉴定和蛋白质含量测定
(1)pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰转基因水稻花表型鉴定
在pUbi::OsMADS1-Ri的T0转基因植株花发育成熟期，对2#、4#和12#号植株的花和花器官进行表型鉴定。结果如图36所示，pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰转基因水稻花表型鉴定。图中比例尺为1mm。从图中可以看出，与野生型对照水稻品种日本晴相比，2#、4#和12#号T0代植株花的颖壳形态异常、不能正常闭合，出现桨片叶质化异常伸长、雄蕊数目减少、双生雌蕊等花器官数目、形态和结构异常变异等表型。
结果说明使用基于组成型干扰载体pLHRNAi的pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰载体由于干扰了OsMADS1基因在花中的正常表达，影响了OsMADS1对花发育的正常调控作用，导致pUbi::OsMADS1-Ri的T0转基因植株出现花器官数目、形态和结构变异等异常表型，可能会影响组成型干扰植株种子正常发育、结实率和形态。
(2)pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰转基因水稻结实率测定
在pUbi::OsMADS1-Ri的T0转基因阳性植株种子成熟收获后，对2#、4#和12#号植株的结实率进行统计分析。结果如图37所示，pUbi::OsMADS1-RNAi种子组成型干扰转基因水稻结实率统计。从图中可以看出，2#、4#和12#号T0代植株结实率显著降低，都低于10％。
结果表明，使用基于组成型干扰载体pLHRNAi构建的pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰载体，在有效抑制OsMADS1基因在种子中表达量的但同时也干扰了OsMADS1在花中的正常表达，影响了OsMADS1对花发育的正常调控作用，引起pUbi::OsMADS1-Ri的T0转基因植株出现花器官数目、形态和结构变异等异常表型，导致转基因后代的结实率极低，在育种和生产中难以利用。另一方面，使用基于pLHRNAi的pUbi::OsMADS1-RNAi载体导致转基因后代出现花器官数目、形态和结构的异常变异，会影响受精作用和后续的种子发育，因此使用pUbi::OsMADS1-RNAi载体不能特意研究OsMADS1对水稻种子发育的直接特定调控功能。
(3)pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰转基因水稻粒型鉴定
在pUbi::OsMADS1-Ri的T0代转基因阳性植株种子成熟收获后，对2#、4#和12#号植株谷粒的表型进行鉴定。结果如图38所示，OsMADS1组成型干扰转基因水稻粒型鉴定。从图中可以看出，相比野生型受体对照水稻品种日本晴，2#、4#和12#号植株种子的内外颖壳形态异常，不能正常闭合，种子中的糙米明显变小。
结果表明，使用基于组成型干扰载体pLHRNAi构建的pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰载体，在有效抑制OsMADS1基因在种子中表达量的同时但也干扰了OsMADS1在花中的正常表达，影响了OsMADS1对花发育的正常调控作用，引起pUbi::OsMADS1-Ri的T0转基因植株出现花器官数目、形态和结构变异等异常表型，导致转基因后代不仅结实率极低同时种子发育和形态结构异常，在育种和生产中难以利用。另一方面，使用基于pLHRNAi的pUbi::OsMADS1-RNAi载体导致转基因后代出现内外稃形态和结构的异常变异，会影响后续种子内外颖壳发育、形态结构以及种子其他方面的发育，因此使用pUbi::OsMADS1-RNAi载体不能特意研究OsMADS1对水稻种子发育的直接特定调控功能。
(4)pUbi::OsMADS1-RNAi组成性干扰转基因水稻稻米蛋白质含量测定
取pUbi:OsMADS1-Ri的T0代转基因阳性植株2#、4#和12#号植株的谷粒，用糙米机去除颖壳得到糙米，再用磨粉机将糙米磨成粉末，用杜马斯燃烧定氮法测定样品总氮含量，最后乘以水稻总氮含量与总蛋白含量的换算系数5.95，得到糙米总蛋白含量。结果如图39所示，该2#、4#和12#号这3个转基因水稻植株的糙米总蛋白含量均极显著高于日本晴，特别是2#和12#号植株糙米的蛋白含量高达13.99％和13.08％。
结果表明，使用基于组成型干扰载体pLHRNAi的pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰载体，在有效抑制OsMADS1基因在种子中表达量的但同时也干扰了OsMADS1在花中的正常表达，影响了OsMADS1对花发育的正常调控作用，引起pUbi::OsMADS1-Ri的T0转基因植株出现花器官数目、形态和结构变异等异常表型，导致转基因后代不仅结实率极低同时种子发育和形态结构异常。虽然OsMADS1基因组成型干扰后代的蛋白质含量极显著提高，但是由于其种子形态结构严重异常、糙米明显变小，同时结实率极低，难以在育种和生产中加以利用。另一方面，使用基于pLHRNAi的pUbi::OsMADS1-RNAi载体导致转基因后代出现糙米明显变小的形态变异。糙米粒型大小以及胚和胚乳所占糙米的比例也是决定稻米蛋白质含量的重要因素。因此，使用基于pLHRNAi的pUbi::OsMADS1-RNAi载体不能特意研究和区别转基因后代中蛋白质含量提高是由于OsMADS1基因对蛋白相关基因直接调控的结果，还是由于转基因后代糙米粒型变化而导致蛋白质含量提高的间接结果。
3、对照组成型干扰载体pLHRNAi和pUbi::OsMADS1-RNAi在种子中表达基因特定功能研究与应用中的局限性。
pLHRNAi载体由于带有来自玉米的pUbi组成型表达启动子,因此在水稻根茎叶营养器官、花器官和种子中的组成型干扰效率很高。但是，正是由于pLHRNAi在水稻各组织器官中组成型干扰效率很高的优势，导致pLHRNAi载体以及基于该载体构建的pUbi::OsMADS1-RNAi组成型干扰载体，存在不能特异性地干扰种子中表达的OsMADS1等靶基因的表达但不干扰花器官及其他营养器官中OsMADS1等靶基因的正常表达和调控功能，从而特异研究在种子中表达的OsMADS1等靶基因对水稻种子发育和品质的直接特定调控功能的技术局限性和缺点。
针对pLHRNAi组成型干扰载体的上述技术局限性和缺点，本发明利用pLHRNAi载体骨架的优势，使用pOsOle18种子特异性启动子构建了pOsOle18-RNAi和pOsOle18::OsMADS1-RNAi种子特异性干扰载体。pOsOle18-RNAi和pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体在利用pLHRNAi载体优点的基础上克服了pLHRNAi载体的上述技术局限性和缺点，能通过特异性地干扰种子中表达靶基因的表达量但不影响靶基因在花器官和其他营养器官中的表达量和正常功能，从而达到特异研究种子中表达OsMADS1等靶基因对水稻种子发育和品质的直接特定调控功能的目的，同时还能通过特意调控OsMADS1等靶基因在种子中的表达量，从而达到改良水稻粒型和品质，在育种中加以利用的目的。
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 一种包含pOsOle18启动子的种子特异性干扰载体及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2105
<212> DNA
<213> pOsOle18启动子序列(pOsOle18)
<400> 1
tgggcccggc gcgccaagct tatgtctgcc agcattgtga agatatggga tacgcgaaat 60
atcaaattgt ctctctccaa cagaagctct caagcagcaa tgcaaccttt ggtaagcagc 120
taacaatcac tacgcaatat gtttgtagcc caatttcaag acttaccgat catttgtgca 180
ggagggtgtg aaacatggga tctcttgctt gtctcaagac tcgtatggtg cctatattgc 240
tgcgtcatgc atggataaca ggtataaccg caatcaacca cactgcctca gacttaatat 300
gccatttgtg aaggctgcct ttgactttat aagcctttca ggatctattt gtacagtgct 360
cttcatatgg ataaaggccc aattaaggct tacactggca gcaaaattga atcttttttt 420
gtcaaggtca gtgagtgaac aagctgagtt gatttccatt tttcaaaccg catgcctgct 480
tgttcttagg tagttttatc tgctatgttt tataacacct gatatgttgg tcaaatgcag 540
tctgctatca gccctgatgg aactcacatt cttggtggtt cgagtgatgg caacgtgtac 600
ttatggcagg tagttgttgg atcatgttat catttcgcac acgcattagc tgctctttta 660
ctttctattc atgccactac tttttcactg acataggtgg atcagcctga aagaggtcct 720
ataattttgg aaggccatga aggtgaagct acttcagttg actggtatgt tctacataca 780
attgtagttt ttttttgtgt aaatcttatc aaccatccaa tgttcagatt tcagtacgat 840
tttttcacaa ttttcaggtg tgcatcagag gtcgggaaga tcgcaacgtc atctgacgat 900
tccaaggtga gtatgtgatt aaccttgcaa attttgttca ttcaactttc atgaatctta 960
tgagaatgag atccttttct ttttctatta cacacctaca tgttgcaagc gaatttaaat 1020
gcctgttttg gtatgtagaa aggggagctg ctgatattca gtattttttt taagaaaacc 1080
actgataaca acactttatg atgtgtatct atcaggttcg cgtatggaat actgagagaa 1140
gggtgttccc aaacacaagt tccccaacgg tcatccgcaa gagaataacc gcaccaaaca 1200
ctggaagccg gtctgctagc catgagctag ctactacctc aagagatgta ggagtagcag 1260
cctgcaccag tgcagatggt gaattgccaa ctggttcacg ctctcccctt cagcccagag 1320
tactggagtt tggcacaccg gagtcagcga agaagagagc ctttaggttg tttcaggagg 1380
actcattgga cataaggaaa agcccagagg ctcaaatgaa cagcccttct tcggttctaa 1440
gccccccaca ttcactgaag aggagaacaa ttcgggacta ctttgctagt agctcatctt 1500
gtgagcacac caagcatgtc catgaccttg cactcttggc tcactcgtca actgtgaaga 1560
acctcaaaaa tgctcaatat agctacaggt gcctgaaaaa ataactttaa agttttgaac 1620
atcgatttca ctaaacaaca attattatct ccctctgaaa tgttgctacc taagatgata 1680
gtttagaact ctagaatcat tgtcggcgga gaaagtaaat tattttcccc aaatttccag 1740
ctatgaaaaa accctcacca aacaccatca aacaagagtt caccaaaccg cccatgcggc 1800
catgctgtca cgcaacgcac cgcattgcct gatggccgct cgatgcatgc atgcttcccc 1860
gtgcacatat ccgacagacg cgccgtgtca gcgagctcct cgaccgacct gtgtagccca 1920
tgcaagcatc caccccctcc acgtacaccc cctcctcctc cctacgtgtc accgctctct 1980
ccacctatat atgcccacct ggcccctctc ctcccatctc cacttcaccc gatcgcttct 2040
tcttcttctt cttcgttgca ttcatcttgc tagctagctt agcaggtacc aggcctgagc 2100
tctat 2105
<210> 2
<211> 1151
<212> DNA
<213> OsMADS1基因cDNA序列(OsMADS1 cDNA)
<400> 2
gatcaggtag ccaaaccaca ccaccataaa gctagcttgc aaaggggata gagtagtaga 60
gagagagaga gaggagagga ggaggaagaa gatggggagg gggaaggtgg agctgaagcg 120
gatcgagaac aagatcagcc ggcaggtgac gttcgccaag cgcaggaacg gcctgctcaa 180
gaaggcctac gagctctccc tcctctgcga cgccgaggtc gccctcatca tcttctccgg 240
ccgcggccgc ctcttcgagt tctccagctc atcatgcatg tacaaaacct tggagaggta 300
ccgcagctgc aactacaact cacaggatgc agcagctcca gaaaacgaaa ttaattacca 360
agaatacctg aagctgaaaa caagagttga atttcttcaa accacacaga gaaatattct 420
tggtgaggat ttgggcccac taagcatgaa ggagctggag cagcttgaga accagataga 480
agtatccctc aaacaaatca ggtcaagaaa gaaccaagca ctgcttgatc agctgtttga 540
tctgaagagc aaggagcaac agctgcaaga tctcaacaaa gacttgagga aaaagttaca 600
ggaaaccagt gcagagaatg tgctccatat gtcctggcaa gatggtggtg ggcacagcgg 660
ttctagcact gttcttgctg atcagcctca tcaccatcag ggtcttctcc accctcaccc 720
agatcagggt gaccattccc tgcagattgg gtatcatcac cctcatgctc accatcacca 780
ggcctacatg gaccatctga gcaatgaagc agcagacatg gttgctcatc accccaatga 840
acacatccca tccggctgga tatgatgtgt gtgttcagtt caggcttcag gcttcagaga 900
agccaatgca aacagtgtcc tgtaatccag taattacagg gcatatgtaa tgtaatgtaa 960
tgtaatccct gatctatatt ttgctaagta cgtgcgtgct ctcttacgac cttctccccc 1020
aaacagttaa tcaggggaat aataatttcg tttgatgcac gtactgtatg tctgtatctg 1080
tcactgtatc gtaggaccgt ccatgtataa caatttccgt tttggatgtg gtaacaagtt 1140
aattggcact t 1151
<210> 3
<211> 462
<212> DNA
<213> OsMADS1基因正义干扰片段(OsMADS1)
<400> 3
tagcttagca ggtaccaaca aatcaggtca agaaagaacc aagcactgct tgatcagctg 60
tttgatctga agagcaagga gcaacagctg caagatctca acaaagactt gaggaaaaag 120
ttacaggaaa ccagtgcaga gaatgtgctc catatgtcct ggcaagatgg tggtgggcac 180
agcggttcta gcactgttct tgctgatcag cctcatcacc atcagggtct tctccaccct 240
cacccagatc agggtgacca ttccctgcag attgggtatc atcaccctca tgctcaccat 300
caccaggcct acatggacca tctgagcaat gaagcagcag acatggttgc tcatcacccc 360
aatgaacaca tcccatccgg ctggatatga tgtgtgtgtt cagttcaggc ttcaggcttc 420
agagaagcca atgcaaacaa ggcctcgtca gctccatctc ca 462
<210> 4
<211> 459
<212> DNA
<213> OsMADS1基因反义干扰片段(OsMADS1)
<400> 4
cggggatccg tcgactactg tttgcattgg cttctctgaa gcctgaagcc tgaactgaac 60
acacacatca tatccagccg gatgggatgt gttcattggg gtgatgagca accatgtctg 120
ctgcttcatt gctcagatgg tccatgtagg cctggtgatg gtgagcatga gggtgatgat 180
acccaatctg cagggaatgg tcaccctgat ctgggtgagg gtggagaaga ccctgatggt 240
gatgaggctg atcagcaaga acagtgctag aaccgctgtg cccaccacca tcttgccagg 300
acatatggag cacattctct gcactggttt cctgtaactt tttcctcaag tctttgttga 360
gatcttgcag ctgttgctcc ttgctcttca gatcaaacag ctgatcaagc agtgcttggt 420
tctttcttga cctgatttgt tgtaacgcgt cttccacct 459
<210> 5
<211> 2242
<212> DNA
<213> 载体pOsOle18-RNAi上pOsOle18启动子的测序序列(pOsOle18)
<400> 5
tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc 60
gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg 120
atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt tgggcccggc gcgccaagct 180
tatgtctgcc agcattgtga agatatggga tacgcgaaat atcaaattgt ctctctccaa 240
cagaagctct caagcagcaa tgcaaccttt ggtaagcagc taacaatcac tacgcaatat 300
gtttgtagcc caatttcaag acttaccgat catttgtgca ggagggtgtg aaacatggga 360
tctcttgctt gtctcaagac tcgtatggtg cctatattgc tgcgtcatgc atggataaca 420
ggtataaccg caatcaacca cactgcctca gacttaatat gccatttgtg aaggctgcct 480
ttgactttat aagcctttca ggatctattt gtacagtgct cttcatatgg ataaaggccc 540
aattaaggct tacactggca gcaaaattga atcttttttt gtcaaggtca gtgagtgaac 600
aagctgagtt gatttccatt tttcaaaccg catgcctgct tgttcttagg tagttttatc 660
tgctatgttt tataacacct gatatgttgg tcaaatgcag tctgctatca gccctgatgg 720
aactcacatt cttggtggtt cgagtgatgg caacgtgtac ttatggcagg tagttgttgg 780
atcatgttat catttcgcac acgcattagc tgctctttta ctttctattc atgccactac 840
tttttcactg acataggtgg atcagcctga aagaggtcct ataattttgg aaggccatga 900
aggtgaagct acttcagttg actggtatgt tctacataca attgtagttt ttttttgtgt 960
aaatcttatc aaccatccaa tgttcagatt tcagtacgat tttttcacaa ttttcaggtg 1020
tgcatcagag gtcgggaaga tcgcaacgtc atctgacgat tccaaggtga gtatgtgatt 1080
aaccttgcaa attttgttca ttcaactttc atgaatctta tgagaatgag atccttttct 1140
ttttctatta cacacctaca tgttgcaagc gaatttaaat gcctgttttg gtatgtagaa 1200
aggggagctg ctgatattca gtattttttt taagaaaacc actgataaca acactttatg 1260
atgtgtatct atcaggttcg cgtatggaat actgagagaa gggtgttccc aaacacaagt 1320
tccccaacgg tcatccgcaa gagaataacc gcaccaaaca ctggaagccg gtctgctagc 1380
catgagctag ctactacctc aagagatgta ggagtagcag cctgcaccag tgcagatggt 1440
gaattgccaa ctggttcacg ctctcccctt cagcccagag tactggagtt tggcacaccg 1500
gagtcagcga agaagagagc ctttaggttg tttcaggagg actcattgga cataaggaaa 1560
agcccagagg ctcaaatgaa cagcccttct tcggttctaa gccccccaca ttcactgaag 1620
aggagaacaa ttcgggacta ctttgctagt agctcatctt gtgagcacac caagcatgtc 1680
catgaccttg cactcttggc tcactcgtca actgtgaaga acctcaaaaa tgctcaatat 1740
agctacaggt gcctgaaaaa ataactttaa agttttgaac atcgatttca ctaaacaaca 1800
attattatct ccctctgaaa tgttgctacc taagatgata gtttagaact ctagaatcat 1860
tgtcggcgga gaaagtaaat tattttcccc aaatttccag ctatgaaaaa accctcacca 1920
aacaccatca aacaagagtt caccaaaccg cccatgcggc catgctgtca cgcaacgcac 1980
cgcattgcct gatggccgct cgatgcatgc atgcttcccc gtgcacatat ccgacagacg 2040
cgccgtgtca gcgagctcct cgaccgacct gtgtagccca tgcaagcatc caccccctcc 2100
acgtacaccc cctcctcctc cctacgtgtc accgctctct ccacctatat atgcccacct 2160
ggcccctctc ctcccatctc cacttcaccc gatcgcttct tcttcttctt cttcgttgca 2220
ttcatctgct agctagctag ca 2242
<210> 6
<211> 1160
<212> DNA
<213> 插入OsMADS1基因反义干扰片段的pOsOle18::OsMADS1 (antisense)-RNAi载体上与插入OsMADS1基因反义干扰片段的pUbi::OsMADS1 (antisense)-RNAi载体上对应的OsMADS1基因反义干扰片段(OsMADS1)
<400> 6
atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc 60
gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc 120
atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc 180
atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga 240
tcggggaaat tcgagctggt cacctgtaat tcacacgtgg tggtggtggt ggtggctagc 300
gttaacacta gtcagatcta ccatggtgga ctcctcttag aattcccggg gatccgtcga 360
ctacaacaaa tcaggtcaag aaagaaccaa gcactgcttg atcagctgtt tgatctgaag 420
agcaaggagc aacagctgca agatctcaac aaagacttga ggaaaaagtt acaggaaacc 480
agtgcagaga atgtgctcca tatgtcctgg caagatggtg gtgggcacag cggttctagc 540
actgttcttg ctgatcagcc tcatcaccat cagggtcttc tccaccctca cccagatcag 600
ggtgaccatt ccctgcagat tgggtatcat caccctcatg ctcaccatca ccaggcctac 660
atggaccatc tgagcaatga agcagcagac atggttgctc atcaccccaa tgaacacatc 720
ccatccggct ggatatgatg tgtgtgttca gttcaggctt caggcttcag agaagccaat 780
gcaaacagta acgcgtcttc cacctgcacc catgtttctg cagaaaacca aaagcaaaag 840
aatcaacaag ctgaaaactc aagactatgg aatagtttta tcattaattc taaaaaacag 900
agcatgcaca agaaacaagt ggtaacgatt caagagagtc ttcagacaaa tgatccaaag 960
tgggaaatca ggttgtgaaa gggattgcca caaatagaaa atgcgtggac caaaaggaat 1020
aaagagtaga gaagcggcat aatgtgagaa atacaaaaac gattgcgttg agaatacgac 1080
tagtagtaag taatacgatg ttaataaggc aggtcacatc tcttgcttgt ggttaacatc 1140
agtttgcttg tattaaaaat 1160
<210> 7
<211> 2478
<212> DNA
<213> 同时插入OsMADS1基因正、反义干扰片段的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体中测序的OsOle18启动子序列和OsMADS1基因正义干扰片段对应片段序列(OsMADS1)
<400> 7
gagctcaggc ctggtacctg tttgcattgg cttctctgaa gcctgaagcc tgaactgaac 60
acacacatca tatccagccg gatgggatgt gttcattggg gtgatgagca accatgtctg 120
ctgcttcatt gctcagatgg tccatgtagg cctggtgatg gtgagcatga gggtgatgat 180
acccaatctg cagggaatgg tcaccctgat ctgggtgagg gtggagaaga ccctgatggt 240
gatgaggctg atcagcaaga acagtgctag aaccgctgtg cccaccacca tcttgccagg 300
acatatggag cacattctct gcactggttt cctgtaactt tttcctcaag tctttgttga 360
gatcttgcag ctgttgctcc ttgctcttca gatcaaacag ctgatcaagc agtgcttggt 420
tctttcttga cctgatttgt ttgctaagct agctagcaag atgaatgcaa cgaagaagaa 480
gaagaagaag cgatcgggtg aagtggagat gggaggagag gggccaggtg ggcatatata 540
ggtggagaga gcggtgacac gtagggagga ggagggggtg tacgtggagg gggtggatgc 600
ttgcatgggc tacacaggtc ggtcgaggag ctcgctgaca cggcgcgtct gtcggatatg 660
tgcacgggga agcatgcatg catcgagcgg ccatcaggca atgcggtgcg ttgcgtgaca 720
gcatggccgc atgggcggtt tggtgaactc ttgtttgatg gtgtttggtg agggtttttt 780
catagctgga aatttgggga aaataattta ctttctccgc cgacaatgat tctagagttc 840
taaactatca tcttaggtag caacatttca gagggagata ataattgttg tttagtgaaa 900
tcgatgttca aaactttaaa gttatttttt caggcacctg tagctatatt gagcattttt 960
gaggttcttc acagttgacg agtgagccaa gagtgcaagg tcatggacat gcttggtgtg 1020
ctcacaagat gagctactag caaagtagtc ccgaattgtt ctcctcttca gtgaatgtgg 1080
ggggcttaga accgaagaag ggctgttcat ttgagcctct gggcttttcc ttatgtccaa 1140
tgagtcctcc tgaaacaacc taaaggctct cttcttcgct gactccggtg tgccaaactc 1200
cagtactctg ggctgaaggg gagagcgtga accagttggc aattcaccat ctgcactggt 1260
gcaggctgct actcctacat ctcttgaggt agtagctagc tcatggctag cagaccggct 1320
tccagtgttt ggtgcggtta ttctcttgcg gatgaccgtt ggggaacttg tgtttgggaa 1380
cacccttctc tcagtattcc atacgcgaac ctgatagata cacatcataa agtgttgtta 1440
tcagtggttt tcttaaaaaa aatactgaat atcagcagct cccctttcta cataccaaaa 1500
caggcattta aattcgcttg caacatgtag gtgtgtaata gaaaaagaaa aggatctcat 1560
tctcataaga ttcatgaaag ttgaatgaac aaaatttgca aggttaatca catactcacc 1620
ttggaatcgt cagatgacgt tgcgatcttc ccgacctctg atgcacacct gaaaattgtg 1680
aaaaaatcgt actgaaatct gaacattgga tggttgataa gatttacaca aaaaaaaact 1740
acaattgtat gtagaacata ccagtcaact gaagtagctt caccttcatg gccttccaaa 1800
attataggac ctctttcagg ctgatccacc tatgtcagtg aaaaagtagt ggcatgaata 1860
gaaagtaaaa gagcagctaa tgcgtgtgcg aaatgataac atgatccaac aactacctgc 1920
cataagtaca cgttgccatc actcgaacca ccaagaatgt gagttccatc agggctgata 1980
gcagactgca tttgaccaac atatcaggtg ttataaaaca tagcagataa aactacctaa 2040
gaacaagcag gcatgcggtt tgaaaaatgg aaatcaactc agcttgttca ctcactgacc 2100
ttgacaaaaa aagattcaat tttgctgcca gtgtaagcct taattgggcc tttatccata 2160
tgaagagcac tgtacaaata gatcctgaaa ggcttataaa gtcaaaggca gccttcacaa 2220
atggcatatt aagtctgagg cagtgtggtt gattgcggtt atacctgtta tccatgcatg 2280
acgcagcaat ataggcacca tacgagtctt gagacaagca agagatccca tgtttcacac 2340
cctcctgcac aaatgatcgg taagtcttga aattgggcta caaacatatt gcgtagtgat 2400
tgttagctgc ttaccaaagg ttgcattgct gcttgagagc ttctgttgga gagagacaat 2460
ttgatattcg cgttcccc 2478
<210> 8
<211> 469
<212> DNA
<213> 同时插入OsMADS1基因正、反义干扰片段的pUbi::OsMADS1-RNAi载体中测序的OsMADS1基因正义干扰片段对应片段序列(OsMADS1)
<400> 8
ttctgcacta ggtaccaggc ctgaacaaat caggtcaaga aagaaccaag cactgcttga 60
tcagctgttt gatctgaaga gcaaggagca acagctgcaa gatctcaaca aagacttgag 120
gaaaaagtta caggaaacca gtgcagagaa tgtgctccat atgtcctggc aagatggtgg 180
tgggcacagc ggttctagca ctgttcttgc tgatcagcct catcaccatc agggtcttct 240
ccaccctcac ccagatcagg gtgaccattc cctgcagatt gggtatcatc accctcatgc 300
tcaccatcac caggcctaca tggaccatct gagcaatgaa gcagcagaca tggttgctca 360
tcaccccaat gaacacatcc catccggctg gatatgatgt gtgtgttcag ttcaggcttc 420
aggcttcaga gaagccaatg caaacagagc tctatcgccc ctacgtcag 469
<210> 9
<211> 12126
<212> DNA
<213> pOsOle18-RNAi载体序列(pOsOle18-RNAi)
<400> 9
ctagccacca ccaccaccac cacgtgtgaa ttacaggtga ccagctcgaa tttccccgat 60
cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 120
attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 180
acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 240
atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 300
ttactagatc gggaattaaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa 360
gagaaaagag cgtttattag aataacggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt 420
tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat 480
ccaacccctc cgctgctata gtgcagtcgg cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga 540
aaacgacatg tcgcacaagt cctaagttac gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg 600
gcgttttctt gtcgcgtgtt ttagtcgcat aaagtagaat acttgcgact agaaccggag 660
acattacgcc atgaacaaga gcgccgccgc tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac 720
cgacgaccag gacttgacca accaacgggc cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct 780
gttttccgag aagatcaccg gcaccaggcg cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga 840
ccacctacgc cctggcgacg ttgtgacagt gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac 900
ccgcgaccta ctggacattg ccgagcgcat ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct 960
ggcagagccg tgggccgaca ccaccacgcc ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc 1020
cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc 1080
cgccaaggcc cgaggcgtga agtttggccc ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc 1140
gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct 1200
tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac 1260
cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga ggacgcattg accgaggccg acgccctggc 1320
ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac 1380
gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc 1440
gagccgcccg cgcacgtctc aaccgtgcgg ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat 1500
gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta 1560
aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg 1620
cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc 1680
agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg 1740
ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg 1800
ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg 1860
acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg 1920
acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc 1980
cttacgacat atgggccacc gccgacctgg tggagctggt taagcagcgc attgaggtca 2040
cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg 2100
gcggtgaggt tgccgaggcg ctggccgggt acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca 2160
cgcagcgcgt gagctaccca ggcactgccg ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac 2220
ccgagggcga cgctgcccgc gaggtccagg cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca 2280
tttgagttaa tgaggtaaag agaaaatgag caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg 2340
tccgagcgca cgcagcagca aggctgcaac gttggccagc ctggcagaca cgccagccat 2400
gaagcgggtc aactttcagt tgccggcgga ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt 2460
acgccaaggc aagaccatta ccgagctgct atctgaatac atcgcgcagc taccagagta 2520
aatgagcaaa tgaataaatg agtagatgaa ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa 2580
atcaagaaca accaggcacc gacgccgtgg aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt 2640
ggccaggcgt aagcggctgg gttgtctgcc ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc 2700
ccgaggaatc ggcgtgacgg tcgcaaacca tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg 2760
ggtgatgacc tggtggagaa gttgaaggcc gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag 2820
gcagaagcac gccccggtga atcgtggcaa gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc 2880
cggcaaccgc cggcagccgg tgcgccgtcg attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa 2940
ccagattttt tcgttccgat gctctatgac gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg 3000
gacgtggccg ttttccgtct gtcgaagcgt gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac 3060
gagcttccag acgggcacgt agaggtttcc gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg 3120
gattacgacc tggtactgat ggcggtttcc catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg 3180
gaagggaagg gagacaagcc cggccgcgtg ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag 3240
ttctgccggc gagccgatgg cggaaagcag aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg 3300
ttaaacacca cgcacgttgc catgcagcgt acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg 3360
acggtatccg agggtgaagc cttgattagc cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg 3420
cggccggagt acatcgagat cgagctagct gattggatgt accgcgagat cacagaaggc 3480
aagaacccgg acgtgctgac ggttcacccc gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc 3540
cgttttctct accgcctggc acgccgcgcc gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc 3600
aagacgatct acgaacgcag tggcagcgcc ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg 3660
cgcaagctga tcgggtcaaa tgacctgccg gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag 3720
gctggcccga tcctagtcat gcgctaccgc aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt 3780
tcctaatgta cggagcagat gctagggcaa attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa 3840
ggtctctttc ctgtggatag cacgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg 3900
aacccgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact 3960
gatataaaag agaaaaaagg cgatttttcc gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact 4020
cttaaaaccc gcctggcctg tgcataactg tctggccagc gcacagccga agagctgcaa 4080
aaagcgccta cccttcggtc gctgcgctcc ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc 4140
gcggccgctg gccgctcaaa aatggctggc ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga 4200
caagccgcgc cgtcgccact cgaccgccgg cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg 4260
tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 4320
tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 4380
gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac 4440
tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac 4500
agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 4560
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 4620
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 4680
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 4740
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 4800
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 4860
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 4920
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 4980
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 5040
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 5100
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 5160
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 5220
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 5280
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 5340
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat 5400
tcatccagta aaatataata ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca 5460
aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag 5520
gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact 5580
ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc 5640
tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg 5700
tcttcttccc agttttcgca atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat 5760
tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga 5820
aagagcctga tgcactccgc atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca 5880
tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca 5940
tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg 6000
tccttttccc gttccacatc ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa 6060
tataggtttt cattttctcc caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta 6120
tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta 6180
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ataacaagac gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa 6300
cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt 6360
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tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat 6480
cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac 6540
tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg 6600
gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt aaacaaattg acgcttagac aacttaataa 6660
cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat taacgccgaa ttaattcggg ggatctggat 6720
tttagtactg gattttggtt ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa 6780
tacaaataca tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac 6840
cctaattccc ttatctggga actactcaca cattattatg gagaaactcg agcttgtcga 6900
tcgacagatc cggtcggcat ctactctatt tctttgccct cggacgagtg ctggggcgtc 6960
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gggcgatttg tgtacgcccg acagtcccgg ctccggatcg gacgattgcg tcgcatcgac 7080
cctgcgccca agctgcatca tcgaaattgc cgtcaaccaa gctctgatag agttggtcaa 7140
gaccaatgcg gagcatatac gcccggagtc gtggcgatcc tgcaagctcc ggatgcctcc 7200
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tggcgacctc gtattgggaa tccccgaaca tcgcctcgct ccagtcaatg accgctgtta 7320
tgcggccatt gtccgtcagg acattgttgg agccgaaatc cgcgtgcacg aggtgccgga 7380
cttcggggca gtcctcggcc caaagcatca gctcatcgag agcctgcgcg acggacgcac 7440
tgacggtgtc gtccatcaca gtttgccagt gatacacatg gggatcagca atcgcgcata 7500
tgaaatcacg ccatgtagtg tattgaccga ttccttgcgg tccgaatggg ccgaacccgc 7560
tcgtctggct aagatcggcc gcagcgatcg catccatagc ctccgcgacc ggttgtagaa 7620
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cggccgatgc aaagtgccga taaacataac gatctttgta gaaaccatcg gcgcagctat 7800
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cctccgagag ctgcatcagg tcggagacgc tgtcgaactt ttcgatcaga aacttctcga 7920
cagacgtcgc ggtgagttca ggctttttca tatctcattg ccccccggga tctgcgaaag 7980
ctcgagagag atagatttgt agagagagac tggtgatttc agcgtgtcct ctccaaatga 8040
aatgaacttc cttatataga ggaaggtctt gcgaaggata gtgggattgt gcgtcatccc 8100
ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt 8160
ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg 8220
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tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc 8340
ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt 8400
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gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc 8520
catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat 8580
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ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct 8760
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caaatgcagt ctgctatcag ccctgatgga actcacattc ttggtggttc gagtgatggc 9360
aacgtgtact tatggcaggt agttgttgga tcatgttatc atttcgcaca cgcattagct 9420
gctcttttac tttctattca tgccactact ttttcactga cataggtgga tcagcctgaa 9480
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cagtacgatt ttttcacaat tttcaggtgt gcatcagagg tcgggaagat cgcaacgtca 9660
tctgacgatt ccaaggtgag tatgtgatta accttgcaaa ttttgttcat tcaactttca 9720
tgaatcttat gagaatgaga tccttttctt tttctattac acacctacat gttgcaagcg 9780
aatttaaatg cctgttttgg tatgtagaaa ggggagctgc tgatattcag tatttttttt 9840
aagaaaacca ctgataacaa cactttatga tgtgtatcta tcaggttcgc gtatggaata 9900
ctgagagaag ggtgttccca aacacaagtt ccccaacggt catccgcaag agaataaccg 9960
caccaaacac tggaagccgg tctgctagcc atgagctagc tactacctca agagatgtag 10020
gagtagcagc ctgcaccagt gcagatggtg aattgccaac tggttcacgc tctccccttc 10080
agcccagagt actggagttt ggcacaccgg agtcagcgaa gaagagagcc tttaggttgt 10140
ttcaggagga ctcattggac ataaggaaaa gcccagaggc tcaaatgaac agcccttctt 10200
cggttctaag ccccccacat tcactgaaga ggagaacaat tcgggactac tttgctagta 10260
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ctgtgaagaa cctcaaaaat gctcaatata gctacaggtg cctgaaaaaa taactttaaa 10380
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tgcttccccg tgcacatatc cgacagacgc gccgtgtcag cgagctcctc gaccgacctg 10680
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ccgctctctc cacctatata tgcccacctg gcccctctcc tcccatctcc acttcacccg 10800
atcgcttctt cttcttcttc ttcgttgcat tcatcttgct agctagctta gcaggtacca 10860
ggcctgagct ctatcgcccc tacgtcagct ccatctccag gtccgtcgct tctcttccat 10920
ttcttctcat tttcgatttt gattcttatt tctttccagt agctcctgct ctgtgaattt 10980
ctccgctcac gatagatctg cttatactcc ttacattcaa ccttagatct ggtctcgatt 11040
ctctgtttct ctgttttttt cttttggtcg agaatctgat gtttgtttat gttctgtcac 11100
cattaataat aatgaactct ctcattcata caatgattag tttctctcgt ctacaaaacg 11160
atatgttgca ttttcacttt tcttcttttt ttctaagatg atttgctttg accaatttgt 11220
ttagatcttt attttatttt attttctggt gggttggtgg aaattgaaaa aaaaaaaaac 11280
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tgcttctact attgaatctt tcctggattt tttactccta ttgggttttt atagtaaaaa 11400
tacataataa aaggaaaaca aaagttttat agattctctt aaacccctta cgataaaagt 11460
tggaatcaaa ataattcagg atcagatgct ctttgattga ttcagatgcg attacagttg 11520
catggcaaat tttctagatc cgtcgtcaca ttttattttc tgtttaaata tctaaatctg 11580
atatatgatg tcgacaaatt ctggtggctt atacatcact tcaactgttt tcttttggct 11640
ttgtttgtca acttggtttt caatacgatt tgtgatttcg atcgctgaat ttttaataca 11700
agcaaactga tgttaaccac aagcaagaga tgtgacctgc cttattaaca tcgtattact 11760
tactactagt cgtattctca acgcaatcgt ttttgtattt ctcacattat gccgcttctc 11820
tactctttat tccttttggt ccacgcattt tctatttgtg gcaatccctt tcacaacctg 11880
atttcccact ttggatcatt tgtctgaaga ctctcttgaa tcgttaccac ttgtttcttg 11940
tgcatgctct gttttttaga attaatgata aaactattcc atagtcttga gttttcagct 12000
tgttgattct tttgcttttg gttttctgca gaaacatggg tgcaggtgga agacgcgtta 12060
cgtagtcgac ggatccccgg gaattctaag aggagtccac catggtagat ctgactagtg 12120
ttaacg 12126
<210> 10
<211> 12973
<212> DNA
<213> pOsOle18-RNAi载体同时插入OsMADS1基因正、反义干扰片段的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体序列(pOsOle18::OsMADS1-RNAi)
<400> 10
ctagccacca ccaccaccac cacgtgtgaa ttacaggtga ccagctcgaa tttccccgat 60
cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 120
attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 180
acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 240
atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 300
ttactagatc gggaattaaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa 360
gagaaaagag cgtttattag aataacggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt 420
tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat 480
ccaacccctc cgctgctata gtgcagtcgg cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga 540
aaacgacatg tcgcacaagt cctaagttac gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg 600
gcgttttctt gtcgcgtgtt ttagtcgcat aaagtagaat acttgcgact agaaccggag 660
acattacgcc atgaacaaga gcgccgccgc tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac 720
cgacgaccag gacttgacca accaacgggc cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct 780
gttttccgag aagatcaccg gcaccaggcg cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga 840
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ggcagagccg tgggccgaca ccaccacgcc ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc 1020
cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc 1080
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gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct 1200
tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac 1260
cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga ggacgcattg accgaggccg acgccctggc 1320
ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac 1380
gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc 1440
gagccgcccg cgcacgtctc aaccgtgcgg ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat 1500
gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta 1560
aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg 1620
cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc 1680
agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg 1740
ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg 1800
ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg 1860
acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg 1920
acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc 1980
cttacgacat atgggccacc gccgacctgg tggagctggt taagcagcgc attgaggtca 2040
cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg 2100
gcggtgaggt tgccgaggcg ctggccgggt acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca 2160
cgcagcgcgt gagctaccca ggcactgccg ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac 2220
ccgagggcga cgctgcccgc gaggtccagg cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca 2280
tttgagttaa tgaggtaaag agaaaatgag caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg 2340
tccgagcgca cgcagcagca aggctgcaac gttggccagc ctggcagaca cgccagccat 2400
gaagcgggtc aactttcagt tgccggcgga ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt 2460
acgccaaggc aagaccatta ccgagctgct atctgaatac atcgcgcagc taccagagta 2520
aatgagcaaa tgaataaatg agtagatgaa ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa 2580
atcaagaaca accaggcacc gacgccgtgg aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt 2640
ggccaggcgt aagcggctgg gttgtctgcc ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc 2700
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ggtgatgacc tggtggagaa gttgaaggcc gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag 2820
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cggcaaccgc cggcagccgg tgcgccgtcg attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa 2940
ccagattttt tcgttccgat gctctatgac gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg 3000
gacgtggccg ttttccgtct gtcgaagcgt gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac 3060
gagcttccag acgggcacgt agaggtttcc gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg 3120
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ttctgccggc gagccgatgg cggaaagcag aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg 3300
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acggtatccg agggtgaagc cttgattagc cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg 3420
cggccggagt acatcgagat cgagctagct gattggatgt accgcgagat cacagaaggc 3480
aagaacccgg acgtgctgac ggttcacccc gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc 3540
cgttttctct accgcctggc acgccgcgcc gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc 3600
aagacgatct acgaacgcag tggcagcgcc ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg 3660
cgcaagctga tcgggtcaaa tgacctgccg gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag 3720
gctggcccga tcctagtcat gcgctaccgc aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt 3780
tcctaatgta cggagcagat gctagggcaa attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa 3840
ggtctctttc ctgtggatag cacgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg 3900
aacccgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact 3960
gatataaaag agaaaaaagg cgatttttcc gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact 4020
cttaaaaccc gcctggcctg tgcataactg tctggccagc gcacagccga agagctgcaa 4080
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gcggccgctg gccgctcaaa aatggctggc ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga 4200
caagccgcgc cgtcgccact cgaccgccgg cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg 4260
tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 4320
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gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 4800
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accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 4920
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 4980
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 5040
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tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga 5820
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tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca 5940
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tccttttccc gttccacatc ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa 6060
tataggtttt cattttctcc caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta 6120
tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta 6180
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tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg 6600
gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt aaacaaattg acgcttagac aacttaataa 6660
cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat taacgccgaa ttaattcggg ggatctggat 6720
tttagtactg gattttggtt ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa 6780
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tggcgacctc gtattgggaa tccccgaaca tcgcctcgct ccagtcaatg accgctgtta 7320
tgcggccatt gtccgtcagg acattgttgg agccgaaatc cgcgtgcacg aggtgccgga 7380
cttcggggca gtcctcggcc caaagcatca gctcatcgag agcctgcgcg acggacgcac 7440
tgacggtgtc gtccatcaca gtttgccagt gatacacatg gggatcagca atcgcgcata 7500
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ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt 8160
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tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc 8340
ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt 8400
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catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat 8580
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ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct 8760
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actagtgtta acg 12973
<210> 11
<211> 12060
<212> DNA
<213> pLHRNAi载体序列(pLHRNAi)
<400> 11
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cagacgtcgc ggtgagttca ggctttttca tatctcattg ccccccggga tctgcgaaag 7980
ctcgagagag atagatttgt agagagagac tggtgatttc agcgtgtcct ctccaaatga 8040
aatgaacttc cttatataga ggaaggtctt gcgaaggata gtgggattgt gcgtcatccc 8100
ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt 8160
ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg 8220
catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggtg ccaccttcct 8280
tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc 8340
ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt 8400
tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat gttatcacat caatccactt 8460
gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc 8520
catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat 8580
gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag 8640
ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag 8700
ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct 8760
ccaccatgtt gggcccggcg cgccaagctt ctagtgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc 8820
ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt 8880
tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact 8940
ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 9000
tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt 9060
ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat 9120
acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact 9180
aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact 9240
ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa 9300
aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg 9360
agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa 9420
ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct 9480
ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa 9540
ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg 9600
gcacggcagc tacgggggat tcctttccca ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc 9660
cgtaataaat agacaccccc tccacaccct ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc 9720
acacacacac aaccagatct cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 9780
ccgctcgtcc tccccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg 9840
ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat 9900
ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta 9960
acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga 10020
tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt 10080
tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt 10140
tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac 10200
tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac 10260
gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt 10320
ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt 10380
gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat 10440
ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg 10500
gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata 10560
catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa 10620
taaacaagta tgttttataa ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag 10680
cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt 10740
ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcactaggt accaggcctg 10800
agctctatcg cccctacgtc agctccatct ccaggtccgt cgcttctctt ccatttcttc 10860
tcattttcga ttttgattct tatttctttc cagtagctcc tgctctgtga atttctccgc 10920
tcacgataga tctgcttata ctccttacat tcaaccttag atctggtctc gattctctgt 10980
ttctctgttt ttttcttttg gtcgagaatc tgatgtttgt ttatgttctg tcaccattaa 11040
taataatgaa ctctctcatt catacaatga ttagtttctc tcgtctacaa aacgatatgt 11100
tgcattttca cttttcttct ttttttctaa gatgatttgc tttgaccaat ttgtttagat 11160
ctttatttta ttttattttc tggtgggttg gtggaaattg aaaaaaaaaa aaacagcata 11220
aattgttatt tgttaatgta ttcatttttt ggctatttgt tctgggtaaa aatctgcttc 11280
tactattgaa tctttcctgg attttttact cctattgggt ttttatagta aaaatacata 11340
ataaaaggaa aacaaaagtt ttatagattc tcttaaaccc cttacgataa aagttggaat 11400
caaaataatt caggatcaga tgctctttga ttgattcaga tgcgattaca gttgcatggc 11460
aaattttcta gatccgtcgt cacattttat tttctgttta aatatctaaa tctgatatat 11520
gatgtcgaca aattctggtg gcttatacat cacttcaact gttttctttt ggctttgttt 11580
gtcaacttgg ttttcaatac gatttgtgat ttcgatcgct gaatttttaa tacaagcaaa 11640
ctgatgttaa ccacaagcaa gagatgtgac ctgccttatt aacatcgtat tacttactac 11700
tagtcgtatt ctcaacgcaa tcgtttttgt atttctcaca ttatgccgct tctctactct 11760
ttattccttt tggtccacgc attttctatt tgtggcaatc cctttcacaa cctgatttcc 11820
cactttggat catttgtctg aagactctct tgaatcgtta ccacttgttt cttgtgcatg 11880
ctctgttttt tagaattaat gataaaacta ttccatagtc ttgagttttc agcttgttga 11940
ttcttttgct tttggttttc tgcagaaaca tgggtgcagg tggaagacgc gttacgtagt 12000
cgacggatcc ccgggaattc taagaggagt ccaccatggt agatctgact agtgttaacg 12060

Claims (10)

1.一种种子特异性干扰载体，其特征在于：所述载体为pOsOle18-RNAi载体，其DNA序列如SEQ ID NO 9所示。
2.权利要求1所述种子特异性干扰载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)获得双酶切pLHRNAi线性载体；
(2)将所述线性载体与pOsOle18的DNA片段进行同源重组反应，即得所需的种子特异性干扰载体。
3.根据权利要求2所述的种子特异性干扰载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述双酶切为使用HindIII和KpnI限制性内切酶进行。
4.权利要求1所述种子特异性干扰载体在研究种子表达基因的功能中的应用。
5.权利要求1所述种子特异性干扰载体在种子中特异性调控种子发育和/或蛋白质含量调节基因的表达，调控种子发育、改良水稻粒型、调控稻米蛋白质含量中的应用。
6.一种OsMADS1种子特异性干扰载体，其特征在于：所述载体为pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体，其DNA序列如SEQ ID NO 10所示。
7.权利要求6所述OsMADS1种子特异性干扰载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)获得pOsOle18-RNAi载体，其DNA序列如SEQ ID NO 9所示；
(2)获得OsMADS1基因正义干扰片段，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示；
(3)获得OsMADS1基因反义干扰片段，其DNA序列如SEQ ID NO 4所示；
(4)将所述OsMADS1基因正义干扰片段和OsMADS1基因反义干扰片段分别插入所述pOsOle18-RNAi载体中，即得所需的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体；具体按方法1或方法2进行：
方法1：将所述OsMADS1基因正义干扰片段插入所述pOsOle18-RNAi载体，得到含有所述OsMADS1基因正义干扰片段插入的中间载体A，再将所述OsMADS1基因反义干扰片段插入所述中间载体A，即得所需的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体；
方法2：将所述OsMADS1基因反义干扰片段插入所述pOsOle18-RNAi载体，得到含有所述OsMADS1基因反义干扰片段插入的中间载体B，再将所述OsMADS1基因正义干扰片段插入所述中间载体B，即得所需的pOsOle18::OsMADS1-RNAi载体。
8.根据权利要求7所述OsMADS1种子特异性干扰载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)的方法1为：
所述OsMADS1基因正义干扰片段插入位点位于所述pOsOle18-RNAi载体的FAD2内含子左侧多克隆位点的KpnI和StuI酶切位点之间；和/或；所述OsMADS1基因反义干扰片段插入位点位于所述pOsOle18-RNAi载体插入了OsMADS1基因正义干扰片段的中间载体A的FAD2启动子右侧多克隆位点的BamHI及MluI酶切位点之间；
所述步骤(4)的方法2为：
所述OsMADS1基因反义干扰片段插入位点位于所述pOsOle18-RNAi载体的FAD2启动子右侧多克隆位点的BamHI及MluI酶切位点之间；和/或；所述OsMADS1基因正义干扰片段插入位点位于所述pOsOle18-RNAi载体插入了OsMADS1基因反义干扰片段的中间载体B的FAD2内含子左侧多克隆位点的KpnI和StuI酶切位点之间。
9.权利要求6所述OsMADS1种子特异性干扰载体在研究OsMADS1基因对水稻种子发育、种子形态和稻米蛋白质含量的特定调控功能中的应用。
10.权利要求6所述OsMADS1种子特异性干扰载体在改良水稻粒型和蛋白质含量中的应用。
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