CN102191262A - 一种rna干扰载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种RNA干扰载体及其应用。本发明提供了一种RNA干扰载体，包括FAD2基因内含子、位于所述FAD2基因内含子两侧的上游多克隆位点和下游多克隆位点。所述FAD2基因内含子为序列表中序列1自5’末端第60-1190位核苷酸。本发明的实验证明，本发明提供了一种适用于植物的RNA干扰载体；RNA干扰载体在受体中表达形成的shRNA被Dicer酶剪切成siRNA；siRNA能特异性地抑制靶基因的表达，从而达到控制水稻株高，研究CYP90D2/D2基因功能的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物生物技术领域，特别是一种RNA干扰载体及其应用。
背景技术
株高是作物育种中的一个重要农艺性状。适当的株高有利于提高作物的生物量，增强抗倒伏能力，增加产量。在作物株高的常规育种中，通常使用矮源亲本作为供体亲本，使用株高偏高的优良品种作为受体亲本，先通过杂交将供体亲本的矮源基因导入到受体亲本中，再通过连续回交，在回交后代中选育具有适当株高的优良品系。通过常规育种来改良作物的株高在水稻及小麦等作物中取得了巨大的成功，但是这种方法也存在着一些不足：一是在常规育种中存在连锁累赘现象，即有利基因可能与另外一些不利基因紧密连锁，因此很难用回交的方法将这些不利基因排除掉；二是将供体亲本有利性状导入供体亲本的同时，也将供体亲本的其它一些不良性状导入到受体亲本中，因此要通过数次回交来排除这些不良性状，增加了工作量，延长了育种周期。
赤霉素(Gibberellin，GA)和油菜素内酯(Brassinosteroid，BR)是控制植物株高的两种最主要的植物激素，一些GA和BR突变体表现出不同程度的矮化表型。RNA干扰技术具有高效性、高特异性、重复性好及操作简便等特点，能够弥补上述常规育种的不足，因此可用使用RNA干涉技术来抑制GA或BR合成基因的表达，从而达到改良作物株高，减少育种周期的目的。
常用的植物RNA干扰载体除了常规双元载体所必备的核心元件，如启动子，多克隆位点，抗性标记基因外，还包含一段DNA序列作为shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA)的环状结构。植物RNAi干扰载体一般用细菌的GUS(转β-葡糖醛酸酶)基因片段或植物基因的内含子作为环状结构。与用GUS基因作为shRNA的环状结构的RNA干扰载体相比，用带剪接位点的基因内含子作为shRNA的环状结构的RNA干扰载体具有更高的干扰效率。
在植物转基因载体中，现在常用的外源组成型启动子有来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV35S promoter)，来自于玉米的Ubiquitin(多聚泛素蛋白基因)启动子，及来自水稻的Actin(肌动蛋白基因)启动子。在水稻等单子叶植物中，Ubiquitin及Actin启动子的表达效率要比35S启动子高出几十倍。
在将外源片段克隆到载体的分子生物学操作中，同源重组定向克隆和双酶切连接是两种常用的克隆方法。相比后者，前者的优势在于不需要用限制性内切酶酶切目的克隆片段，克服了酶切位点的限制，同时减少了操作步骤，有助于减少工作量，提高工作效率。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种RNA干扰载体。
本发明提供的RNA干扰载体，包括FAD2基因内含子、位于所述FAD2基因内含子两侧的上游多克隆位点和下游多克隆位点；
所述FAD2基因内含子的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第60-1190位。
所述上游多克隆位点为Kpn I、Stu I、EcoICRI和Sac I；
所述下游多克隆位点为Mlu I、SnaB I和BamHI。
所述FAD2基因内含子含有Pst I识别位点，所述Pst I识别位点为序列表中序列1自5’末端第1185-1190位核苷酸；可与所述下游多克隆位点构成新的下游多克隆位点。
所述干扰载体的启动子为Ubiquitin启动子。
本发明的另一个目的提供一种RNA干扰载体。
本发明提供的RNA干扰载体，按照如下方法制备：将DNA片段1与pCUbi1390载体骨架共培养，得到的载体；
所述DNA片段1包括含有上游多克隆位点的片段a、FAD2基因内含子、含有下游多克隆位点片段的b组成；
所述FAD2基因内含子的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第60-1190位；
所述片段a的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-30位；
所述片段a上与pCUbi1390载体Pst I左侧序列同源的核苷酸为序列1的自5’末端第1-18位核苷酸；
所述片段b的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1185-1241位，
所述片段b上与pCUbi1390载体Pst I右侧序列同源的核苷酸为序列表1自5’末端第1224-1241位核苷酸。
序列1的自5’末端第60-61位的GT和第1189-1190位的AG分别为内含子的剪切位点。
序列1的自5’末端第31-59位的核苷酸为FAD2基因部分外显子。
所述DNA片段1的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述上游多克隆位点为Kpn I、Stu I、EcoICRI和Sac I；
所述下游多克隆位点为Mlu I、SnaB I和BamH I。
所述FAD2基因内含子中含有Pst I识别位点，所述Pst I识别位点为序列表中序列1自5’末端第1185-1190位核苷酸；可与所述下游多克隆位点构成新的下游多克隆位点。
所述pCUbi1390载体骨架为将pCUbi1390经过Pst I酶切得到的线性载体。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
本发明提供的重组载体，按照如下I或II方法制备：
I包括如下步骤：
1)将DNA片段2插入所述的干扰载体的上游多克隆位点，得到含有所述下游多克隆位点的中间载体A；
2)将DNA片段3插入步骤1)得到的中间载体A的所述下游多克隆位点，得到重组载体；
II包括如下步骤：
A、将DNA片段3插入所述的干扰载体的下游多克隆位点，得到含有所述上游多克隆位点的中间载体B；
B、将DNA片段2插入步骤A得到的中间载体B的所述上游多克隆位点，得到重组载体；
所述DNA片段2包括目标蛋白编码基因片段和分别位于目标蛋白编码基因两侧的用于插入载体的2种DNA分子，所述分别位于目标蛋白编码基因片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子均包括所述上游多克隆位点中的至少一种酶切位点、与所述干扰载体或与所述中间载体B同源的核苷酸；
所述DNA片段3包括目标蛋白编码基因的反向互补片段和分别位于所述目标蛋白编码基因的反向互补片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子，所述分别位于所述目标蛋白编码基因的反向互补片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子均包括所述下游多克隆位点中的至少一种酶切位点、与所述干扰载体或与所述中间载体A同源的核苷酸；
所述DNA片段2的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述DNA片段3的核苷酸序列为序列表中序列4。
所述DNA片段2也可以插在干扰载体下游多克隆位点，所述DNA片段3也可以插在干扰载体上游多克隆位点，只要正义片段和反义片段的方向相反即可。
上述重组载体的构建中，DNA片段2和DNA片段3中既有同源重组序列又有双酶切位点，即可通过同源重组插入载体的多克隆位点处，得到重组载体；又可以通过双酶切与经过同样酶切得到的载体连接，得到重组载体。
所述的干扰载体和/或所述重组载体在植物转基因育种和/或鉴定基因功能中的应用。
所述重组载体在植物转基因育种和/或基因功能研究中的应用为抑制目的植物中的靶基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物的株高低于所述目的植物；所述抑制目的植物中的靶基因的表达的方法是通过向所述目的植物中转入重组表达载体实现的。
所述靶基因的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物优选为水稻；
所述株高由节间长度和/或穗长体现。
水稻株高＝节间长+穗长。
本发明的实验证明，本发明提供了一种适用于植物的RNA干扰载体；并且利用其来构建针对水稻油菜素内酯(Brassinosteroid，BR)合成酶基因-CYP90D2/D2的RNA干扰载体，并转化kitaake受体水稻品种。RNA干扰载体在受体中表达形成的shRNA被Dicer酶剪切成siRNA(Small interfering RNA，干扰小RNA)；siRNA能特异性抑制靶基因的表达，从而达到控制水稻株高，研究CYP90D2/D2基因功能的目的。
与现有的植物RNA干扰载体相比，本发明具有以下的优势：
1、使用玉米的Ubiquitin强启动子。应用该RNA干扰载体能显著提高shRNA的表达量，从而提高靶基因的干扰效率，增强干扰效果，该载体特别适用于水稻等单子叶植物。
2、使用拟南芥FAD2(脂肪酸去饱和酶2)基因的内含子作为shRNA的环状结构。在内含子剪接过程中，shRNA中靶基因正义及反义序列的相互配对得到增强，增加了shRNA被Dicer酶剪切成siRNA的概率，从而提高靶基因的干扰效率，增强干扰效果。
3、在载体FAD2基因内含子的左右两侧多克隆位点处各添加了4个限制性内切酶酶切位点，方便靶基因干扰片段的克隆。
4、在设计靶基因干扰片段PCR引物时，在引物中同时引入同源重组序列及双酶切位点。后续实验可视具体情况选用同源重组定向克隆或双酶切连接克隆方法，不仅操作灵活，而且用同源重组定向克隆方法克服了酶切位点的限制。
5、本发明包含设计、克隆靶基因干扰片段，筛选含有靶基因干扰片段的重组载体，检测转基因干扰植株等一系列操作的标准化方法；及在筛选含有靶基因干扰片段重组载体、检测转基因干扰植株等应用过程中所使用的PCR检测引物。在应用该RNA干扰载体时，实验操作变得简单易行，有利于减少失误，提高工作效率。
附图说明
图1为pLHRNAi载体的构建流程及结构示意图
图2为pLHRNAi-D2载体的构建流程及结构示意图
图3为pLHRNAi重组载体的构建及鉴定
图4为pLHRNAi-sense D2重组载体的构建及鉴定
图5为pLHRNAi-D2重组载体的构建及鉴定
图6为pLHRNAi-D2载体结构示意图
图7为受体材料kitaake的愈伤组织
图8为D2基因T0代干扰植株成熟期表型鉴定
图9为RT-PCR检测T0代阳性干扰植株D2基因的表达量
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、RNA干扰载体pLHRNAi的构建
RNA干扰载体pLHRNAi是用同源重组定向克隆的方法，将拟南芥FAD2基因的内含子正向克隆到带潮霉素筛选标记的植物双元载体pCUbi1390中，RNA干扰载体pLHRNAi的结构示意图如图1所示，具体方法如下：
1、拟南芥FAD2基因内含子片段的获得
采用CTAB法提取拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.))(Kraft E，Stone SL，Ma LG，Su N，Gao Y，Lau OS，Deng XW，Callis J(2005)Genome analysis and functionalcharacterization of the E2 and RING-Type E3 ligase ubiquitination enzymes ofArabidopsis.Plant Physiol 139：1597-1611，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)基因组DNA。
设计扩增内含子的引物序列如下(带下划线的字母表示pCUbi1390载体上Pst I酶切位点两侧的同源重组序列，左斜线表示限制性内切酶切割位点。)：
FAD2 intron-F：5’-ACTTCTGCACTAGGTAC/CAGG/CCTGAG/CT/CTATCGCCCCTACGTCAGCTC-3’(此时上游引物的酶切位点依次为Kpn I、Stu I、EcoICR I、Sac I)；
FAD2 intron-R：5’-TCCCGGG/GATCCGTCGACTAC/GTAA/CGCGTCTTCCACCTGCACCCATGTT-3’(此时下游引物的酶切位点依次为(引物没有添加Pst I酶切位点，Pst I酶切位点是FAD2内含子的尾部自带的，恰好可以使用，而且不会影响内含子的正常剪切功能，Mlu I、SnaB I和BamH I)。
PCR扩增程序：94℃ 2min；再98℃ 10sec，60℃ 5sec，72℃ 1.5min，30个循环；最后72℃ 7min。
以上述基因组DNA为模板，采用上述PCR扩增程序，以FAD2 intron-F和FAD2intron-R作为引物进行PCR扩增。
结果如图3A所示，为Pst I酶切pCUbi1390载体及FAD2基因内含子PCR扩增检测，M：DL 15000 DNA marker；1：pCUbi1390载体对照；2：经Pst I酶切的pCUbi1390载体(后面的实验中出现)；3：FAD2基因内含子PCR扩增片段。可以看出，得到1.24kb大小的PCR产物。将PCR产物送去测序，结果表明该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸。该PCR产物由含有上游多克隆位点的片段a、FAD2基因内含子、含有下游多克隆位点的片段b组成。序列1的自5’末端第1-30位为片段a；序列1的自5’末端第1-18位核苷酸与pCUbi1390载体Pst I左侧序列(靠近Ubiquitin启动子一侧)同源；序列1的自5’末端第60-1190位为FAD2基因内含子片段，其中第1185-1190位为Pst I酶切位点；序列1的自5’末端第60-61位的GT和第1189-1190位的AG为内含子剪切位点；序列1的自5’末端第1185-1241位为片段b；序列1的自5’末端第1224-1241位与pCUbi1390载体Pst I右侧序列同源(远离Ubiquitin启动子一侧)；序列1的自5’末端第31-59位的核苷酸为FAD2基因部分外显子。
所述上游多克隆位点为Kpn I、Stu I、EcoICR I和Sac I；
所述下游多克隆位点为Mlu I、SnaB I和BamH I。
FAD2基因内含子的Pst I酶切位点可与所述下游多克隆位点共同构成新的下游多克隆位点。
回收PCR产物备用。
也可以人工合成序列1。
2、Pst I酶切pCUbi1390线性载体的制备
使用Fermentas中国有限公司的FastDigest Pst I限制性内切酶，酶切pCUbi1390载体(Peng H，Zhang Q，Li YD，Lei CL，Zhai Y，Sun XH，Sun DY，Sun Y，Lu TG(2009)putative leucine-rich repeat receptor kinase，OsBRR1，is involved in rice blastresistance.Planta 230：377-385，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)，回收经过酶切的pCUbi1390线性载体备用。电泳检测如图3A的3。
3、pLHRNAi重组载体的获得
1)FAD2基因内含子的同源重组定向克隆
使用GenScript中国有限公司的CloneEZ同源重组定向克隆试剂盒将步骤1得到的回收的PCR产物与步骤2得到的回收的线性载体进行同源重组反应，反应体系如表1所示：
表1 同源重组反应体系
| 试剂 | 使用量 |
| 线性载体(≈80ng/μl) | 10μl |
| PCR回收产物(≈50ng/μl) | 4μl |
| 10×CloneEZ Buffer | 2μl |
| CloneEZ Enzyme | 2μl |
| RNase Free dH2O | 2μl |
| 总体积 | 20μl |
同源重组定向克隆的操作步骤如下：
(1)在1.5ml离心管中配制上述反应体系中各反应组分，轻微混匀，将样品在22℃水浴锅中重组反应30min；
(2)反应结束后，将样品放在冰上孵育5min。
(3)将步骤(2)得到的产物转入DH5α感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，得到转化子。
2)鉴定pLHRNAi重组载体
挑选上述转化子，接种于含卡拉霉素的LB液体培养基中，过夜培养；取过夜培养的菌液作为PCR反应模板，使用FAD2 intron-F及FAD2 intron-R引物，进行PCR扩增反应。
结果如图3B所示，PCR鉴定pLHRNAi重组载体，M：DL 2000 DNA marker；1-3：模板来自不含FAD2基因内含子的pCUbi1390空载体克隆；4-8：模板来自含FAD2基因内含子的pLHRNAi重组载体克隆。从图中看出，得到1.24kb DNA条带的即为阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，结果如图3C所示，pLHRNAi重组载体检测，M：DL 15000 DNA marker；1：pCUbi1390载体对照；2：pLHRNAi重组载体。从图中看出，得到重组载体。
将该质粒送去测序，测序引物为Left MCS-F及Right MCS-R(引物序列与载体pCUbi1390上的片段相匹配)，引物序列如下：
Left MCS-F：5’-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3’；
Right MCS-R：5’-TAATCATCGCAAGACCGGCAACAGG-3’。
测序结果表明该质粒为将序列表中的序列1(含有FAD2内含子片段)克隆到pCUbi1390载体的Pst I酶切位点处得到的重组载体，且将FAD2基因内含子片段克隆到pCUbi1390载体的Ubiquitin启动子后面，将该质粒命名为pLHRNAi，即为RNA干扰载体。该载体的结构示意图如图1所示，从图中看出，该载体具有上游多克隆位点和下游多克隆位点，其FAD2基因内含子的Pst I酶切位点与下游多克隆位点共同构成新的下游多克隆位点。
实施例2、RNA干扰载体pLHRNAi的应用
一、D2基因RNA干扰载体pLHRNAi-D2的构建
1、D2基因干扰片段的获得
油菜素内酯(Brassinosteroid，BR)为控制植物株高的重要植物激素，其由一系列的油菜素内酯合成酶合成。在水稻中，CYP90D2/D2基因编码油菜素合成途径中的一个关键合成酶。
1)引物设计
(1)扩增D2基因正义干扰片段所用的引物
带下划线的字母表示pLHRNAi载体的上游多克隆位点上，Sac I酶切位点两侧的同源重组序列(可通过同源同组定向克隆到载体上)，左斜线表示Kpn I及Sac I限制性内切酶切割位点(可通过双酶切连接克隆到载体上)，引物序列如下：
D2RNAi-sense-F：
5’-TTCTGCACTAGGTAC/CAGGCCTGCTGGCACTAGGCTCTACAGATCAC-3’(此引物含有Kpn I酶切位点)；
D2RNAi-sense-R：
5’-CTGACGTAGGGGCGATAGAGCT/CTGGGGAAGTTGACGATGTGG-3’(此引物含有Sac I酶切位点)。
以上的引物中既有同源重组序列又有酶切位点，后期的PCR产物既可通过同源重组与载体连接，也可通过双酶切连接与载体连接。
(2)扩增D2基因反义干扰片段所用的引物
带下划线的字母表示pLHRNAi载体的下游多克隆位点上，SnaB I酶切位点两侧的同源重组序列(可通过同源同组定向克隆到载体上)，左斜线表示BamH I及Mlu I限制性内切酶切割位点(可通过双酶切连接克隆到载体上)，引物序列如下：
D2RNAi-antisense-F：
5’-CGGG/GATCCGTCGACTACCTGGCACTAGGCTCTACAGATCAC-3’(此引物含有BamH I酶切位点)；
D2RNAi-antisense-R：
5’-AGGTGGAAGA/CGCGTTACTGGGGAAGTTGACGATGTGG-3’(此引物含有Mlu I酶切位点)。
以上的引物中既有同源重组序列又有酶切位点，后期的PCR产物既可通过同源重组与载体连接，也可通过双酶切连接与载体连接。
2)水稻品种kitaake幼苗RNA的提取及cDNA的制备
使用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，提取水稻kitaake(Oryza sativa)(Zhang X，Guo XP，Lei CL，Cheng ZJ，Lin QB，Wang JL，Wu FQ，Wang J，Wan JM(2010)Overexpression of S1CZFP1，a novelTFIIIA-type zinc finger protein from tomato，confers enhanced cold tolerancein transgenic arabidopsis and Rice.Plant Mol Biol Rep 29：185-196，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)14天幼苗的RNA，反转录得到cDNA。
3)PCR扩增D2基因干扰片段
以cDNA为模板，用D2RNAi-sense-F及D2RNAi-sense-R引物进行PCR扩增，得到PCR产物1。以cDNA为模板，用D2RNAi-antisense-F及D2RNAi-antisense-R引物进行PCR扩增，得到PCR产物2。
将上述PCR产物电泳检测，结果如图4A所示，D2基因干扰片段PCR检测，M：DL2000 DNA marker；1：D2基因正义干扰片段；2：D2基因反义干扰片段。从图中看出，PCR产物1大小为760bp，PCR产物2大小为750bp。将PCR产物1和2均送去测序，结果表明PCR产物1具有序列表中序列3所示核苷酸(序列3(除去序列两端所加的，克隆片段所需的，载体pLHRNAi上游多克隆位点的Sac I酶切位点两侧的同源重组序列及Kpn I、Sac I双酶切位点)为序列2的一部分；序列3的自5’末端第24-737位核苷酸为序列2的自5’末端第701-1414位核苷酸的序列。)，PCR产物1即为正义D2基因干扰片段；PCR产物2具有序列表中序列4所示核苷酸(序列4(除去序列两端所加的，克隆片段所需的，载体pLHRNAi下游多克隆位点的SnaB I酶切位点两侧的同源重组序列及Mlu I、BamH I双酶切位点)，为序列3(除去序列两端所加的，克隆片段所需的，载体pLHRNAi上游多克隆位点的Sac I酶切位点两侧的同源重组序列及Kpn I、Sac I双酶切位点)序列的反向互补片段。序列4的自5’末端第19-732位核苷酸为序列3的自5’末端第24-737位核苷酸的反向互补片段，因此PCR产物2即为反义D2基因干扰片段。
分别回收PCR产物1和2。
2、带D2基因正义干扰片段的pLHRNAi-sense-D2重组载体的获得
1)D2基因正义干扰片段的同源重组定向克隆
用Sac I酶切实施例1得到的pLHRNAi载体，结果如图4B所示，Sac I酶切pLHRNAi载体检测，M：DL 15000 DNA marker；1：pLHRNAi载体对照；2：经Sac I酶切的pLHRNAi载体。可以看出，得到了线性pLHRNAi，回收待用。
采用同源重组定向克隆的方法(具体步骤和反应体系见实施例1的3)，先将回收的PCR产物1和线性pLHRNAi进行同源重组反应，再将同源重组产物转入DH5α感受态细胞，得到转化子。
2)鉴定pLHRNAi-sense-D2重组载体
挑选1)中所得的转化子，接种于含卡拉霉素的LB液体培养基中，过夜培养；取过夜培养的菌液作为PCR反应模板，使用Left MCS-F及Left MCS-R引物，进行PCR扩增反应。结果如图4C所示，PCR鉴定pLHRNAi-sense D2重组载体，M：DL 2000 DNA marker；1-6：模板来自pLHRNAi-sense D2重组载体克隆。可以看出，得到854bp DNA条带的即为阳性克隆，引物序列如下：
Left MCS-F：5’-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3’；
Left MCS-R：5’-GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3’。
提取阳性克隆的质粒，电泳检测如图4D所示，pLHRNAi-sense D2重组载体检测M：DL 15000 DNA marker；1：pLHRNAi载体对照；2-4：重组载体，可以看出得到重组载体。
将该质粒送去测序，测序引物为Left MCS-F及Left MCS-R，测序结果表明，该质粒为将序列表中的序列3(D2基因正义干扰片段)克隆到pLHRNAi载体的上游多克隆位点Sac I处得到的重组载体，将质粒命名为pLHRNAi-sense-D2载体
3、带D2基因正义及反义干扰片段的pLHRNAi-D2重组载体的获得
1)D2基因反义干扰片段的同源重组定向克隆
用SnaBI酶切步骤2、2)中得到的pLHRNAi-sense-D2，回收线性pLHRNAi-sense-D2。电泳见图5A所示，SnaBI酶切pLHRNAi-sense D2载体检测，M：DL 15000 DNA marker；1：pLHRNAi-sense D2载体对照；2：经SnaBI酶切的pLHRNAi-sense D2线性载体，可以看出得到线性载体。
采用同源重组定向克隆的方法(具体步骤和反应体系见实施例1的3)，先将回收的PCR产物2和线性pLHRNAi-sense-D2进行同源重组反应，再将同源重组产物转入DH5α感受态细胞，得到转化子。
2)鉴定pLHRNAi-D2重组载体
挑选1)中所得的转化子，接种于含卡拉霉素的LB液体培养基中，过夜培养；取过夜培养的菌液作为PCR反应模板，使用Right MCS-F及Right MCS-R引物，进行PCR扩增反应。结果如图5B所示，PCR鉴定pLHRNAi-D2重组载体，M：DL 2000 DNA marker；1-6：模板来自pLHRNAi-D2重组载体。可以看出，得到1.09kb DNA条带的即为阳性克隆。引物序列如下：
Right MCS-F：5’-CCTTTCACAACCTGATTTCCCA-3’；
Right MCS-R：5’-TAATCATCGCAAGACCGGCAACAGG-3’。
提取阳性克隆的质粒，电泳检测如图5C所示，pLHRNAi-D2重组载体检测，M：DL15000 DNA marker；1：pLHRNAi-sense D2载体对照；2-4：重组载体，可以看出，得到重组载体。
将该质粒送去测序，以Left MCS-F，Left MCS-R，Right MCS-F及Right MCS-R作为测序引物。测序结果表明，该质粒为将序列表中的序列4(D2基因反义干扰片段)克隆到pLHRNAi-sense-D2载体SnaB I酶切位点处得到的重组载体；也可以说该质粒为将序列表中的序列3(D2基因正义干扰片段)克隆到pLHRNAi载体的上游多克隆位点中的Sac I处，且将序列表中的序列4(D2基因反义干扰片段)克隆到pLHRNAi载体的下游多克隆位点中的SnaB I处得到的重组载体。将该质粒命名为pLHRNAi-D2。pLHRNAi-D2的结构示意图如图6所示，构建流程如图2所示。
也可以采用上述同源重组定向克隆的基本方法，先将D2基因反义干扰片段进行同源重组定向克隆得到中间载体，再将D2基因正义干扰片段插入上述中间载体，得到pLHRNAi-D2重组载体。经过测序鉴定，载体构建正确。
也可以运用酶切连接的方法构建pLHRNAi-D2重组载体：
具体如下：先将PCR产物1用Kpn I及Sac I酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的pLHRNAi载体连接，得到中间载体；再将PCR产物2用Mlu I及BamH I酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的中间载体连接，得到pLHRNAi-D2重组载体。经过测序鉴定，载体构建正确。
二、RNA干扰载体pLHRNAi-D2的遗传转化
将pLHRNAi-D2载体转入EHA105农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(Wu ZM，Zhang X，He B，Diao LP，Sheng SL，Wang JL，Guo XP，Su N，Wang LF，Jiang L，WangCM，Zhai HQ，Wan JM(2007)A chlorophyll-deficient Rice mutant with impairedchlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis.Plant Physiol145：29-40，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)中，得到转化子。将转化子提取质粒送去测序，结果表明质粒为pLHRNAi-D2，因此将含有pLHRNAi-D2的转化子命名为EHA105/pLHRNAi-D2。
将EHA105/pLHRNAi-D2转入水稻kitaake(以下简称野生型水稻)胚的愈伤组织(图7，左图部分为种子胚诱导的愈伤组织；右图部分为经过继代培养一次的愈伤组织。)中，具体步骤如下：
(1)28℃培养EHA105/pLHRNAi-D2农杆菌16hr，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L的N6液体培养基中至浓度为OD600≈0.5；
N6液体培养基配方：
(2)取适量经过继代培养的kitaake水稻成熟胚愈伤组织与上述菌液混合，侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基中，24℃共培养3天；
共培养基配方：
(3)将上述愈伤接种在含有150mg/L G418的N6固体筛选培养基上第一次筛选16天；
(4)挑取健康愈伤转入200mg/L G418的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；
(5)挑取抗性愈伤转入含有150mg/L G418的分化培养基上分化培养；
分化培养基配方：
(6)待分化成苗的再生水稻植株长至15cm高时(约45天)，打开瓶口炼苗3天，并移栽至温室栽培，得到41株T0代D2基因干扰水稻。
采用同样的方法将空载体pLHRNAi转入kitaake水稻中，得到T0代转空载体水稻；提取DNA作为模板，以D2RNAi-sense-F和D2RNAi-sense-R作为引物，进行PCR。结果没有扩增出目的片段。
三、D2基因T0代干扰水稻基因型及表型鉴定
1、基因型鉴定
提取T0代D2基因干扰植株的DNA，以Left MCS-F及Left MCS-R为引物，进行PCR扩增，得到854bp DNA条带的即为T0代D2基因干扰水稻。共得到26株PCR鉴定为阳性的T0代D2基因干扰水稻，其中有19株表现出不同程度的矮化表型，证明这19株为阳性T0代D2基因干扰水稻，命名为kri1-19。
以野生型水稻和T0代转空载体水稻(命名为Control)作为对照，统计这19株为阳性T0代D2基因干扰水稻的穗长、各节间长度及株高，实验重复三次，结果取平均值，结果见表1所示。
表1 T0代D2基因干扰水稻的穗长、节间长度及株高统计
从表1中可以看出，与野生型水稻相比，kri1-19的阳性T0代D2基因干扰水稻的穗长及节间长度均缩短。水稻的株高由穗长及节间长度组成，因此株高也降低。其中的6株(kri14-19)表现出极端矮化表型。在这些极端矮化干扰水稻(kri14-19)中，所有节间都极度缩短；在轻微及中度矮化干扰水稻(轻微：kri1-4；中度：kri5-13)中，有的水稻的每个节间都均匀缩短；有的水稻的最后两个节间没有形成，其它节间部分缩短。野生型水稻和T0代转空载体水稻结果无显著差异。
从图8A，D2基因T0代干扰水稻成熟期表型，Wild type：野生型水稻；kri2，kri5，kri15：T0代D2基因干扰水稻；箭头表示水稻的穗部；比例尺为10cm。可以看出编号为Kri15的阳性T0代D2基因干扰水稻表现为极端矮化，叶片直立，不育(不育即指整株水稻不结实，用数据表示即为：小穗育性(水稻穗部的种子数/种子数+空颖壳数)为0)。
进一步观察，如图8B所示，T0代D2基因干扰水稻节间表型，Wild type：野生型(kitaake)对照水稻；kri2，kri5，kri15：D2基因T0代干扰水稻；箭头表示水稻的茎节；比例尺为10cm。可以看出，编号为Kri15的阳性T0代D2基因干扰水稻的所有节间都极度缩短；编号为Kri15及Kri16的阳性T0代D2基因干扰水稻的每个节间都均匀缩短。
提取kri2(轻微矮化)、kri5(中度矮化)及kri15(极端矮化)的阳性T0代D2基因干扰水稻的RNA，反转录cDNA；以野生型水稻为对照，用RT-PCR检测阳性干扰植株D2基因的表达情况，引物为D2 RT-F及D2 RT-R，序列如下：
D2 RT-F：5’-ATGGCGAGGCTGATACAGAGG-3’；
D2 RT-R：5’-CTAGTCGTCGTCCTCCTTGGC-3’。
以Osactine基因作为内参，引物序列为：
Osactine RT-F：5’-TGGAACTGGTATGGTCAAGGC-3’；
Osactine RT-R：5’-AGTCTCATGGATACCCGCAG-3’。
结果如图9所示，Wild type：野生型(kitaake)对照植株；kri2，kri5，kri15：D2基因T0代干扰植株；OsActin：水稻中的肌动蛋白基因，作为RT-PCR的内参。与野生型水稻相比，阳性T0代D2基因干扰水稻中D2基因的表达量明显减低。这些阳性干扰植株中，D2基因的表达量和干扰植株表型的严重程度成负相关关系。在极端矮化的干扰植株(kri15)中，几乎检测不到D2基因的表达；在中度矮化的干扰植株(kri5)中，D2基因的表达量显著下降；在轻微矮化的干扰植株(kri2)中，D2基因的表达量有所降低。这说明D2基因干扰株系的矮化表型是由于D2基因的表达受到抑制引起的，因此达到了使用RNA干扰载体pLHRNAi来抑制D2基因的表达，从而控制水稻株高的目的。
以上结果说明RNA干扰载体pLHRNAi在植物转基因育种及基因功能研究方面具有重要的应用价值，本发明为植物转基因育种及基因功能研究提供了新的技术手段。
Claims (10)
1.一种RNA干扰载体，包括FAD2基因内含子、位于所述FAD2基因内含子两侧的上游多克隆位点和下游多克隆位点；
所述FAD2基因内含子的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第60-1190位。
2.根据权利要求1所述的干扰载体，其特征在于：
所述上游多克隆位点为Kpn I、Stu I、EcoICR I和Sac I；
所述下游多克隆位点为Mlu I、SnaB I和BamH I。
3.根据权利要求1或2所述的干扰载体，其特征在于：
所述干扰载体的启动子为Ubiquitin启动子。
4.一种RNA干扰载体，按照如下方法制备：将DNA片段1与pCUbi1390载体骨架共培养，得到的载体；
所述DNA片段1包括含有上游多克隆位点的片段a、FAD2基因内含子、含有下游多克隆位点的片段b组成；
所述FAD2基因内含子的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第60-1190位；
所述片段a的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-30位；
所述片段b的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1185-1241位。
5.根据权利要求4所述的干扰载体，其特征在于：
所述DNA片段1的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述上游多克隆位点为Kpn I、Stu I、EcoICR I和Sac I；
所述下游多克隆位点为Mlu I、SnaB I和BamH I。
6.根据权利要求4或5所述的干扰载体，其特征在于：
所述pCUbi1390载体骨架为将pCUbi1390经过Pst I酶切得到的线性载体。
7.一种重组载体，按照如下I或II方法制备：
I包括如下步骤：
1)将DNA片段2插入权利要求1-6中任一所述的干扰载体的上游多克隆位点，得到含有所述下游多克隆位点的中间载体A；
2)将DNA片段3插入步骤1)得到的中间载体A的所述下游多克隆位点，得到重组载体；
II包括如下步骤：
A、将DNA片段3插入权利要求1-6中任一所述的干扰载体的下游多克隆位点，得到含有所述上游多克隆位点的中间载体B；
B、将DNA片段2插入步骤A得到的中间载体B的所述上游多克隆位点，得到重组载体；
所述DNA片段2包括目标蛋白编码基因片段和分别位于目标蛋白编码基因两侧的用于插入载体的2种DNA分子，所述分别位于目标蛋白编码基因片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子均包括所述上游多克隆位点中的至少一种酶切位点、与所述干扰载体或与所述中间载体B同源的DNA片段；
所述DNA片段3包括目标蛋白编码基因的反向互补片段和分别位于所述目标蛋白编码基因的反向互补片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子，所述分别位于所述目标蛋白编码基因的反向互补片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子均包括所述下游多克隆位点中的至少一种酶切位点、与所述干扰载体或与所述中间载体A同源的DNA片段；
所述DNA片段2的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述DNA片段3的核苷酸序列为序列表中序列4。
8.权利要求1-6中任一所述的干扰载体和/或权利要求7所述重组载体在植物转基因育种和/或鉴定基因功能中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述重组载体在植物转基因育种和/或鉴定基因功能中的应用为抑制目的植物中的靶基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物的株高低于所述目的植物；
所述抑制目的植物中的靶基因的表达的方法是通过向所述目的植物中转入重组表达载体实现的。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：
所述靶基因的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物优选为水稻；
所述株高由节间长度和/或穗长体现。
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