CN110157707A - 一个水稻miRNA及其前体基因在水稻抗白叶枯病中的应用 - Google Patents

一个水稻miRNA及其前体基因在水稻抗白叶枯病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一个水稻miRNA及其前体基因在水稻抗白叶枯病中的应用。本发明要求保护一种miRNA(osa‑miR167h‑3p)，如序列表的序列1所示。本发明还保护所述miRNA的前体基因。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在植物中过表达所述miRNA，得到抗病性提高的转基因植物。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在植物中导入所述前体基因，得到抗病性提高的转基因植物。本发明可用于改良水稻对白叶枯病的抗性，对于培育抗白叶枯病水稻新品种具有重要的意义，适合于推广应用。

Description

一个水稻miRNA及其前体基因在水稻抗白叶枯病中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一个水稻miRNA及其前体基因在水稻抗白叶枯病中的应用。
背景技术
水稻是全球重要的粮食作物，由黄单胞杆菌水稻致病变种引起的水稻白叶枯病是水稻生产上的主要细菌性病害，在亚洲地区发生尤为严重。在我国华南稻区，水稻白叶枯病发病面积广、发病率高、传染快，严重制约着我国粮食的生产安全。培育和种植抗病品种是当前防治水稻白叶枯病经济有效的措施。迄今，已正式报道44个水稻抗白叶枯病基因，其中仅Xa3、Xa4、Xa21和Xa23等基因在育种中广泛应用。黄单胞杆菌水稻致病变种变异速度快，多样性复杂，生产实践表明携带单一抗病基因的品种大面积推广种植后，导致优势毒性小种增多或病菌变异出新的毒性小种，品种抗性极易丧失。
microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为20-24nt的非编码单链RNA分子，在植物的生长发育、细胞代谢、信号转导、生物胁迫和非生物胁迫等过程起着关键作用。
与抗病基因相比，miRNA能及时精确地调控抗病相关基因的表达，启动抗病反应，增强植物的抗病性，还可以避免抗病基因在植物体内的持续表达带来的不良影响。因此，鉴定水稻抗病相关miRNA，对于水稻抗病育种具有重要价值。
发明内容
本发明的目的是提供一个水稻miRNA及其前体基因在水稻抗白叶枯病中的应用。
本发明要求保护一种miRNA(osa-miR167h-3p)，如序列表的序列1所示。
本发明还保护所述miRNA的前体基因。具体来说，本发明保护所述miRNA在水稻中的前体基因。所述前体基因具体可为序列表的序列表的序列2所示的DNA分子。
本发明还保护所述miRNA在调控植物的抗病性中的应用。所述调控为正调控。所述正调控的含义为：miRNA水平增高，抗病性提高。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述植物可为禾本科植物。所述植物可为水稻，例如水稻日本晴。所述抗病性可为对白叶枯病的抗病性。所述抗病性可为对水稻白叶枯病的抗病性。
本发明还保护所述前体基因在制备抗病性提高的转基因植物中的应用。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述植物可为禾本科植物。所述植物可为水稻，例如水稻日本晴。所述抗病性可为对白叶枯病的抗病性。所述抗病性可为对水稻白叶枯病的抗病性。
本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在植物中过表达所述miRNA，得到抗病性提高的转基因植物。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述植物可为禾本科植物。所述植物可为水稻，例如水稻日本晴。所述抗病性可为对白叶枯病的抗病性。所述抗病性可为对水稻白叶枯病的抗病性。
本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在植物中导入所述前体基因，得到抗病性提高的转基因植物。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述植物可为禾本科植物。所述植物可为水稻，例如水稻日本晴。所述抗病性可为对白叶枯病的抗病性。所述抗病性可为对水稻白叶枯病的抗病性。
本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在植物中导入所述前体基因并表达，得到抗病性提高的转基因植物。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述植物可为禾本科植物。所述植物可为水稻，例如水稻日本晴。所述抗病性可为对白叶枯病的抗病性。所述抗病性可为对水稻白叶枯病的抗病性。
本发明还保护以上任一所述方法在植物育种中的应用。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述植物可为禾本科植物。所述植物可为水稻，例如水稻日本晴。所述育种的目的为获得抗病性提高的植物。所述抗病性可为对白叶枯病的抗病性。所述抗病性可为对水稻白叶枯病的抗病性。
以上任一所述水稻白叶枯病具体可为黄单胞杆菌水稻致病变种引起的。
以上任一所述水稻白叶枯病具体可为水稻白叶枯病菌PXO99引起的。水稻白叶枯病菌PXO99，为菲律宾强毒力菌株。
本发明公开了一种miRNA，即osa-miR167h-3p，提供了其成熟序列及其前体基因序列。osa-miR167h-3p具有正向调控水稻的抗病性的功能。过表达osa-miR167h-3p前体基因可以显著提高水稻对白叶枯病的抗病性。本发明可用于改良水稻对白叶枯病的抗性，对于培育抗白叶枯病水稻新品种具有重要的意义，适合于推广应用。
附图说明
图1为实施例1中接种水稻白叶枯病菌PXO99后不同材料中osa-miR167h-3前体基因的相对表达量。
图2为实施例2中PCR鉴定的部分结果；M：DL2000DNA marker；1：阳性对照；2：阴性对照；3：OE-3植株；4：OE-4植株；5：OE-12植株。
图3为实施例2中osa-miR167h-3p前体基因的相对表达量的检测结果。
图4为实施例2中病斑长度的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
水稻日本晴(Nip)，属于普通栽培稻粳稻品种。水稻白叶枯病菌PXO99，为菲律宾强毒力菌株。水稻品种日本晴对水稻白叶枯病菌PXO99表现为中感。
pCUbi1390载体：BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心。
根癌农杆菌EHA105：BioVector NTCC典型培养物保藏中心。
miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司，货号为KR211。网址：https://www.docin.com/p-2044311570.html。miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司，货号为FP411；网址：http://www.docin.com/p-2042264874.html。
实施例1、osa-miR167h-3p的获得
将水稻种子(抗病导入系FF329、轮回亲本HHZ)放在浸种袋中，37℃催芽2天，然后移入育秧盘，2周后移栽于大田，每份材料种植10行，每行8株。待分蘖盛期，对植株进行水稻白叶枯病菌PXO99侵染，采用剪叶法接种，每株接种5-6片，分别在接种后0h、12h、24h和36h取样，每个时间点取2个重复，共计16个样品。收集样本时应取水稻接种部分及其向下延伸的约1cm部分，取样后立即放入液氮冷冻，并于-80℃保存。
采用TIANGEN公司的植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取上述16个样品，将提取好的RNA进行质检和小分子RNA建库。具体建库过程为：采用质检合格的样品，以1.5μg RNA作为样本起始量，利用T4RNA Ligase1和T4RNA Ligase2分别在small RNA的3’端和5’端连接上接头，反转录合成cDNA，PCR扩增，采用胶分离技术筛选目的片段，切胶回收得到的片段即为small RNA文库。运用Illumina Hiseq 2000平台进行测序，得到每个样本的数据量约为10M。
将测序得到的原始数据进行过滤筛选获得含有miRNA的未注释的reads，使用miRDeep2软件将未注释的reads与水稻参考基因组(MSU_v7.0)进行序列比对，比对上的reads即为Mapped Reads。再将Mapped Reads与miRBase数据库进行比对，获得已知miRNA；通过miRBase数据库中已知的miRNA及Randfold软件预测新miRNA的二级结构，进而预测新miRNA。采用R工具包中的DESeq2对抗感材料间的miRNA进行差异表达筛选，筛选标准为FoldChange>2或Fold Change<1/2及FDR<0.05，获得一些可能参与白叶枯抗性的miRNA。其中鉴定到的miRNA之一为osa-miR167h-3p。
osa-miR167h-3p的成熟序列(序列表中的序列1)：AGGUCAUGCUGUAGUUUCAUC。
水稻日本晴中，osa-miR167h-3p的前体基因序列(序列表中的序列2)：CACAAGTTGGTGAAGCTGCCAGCATGATCTGATGATGATGATGATCCACCTCTCTCATCTGTGTTCTTGATTAATTACGGATCAATCGATCAGGTCATGCTGTAGTTTCATCTGCTGGTT。
根据差异表达筛选的结果(见表1)发现，osa-miR167h-3p在接种PXO99后的4个时间点，抗病材料FF329中的表达量都远远高于感病材料HHZ，约是HHZ的6.5-15倍，其中在0h的差异表达倍数最小，在12h的差异表达倍数最大(表1)，初步推测osa-miR167h-3p可能正调控水稻白叶枯抗性。
表1osa-miR167h-3p在接种PXO99后不同时间点不同材料间的表达量
#ID H-0 F-0 H-12 F-12 H-24 F-24 H-36 F-36
osa-miR167h-3p 393.23 2570.05 331.68 5253.57 472.06 4471.95 357.39 4713.14
注：H-0指感病材料HHZ接种PXO99后0h；F-0指抗病材料FF329接种PXO99后0h，其他样品依次类推。
为了验证测序数据的可靠性，采用荧光定量PCR方法检测上述16个样品中osa-miR167h-3p的表达量。
(1)采用miRcute增强版miRNA cDNA第一链合成试剂盒合成成熟miRNA的cDNA。反转录体系：Total RNA 2μg，2×miRNA RT Reaction Buffer 10μl，miRNA RT Enzyme Mix 2μl，加RNase-Free ddH2O补充至20μl。反转录程序：42℃60min,95℃3min。反应完成后稀释10倍放置-20℃保存备用。
(2)设计osa-miR167h-3p的荧光定量PCR的正向特异性引物，下游引物为试剂盒通用引物，以U6作为内参基因，使用miRcute Plus miRNA qPCR Kit的SYBR Green法进行qPCR检测。反应体系：2×miRcute Plus miRNA PreMix(SYBR&ROX)10μl，osa-miR167h-3p-qF(10μM)0.4μl，Reverse Primer(10μM)0.4μl，miRNA第一链cDNA 2μl，加dd ddH2O补充至20μl。反应程序：95℃5min；94℃20s，60℃34s,40个循环；溶解曲线分析。
用于荧光定量PCR的引物如下：
U6-qF：CGATAAAATTGGAACGATACAGA；
osa-miR167h-3p-qF：cgggccAGGTCATGCTGTAGTTTCATC。
(3)采用2-ΔΔCt计算osa-miR167h-3p的表达量，并对抗病材料FF329和感病材料HHZ的表达量进行比较分析。结果见图1，在抗病材料FF329中，接种PXO99后0h、12h、24h和36h，osa-miR167h-3p的表达量都远远高于感病材料HHZ，约是HHZ的3-7倍。
与表1的测序数据相比，荧光定量PCR显示的差异倍数略小于测序数据，但表达趋势是一致的。总的来说，在接种PXO99后，抗病材料FF329中的osa-miR167h-3p表达量高于感病材料HHZ中的表达量，可能正调控水稻白叶枯抗性。
实施例2、转基因植株的获得和鉴定
一、osa-miR167h-3p前体基因过表达载体的构建
将pCUbi1390载体中的“TGCAGGTCGAC”取代为序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到重组质粒pUbi::premiR167h-3p。pCUbi1390载体已进行测序，如序列表的序列3所示。重组质粒pUbi::premiR167h-3p已进行测序验证，如序列表的序列4所示。
序列表的序列2所示的双链DNA分子是从水稻日本晴基因组DNA中PCR扩增得到的。
二、转基因水稻植株的获得
将重组质粒pUbi::premiR167h-3p导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。采用农杆菌侵染法将重组农杆菌对水稻日本晴的胚性愈伤组织进行遗传转化，采用50mg/L的潮霉素进行抗性筛选，然后进行再生培养，得到再生植株(T0代植株)。
通过PCR鉴定从再生植株中筛选转基因植株。PCR鉴定的具体方法：提取植株叶片的基因组DNA，采用pCUbi1390-VF和miR167h-3p-JR组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，如果具有特异性扩增产物(165bp)，该植株为转基因植株(又称为过表达植株)。将重组质粒pUbi::premiR167h-3p作为阳性对照。将水稻日本晴的基因组DNA作为阴性对照。部分植株的电泳图见图2。
pCUbi1390-VF：5’-TCGATGCTCACCCTGTTGTT-3’；
miR167h-3p-JR：5’-AACCAGCAGATGAAACTACAGC-3’。
将T0代转基因植株自交并收获种子，得到T1代种子。将T1代种子培育为植株，即为T1代植株。T1代植株自交并收获种子，得到T2代种子。将T2代种子培育为植株，即为T2代植株。植株进行PCR鉴定(方法同上)。
对于某一T0代转基因植株，如果其自交获得的T2代植株均为转基因植株，该T0代植株为纯合的转基因植株，该T0代植株的自交后代为一个纯合的转基因株系。
随机取3个纯合的转基因株系(OE-3株系、OE-4株系、OE-12株系)，进行步骤四和步骤五的鉴定。
三、转空载体水稻植株的获得
用pCUbi1390载体代替重组质粒pUbi::premiR167h-3p，按照步骤二进行操作，得到转空载体植株。
四、osa-miR167h-3p前体基因过表达株系的表达量分析
供试植株为：OE-3株系的T2代植株、OE-4株系的T2代植株、OE-12株系的T2代植株、水稻日本晴植株。
取供试植株的叶片，提供总RNA，然后采用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行反转录得到cDNA，然后采用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒进行荧光定量PCR以检测osa-miR167h-3p前体基因的表达量。荧光定量PCR采用U6基因作为内参基因。荧光定量PCR时加入针对目标基因的上游引物。
用于检测U6基因的上游引物如下：
U6-qF：CGATAAAATTGGAACGATACAGA。
用于检测osa-miR167h-3p基因的上游引物如下：
osa-miR167h-3p-qF：cgggccAGGTCATGCTGTAGTTTCATC。
osa-miR167h-3p前体基因的相对表达量结果见图3。与水稻日本晴相比，三个转基因株系(OE-3株系、OE-4株系、OE-12株系)中osa-miR167h-3p前体基因的相对表达量均显著上调，为水稻日本晴的2.5-3倍。
五、转基因株系的抗白叶枯病鉴定
供试植株为：OE-3株系的T2代植株、OE-4株系的T2代植株、OE-12株系的T2代植株)、水稻日本晴植株、转空载体株系的T2代植株。
1、将供试植株在温室中培养约25天，然后移栽至网室中，单株种植。
2、植株生长至分蘖盛期时，采用剪叶法接种水稻白叶枯病菌PXO99(即用剪刀蘸取水稻白叶枯病菌PXO99菌液后剪除叶片的顶端约1cm，水稻白叶枯病菌PXO99菌液的菌浓度为1×109cfu/mL)，每株植株接种5-6个剑叶，然后继续培养14天。
3、完成步骤2后，可以观察到每个接种叶片沿叶脉有一个病斑，测量每个接种叶片的病斑长度。
每个株系对20株植株进行检测。
结果见图4。水稻日本晴的平均病斑长度为8.2cm，OE-3株系、OE-4株系和OE-12株系的平均病斑长度依次为3.8cm、3.2cm和4cm，均显著小于水稻日本晴的病斑长度。转空载体植株的病斑长度与水稻日本晴无显著差异。结果表明，过表达osa-miR167h-3p前体基因能显著提高水稻对白叶枯病的抗病性。
以上结果表明，osa-miR167h-3p前体基因正向调控水稻对白叶枯病的抗性。
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aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg 1620
cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc 1680
agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg 1740
ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg 1800
ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg 1860
acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg 1920
acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc 1980
cttacgacat atgggccacc gccgacctgg tggagctggt taagcagcgc attgaggtca 2040
cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg 2100
gcggtgaggt tgccgaggcg ctggccgggt acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca 2160
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aatgagcaaa tgaataaatg agtagatgaa ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa 2580
atcaagaaca accaggcacc gacgccgtgg aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt 2640
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cggcaaccgc cggcagccgg tgcgccgtcg attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa 2940
ccagattttt tcgttccgat gctctatgac gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg 3000
gacgtggccg ttttccgtct gtcgaagcgt gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac 3060
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gattacgacc tggtactgat ggcggtttcc catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg 3180
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ttctgccggc gagccgatgg cggaaagcag aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg 3300
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cgttttctct accgcctggc acgccgcgcc gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc 3600
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gatataaaag agaaaaaagg cgatttttcc gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact 4020
cttaaaaccc gcctggcctg tgcataactg tctggccagc gcacagccga agagctgcaa 4080
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tacaaataca tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac 6840
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gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc 8520
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taaacaagta tgttttataa ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag 10680
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<210> 4
<211> 10969
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
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agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 4560
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 4620
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 4680
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 4740
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 4800
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 4860
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 4920
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 4980
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 5040
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 5100
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 5160
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 5220
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 5280
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 5340
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat 5400
tcatccagta aaatataata ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca 5460
aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag 5520
gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact 5580
ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc 5640
tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg 5700
tcttcttccc agttttcgca atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat 5760
tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga 5820
aagagcctga tgcactccgc atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca 5880
tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca 5940
tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg 6000
tccttttccc gttccacatc ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa 6060
tataggtttt cattttctcc caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta 6120
tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta 6180
gccatttatt atttccttcc tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt 6240
ataacaagac gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa 6300
cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt 6360
tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc 6420
tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat 6480
cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac 6540
tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg 6600
gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt aaacaaattg acgcttagac aacttaataa 6660
cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat taacgccgaa ttaattcggg ggatctggat 6720
tttagtactg gattttggtt ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa 6780
tacaaataca tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac 6840
cctaattccc ttatctggga actactcaca cattattatg gagaaactcg agcttgtcga 6900
tcgacagatc cggtcggcat ctactctatt tctttgccct cggacgagtg ctggggcgtc 6960
ggtttccact atcggcgagt acttctacac agccatcggt ccagacggcc gcgcttctgc 7020
gggcgatttg tgtacgcccg acagtcccgg ctccggatcg gacgattgcg tcgcatcgac 7080
cctgcgccca agctgcatca tcgaaattgc cgtcaaccaa gctctgatag agttggtcaa 7140
gaccaatgcg gagcatatac gcccggagtc gtggcgatcc tgcaagctcc ggatgcctcc 7200
gctcgaagta gcgcgtctgc tgctccatac aagccaacca cggcctccag aagaagatgt 7260
tggcgacctc gtattgggaa tccccgaaca tcgcctcgct ccagtcaatg accgctgtta 7320
tgcggccatt gtccgtcagg acattgttgg agccgaaatc cgcgtgcacg aggtgccgga 7380
cttcggggca gtcctcggcc caaagcatca gctcatcgag agcctgcgcg acggacgcac 7440
tgacggtgtc gtccatcaca gtttgccagt gatacacatg gggatcagca atcgcgcata 7500
tgaaatcacg ccatgtagtg tattgaccga ttccttgcgg tccgaatggg ccgaacccgc 7560
tcgtctggct aagatcggcc gcagcgatcg catccatagc ctccgcgacc ggttgtagaa 7620
cagcgggcag ttcggtttca ggcaggtctt gcaacgtgac accctgtgca cggcgggaga 7680
tgcaataggt caggctctcg ctaaactccc caatgtcaag cacttccgga atcgggagcg 7740
cggccgatgc aaagtgccga taaacataac gatctttgta gaaaccatcg gcgcagctat 7800
ttacccgcag gacatatcca cgccctccta catcgaagct gaaagcacga gattcttcgc 7860
cctccgagag ctgcatcagg tcggagacgc tgtcgaactt ttcgatcaga aacttctcga 7920
cagacgtcgc ggtgagttca ggctttttca tatctcattg ccccccggga tctgcgaaag 7980
ctcgagagag atagatttgt agagagagac tggtgatttc agcgtgtcct ctccaaatga 8040
aatgaacttc cttatataga ggaaggtctt gcgaaggata gtgggattgt gcgtcatccc 8100
ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt 8160
ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg 8220
catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggtg ccaccttcct 8280
tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc 8340
ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt 8400
tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat gttatcacat caatccactt 8460
gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc 8520
catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat 8580
gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag 8640
ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag 8700
ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct 8760
ccaccatgtt gggcccggcg cgccaagctt ctagtgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc 8820
ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt 8880
tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact 8940
ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 9000
tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt 9060
ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat 9120
acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact 9180
aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact 9240
ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa 9300
aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg 9360
agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa 9420
ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct 9480
ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa 9540
ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg 9600
gcacggcagc tacgggggat tcctttccca ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc 9660
cgtaataaat agacaccccc tccacaccct ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc 9720
acacacacac aaccagatct cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 9780
ccgctcgtcc tccccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg 9840
ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat 9900
ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta 9960
acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga 10020
tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt 10080
tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt 10140
tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac 10200
tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac 10260
gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt 10320
ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt 10380
gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat 10440
ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg 10500
gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata 10560
catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa 10620
taaacaagta tgttttataa ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag 10680
cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt 10740
ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcactaggt acccacaagt 10800
tggtgaagct gccagcatga tctgatgatg atgatgatcc acctctctca tctgtgttct 10860
tgattaatta cggatcaatc gatcaggtca tgctgtagtt tcatctgctg gttggatccc 10920
cgggaattct aagaggagtc caccatggta gatctgacta gtgttaacg 10969

Claims (10)

1.一种miRNA，如序列表的序列1所示。
2.权利要求1中所述miRNA的前体基因。
3.权利要求1中所述miRNA的前体基因，如序列表的序列表的序列2所示。
4.权利要求1所述miRNA在调控植物的抗病性中的应用。
5.权利要求1所述miRNA在正调控植物的抗病性中的应用。
6.权利要求2或3所述前体基因在制备抗病性提高的转基因植物中的应用。
7.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在植物中过表达权利要求1所述miRNA，得到抗病性提高的转基因植物。
8.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在植物中导入权利要求2或3所述前体基因，得到抗病性提高的转基因植物。
9.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在植物中导入权利要求2或3所述前体基因并表达，得到抗病性提高的转基因植物。
10.权利要求7至9中任一所述方法在植物育种中的应用。
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