CN101250550A - 改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改变稻米储藏蛋白分布的表达载体及其制法和用途，所述表达载体包括基因启动子、储藏蛋白基因片段、终止子及内切酶敏感序列，其中基因启动子为在稻米中心部位能够表达的基因启动子。所述表达载体可应用于转化水稻，以获取稻米中心部位蛋白质含量和质量改变的新品种。本发明克服了现有技术只能提高稻米近糊粉层周围蛋白质含量和质量的缺陷，获得了稻米蛋白质表达于米粒中心的特殊效果；而且避免了现有技术存在的品质改良会影响产量下降的缺陷；由本发明的表达载体转化获得的水稻新品质，其后代精米蛋白质含量在未转化的对照精米蛋白质含量的基础上提高至少10％。

Description

改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体及其制法和用途

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体说，是涉及改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体及其制法和用途。

背景技术

我国是一个人口众多的发展中国家，为满足我国不断增长人口对农作物的需求，采用增加种植面积来达到增产的目的已经不符合当前我国的基本国策，而通过在现有单产基础上提高农作物蛋白质的生产率获得更有营养的农作物，是一种更为科学和经济的增产方式。

水稻是我国最重要的粮食作物，水稻的营养品质与人民生活之间的关系最为密切。水稻营养品质主要指稻米蛋白质和必需氨基酸含量。人体对于蛋白质的摄取主要以直接或间接方式从植物种子中获得。中国是水稻种植和消费大国，对于这样一个以稻米为主食的国家来说，许多地区的人们从植物种子中摄取的蛋白质较大部分来自于稻米。目前常规水稻栽培品种稻米总蛋白质含量较低，一般为7％～9％。张瑞品等人认为在以稻米为主食的地区，精米提供了至少40％的蛋白质，如果把我国稻米蛋白质含量在现有基础上再提高1％～2％，无疑对改善我国人民的营养水平将是很大的贡献(张瑞品等，水稻品质育种，农作物品质育种(刘后利主编)，湖北科学技术出版社，2001，pp：27，37)。对于有些不能食用动物蛋白的特殊疾病患者，高蛋白稻米对这样的人群更为重要。

水稻高蛋白育种对于动物、水稻早期自身的生长以及环境等多方面都会带来一定的益处。以高蛋白水稻作为饲养家畜的饲料，减少和避免使用动物饲料，将更有助于家畜的生长，也可改变我国每年需进口玉米、豆类饲料而消耗大量外汇的状况。稻米的贮藏蛋白在种子萌动发芽中是一种氮源，具有非常重要的作用。如果以高蛋白水稻稻谷作为种子，内源氮素丰富，就有可能减少早期氮肥的使用，从而将会降低肥料对环境的污染以及降低种植成本。种植高蛋白水稻还可提高单位土地面积蛋白质生产量，提高土地的生产率。

水稻稻米蛋白质的营养价值，不仅受含量的影响，更重要取决于组成它的各种必需氨基酸之间的平衡。在水稻稻米蛋白质中，赖氨酸为第一限制性氨基酸，苏氨酸为第二限制氨基酸，甲硫氨酸、色氨酸仅次于前两者。因此，这四种必需氨基酸的含量的高低决定了稻米所含蛋白质品质的优劣(张瑞品等，水稻品质育种，农作物品质育种(刘后利主编)，湖北科学技术出版社，2001，pp：27，37)。在19世纪末，著名的植物蛋白化学之父TB·Osborne基于种子蛋白的特性提出了植物种子蛋白质分类方法。根据溶解度不同，可将种子蛋白分为四类：溶于水的清蛋白，溶于稀盐溶液的球蛋白，溶于醇溶液的醇溶蛋白和溶于稀酸或稀碱溶液的谷蛋白。作为水稻种子重要的贮藏蛋白，谷蛋白在水稻种子缺乏的重要氨基酸含量方面相对较好(赵则胜等，中国特种稻，上海：上海科学技术出版社.1995，pp：149)。目前较多研究者都认为水稻谷蛋白(Glutelin)和豆球蛋白(Legumin)之间有相似之处，具有类似的分子结构和类似的翻译后加工程序(Shotwell，Oat globulins.In.Shewry PR，Casey R，eds.Seed proteins.Dordrecht：Kluwer Academic Publishers，1999：pp389-400；Takaiwa等，Richglobulins.In.Shewry PR，Casey R，eds.Seed proteins.Dordrecht：Kluwer AcademicPublishers，1999，pp：401～405)，以及两者的氨基酸序列具有较高的同源性。赵文明研究认为(实验生物学报，1998，21(2)：239～243)，在水稻谷蛋白β亚基与豆球蛋白(Legumin)β亚基的氨基酸顺序中，有47％的氨基酸顺序完全相同。这表明，水稻谷蛋白还是一个比较优质的贮藏蛋白。

在20世纪80年代人们在对稻米蛋白质分布的研究中发现，水稻胚乳中存在两种蛋白体，PB-I和PB-II。PB-I含醇溶蛋白，不能被人体消化利用，而PB-II主要含有谷蛋白和球蛋白，易于被消化。这两种蛋白体主要富集于近糊粉层的周围，很少在米粒的中心区域出现。我们实验室选取开花后20天(谷蛋白表达已过高峰时期)未成熟的水稻种子，在经过常规制样操作后采用电镜观察，结果也显示蛋白体主要分布于稻米的周围。张宪银等(作物学报，2002，28(1)：110～114)也曾对水稻谷蛋白Gt1基因启动子进行研究，从他们的报道显示由Gt1启动子引导的gus报告基因也只在稻米的周边显色，这说明Gt1谷蛋白只在稻米的周边积累。在糙米加工成精米时，稻米中的大量蛋白质会因此而流失。

众所周知，启动子是基因表达的重要控制元件。从目前利用基因工程改良水稻稻米蛋白质含量及质量的现有报道研究分析，人们都是采用水稻的谷蛋白基因启动子，如Gt1或GluB-1等与豆科作物贮藏蛋白基因融合构成表达载体转化水稻(Zhenwei等，Plant Physiol.1995，109：777～786；Sindhu等，Plant Science，1997，130(2)：189～196；Tomoyuki等，Plant Physiol.1999，120：1063～1073；Keiko等，Biosci Biotechnol Biochem，1999，63(2)：314～318)；最近还有报道将Gt1启动子与来自于四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus L.)小分子量高赖氨酸基因(LRPcDNA)融合构成表达载体转化水稻(唐俐等，作物学报，2006，32(8)：1248～1251)。但由于如上所说的水稻谷蛋白基因的产物都主要在稻米的近糊粉层周围表达，所以，利用谷蛋白Gt1或GluB-1等启动子与大豆球蛋白基因融合构建表达载体，通过转基因操作导入水稻也只能达到提高稻米近糊粉层周围的蛋白质含量和质量。而且目前这些研究大多都是将目的基因和抗性选择标记基因构建在一个表达载体上，不利于转基因后代的生产应用。

为了改变稻米储藏蛋白的分布，必须更换现有水稻中谷蛋白基因的启动子，将它替换成在常规稻米中心部位能够表达的基因，如ADPG焦磷酸化酶基因adpg、可溶性淀粉合成酶基因sss、淀粉分支酶基因sbe或是颗粒凝结型淀粉合成酶(GBSS I)，即蜡质蛋白基因waxy等的启动子。

从目前已报道的文献中，蜡质蛋白基因(waxy)启动子多用于引导蜡质基因反义片段降低稻米直链淀粉含量(Shimada H，et al，TheorAppl Genet，1993，86(6)：665～672；Terada R，et al，Plant Cell Physiol，2000，41(7)：881～888；王新其等，上海农业学报，2002，18(增刊)：69～73；陈秀花等，科学通报，2002，47(9)：684～688；刘巧泉等，Transgenic Res，2003，12：71～82；李建粤等，科学通报，2004，49(24)：2556～2561；沈革志等，植物生理与分子生物学学报，2004，30(6)：637～643)，尚未有利用该启动子在稻米中心部位表达的特性来改变水稻储藏蛋白表达位点的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种改变稻米储藏蛋白分布的表达载体及其制法和用途，以克服现有技术中利用水稻谷蛋白基因启动子与豆科作物贮藏蛋白基因或其他小分子量非贮藏蛋白基因融合构成表达载体转化水稻，获得的转化子及其后代稻米只能提高稻米近糊粉层周围蛋白质含量和质量的缺陷。

本发明的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体，包括基因启动子、储藏蛋白基因片段、终止子及内切酶敏感序列，其特征在于，所述基因启动子为在稻米中心部位能够表达的基因启动子。

所述基因启动子优选水稻蜡质基因启动子。

所述储藏蛋白基因片段优选水稻谷蛋白基因片段或谷蛋白基因cDNA编码序列或大豆球蛋白基因的cDNA编码序列片段。

所述水稻谷蛋白基因优选Gt1谷蛋白全基因或Gt1谷蛋白基因的cDNA编码序列。

所述大豆球蛋白基因优选Gy7球蛋白基因的cDNA编码序列。

所述终止子优选CaMV 35S基因终止子或Nos基因终止子。

本领域的普通技术人员无需通过特殊的试验即可知道，所述的水稻谷蛋白Gt1全基因或者Gt1谷蛋白基因的cDNA编码序列可以用一系列与GenBank号Y00687基因相同或是和Y00687相类似的基因，如谷蛋白B亚家族成员来替代；所述的大豆球蛋白Gy7基因的cDNA编码序列可以指与GenBank号AF319777同源的基因。

本发明的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体的制备方法，包括如下步骤：

1)采用PCR方法扩增基因启动子和储藏蛋白基因片段；

2)将基因启动子和储藏蛋白基因片段的PCR扩增产物与终止子及其他载体序列连接，即得本发明的表达载体。

在所述基因启动子下游可有信号肽编码序列，所述信号肽编码序列优选水稻储藏蛋白基因信号肽编码序列。

本领域的普通技术人员无需通过特殊的试验即可知道，除了采用PCR方法获得基因启动子和水稻谷蛋白基因或者大豆球蛋白基因片段之外，还可以通过制备好的水稻、大豆基因组或cDNA文库筛选获得所需的目标DNA片段。这些获得目的基因片段的不同方法只是制备本发明所说的表达载体的不同途径，并不影响本发明利用在稻米中心表达的基因启动子定位稻米中不同储藏蛋白质基因表达部位的构思本身。

本发明的改变稻米储藏蛋白分布的表达载体可应用于转化水稻，以获取稻米中心部位蛋白质含量和质量改变的新品种。

通过表达载体中基因启动子的引导，目的基因即蛋白质编码基因序列可以在稻米中心部位表达，变换蛋白质编码基因序列，如换成水稻其他谷蛋白或球蛋白基因，即可以使稻米中心不同种类蛋白质含量有所变化，也可以提高可溶性蛋白质比例以使可吸收蛋白质总量增加，进而提高稻米营养品质；如换成赖氨酸、苏氨酸等人体必需氨基酸含量或比例较高的蛋白质编码基因，则可以在氨基酸组成上改良稻米营养品质，上述内容均属于本发明技术构思的等同变换。

本发明的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体还可应用于转化小麦、大麦、玉米等其他禾本科植物以获取新品种。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1)利用杂交等常规方法培育高蛋白水稻，稻谷产量往往与稻米蛋白质含量呈反相关关系，而本发明提供的改变稻米储藏蛋白分布的表达载体可利用转基因技术将水稻谷蛋白基因或大豆球蛋白基因导入水稻，避免了水稻等禾谷类作物的品质改良会影响产量下降的缺陷；

2)现有技术只能提高稻米近糊粉层周围蛋白质含量和质量，在糙米加工成精米时，稻米中的大量蛋白质会因此而流失，而本发明的表达载体转化水稻，获得稻米蛋白质表达于米粒中心的特殊效果，克服了原有技术上的不足；

3)本发明的改变稻米储藏蛋白分布的表达载体所转化获得的水稻新品质，其后代精米蛋白质含量在未转化的对照精米蛋白质含量的基础上提高至少10％；

4)本发明构建的p1301-Wx-Gt1S-Gy7或p1300-Wx-Gt1S-Gy7表达载体转化水稻，可使后代精米蛋白质含量比未转化的对照提高10％同时，其精米赖氨酸含量也比未转基因对照精米提高10％；

5)本发明可为开展小麦、玉米、大麦等重要农作物营养品质改良研究奠定基础。

本文所用的术语“水稻Gt1基因”是指编码能够溶于稀酸或稀碱溶液的水稻谷蛋白A亚家族中的成员之一。

本文所用的术语“大豆Gy7基因”是指编码大豆种子贮藏蛋白中沉降值为11S的球蛋白(Glycinin)家族之中的一类球蛋白的基因，比如GenBank号为AF319776的全基因或者GenBank号为AF319777的mRNA序列。

本文所用的术语“PCR方法”是指聚合酶链式反应的基因扩增方法。

本文所用的术语“CaMV 35S基因终止子”是指来自于花椰菜花叶病毒的35S终止子。

本文所用的术语“Nos基因终止子”是指来自于胭脂碱合成酶基因的终止子。

本文所用的术语“中间载体”是指在目标载体制备过程中获得的载体。

本文所用的术语“T-DNA”是指根癌农杆菌Ti质粒中可转移并整合到寄主植物细胞染色体上去的特定DNA片段，亦即一种转位单元。

附图说明

图1是实施例1构建的表达载体的T-DNA结构图，图中：Wx-pro为水稻waxy基因启动子；Int1为水稻waxy基因第一内含子；Gt1为水稻谷蛋白基因；Gt1cDNA为水稻谷蛋白Gt1基因编码序列；LB、RB为T-DNA的左右边界；Terminator指基因终止子；35S-pro、35S-ter为CaMV 35S基因启动子和终止子；hpt为潮霉素抗性基因；gus为β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Nos-ter为Nos基因终止子；

图2是pCAMBIA1301质粒的T-DNA结构图，图中：LB、RB为T-DNA的左右边界；35S-pro、35S-ter为CaMV 35S基因启动子和终止子；hpt为潮霉素抗性基因；gus为β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Xh为XhoI的缩写；Bs为BstXI的缩写；E为EcoRI的缩写；Sa为SacI的缩写；K为KpnI的缩写；S为SmaI的缩写；B为BamHI的缩写；X为XbaI的缩写；Sal为SalI的缩写；P为PstI的缩写；H为HindIII的缩写；

图3是pCAMBIA1300质粒的T-DNA结构图，图中：LB、RB为T-DNA的左右边界；35S-pro、35S-ter为CaMV 35S基因启动子和终止子；hpt为潮霉素抗性基因；Xh为XhoI的缩写；Bs为BstXI的缩写；E为EcoRI的缩写；Sa为SacI的缩写；K为KpnI的缩写；S为SmaI的缩写；B为BamHI的缩写；X为XbaI的缩写；Sal为SalI的缩写；P为PstI的缩写；H为HindIII的缩写；

图4是实施例2构建的表达载体的T-DNA结构图，图中：LB、RB为T-DNA的左右边界；Wx-pro为水稻waxy基因启动子；Int1为水稻waxy基因第一内含子；Gt1为水稻谷蛋白基因；Gt1cDNA为水稻谷蛋白Gt1基因编码序列；Terminator指基因终止子；

图5是实施例3构建的表达载体的T-DNA结构图，图中：LB、RB为T-DNA的左右边界；Wx-pro为水稻waxy基因启动子；Int1为水稻waxy基因第一内含子；Gt1S为水稻谷蛋白Gt1基因信号肽；Gy7cDNA为大豆球蛋白Gy7基因编码序列；Terminator指基因终止子；

图6是实施例4构建的表达载体的T-DNA结构图，图中：Wx-pro为水稻waxy基因启动子；Int1为水稻waxy基因第一内含子；Gt1S为水稻谷蛋白Gt1基因信号肽；Gy7cDNA为大豆球蛋白Gy7基因编码序列；LB、RB为T-DNA的左右边界；Terminator指基因终止子；35S-pro、35S-ter为CaMV 35S基因启动子和终止子；hpt为潮霉素抗性基因；gus为β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Nos-ter为Nos基因终止子。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

构建表达载体和水稻转化操作中涉及的常规PCR扩增、限制性内切酶酶切和连接、根癌农杆菌培养转化等方法主要参考《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J等，分子克隆实验指南(第二版)，科学出版社，1992)。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例是为了说明构建含有抗性标记基因、由蜡质基因启动子引导的水稻谷蛋白基因表达载体的方法及所获载体的结构组成，构建过程如下：

a)在pCAMBIA1301(简称p1301，来自于中科院上海植物生理与生态研究所王宗阳研究员)质粒载体(见图2所示)NOS终止子两端设计PCR引物，上游和下游都引入HindIII酶切位点；将PCR产物与T载体连接得到T-1载体，并转化大肠杆菌感受态细胞；然后用HindIII对T-1质粒进行酶切，电泳回收小片段，将该小片段与pCAMBIA1301质粒HindIII酶切产物进行连接，得到pCAMBIA1301-NOS载体(简称p1301-NOS)，转化大肠杆菌感受态细胞；采用PCR、酶切及测序鉴定，选择正向连接的类型；

b)参照GenBank公布的Gt1基因序列(GenBank：Y00687)，分别在Gt1基因编码区起始点ATG和3’UTR设计一对引物，上游引物含有NcoI酶切位点，下游引物引入PstI酶切位点，以栽培水稻叶片DNA为模板进行PCR扩增获得Gt1基因全序列；或取水稻开花后约15天的胚乳进行mRNA提取，利用RT-PCR技术获得Gt1cDNA；将PCR产物与靠近NcoI酶切位点上游带有EcoRI酶切位点的T载体连接得到Gt1-T载体，并转化大肠杆菌感受态细胞；通过酶切、PCR及测序鉴定Gt1-T载体；

c)从公开号为CN1298021A专利说明书上查找232籼型水稻蜡质基因第一内含子核苷酸序列，参照该序列在距离翻译起始点ATG上游第一内含子约0.45kb处EcoRI酶切位点和翻译起始点ATG前分别设计引物，在设计的引物上下游各携带有EcoRI酶切位点和NcoI酶切位点；利用PCR从栽培水稻总DNA中扩增获得约0.45kb蜡质基因第一内含子部分序列，将PCR产物与T载体连接获得EN-T载体，并转化感受态大肠杆菌；同样利用酶切、PCR等常规方法检测EN-T载体；

d)将Gt1-T和EN-T载体都用EcoRI和NcoI进行双酶切，电泳回收EN-T载体双酶切后的小片段，将回收的小片段与Gt1-T载体双酶切产物进行连接，获得EN+Gt1-T载体；同样利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测EN+Gt1-T载体；

e)将EN+Gt1-T和p1301-NOS两个载体，进行EcoRI和PstI双酶切反应，电泳回收EN+Gt1-T酶切后的大片段，将该大片段与p1301-NOS载体双酶切产物连接，得到p1301-EN-Gt1-NOS载体；同样利用酶切、PCR等常规方法检测p1301-EN-Gt1-NOS载体；

f)从公开号为CN1298021A专利说明书上查找232籼型水稻蜡质基因启动子和第一内含子核苷酸序列，参照该序列在距离翻译起始点ATG上游第一内含子约0.45kb处EcoRI酶切位点和距离翻译起始点ATG前约2.6kb处分别设计引物，在设计的引物上下游都引入EcoRI酶切位点；利用PCR从栽培水稻总DNA中扩增获得蜡质基因启动子和部分第一内含子序列，将PCR产物与T载体连接获得T-2载体，并转化感受态大肠杆菌；同样利用酶切、PCR等常规方法检测T-2载体；

g)将T-2载体和p1301-EN-Gt1-NOS载体都采用EcoRI酶进行酶切，将T-2载体酶切获得的小片段与p1301-EN-Gt1-NOS载体酶切产物连接，获得的载体转化感受态大肠杆菌；采用PCR、酶切及测序鉴定，选择正向连接的类型，由此成功构建出含有抗性标记基因、由水稻蜡质基因启动子引导的水稻谷蛋白基因表达载体：p1301-Wx-Gt1或p1301-Wx-Gt1cDNA(见图1所示)。

实施例2

本实施例是为了说明构建不含有抗性标记基因、由蜡质基因启动子引导水稻谷蛋白基因表达载体的方法及所获载体的结构组成，构建过程如下：

按照实施例1的同样方法，从公开号为CN1298021A专利说明书上查找232籼型水稻蜡质基因启动子核苷酸序列，参照该序列在翻译起始点ATG前约2.6kb处设计上游引物，在引物一端引入KpnI酶切位点；采用实施例1的同样方法，在Gt1基因编码区后的3’UTR处设计下游引物，一端引入XhoI酶切位点；以如上设计的一对新引物对实施例1已构建的p1301-Wx-Gt1进行PCR扩增反应，获得含有蜡质基因启动子引导水稻谷蛋白基因DNA序列，将PCR产物与T载体连接获得T-3载体，并转化感受态大肠杆菌；同样利用酶切、PCR等常规方法检测T-3载体；利用XhoI和KpnI酶消化T-3载体和pCAMBIA1300(简称p1300，来自于中科院上海植物生理与生态研究所王宗阳研究员)质粒(见图3所示)，琼脂糖凝胶电泳后分别回收两个酶切大片段，进行连接，由此成功构建了不含有抗性标记基因、由水稻蜡质基因启动子引导的水稻谷蛋白基因表达载体：p1300-Wx-Gt1或p1300-Wx-Gt1cDNA(见图4所示)。

实施例3

本实施例是为了说明构建不含有抗性标记基因、由蜡质基因启动子引导的大豆球蛋白基因表达载体的方法及所获载体的结构组成，构建过程如下：

a)从中熟阶段的大豆(Glycine max)子叶中提取总RNA，利用反转录试剂盒获得cDNA的第一链，再根据Genbank AF319777公布的大豆球蛋白Gy7mRNA序列设计一对特异PCR引物，上游引物不引入酶切位点，下游引物引入XhoI位点和添加保护碱基，利用在PCR产物末端不含A的高保真DNA聚合酶，以cDNA的第一链为模板，PCR扩增获得大豆球蛋白Gy7基因信号肽以后的cDNA序列；

b)按照实施例1的同样方法，从公开号为CN1298021A专利说明书上查找232籼型水稻蜡质基因启动子核苷酸序列，参照该序列在翻译起始点ATG前约2.6kb处设计上游引物，在引物一端引入KpnI酶切位点，参照GenBank公布的Gt1基因序列(GenBank：Y00687)，在Gt1基因翻译起始点ATG后第72个核苷酸对的谷蛋白信号肽序列处设计相应的下游引物，下游引物一端也不引入酶切位点，也采用在PCR产物末端不含A的高保真DNA聚合酶，以实施例1或2中构建的载体为模板进行PCR扩增；用该对新设计的引物进行PCR扩增反应，获得水稻蜡质基因启动子和谷蛋白基因Gt1信号肽序列；

c)将大豆球蛋白Gy7cDNA信号肽以后核苷酸序列的PCR产物采用XhoI酶切处理，同时将含有水稻蜡质基因启动子和谷蛋白基因Gt1信号肽的PCR产物采用KpnI酶切处理，前后两种酶切产物在T4连接酶作用下进行连接，然后再与含有KpnI和XhoI两种酶切位点的T-载体在经这两种相应的酶处理后回收的片段进行连接获得T-5载体，并转化感受态大肠杆菌；同样利用酶切、PCR等常规方法检测T-5载体；采用KpnI和XhoI双酶切T-5载体，回收酶切后的大片段，并与pCAMBIA1300质粒(见图3所示)同样经KpnI和XhoI双酶切后的产物连接，由此成功构建了不含有抗性标记基因、由水稻蜡质基因启动子和水稻谷蛋白基因信号肽引导的大豆球蛋白基因表达载体：p1300-Wx-Gt1S-Gy7cDNA(见图5所示)。

实施例4

本实施例是为了说明构建含有抗性标记基因、由蜡质基因启动子引导的大豆球蛋白基因表达载体的方法及所获载体的结构组成，构建过程如下：

按照实施例1的同样方法，从公开号为CN1298021A专利说明书上查找232籼型水稻蜡质基因启动子核苷酸序列，参照该序列在翻译起始点ATG前约2.6kb处设计上游引物，在引物一端引入BamHI酶切位点；在p1300质粒(图3)35S基因终止子下游设计PCR引物，引物一端同样引入BamHI酶切位点；以实施例3已构建的p1300-Wx-Gt1S-Gy7cDNA载体为模板进行PCR反应，将PCR扩增获得含有蜡质基因启动子、谷蛋白Gt1基因信号肽和大豆球蛋白Gy7cDNA及35S终止子产物与T载体连接，得到T-6载体，并转化感受态大肠杆菌；同样利用酶切、PCR等常规方法检测T-6载体；利用BamHI酶消化T-6载体，将电泳回收的大片段与同样采用BamHI酶消化p1301质粒(图2)的产物连接，连接产物转化感受态大肠杆菌，利用酶切、PCR等常规方法进行检测，由此成功构建出含有抗性标记基因、由水稻蜡质基因启动子引导的大豆球蛋白基因表达载体：p1301-Wx-Gt1S-Gy7cDNA(见图6所示)。

实施例5

本实施例是为了说明如何利用实施例1或2或3或4构建的表达载体转化水稻。

分别利用表达载体p1301-Wx-Gt1或p1301-Wx-Gt1S-Gy7cDNA单质粒对水稻进行遗传转化，或采用p1300-Wx-Gt1或p1300-Wx-Gt1S-Gy7cDNA与含有潮霉素抗性基因和gus报告基因pCAMBIA1301质粒载体共转化水稻，在培育转基因水稻中涉及的根癌农杆菌培养及抗性愈伤组织筛选及植株再生主要参照刘巧泉的方法进行(刘巧泉等，植物生理学报，1998，24(3)：259～271)，共转化获得转基因水稻操作主要参照李建粤等人的方法进行(李建粤等，科学通报，2004，49(24)：2556～2561)，即能够获得精米蛋白质含量比对照提高10％的转基因后代。

实施例6

本实施例为转基因稻米中心部位蛋白质表达含量的测定方法。

分别取含有目的基因转基因稻米和没有目的基因非转基因对照稻米进行去糙加工，利用微量凯氏定氮法检测转基因和非转基因对照糙米及精米总蛋白含量，结果显示：转基因水稻精米蛋白质含量比非转基因对照提高10％以上；采用氨基酸自动分析仪检测转化p1301-Wx-Gt1S-Gy7cDNA和p1300-Wx-Gt1S-Gy7cDNA两种表达载体的水稻精米，结果显示：转基因水稻精米赖氨酸含量也比对照至少提高10％。

Claims (10)

1.一种改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体，包括基因启动子、储藏蛋白基因片段、终止子及内切酶敏感序列，其特征在于，所述基因启动子为在稻米中心部位能够表达的基因启动子。

2.根据权利要求1所述的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体，其特征在于，所述基因启动子为水稻蜡质基因启动子。

3.根据权利要求1所述的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体，其特征在于，所述储藏蛋白基因片段为水稻谷蛋白基因片段或谷蛋白基因cDNA编码序列或大豆球蛋白基因cDNA编码序列片段。

4.根据权利要求3所述的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体，其特征在于，所述水稻谷蛋白基因为Gt1谷蛋白全基因或Gt1谷蛋白基因的cDNA编码序列。

5.根据权利要求3所述的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体，其特征在于，所述大豆球蛋白基因为Gy7球蛋白基因的cDNA编码序列。

6.根据权利要求1所述的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体，其特征在于，所述终止子为CaMV 35S基因终止子或Nos基因终止子。

7.一种权利要求1所述的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)采用PCR方法扩增基因启动子和储藏蛋白基因片段；

2)将基因启动子和储藏蛋白基因片段的PCR扩增产物与终止子及其他载体序列连接，即得本发明的表达载体。

8.根据权利要求7所述的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体的制备方法，其特征在于，在所述基因启动子下游有信号肽编码序列。

9.根据权利要求8所述的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体，其特征在于，所述信号肽编码序列为水稻储藏蛋白基因信号肽编码序列。

10.一种权利要求1所述的改变稻米贮藏蛋白分布的表达载体的用途，其特征在于，所述表达载体用于转化水稻，以获取稻米中心部位蛋白质含量和质量改变的新品种。

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