CN101525622A - 一种种子特异表达的淀粉合成酶基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明采用Genomic walking法，根据玉米dull1基因的cDNA序列(GenBankAccession No：AF036891)设计特异巢式引物，以玉米基因组为模板，从玉米中分离了一种玉米淀粉合成酶基因dull1启动子。该启动子具有时空特异表达特性，能驱动目的基因在灌浆期的植物种子中高效表达，而在叶片、叶脉和根部不表达，在植物生物反应器研究中将有广泛的用途。该启动子的发明为研究植物淀粉合成代谢的表达调控机制奠定了基础，同时也为基因工程技术调控淀粉的生物合成创造了条件，在植物淀粉改良和植物生物反应器研究中将发挥重要作用。

Description

一种种子特异表达的淀粉合成酶基因启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域，具体的说，涉及一种种子特异表达的淀粉合成酶基因启动子及其应用。

背景技术

种子是人和动物的主要食物来源，而且还是许多工业的原材料，与人类的生产生活密切相关。但是，由于植物自身的局限性，种子中所含的蛋白和其他成分不能完全满足人类的需求。随着现代分子生物学的飞速发展，转基因植物在理论研究和植物育种上的应用越来越广泛，通过DNA重组技术，植物不仅可以获得一些本身不具备的抗虫、抗病、抗逆等特性，还可以在种子中合成一些本身不具有的必需氨基酸来提高营养价值，或者进行代谢修饰，产生更符合人类需求的代谢产物等。

植物作为生物反应器生产药用蛋白是一个极具商业前景的领域，植物生物反应器是指以植物悬浮细胞、某一组织和器官或整株植物为工厂生产具有重要功能的蛋白。与传统的微生物发酵相比，由于植物是真核生物，外源蛋白在合成后的修饰加工更接近于真实状态，因此具有更高的生物活性，克服了微生物表达外源蛋白不能进行修饰加工的缺陷；与动物细胞培养和转基因动物相比，不仅技术上相对容易实现，而且成本低廉。此外，转基因植物生产药用蛋白还具有以下优点：不需要复杂的生产设备；生产的药用蛋白可供人和动物直接食用，不需要象传统方法(如发酵法)生产药用蛋白那样进行分离提纯；比传统的口服药物更有效，植物细胞中的药用蛋白通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护，降低了胃酸的破环作用；易于储存和分发，不需要冷藏设备即可保存数年而保持活性等。

种子是作物的主要营养贮藏器官，是人和家畜的重要食物来源。因此种子是表达外源蛋白的理想场所。目前植物基因工程上经常采用CaMV35S启动子、玉米Ubiquitin启动子和水稻Actin1启动子等组成型启动子，所谓组成型启动子是指能够启动下游基因在受体植物的任何组织和器官内持续、高效表达的一类启动子，这类启动子不具有组织特异性，而外源基因的额外高效表达不仅是一种浪费，而且会对植物形成一种生理负担并有可能对植物组织造成伤害，从而影响植物的正常生长发育。应用组织特异性启动子则可以避免这种影响，组织特异启动子是指只能在特定时间或条件下启动下游基因在受体植物的特定组织和器官内表达的一类启动子。要在特定部位或组织中表达目的蛋白，就必须选用组织特异性启动子，以确保目的基因在特定组织中正常表达。目前已有的组织特异启动子有根特异性启动子，韧皮部特异性启动子，叶片特异性启动子，胚乳特异性启动子和种子特异性启动子等。现有的种子特异性启动子主要来源于植物贮藏蛋白基因，如谷醇溶蛋白基因启动子、花生种子豆球蛋白legA基因启动子、水稻谷蛋白gluA和gluB基因启动子和玉米醇溶蛋白基因启动子等，但贮藏蛋白基因启动子一个明显的缺陷是活性一般要受到氮素供应的限制。

淀粉是种子的主要组成部分，在作物种子中，淀粉一般占到籽粒重量的70％左右。植物淀粉合成酶按存在状态可分为可溶性淀粉合成酶和颗粒结合性淀粉合成酶。玉米可溶性淀粉合成酶主要由zSSI和zSSIII组成，zSSIII由dull1基因编码。通过检测不同时期玉米的根，茎、叶以及授粉后不同天数的玉米籽粒、种皮、胚乳发现dull1基因的mRNA只能在授粉10天以后的籽粒中检测到，说明该基因是一个种子特异表达的启动子。

发明内容：

本发明的目的是提供一种玉米淀粉合成酶基因dull1启动子，用于驱动外源基因在转基因植物的种子中特异表达。所述启动子是具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：1

2)序列表中SEQ ID No：2所示的由1773个碱基组成的核苷酸序列；

所述SEQ ID NO：2是序列表中SEQ ID No：1所示的序列第-1651至+122的1773bp核苷酸序列，该序列足以驱动外源基因在转基因植物的籽粒中特异表达。

本发明的另一个目的是提供一种含有上述启动子序列与所需目的基因的编码区核苷酸序列连接后产生的重组质粒。

本发明的另一个目的是提供上述重组质粒在转基因植物中的应用。

本发明涉及首次克隆的具有植物种子特异表达的玉米淀粉合成酶III基因dull1启动子的核苷酸序列。包括该启动子启动目的基因的时空特异表达特性以及该启动子与gusA报告基因编码区融合的重组质粒在植物组织中的表达。

植物种子是表达外源蛋白的理想场所。与传统的微生物发酵相比，由于植物是真核生物，外源蛋白在合成后的修饰加工更接近于真实状态，因此具有更高的生物活性，克服了微生物表达外源蛋白不能进行修饰加工的缺陷；与动物细胞培养和转基因动物相比，不仅技术上相对容易实现，而且成本低廉。此外，转基因植物种子生产药用蛋白还具有不需要复杂的生产设备；生产的药用蛋白可供人和动物直接食用，不需要像传统方法(如发酵法)生产药用蛋白那样进行分离提纯；比传统的口服药物更有效，植物细胞中的药用蛋白通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护，降低了胃酸的破环作用；易于储存和分发，不需要冷藏设备即可保存数年而保持活性等优点。

要在植物种子中表达目的蛋白，就必须选用种子特异性启动子，以确保目的基因在种子中正常表达。目前植物基因工程上经常采用CaMV35S启动子、玉米Ubiquitin启动子和水稻Actin1启动子等组成型启动子，这类启动子不具有组织特异性，而外源基因的额外高效表达不仅是一种浪费，而且会对植物形成一种生理负担并有可能对植物组织造成伤害，从而影响植物的正常生长发育。目前已有的组织特异启动子有根特异性启动子，韧皮部特异性启动子，叶片特异性启动子，胚乳特异性启动子和种子特异性启动子等。现有的种子特异性启动子主要来源于植物贮藏蛋白基因，如谷醇溶蛋白基因启动子、花生种子豆球蛋白legA基因启动子、水稻谷蛋白gluA和gluB基因启动子和玉米醇溶蛋白基因启动子等，但贮藏蛋白基因启动子一个明显的缺陷是活性一般要受到氮素供应的限制。

本发明采用Genomic walking法，根据玉米dull1基因的cDNA序列(GenBankAccession No：AF036891)设计特异巢式引物，以玉米基因组为模板，从玉米中分离了dull1基因启动子，该启动子的核苷酸序列见SEQ ID No：1。该启动子能驱动目的基因在植物种子中特异表达，而且淀粉合成酶基因不受氮素供应的限制。本发明首次获得的玉米dull1启动子序列3474bp(序列表中SEQ ID No：1所示)，其部分片段是序列表中SEQ ID No：1所示的序列第-1651至+122的核苷酸序列1773bp(序列表中SEQ ID No：2所示)，该序列足以驱动外源基因在转基因植物的籽粒中特异表达。其具体开发过程为：

一、玉米dull1基因表达部位分析

首先提取玉米不同时期不同组织总RNA，用TOYOBO公司反转录试剂盒按以下体系做反转录：

总RNA                  500-1000μg

5×RT Buffer           4μL

dNTP Mixture(各10mmol/L)    2μL

RNase Inhibitor(10U/μL)    1μL

Oligo(dT)₂₀                 1μL

ReverTra Ace                1μL

用RNase-Free H₂O补至        20μL

反应条件为：42℃    20min

99℃                5min

然后将反转录产物稀释10倍作为模板进行Real-Time PCR检测，内参基因选用玉米Actin97基因。标准曲线用反转录产物倍比稀释作模板制定。所用到的引物序列如下(所有引物均由Invitrogen公司合成，下同)：

Actin97引物：

Pa1：5’---GTTGGGCGTCCTCGTCA---3’

Pa2：5’---TGGGTCATCTTCTCCCTGTT---3’

dull1引物：

Pd1：5’---CACTCGCCTGACAGCCCAAAAG ---3’

Pd2：5’---GCCAGCGTATATCAGATGCGAGAG---3’

Real-Time PCR采用天根生化科技有限公司RealMasterMix试剂盒，反应体系为：

2×RealMasterMix  12.5μL

引物1              0.5μL

引物2              0.5μL

cDNA模板           1.0μL

H₂O                10.5μL

总体积             25μL

反应程序为：95℃   1min

68℃               5min

Real-Time PCR检测显示，dull1基因转录的mRNA可以在胚乳和种皮中表达，在叶片、叶脉和根部没有表达。

二、玉米dull1 5’侧翼序列的克隆

提取玉米基因组DNA，根据GenBank中玉米dull1基因的mRNA序列(Accession No：AF036891)设计两个反向巢式引物，用玉米基因组DNA为模板，用SON-PCR法克隆dull1基因5’侧翼未知序列，LA Taq酶购自TaKaRa公司，引物序列如下：

Pson 1：5’-CTCCGAAGGCAGAGAGGGCTCTG-3’

Pson2：5’-CCGTAGGACCATCTCCATTTCTAG-3’

第一轮PCR反应体系如下：

10×LA PCR buffer         5μL

dNTP(10mmol/L)            5μL

MgCl₂                     5μL

gDNA(100ng/μL)           0.5μL

Pson1(10mmol/L)           2μL

LA Taq酶(5U/μL)          0.5μL

ddH₂O                     32μL

总体积                    50μL

PCR反应条件如下：

94℃                      3min

94℃                      30sec

29℃                      3min

29℃Ramp 3 min to 72℃

72℃                      2.5min

72℃                      7.5min

第二轮PCR反应体系如下：

10×LA PCR buffr          5μL

dNTP(10mmol/L)            5μL

MgCl₂                     5μL

第一轮PCR产物             0.5μL

Pson2(10mmol/L)           2μL

LA Taq酶(5U/μL)          0.5μL

ddH₂O                     32μL

总体积                    50μL

PCR反应条件如下：

94℃                      3min

94℃                      30sec

29℃                3min

29℃                Ramp 3 min to 72℃

72℃                2.5min

72℃                7.5min

PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，切取含最大长度的PCR产物胶块，用DNA凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)回收，连接进pMD18-T载体后进行测序，测序结果如SEQ ID No：1所示。

三、dull1P启动子活性的验证：

首先构建含dull1基因启动子与报告基因融合的植物表达载体。根据SEQ IDNo：1序列，设计合成含有限制性酶切位点的启动子引物，以连结在测序载体pMD18-T上的3.5Kb的序列为模板通过PCR扩增法克隆1.8Kb的dull1基因启动子序列。

Pde 1：5’---CACTCGTCGACGCCTTTGAGACTG---3’

Pde 2：5’---TCTCCATGGCTAGAAGGGGAAGAAAAGAAG---3’

Pde1划线部分为序列自身含有的SalI酶切位点，Pde2划线部分为添加的NcoI酶切位点。

反应体系如下：

10×LA PCR buffer      5μL

dNTP(10mmol/L)         5μL

MgCl₂                  5μL

Pde1(10mmol/L)         2μL

Pde2(10mmol/L)         2μL

模扳(10ng/μL)         0.5μL

LA Taq酶(5U/μL)       0.5μL

ddH₂O                  30μL

总体积                 50μL

PCR反应条件如下：

94℃        3min

72℃        8min

Hold        4℃

将扩增出的1779bp的启动子序列命名为dull1P，连接到pMD18-T测序载体上，经Invitrogen公司测序，表明扩增没有出现错配，结果见SEQ ID No：2。根据引物Pde1和Pde2两段设计的限制性酶切位点，用SalI和NcoI将dull1P片段从pMD18-T载体上切下，回收后与经SalI和NcoI双酶切的pCAMBIA1301载体片段连接。连接产物转化DH5α菌株中，挑选阳性克隆送Invitrogen公司测序，证明连接正确。将阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基上繁殖后用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取质粒。

取玉米骨干自交系18-599授粉后8-12天的胚乳(无菌处理)作为基因枪转化的受体，在含有高渗培养基(MS盐+0.4mol/L蔗糖)的培养皿(直径9cm)中央2-3cm处高渗处理4h，然后用基因枪进行轰击，将构建的融合表达载体转入玉米胚乳。28℃暗培养2天后，进行组织化学染色分析，结果表明，该启动子能驱动gusA基因的高效表达。

本发明启动子分离及其功能的阐明，不仅为研究植物淀粉合成代谢的表达调控机制奠定了基础，为基因工程技术调控淀粉的生物合成创造了条件，而且为利用作物籽粒作为生物反应器生产药用蛋白提供了条件。该启动子在植物淀粉改良和植物生物反应器研究中将发挥重要作用。

本发明启动子的意义及应用价值在于：

1.本发明通过Genomic walking法首次克隆了玉米淀粉合成关键酶基因dulll的启动子序列，为确定淀粉合成酶基因启动子中的关键顺式作用元件，从而揭示植物淀粉合成代谢的调控途径奠定了基础。

2.本发明的淀粉合成酶基因启动子用于基因工程技术调控淀粉合成能在表达部位和表达强度上与植物本身淀粉合成酶基因完全一致，能最大效果的起到调控作用。

3.本发明的启动子具有时空特异表达特性，能驱动目的基因在灌浆期的植物种子中高效表达，而在叶片、叶脉和根部不表达，在植物生物反应器研究中将有广泛的用途。

附图说明

图1为Real-Time PCR检测dull1基因在不同组织中的表达情况

图2为SON-PCR扩增玉米dull1基因5’侧翼序列的电泳图谱

图3为dull1P片断构建到真核表达载体pCAMBIA1301上的图谱示意图

图4为dull1基因启动子驱动gusA报告基因的组织化学染色结果

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：玉米dull1基因表达部位分析

1.玉米不同时期不同组织总RNA的提取

取50-100mg新鲜或-70℃液氮中保存的组织，用液氮研磨，置1.5mL离心管中，加入1mL Trizol(购自Invitrogen公司)充分震荡，室温静置5min。加入0.2mL氯仿，振荡15sec，静置2min。4℃12000r/min离心15min，取上清。加入等体积乙二醇丁醚，将管中液体轻轻混匀，冰浴静置1h。4℃ 10000r/min离心10min，弃上清。加入1mL 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃7500r/min离心5min，弃上清。加入1mL 100％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃7500r/min离心5min，弃上清，晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解。然后用核酸蛋白检测仪(BIO-RAD公司)测定浓度及纯度，并用变性琼脂糖胶电泳检测RNA完整性。

2.RT-PCR

所有检测合格的RNA用TOYOBO公司反转录试剂盒按以下体系做反转录：

总RNA                    500-1000μg

5×RT Buffer             4μL

dNTP Mixture(各10mmol/L) 2μL

RNase Inhibitor(10U/μL) 1μL

Oligo(dT)₂₀              1μL

ReverTra Ace             1μL

用RNase-Free H2O补至     20μL

反应条件为：42℃         20min

99℃                     5min

3.Real-Time PCR检测玉米dull1基因在不同组织中的表达情况

将反转录产物稀释10倍作为模板进行Real-Time PCR检测，内参基因选用玉米Actin97基因。标准曲线用反转录产物倍比稀释作模板制定。所用到的引物序列如下(所有引物均由Invitrogen公司合成，下同)：

Actin97引物：

Pa1：5’---GTTGGGCGTCCTCGTCA---3’

Pa2：5’---TGGGTCATCTTCTCCCTGTT---3’

dull1引物：

Pd1：5’---CACTCGCCTGACAGCCCAAAAG---3’

Pd2：5’---GCCAGCGTATATCAGATGCGAGAG ---3’

Real-Time PCR采用天根生化科技有限公司RealMasterMix试剂盒，反应体系为：

2×RealMasterMix   12.5μL

引物1              0.5μL

引物2              0.5μL

cDNA模板           1.0μL

H₂O                10.5μL

总体积             25μL

反应程序为：95℃   1min

68℃               5min

Real-Time PCR检测显示，dull1基因转录的mRNA可以在胚乳和种皮中表达，在叶片、叶脉和根部没有表达。结果见图1。图1中，E：胚乳；P：种皮；R：根；L：叶片；LS：叶脉。数字为授粉后天数，根、叶片、叶脉取于授粉前14天。

实施例2：玉米dull1 5’侧翼序列的克隆

1.玉米基因组DNA的提取：

称取1.0g新鲜玉米叶片，剪成1cm的小段，放在预冷的研钵中，用液氮迅速研成均匀的粉末，在组织没有溶解之前，将粉末全部装入5mL的离心管中，迅速向离心管中加入2mL，65℃温育的CTAB提取缓冲液，轻轻摇晃混匀后65℃水浴30min-1h，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，轻微震荡15min。室温下，10000r/min离心8min。吸取上清到一个干净的5mL的离心管中。加入等体积预冷的异丙醇(4℃)，室温下10000r/min离心5min。弃上清，用75％乙醇清洗沉淀两次，无水乙醇清洗一次。在真空干燥器中干燥10min，用适量的TEBuffer(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)溶解DNA，在每管中加入3μL 10mg/mLRNaseA 4℃过夜降解基因组DNA中RNA。

2.SON-PCR扩增玉米dull15’侧翼序列

根据GenBank中玉米dull1基因的mRNA序列(Accession No：AF036891)设计两个反向巢式引物，用玉米基因组DNA为模板，用SON-PCR法克隆dull1基因5’侧翼未知序列，LA Taq酶购自TaKaRa公司，引物序列如下：

Pson1：5’-CTCCGAAGGCAGAGAGGGCTCTG-3’

Pson 2：5’-CCGTAGGACCATCTCCATTTCTAG-3’

第一轮PCR反应体系如下：

10×LA PCR buffer      5μL

dNTP(10mmol/L)         5μL

MgCl₂                  5μL

gDNA(100ng/μL)        0.5μL

Pson1(10mmol/L)        2μL

LA Taq酶(5U/μL)       0.5μL

ddH₂O                  32μL

总体积                 50μL

PCR反应条件如下：

94℃                   3min

94℃                   30sec

29℃                   3min

29℃ Ramp 3 min to     72℃

72℃                   2.5min

72℃                   7.5min

第二轮PCR反应体系如下：

10×LA PCR buffer      5μL

dNTP(10mmol/L)         5μL

MgCl₂                  5μL

第一轮PCR产物          0.5μL

Pson2(10mmol/L)        2μL

LA Taq酶(5U/μL)       0.5μL

ddH₂O                  32μL

总体积                 50μL

PCR反应条件如下：

94℃                   3min

94℃                   30sec

29℃                   3min

29℃ Ramp 3 min to     72℃

72℃                2.5min

72℃                7.5min

3.PCR产物的电泳和回收

用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，电泳结束，用凝胶成相系统(BIO-RAD公司)照相分析(见图2)，切取含最大长度的PCR产物胶块，用DNA凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)回收。

4.DNA连接反应

在无菌Eppendorf管中加入：1μL 10×T4 DNA ligase Buffer，4μL回收的PCR产物，1μL pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，1μL T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)，3μL无菌ddH₂O，总体积为10μL。将各组分混匀，16℃中连接过夜。

5.大肠杆菌感受态细胞的制备

挑取大肠杆菌DH5α单菌落到含有50mL LB培养基的三角瓶中，于37℃振荡培养过夜；取10μL到含有50mL LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养到OD600值为0.4-0.6；将培养好的的菌液转移到50mL的离心管中，冰浴10min；在4℃，5000r/min条件下离心5min，去上清，收集细胞；用20mL冰预冷的0.1mol/L CaCl₂轻轻悬浮沉淀，在冰上放置10min；在4℃，5000r/min离心10min，用2mL 0.1mol/L CaCl₂悬浮沉淀，按每管200μL分装细胞悬浮液于无菌的Eppenforf管中，用液氮快速冷冻，储存于-70℃。

6.大肠杆菌的转化

在200μL大肠杆菌感受态细胞中加入10μL DNA连接产物，手指轻弹管壁，混匀混合物，置于冰上30min；42℃水浴热激处理90sec，迅速放回冰上，冰浴2-3min；加入800μL LB培养液，混匀，37℃振荡培养1h；将混合液涂布在氨苄选择性培养基上，37℃过夜培养。

7.阳性克隆的筛选和目的片断测序

从选择性培养基上挑取单个菌落，接种于3mL含50ng/mL的氨苄LB液体培养基中，振荡培养过夜(37℃，200r/min)，用Pson2做PCR检测后，送Invitrogen公司测序，测序结果如SEQ ID No：1所示。

实施例3：dull1P启动子启动活性的验证

1.植物表达载体的构建：

根据SEQ ID No：1序列，设计合成含有限制性酶切位点的启动子引物，以连结在测序载体pMD18-T上的3.5Kb的序列为模板通过PCR扩增法克隆1.8Kb的dull1基因启动子序列。

Pde 1：5’---CACTCGTCGACGCCTTTGAGACTG---3’

Pde 2：5’---TCTCCATGGCTAGAAGGGGAAGAAAAGAAG---3’

Pde1划线部分为序列自身含有的SalI酶切位点，Pde2划线部分为添加的NcoI酶切位点。

反应体系如下：

10×LA PCR buffer     5μL

dNTP(10mmol/L)        5μL

MgCl₂                 5μL

Pde1(10mmol/L)        2μL

Pde2(10mmol/L)        2μL

模扳(10ng/μL)        0.5μL

LA Taq酶(5U/μL)      0.5μL

ddH₂O                 30μL

总体积                50μL

PCR反应条件如下：

94℃                  3min

72℃                  8min

Hold                  4℃

将扩增出的1779bp的启动子序列命名为dull1P，连接到pMD18-T测序载体上，经Invitrogen公司测序，表明扩增没有出现错配，结果见SEQ ID No：2。根据引物Pde1和Pde2两段设计的限制性酶切位点，用SalI和NcoI将dull1P片段从pMD18-T载体上切下，回收后与经SalI和NcoI双酶切的pCAMBIA1301载体片段连接，构建过程见图3。连接产物转化DH5α菌株中，挑选阳性克隆送Invitrogen公司测序，证明连接正确。将阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基上繁殖后用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取质粒。

2.转化受体的准备

取玉米骨干自交系18-599授粉后8-12天的胚乳(无菌处理)作为基因枪转化的受体，在含有高渗培养基(MS盐+0.4mol/L蔗糖)的培养皿(直径9cm)中央2-3cm处渗透处理4h，然后用基因枪进行轰击。

(1)金粉的制备

称60mg金粉(直径1.6μm，Bio-Rad)于1.5mL的Eppendorf管(Thermo公司)中，加入新鲜制备的1mL 70％的乙醇(HPLC级)，置漩涡混合器上震荡3-5min，静置15min，1000r/min离心3min，使金粉沉淀，弃上清液。重复下列步骤3次。再加入1mL消毒蒸馏水，漩涡震荡1min，静置1min；1000r/min离心3sec，使金粉沉淀，弃上清液。加入灭菌的50％甘油，使金粉浓度达到60mg/mL。

漩涡震荡50％甘油中的金粉，沉淀5min，使之成为悬浮液，去掉粗堆集，取50μL悬浮混合液于1.5mL的管中，同时震荡，依次加入5μL DNA(1μg/μL)50μL CaCl₂(2.5mol/L)，20μL亚精胺(0.1mol/L，新鲜配置)，继续震荡2-3min，静置3min(混匀后置于冰上5-10min，使载体DNA分子充分沉降在微粒载体表面，3000-5000r/min离心2sec，沉淀金粉DNA，弃上清液；加入150μL 70％乙醇，不破坏沉淀块，弃上清液；加入150μL 100％乙醇，不破坏沉淀块，弃上清液；加入50μL 100％乙醇，指弹管壁几次，使之重新悬浮，然后低速漩涡2-3sec，就成为可用的微弹了。每次取6μL微弹涂在载体膜中央，每次要尽量取出等量的微粒子，并尽力作到均匀铺在载体膜(70％乙醇灭菌)中央3cm直径之内，自然条件下干燥。

(2)基因枪轰击

使用BIO-RAD公司生产的PDS-1000/He型基因枪进行转化，按照产品说明书提供的方法操作。真空度为25mmHg，气压为1100psi，每皿轰击两枪。将轰击后的胚乳转入琥珀酸钠培养液(20mmol/L琥珀酸钠，20mmol/L CaCl₂，10μmol/L氯霉素，pH＝5.0)25℃黑暗培养24h。

(3)组织化学染色分析

取培养后的材料置于X-Gluc染色液[0.1mmol/L NaPO4，(pH＝7.0)，0.5mmol/L K[Fe(CN)，2mmol/L X-Gluc、1％Triton X-100，1％DMSO，10mmol/Lmmol/L EDTA]中，抽真空半小时后37℃保温过夜，在解剖镜下观察照相，结果见图4。

SEQUENCE LISTING

<110>四川农业大学

<120>一种种子特异表达的淀粉合成酶基因启动子及其应用

<130>090106

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3474

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays.L)

<400>1

ctggacgtgt caccttggct actgttgggc ccatgcttcg ttgcgccgaa ggtcttgcgt    60

gaagaagcag cttcggctga aatcgtcccc aggaaatggc cgaaggttcc tttttataga   120

gcttcggcgt tgcaaaccga cataaagata gaatgacctt tttatccata gaggtctaag   180

ataaggttgt aaacttttgt aaagggcata attgtaattc gtcacaggct gcgtcctgtg   240

tctataaata gatgaacagt acccccgtac tgttcacgct gacttggcat ttgcttttgc   300

gtcacgcttg tactttttac cttctctcag gaccgaaggt acatttgtaa tttgaaatca   360

tttctatttt tccatgttaa taaaatagaa atgattctat gatgatgttt atattatatt   420

tcatgcttta tatgagtcct tcgtcattac ttgttatgtt tacgaaggta tgtctcttat   480

gaccttcgtc cgagactcat tgtttcccga agggacataa tgcttcgaag gacgaaggac   540

tttaacactt aacacttttt atgttgcctt gttcttaact cttagcattt gagaacaagt   600

ccccaacatt gaatatgttt aagcataacg ttgagcgtta ggttcaggta attgtatgtt   660

ttccggttca ctttaatagg tgcatgctca cagttccaga aacaacatga ggtcctatga   720

atatttcatg tttctatgta taatgaaaat aataagcctt catccattcg tatatatact   780

ctttgatctt gtggtgtttg tgcaggtcca gaacatctgc actagaacac ctaaaaagaa   840

gtcctacaaa gatttggtta gttgcttcat gcttttacta ttcctctctt aatacttagc   900

tccataataa gcctccgatt tgtcgccgtt ctgttcaact cattaggtgc gtcaacactg   960

aaattcactc ttatggtcat gttttagtat tgcattagag tttgcatcat gaatcaggga  1020

catccaatgt tgttagatct attaatgcga tgttctctgt cttattttta tcctacaagt  1080

catttcgaga tatgtggttg ctgatcagat gcgggcaatg tcaatttttt tattggagtt  1140

gttaacttga cactcattca ccttctggat tgaaaaccaa gacaatactg catctattta  1200

gttaaacata tcttacttgg ttgctaacac aactaagaga aatactgaaa atcaatcctt  1260

cagtctttcc tttcatagga ttttaatttg tgcatgacaa agagttttac atgtcagaaa  1320

ttaatagatg tcagagagtt cattgcagtt catctccttc actgcatcct gcatattttc  1380

tctctctttc agctggttat actaacaagg gaccactgtt ttgatgcaaa ggtaagcatc  1440

tgcattttac tcgagttaca tgtcactgct accccttaat cccagggtgc ctttgatttg  1500

cgacatccag gagcagatgc gacaggatca caagtaggag gagcggtggc gatgctgtag  1560

cgagaggcgc ggtgccaagg tcgttgtgct gcggtggtgg caggacggga aggagacgaa  1620

aaagcaggag cagggctgtc aacaacgtga tcgagtcgct gagcgaggaa gagtaaggtg  1680

aaggcactcg tcgacgcctt tgagactgac agagggtcat ctagctgcag gaaacagcac  1740

gcctgctgct gctccagcta tggaagcagg tgtcgtgtca tgagcgcttc ttgacctgca  1800

gtgtgcatga tcacctttct tgtaattttg gaattttttt ggttgttagt gaccgtaaaa  1860

gtggcgcttg ttgaggtttg ctcgttccca tgtaaactgg gttttctcat gggagtttcc  1920

atgcttttgt ggtgctacga aaaggaaagt ctgtacaggt tttgtgtcta tgcaaggctt  1980

gagaagttgg cattgtactg ataagtgata agtaaacaag ttattgtaat gatttaaact  2040

agattgtttt gaaaggaaat ggaatggata aagcaaattg aactttgtat tatgttacta  2100

attcatgaaa aatggtacta aacttccgtc aacgttttct atttttctca tttcactcgc  2160

tctatttaca gttacaacta cactgcatat gctagcatat ttgttcatat aatactcttg  2220

ctgatatttt cactgtcaca ggagcatctc tactactatt tgtgttttta tataaatgca  2280

ttttatcata ttgatttcgt ccatgcaaga ggatctctat cgtgtttcac aagataggag  2340

ccgccaagca cttgttcggt ttgtgtagaa cttcacgctc tttcctatcc cggatactta  2400

tatcattatt caggtgatgg tgtctagcaa caacgatagc ctattatcga cttggacgaa  2460

cagccataga tcttcctcaa taacttacgt gccgtcgcaa cgcacgtgca cctacctagt  2520

aaacatataa ataagaaaca ctaggctcaa ccgttcgaat aggcatctaa cgacttactc  2580

cagatggccg cccgggttcg tcgacaaaat gcgacggaat tctctctttt agtgttctac  2640

aaaaaaactg tatattttag ataaatattt acacatgaga attactcgta aattttcggg  2700

ctccgcctga tctttctacg acatagccat caagacctaa catgacacgg attcaaatac  2760

ttcaaagcta gacatatgga atgaaagcat taatttccgt aaacatgcca ctcagcattt  2820

gcaaaacata acaacctaca caaacaagaa acacgacatc ccatctcacc agtaataaaa  2880

atttgtgcca gagtaattta caaaaatagg gtcattggtt tcggatgccg acaaaattgc  2940

ctactaaact tggcatgcca agacgagaca cgcgtgaaca cttttctccc agccgagggc  3000

aagcgcccac gcaaaaacgg atccggacac acgttaaagc gaagcataaa aactcacaca  3060

acacacgtgg aacattctag aacgtatgat catacacaag caacaccggc actcatgaca  3120

catcagccaa cccaactgtg cacatctcat gagctaggga acccacagtt ggacaaacaa  3180

aacattggac ccccccaagc caaggtgaca cgtccagctc ttatacagga caaccacact  3240

tcacaggaaa aaacaaggcg tgaaagaaag aaccgatttt gttctgttta aatggcattt  3300

ccggagaggt gttgtgctat tcatttgcgt cttgtgaagt gattctagtt cagagaaaga  3360

aagaagttga gaatgagaag caagtgaggc gcgtttgctg ggaagtggtt cttgtgaggt  3420

ttaggagttc acccttcttt tcttcccctt ctagaaatgg agatggtcct acgg        3474

<210>2

<211>1779

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays.L)

<400>2

cactcgtcga cgcctttgag actgacagag ggtcatctag ctgcaggaaa cagcacgcct     60

gctgctgctc cagctatgga agcaggtgtc gtgtcatgag cgcttcttga cctgcagtgt    120

gcatgatcac ctttcttgta attttggaat ttttttggtt gttagtgacc gtaaaagtgg    180

cgcttgttga ggtttgctcg ttcccatgta aactgggttt tctcatggga gtttccatgc    240

ttttgtggtg ctacgaaaag gaaagtctgt acaggttttg tgtctatgca aggcttgaga    300

agttggcatt gtactgataa gtgataagta aacaagttat tgtaatgatt taaactagat    360

tgttttgaaa ggaaatggaa tggataaagc aaattgaact ttgtattatg ttactaattc    420

atgaaaaatg gtactaaact tccgtcaacg ttttctattt ttctcatttc actcgctcta    480

tttacagtta caactacact gcatatgcta gcatatttgt tcatataata ctcttgctga    540

tattttcact gtcacaggag catctctact actatttgtg tttttatata aatgcatttt    600

atcatattga tttcgtccat gcaagaggat ctctatcgtg tttcacaaga taggagccgc    660

caagcacttg ttcggtttgt gtagaacttc acgctctttc ctatcccgga tacttatatc    720

attattcagg tgatggtgtc tagcaacaac gatagcctat tatcgacttg gacgaacagc    780

catagatctt cctcaataac ttacgtgccg tcgcaacgca cgtgcaccta cctagtaaac    840

atataaataa gaaacactag gctcaaccgt tcgaataggc atctaacgac ttactccaga    900

tggccgcccg ggttcgtcga caaaatgcga cggaattctc tcttttagtg ttctacaaaa    960

aaactgtata ttttagataa atatttacac atgagaatta ctcgtaaatt ttcgggctcc   1020

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aagctagaca tatggaatga aagcattaat ttccgtaaac atgccactca gcatttgcaa   1140

aacataacaa cctacacaaa caagaaacac gacatcccat ctcaccagta ataaaaattt   1200

gtgccagagt aatttacaaa aatagggtca ttggtttcgg atgccgacaa aattgcctac   1260

taaacttggc atgccaagac gagacacgcg tgaacacttt tctcccagcc gagggcaagc   1320

gcccacgcaa aaacggatcc ggacacacgt taaagcgaag cataaaaact cacacaacac   1380

acgtggaaca ttctagaacg tatgatcata cacaagcaac accggcactc atgacacatc   1440

agccaaccca actgtgcaca tctcatgagc tagggaaccc acagttggac aaacaaaaca   1500

ttggaccccc ccaagccaag gtgacacgtc cagctcttat acaggacaac cacacttcac   1560

aggaaaaaac aaggcgtgaa agaaagaacc gattttgttc tgtttaaatg gcatttccgg   1620

agaggtgttg tgctattcat ttgcgtcttg tgaagtgatt ctagttcaga gaaagaaaga   1680

agttgagaat gagaagcaag tgaggcgcgt ttgctgggaa gtggttcttg tgaggtttag   1740

gagttcaccc ttcttttctt ccccttctag aaatggaga                          1779

Claims (5)

1、一种种子特异表达的淀粉合成酶基因启动子，其特征在于，该启动子具有核苷酸-3340至+134的3474bp的序列，如SEQ ID NO：1所示。

2、根据权利要求1所述的淀粉合成酶基因启动子，其特征在于，该启动子的-1651至+122的1773bp核苷酸序列足以驱动外源基因在转基因植物的籽粒中特异表达，其序列如SEQ ID NO：2所示。

3、一种种子特异表达的含有淀粉合成酶基因启动子的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是含有权利要求1或2所述的核苷酸序列的重组质粒。

4、一种种子特异表达的含有淀粉合成酶基因启动子的细胞系，其特征在于，所述细胞系是含有权利要求1或2所述的核苷酸序列的细胞系。

5、一种种子特异表达的含有淀粉合成酶基因启动子的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌是含有权利要求1或2所述的核苷酸序列的宿主菌。

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