UA121387C2 - Вектор або мобільний генетичний елемент, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, і його застосування для підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослин - Google Patents
Вектор або мобільний генетичний елемент, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, і його застосування для підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослин Download PDFInfo
- Publication number
- UA121387C2 UA121387C2 UAA201611279A UAA201611279A UA121387C2 UA 121387 C2 UA121387 C2 UA 121387C2 UA A201611279 A UAA201611279 A UA A201611279A UA A201611279 A UAA201611279 A UA A201611279A UA 121387 C2 UA121387 C2 UA 121387C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- sucrose
- nucleic acid
- protein
- acid molecule
- sugar
- Prior art date
Links
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 title claims abstract description 197
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 title claims abstract description 197
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 title claims abstract description 108
- 102000003669 Antiporters Human genes 0.000 title claims abstract description 92
- 108090000084 Antiporters Proteins 0.000 title claims abstract description 92
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims description 46
- 238000003860 storage Methods 0.000 title claims description 38
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 title abstract description 188
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 title abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 188
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 175
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 135
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 111
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 110
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 110
- 108010083204 Proton Pumps Proteins 0.000 claims description 87
- 102100021904 Potassium-transporting ATPase alpha chain 1 Human genes 0.000 claims description 81
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 57
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 57
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 39
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 23
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 17
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 6
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 6
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 5
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 5
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 195
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 90
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 52
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 34
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 34
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 18
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 241000021394 Veia Species 0.000 description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 17
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 244000234179 Myrtus ugni Species 0.000 description 11
- 235000012093 Myrtus ugni Nutrition 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 9
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 8
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000008676 import Effects 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 8
- 101710132674 Monosaccharide transporter Proteins 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000006270 Proton Pumps Human genes 0.000 description 6
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 5
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 5
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 5
- 210000000473 mesophyll cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 4
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Natural products OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 3
- -1 triose phosphates Chemical class 0.000 description 3
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101100425714 Brassica oleracea TMT2 gene Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WQQSIXKPRAUZJL-UGDNZRGBSA-N Sucrose 6-phosphate Natural products O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 WQQSIXKPRAUZJL-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 101150028282 TMT-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 101150094313 XPO1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 2
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 2
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- PJTTXANTBQDXME-UGDNZRGBSA-N sucrose 6(F)-phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@]1(CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 PJTTXANTBQDXME-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-2-{[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulfinyl}-1H-benzimidazole Chemical compound N=1C2=CC(OC)=CC=C2NC=1S(=O)CC1=NC=C(C)C(OC)=C1C SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-UHFFFAOYSA-N 6,18-dimethoxy-17-[oxo-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methoxy]-1,3,11,12,14,15,16,17,18,19,20,21-dodecahydroyohimban-19-carboxylic acid methyl ester Chemical compound C1C2CN3CCC(C4=CC=C(OC)C=C4N4)=C4C3CC2C(C(=O)OC)C(OC)C1OC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002767 Acer grandidentatum Species 0.000 description 1
- 235000010319 Acer grandidentatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000010328 Acer nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000002629 Acer saccharinum Nutrition 0.000 description 1
- 235000010157 Acer saccharum subsp saccharum Nutrition 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000006549 Arenga pinnata Nutrition 0.000 description 1
- 241000786798 Atya Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 244000208235 Borassus flabellifer Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 101100533283 Dictyostelium discoideum serp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100284769 Drosophila melanogaster hemo gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 241000152447 Hades Species 0.000 description 1
- 108091030087 Initiator element Proteins 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N Met-Met Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCSC ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000005455 Monosaccharide Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010006769 Monosaccharide Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100352764 Mus musculus Podn gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 240000007643 Phytolacca americana Species 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020003564 Retroelements Proteins 0.000 description 1
- YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N Rosiglitazone Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 101710126391 Sucrose transport protein Proteins 0.000 description 1
- 108700006291 Sucrose-phosphate synthases Proteins 0.000 description 1
- 108050007025 Sugar transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000017952 Sugar transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003673 Symporters Human genes 0.000 description 1
- 108090000088 Symporters Proteins 0.000 description 1
- 101150075071 TRS1 gene Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000613130 Tima Species 0.000 description 1
- 241000838698 Togo Species 0.000 description 1
- APQHKWPGGHMYKJ-UHFFFAOYSA-N Tributyltin oxide Chemical compound CCCC[Sn](CCCC)(CCCC)O[Sn](CCCC)(CCCC)CCCC APQHKWPGGHMYKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001604786 Zygopa Species 0.000 description 1
- DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)[C@@]1(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructofuranose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@](O)(COP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002337 anti-port Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Chemical compound [O-2].[Ca+2] BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000292 calcium oxide Substances 0.000 description 1
- ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Inorganic materials [Ca]=O ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000013523 data management Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229940025237 fructose 1,6-diphosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 235000021552 granulated sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 150000002840 non-reducing disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000020374 simple syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 235000012069 sugar maple Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229950010342 uridine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Fertilizers (AREA)
Abstract
Винахід стосується вектора або мобільного генетичного елемента, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, еукаріотичної або прокаріотичної клітини-хазяїна, трансгенної рослинної клітини, трансгенної рослини або її частини, насінини від трансгенної рослини, способу одержання трансгенної рослини, способу підвищення концентрації сахарози в рослині, олігонуклеотиду, способу виявлення рослин, придатних для створення більш високої концентрації сахарози, застосування білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру для підвищення концентрації сахарози в органі накопичення сахарози рослини.
Description
Цей винахід належить до галузі промислового виробництва цукру із культурних рослин і має відношення до підвищення кількості сахарози в культурних рослинах при сільськогосподарському вирощуванні. Зокрема, цей винахід має відношення до білків, які являють собою протонні помпи тонопласта/антипортери цукру, конкретніше, білків, які являють собою протонні помпи тонопласта/антипортери сахарози, і нуклеїнових кислот, які їх кодують, та їх використання для підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози культурних рослин.
З одного боку, термін "цукор" є збірним терміном для всіх моно- і дисахаридів із солодким смаком, з іншого боку, є загальною комерційною назвою дисахарида сахарози. Сахароза є звичайним побутовим цукром або цукром-піском, і також відома як цукроза. Сахароза є димером однієї молекули а-ЮО-глюкози і однієї молекули В-О-фруктози, які з'єднані між собою а,В-1,2-глікозидним зв'язком.
Сахароза утворюється в рослинах при фотосинтезі. Біосинтез сахарози відбувається в цитоплазмі рослинних клітин. Для цієї мети два тріозофосфати, гліцеральдегід-З-фосфат і дигідроксіацетонфосфат, які утворюються як кінцевий результат асиміляції вуглецю при фотосинтезі (цикл Кальвіна), експортуються з хлоропласта в цитозоль. У цитозолі рослинної клітини з тріозофосфатів утворюються моносахариди ООР-глюкоза і фруктозо-6-фосфат. З цією метою перший - фруктозо-1,6-дисфосфат - утворюється в результаті реакції конденсації між гліцеральдегід-3-фосфатом і дигідроксиацетонфосфатом. Фруктозо-1,6-дифосфат далі вступає в реакцію з утворенням фруктозо-б6-фосфату в результаті дефосфорилювання. У результаті ізомеризації фруктозо-б-фосфат може також утворювати глюкозо-6-фосфат, який після попередньої ізомеризації з утворенням глюкозо-1-фосфату, вступає в реакцію з урідинтрифосфатом (ТР) з утворенням уридиндифосфатглюкози (ШОР-глюкози). Подальша конденсація ОЮОР-глюкози і фруктозо-6-фосфату з утворенням сахарозо-6-фосфату каталізується ферментом сахарозофосфатсинтазою. Необхідна енергія забезпечується делецією уридиндифосфату (ОР). ! нарешті, залишок фосфату сахарозо-6-фосфату розщеплюється ферментом сахарозофосфатфосфатазою в незворотній реакції з утворенням сахарози.
Сахароза являє собою невідновний дисахарид, і тому є найбільш важливим транспортним
Зо цукром у рослинах. Сахароза поновно синтезується в листях рослин, і транспортується по флоемі в органи її накопичування, де вона накопичується в вакуолях рослинних клітин як поживна речовина і як джерело енергії.
Важливе значення для промислового виробництва сахарози мають, зокрема, цукрові буряки (Вега миїдагіє зиБ5р. миїдагіб), цукрова тростина (Засспагит ойісіпагит) і цукрова пальма (Агепда ріппаїа, синонім: Агепда засспагіїега І арії.,, головним чином в Індонезії). У менших кількостях сахарозу також одержують з соку цукрового клена (Асег засспагит). Ці рослини використовують для виробництва сахарози завдяки їх виключно високому вмісту сахарози.
Цукрова тростина містить цукри - в основному сахарозу - у кількості зазвичай від 10 95 до 20 95 в стрижні рослини (орган накопичування сахарози рослини). Тростинний цукор одержують кристалізацією, і рафінуванням соку рослин, який одержують вигнічуванням.
Цукровий буряк є дворічною рослиною, яка створює запас цукру в коренеплоді в перший рік, і цей запас використовується як живлення квітучих рослин на другий рік. Цукор, як правило, одержують зі стружки цукрового буряку в процесі екстракції водою. Потім екстракт обробляють оксидом кальцію для осадження рослинних кислот, таких як щавлева кислота або винна кислота, і білків. Надлишок вапна відокремлюють введенням діоксиду вуглецю. Подальшим випарюванням води з цукрового сиропу в вакуумі одержують розчин сиропу. Цукор, що кристалізується, відокремлюють від решти коричневого сиропу центрифугуванням. Залишок, мелясу, використовують як корм для великої рогатої худоби або для як сировину для спиртового бродіння. Очищення цукру (рафінування) здійснюють шляхом перекристалізації, фільтрації, і упарювання в вакуумі.
Впродовж десятиріч зусиль, що докладались до вирощування рослин, які запасають сахарозу, домоглись істотного підвищення врожайності продукції - органу накопичування сахарози - і концентрації сахарози. Так, наприклад, у сортах цукрових буряків, які зараз вирощуються для виробництва цукру, концентрація сахарози в коренеплоді буряку складає приблизно 15-20 95 (мас.) у розрахунку на сиру масу коренеплоду. Проте, одержувана концентрація сахарози все ще не є задовільною.
Отже, предметом цього винаходу є надання рослин з більш високою концентрацією сахарози і віднаходження способів, із застосуванням яких можна підвищити концентрацію сахарози в рослинах, особливо в цукровій тростині і цукровому буряку. бо У міжнародній заявці, опублікованій як МО 2010/072210 А1, розкритий спосіб підвищення кількості сахарози в цукровому буряку при сільськогосподарському вирощуванні. За цим способом використовують рослини цукрового буряку або цукрової тростини, генетична будова яких спрямована на зниження ферментативної активності інвертази. З цією метою нуклеїнову кислоту, придатну для зменшення ферментативної активності інвертази в рослинній клітині, використовують для формування органу накопичування сахарози рослини, у якому концентрація сахарози є підвищеною в порівнянні з концентрацією сахарози немодифікованого контрольного органу накопичування сахарози рослини такого ж самого генотипу на порівнянній стадії розвитку.
Вакуолі рослин відіграють центральну роль у довгостроковому або короткостроковому накопичуванні цукру, оскільки вакуоля, як органела, займає приблизно 9095 об'єму фотосинтетично активної рослинної клітини (Магпііпоїа, Е. еї аї. (2007) "Масиоїаг Ігапх5рогпіег5 апа
Іпеїк еззепійа! гої іп ріапі теїароїївт", у). Ехр. Вої. 58: 83-102). Таким чином вакуолі, завдяки їх розміру, мають величезне значення для накопичування цукрів (Меипацйз, Н.Е. (2007) "Тгапзрогі
ОЇ ргітагу теїароїйев асго55 Ше ріапі масиоїаг тетбгапе", ЕРГЕВ5 Гей 581: 2223-2226).
Накопичувальні тканини, такі як головний (стрижневий) корінь цукрового буряку (Веїа уцідагів) і стрижень цукрової тростини (Засспагит ойПісіпагит), накопичують велику кількість сахарози у вакуолях клітин їх зберігаючих органів для використання її як джерело енергії для метаболізму рослин.
У різних однодольних і дводольних рослин, таких як Медісадо (ідентифікаційний номер
АС131026), Мб міп'єга (ідентифікаційний номер ААХ47312) і рис (Огула займа; ідентифікаційний номер О502913560), були виявлені білки, які відповідають за транспорт цукру з цитоплазми рослинної клітини в їх вакуолі. У рослини Агабрідорзіх виявили ген, білковий продукт якого являє собою цукровий транспортер, який локалізується в мембрані вакуолі фотосинтетично активних клітин і може імпортувати глюкозу з цитоплазми у вакуоль (М/оптії, А. еї аї. (2006) "МоіІесшіаг ідепійісайоп апа рнузіоіодіса! спагасієгігайоп ої а поме! топозасспагіде іапзропег їот Агабідорвів іпулоїмей іп масисоіаг зидаг ШМапвроп", Ріапі Сеї! 18: 3476-3490). Цей транспортний білок, відомий як транспортер моносахаридів в тонопласті (ТМТ), є локалізованим в мембрані вакуолі - тонопласті. Білок-транспортер моносахаридів в тонопласті (ТМТ) включає в себе три ізоформи Агабрідорвзіб5 ІПаїйапа, які називаються АЇТМТ1, АЇТМТ2 і АЇТМТ3. Гени
Зо АЇТМТІ і АЇТМТ2 мають тканино- і клітиноспецифічні профілі експресії, в той час як ген АЕТМТЗ експресується дуже слабо. За допомогою нокаутів генів ТМТ показують, що модифіковані таким чином рослини накопичують значно менше глюкози і фруктози в їх вакуолях у порівнянні з рослинами дикого типу. Проте щодо накопичення сахарози не було виявлено жодних відмінностей між рослинами дикого типу і рослинами з нокаутованими генами ТМТ.
Транспортер моносахаридів в тонопласті ТМТ1 Агабідорзі5 (паіапа був охарактеризований з електрофізіологічної точки зору як стимульований протонами антипортер глюкози і сахарози, який транспортує глюкозу і сахарозу через вакуольну мембрану з приблизно однаковою специфічністю (5спці2, А. еї а. (2011) "Ргооп-агмеп зисто5е зутроїї апа апіїроїї аге ргомідед ру
Ше масиоіаг апзропегз 5004 апа ТмМт1/2", Тне Ріапі дошигпа! 68: 129-136). У тій самій статті транспортний білок сахарози 5004 Агарідорзіз (Пайапа характеризується як протонна помпа/сімпортер сахарози, який також може бути локалізований у вакуольній мембрані.
У міжнародній заявці, опублікованій як УМО 2011/120549 А1, розкрито, що врожай насіння та вміст білка й олії в насінні можуть бути підвищені або ріст однодольних або дводольних рослин на ранніх стадіях може бути стимульований в рослинах надекспресією транспортера моносахаридів в тонопласті АЇТМТ1. Накопичення сахарози в органі накопичування не розкрите.
На цьому тлі мету цього винаходу було досягнуто внаслідок виявлення білків, відповідальних за імпорт цукру в вакуолі клітин головного (стрижневого) кореня цукрового буряку, зокрема, білка, відповідального за імпорт сахарози у вакуолі клітин головного (стрижневого) кореня цукрового буряку, який є специфічним для сахарози. Завдяки виявленню цих білків, зокрема, завдяки виявленню цього першого сахарозо-специфічного білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, і нуклеотидних послідовностей, що кодують ці білки, запропоновані способи культивування та/або молекулярно-генетичні способи підвищення концентрації сахарози в рослинах, а також надані рослини з більш високою концентрацією сахарози.
За першим аспектом цей винахід має відношення до молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру. За варіантом, якому віддають перевагу, вказана молекула нуклеїнової кислоти кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, який є специфічним для сахарози. Нижче на такий білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, який є бо специфічним для сахарози, посилаються також як на білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози.
За другим аспектом цей винахід має відношення до рекомбінантного гена, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за першим аспектом цього винаходу, або молекулу нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/"антипортер цукру, переважно - білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози. Молекула нуклеїнової кислоти може бути функціонально зв'язана із щонайменше одним регуляторним елементом.
За третім аспектом цей винахід має відношення до вектора або мобільного генетичного елемента, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за першим аспектом цього винаходу або рекомбінантний ген за другим аспектом цього винаходу.
За ще одним аспектом цей винахід має відношення до еукаріотичної клітини-хазяїна або прокаріотичної клітини-хазяїна, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за першим аспектом цього винаходу, переважно як трансген, рекомбінантний ген за другим аспектом цього винаходу або вектор чи мобільний генетичний елемент за третім аспектом цього винаходу.
За ще одним аспектом цей винахід має відношення до білка, який функціонує як протонна помпа/антипортер цукру, який переважно є специфічним для сахарози, або переважно функціонує як протонна помпа/антипортер сахарози.
За ще одним аспектом цей винахід має відношення до трансгенної рослинної клітині, що містить як трансген молекулу нуклеїнової кислоти за першим аспектом цього винаходу, містить як трансген рекомбінантний ген за другим аспектом цього винаходу, або містить вектор чи мобільний генетичний елемент за третім аспектом цього винаходу, і до трансгенної рослини або її частин, які містять щонайменше одну таку трансгенну рослинну клітину.
За ще одним аспектом цей винахід має відношення до насіння трансгенної рослини за попереднім аспекту цього винаходу, де згадане насіння містить як траноген молекулу нуклеїнової кислоти за першим аспектом, містить як трансген рекомбінантний ген за другим аспектом вказане, або містить вектор чи мобільний генетичний елемент за третім аспектом цього винаходу.
За ще одним аспектом цей винахід має відношення до способів одержання трансгенних рослин.
Зо За ще одним аспектом цей винахід має відношення до способів підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослини.
За ще одним аспектом цей винахід має відношення до способів виявлення рослини, придатної для утворення підвищеної концентрації сахарози в органі накопичування сахарози цієї рослини.
За ще одним аспектом цей винахід має відношення до олігонуклеотидів, придатних для використання як молекулярні маркери для діагностичного виявлення молекули нуклеїнової кислоти за першим аспектом цього винаходу.
За ще одним аспектом цей винахід має відношення до антитіл, які виявляють присутність білка, який функціонує як опротонна помпа тонопласта/"антипортер цукру (переважно специфічного для сахарози), переважно як протонна помпа тонопласта/антипортер сахарози.
За ще одним аспектом цей винахід має відношення до застосування білків, які являють собою протонні помпи тонопласта/антипортери цукру, для підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослини.
На Фіг. 1 представлена таблиця із зазначенням ідентичності і подібності амінокислотних послідовностей трьох паралогічних білків, що являють собою транспортери моносахаридів в тонопласті (ТМТ) Агарідорзібх Ійпайапа, чотирьом паралогічним білкам, що являють собою транспортери цукру в тонопласті (Т5Т) Веїа миїдагів.
На Фіг. 2 показана кладограма, яка ілюструє філогенетичні відносини трьох паралогічних білків, що являють собою транспортери моносахаридів в тонопласті (ТМТ) Агабідорбзів ІПаїїапа, і чотирьох паралогічних білків, що являють собою транспортери цукру в тонопласті (Т5Т) Веїа уУцідагів.
На Фіг. З показана стовбчаста діаграма, яка ілюструє концентрацію сахарози в головних (стрижневих) коренях двох сортів цукрових буряків різного віку.
На Фіг. 4 показана стовбчаста діаграма, яка показує відносні кількості тЕеЕМА чотирьох паралогічних генів ТЗТ Веїа миЇдагіз у двох різних сортах цукрових буряків у різні періоди розвитку.
На Фіг. 5 показана стовбчаста діаграма, яка ілюструє концентрацію різних цукрів в листях цукрових буряків сорту "ВеПадоппа КУУ5" у різні періоди розвитку.
На Фіг. 6 показана стовбчаста діаграма, яка показує відносні кількості тЕекМА чотирьох бо паралогічних генів ВУМТ5Т у листях цукрових буряків сорту "ВеПадоппа КУУ5З" в різні періоди розвитку.
На Фіг. 7 показана стовбчаста діаграма, яка ілюструє зміну щільності струму, індукованого різними цукрами (сахаридами), у вакуолях тимчасово трансформованих мезофільних клітин.
Автори цього винаходу визначили білок, позначений у цьому описі як ВМТ512.1, як один з кількісно найбільш поширених білків вакуолярної мембрани клітин головного (стрижневого) кореня цукрових буряків, і несподівано виявили, що цей білок ВмТ512.1 може імпортувати специфічно сахарозу з цитозолю в вакуолі рослинних клітин як транспортер цукру в тонопласті.
Отже, цей білок і білки з аналогічною функцією не тільки представляють собою транспортери цукру в тонопласті (Т5Т), але на них також посилаються як на транспортери сахарози в тонопласті або як на протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, або білки, які являють собою протонні помпи тонопласта/"антипортери сахарози, де "Вм" в скороченні, що використовується в цьому описі, означає Веїа миЇдагіє - організм, у якому цей білок був виявлений вперше. Автори цього винаходу визначили білок ВмТ5Т2.1 як білок, який являє собою протонну помпу/антипортер цукру, який є високо специфічним для сахарози, і який є першим відомим представником цієї родини білків, що транспортують цукор. Крім того, були успішно виявлені три інші паралогічні ізоформи, ВмТ5тТ1, ВмТ512.2 і ВмТ5Т3, які, ймовірно, функціонально пов'язані з відомими білками ТМТ Агабідорвів.
На підставі виявлення цього нового сахарозо-специфічного антипортера автори цього винаходу також виявили нуклеотидні послідовності, які кодують білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, і інші ізоформи.
Отже, відповідно до першого аспекту цей винахід має відношення до молекул нуклеїнової кислоти, які кодують білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, переважно -- білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози.
Відповідно до одного з варіантів здійснення цього винаходу згадана молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, містить молекулу нуклеїнової кислоти, вибрану з групи, до складу якої входять: а) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка відповідає послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2, або молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 8095 є ідентичною нуклеотидній послідовності, яка
Ко) відповідає послідовності 5ЕО ІЮО МО: 2;
Юр) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, комплементарну одній з нуклеотидних послідовностей, що відповідають а); с) молекула нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, яка відповідає а) або Б); а) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, яка відповідає послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1, або молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, амінокислотна послідовність якого щонайменше на 8095 є ідентичною амінокислотній послідовності, яка відповідає послідовності 5ХЕО ІЮО МО: 1; і е) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує гомолог, аналог або ортолог поліпептиду, і яка відповідає послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1.
Відповідно до ще одного з варіантів здійснення цього винаходу згадана молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, містить молекулу нуклеїнової кислоти, вибрану з групи, до складу якої входить: а) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка відповідає послідовності зЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 6 або 5ЕО ІО МО: 8, або молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 8095 є ідентичною нуклеотидній послідовності, яка відповідає послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 6 або 5ЕО ІО МО: 8;
Юр) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, комплементарну одній з нуклеотидних послідовностей, що відповідають а); с) молекула нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, яка відповідає а) або Б); а) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, яка відповідає послідовності зХЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 5 або ЗЕО ІО МО: 7, або молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, амінокислотна послідовність якого щонайменше на 8095 є ідентичною амінокислотній послідовності, і яка відповідає послідовності ЗЕО ІЮ МО: 3, ЗЕО ІО МО: 5 або
ЗБОЮ МО: 7; і е) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує гомолог, 60 аналог або ортолог поліпептиду, і яка відповідає послідовності зХЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 5 або
ЗЕО ІЮО МО: 7.
Термін "молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність" включає не тільки молекули нуклетнових кислот, нуклеотидна послідовність яких складається з нуклеотидної послідовності, більш докладно описаної нижче, але також і молекули нуклеїнових кислот, які на додаток до нуклеотидної послідовності, більш докладно описаної нижче, мають щонайменше один нуклеотид або нуклеотидні послідовності.
Відповідно до альтернативного і/або додаткового варіанту здійснення цього винаходу молекула нуклеїнової кислоти кодує амінокислотну послідовність, що відповідає послідовності
ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 7. Проте, молекула нуклеїнової кислоти може також кодувати амінокислотну послідовність, у якій щонайменше один амінокислотний залишок амінокислотної послідовності був замінений амінокислотою, що має подібні хімічні властивості (консервативна або напівконсервативна амінокислотна заміна). У разі консервативної амінокислотної заміни амінокислоту замінюють іншою амінокислотою з подібними хімічними властивостями. У разі напівконсервативної амінокислотної заміни амінокислоту замінюють іншою амінокислотою, що має аналогічну стеричну будову. Ця заміна переважно не справляє жодного впливу на функції білка. Прикладами амінокислотних замін є
Азр і СІМ, І ем і Пе, Айа і Маї, Агд і Гуз та РпНе і Тгр.
Відповідно до альтернативного і/або додаткового варіанту здійснення цього винаходу нуклеотидні послідовності нуклеїнових кислот і/або амінокислотні послідовності, що кодуються нуклеотидними послідовностями, є ідентичними щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше на 90 95, за варіантом, якому віддають особливу перевагу, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95 або щонайменше на 98 95, і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше на 99 95 нуклеотидній послідовності, що відповідає послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: 4, БЕО
ІО МО: 6 або 5ЕО ІО МО: 8 чи амінокислотній послідовності, що відповідає послідовності 5ЕО ІЮ
МО: 1, ЗЕО ІО МО: 3, ЗЕО ІЮ МО: 5 або ЗЕО ІЮ МО: 7.
Термін "гібридизуватись", у значенні, вживаному в цьому описі, означає гібридизацію в звичайних умовах, таких як описані в Затрьгоок еї аї. (1989) "МоіІесшаг Сіопіпд, А І арогаюгу
Мапиа!" (Соїй Зргіпд Нагрог Гарогаїгу Ргез5, Мем/ Могк), переважно в жорстких умовах.
Зо Жорсткими умовами гібридизації є, наприклад: гібридизація в 4х 55С (цитратно-натрієвий буфер) при температурі 65"С з подальшими численими промиваннями в 0,їх 550 при температурі 65 "С протягом в цілому приблизно 1 год. Менш жорсткими умовами гібридизації є, наприклад: гібридизація в 4х 55С при температурі 37"С з подальшими численими промиваннями в їх 55С при кімнатній температурі. Термін "жорсткі умови гібридизації" може 35 також означати: гібридизація при температурі 68 "С в 0,25 М розчині фосфату натрію, рН 7,2, 7 0 505 (додецилсульфат натрію), 1 мМ розчині ЕОТА (етилендіамінтетраоцтова кислота) і 1 95
В5А (бичачий сироватковий альбумін) протягом 16 год. з подальшими двома промиваннями 2х
ЗЗС і 0,1 95 505 при температурі 68 760.
Для цілей цього винаходу термін "специфічний для сахарози" або "високоспецифічний для 40 сахарози" або "сахарозо-специфічний транспорт" або "сахарозо-високоспецифічний транспорт", або "специфічність до сахарози", або "сахарозо-специфічність" означає, що специфічність білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, для сахарози, порівняно з іншим цукром, є щонайменше у 5 разів, у 10 разів або у 15 разів, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше у 18 разів, у 20 разів, у 22 рази, у 24 рази, у 45 26 разів або у 28 разів, за варіантом, якому віддають особливу перевагу, щонайменше у 30 разів, щонайменше у 31 раз, щонайменше у 32 рази, щонайменше у 33 рази, щонайменше у 34 рази, щонайменше у 35 разів, щонайменше у 36 разів, щонайменше у 37 разів, щонайменше у 38 разів або щонайменше у 39 разів, і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше у 40 разів вищою. Крім того, це може також означати, що специфічність білка, 50 який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, для сахарози, порівняно з моносахаридом, таким як глюкоза або фруктоза, є щонайменше у 5 разів, у 10 разів або у 15 разів, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше у 18 разів, у 20 разів, у 22 рази, у 24 рази, у 26 разів або у 28 разів, за варіантом, якому віддають особливу перевагу, щонайменше у разів, щонайменше у 31 раз, щонайменше у 32 рази, щонайменше у 33 рази, щонайменше у 34 рази, щонайменше у 35 разів, щонайменше у 36 разів, щонайменше у 37 разів, щонайменше у 38 разів або щонайменше у 39 разів, і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше у 40 разів вищою.
Для цілей цього винаходу термін "гомолог" означає білок того ж самого філогенетичного походження, термін "аналог" означає білок, який виконує ту ж саму функцію, але має інше бо філогенетичне походження, і термін "ортолог" означає білок іншого виду, який виконує ту ж саму функцію.
Відповідно до другого аспекту цей винахід має відношення до рекомбінантного гена, що містить молекулу нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу або молекулу нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка переважно кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози. Ця молекула нуклеїнової кислоти може бути функціонально зв'язана з щонайменше одним регуляторним елементом.
Термін "регуляторний елемент" означає нуклеотидні послідовності, які не є частиною нуклеотидної послідовності, що кодує білок, але опосередковують експресію нуклеотидної послідовності, що кодує білок. Регуляторні елементи включають, наприклад, промотори, цис- регуляторні елементи, енхансери, інтрони або термінатори. Залежно від типу регуляторного елемента, він локалізується на молекулі нуклеїнової кислоти перед (тобто, у напрямку 5) або після (тобто, у напрямку 3") нуклеотидної послідовності, що кодує білок. Регуляторні елементи функціонують в клітині живої рослини.
Термін "функціонально зв'язаний" означає, що регуляторний елемент є зв'язаним з нуклеотидною послідовністю, що кодує білок, так, тобто є розташованим по відношенню до нуклеотидної послідовності, що кодує білок, на, наприклад, молекулі нуклеїнової кислоти, так, що експресія нуклеотидної послідовності, що кодує білок, під контролем регуляторного елементу може відбуватись в живій клітині.
Для цілей цього винаходу термін "промотор" означає нуклеотидну послідовність, що регулює експресію гена, і яка зазвичай розташована на 5'-кінці гена, і опосередковує початок транскрипції РНК-полімеразою внаслідок взаємодії з певними ДНК-зв'язувальними білками.
Приклади промоторів, які є функціональними в рослинних клітинах, включають конститутивні промотори, такі як вірусні промотори, наприклад, промотор Сам355, подвійний промотор
Сам355 або рослинні промотори, такі як убіквітинові промотори, описані в ЕР 0 305 6681 5 6,528,701. Крім того, можуть бути використані промотори, які мають, наприклад, специфічну активність на певних етапах розвитку або які є індуковуваними факторами навколишнього середовища, такими як біотичний або абіотичний стрес, або які є тканиноспеціфічними. Можуть бути використані, головним чином, ті промотори, які демонструють підвищену специфічність для органа накопичування сахарози або його частин, тобто ті, які є активними, зокрема, в цьому
Зо органі накопичування сахарози або його частинах. У разі цукрових буряків, згаданим промотором може бути, наприклад, коренеспецифічний промотор або промотор, специфічний для головного (стрижневого) кореня. Фахівець у цій галузі знає їх з відомого рівня техніки: М/О 02/40687, Оптаппзв, Н. еї аї. (2006) "Таргоої рготоїег5 сайзе іїз5це 5ресіїїс депе ехргезвіоп м/йпіп
Ше віогаде гої ої зидаг Бееї", Ріапіа 224: 485-495, Мой, 5ео! АН, вї аї. (2012) "А вуевіроїаю
ЗАО1 ротоїег сопіегз зігопа гоої, Таргоої-, апа їибег-5ресіїіс ехргеззіоп іп Агарідорзів, сатої, апа роїаїо" Тгтапздепіс гезвагсй 21: 265-278. Щодо цукрової тростини, можуть бути використані стеблоспецифічні промотори, наприклад, промотори, відомі з Со5Ппи Абгайпа, Т5іоп "ІбоЇайіоп апа спагасієгігайноп ої а си!т-5ресіїйс рготоїег еіетепі їїот 5идагсапе", дієв. іеПепровзсй: Опімегзйу ої 5івІПепрозсі, 2005. Сомепаєг, С. "Зет з5ресіїйс рготоїегв їот зогупит апа таїіе г иве іп зидагсапе", дізв. теПепрозсі: 5(іеПепрозсп Опімегейу, 2008; та Мидде, 5.К. еї аї. (2013) "Маштге- вівт ехргезвіоп ої а взйепсіпд-гевзівїапі висго5е ізотегазе депе агімез5 ізотайшціовзе асситиїайоп о підп Іеме!5 іп зидагсапе, " Ріапі Віотесппоіоду дошттаї 1: 502-509).
Крім того, придатні промотори включають синтетичні промотори. Це ті промотори, які були створені методами молекулярної біології, які не зустрічаються в природі в цій конфігурації.
Синтетичний промотор являє собою мінімалістичний промотор, який містить лише один або більше вибраний(-их), визначений(-их) цис-елемент(-ів) на додаток до мінімального промотора.
Ці цис-елементи являють собою сайти зв'язування ДНК-зв'язувальних білків, таких як фактори транскрипції, і виділяються з природних промоторів, одержаних з раніше виділених цис- елементів, або виробляються технічним шляхом методами довільної рекомбінації |і вибираються за допомогою відповідних методів; у порівнянні з природним промотором унаслідок його менш складної конструкції синтетичний промотор активується лише декількома екзогенними і ендогенними факторами і, отже, регулюється більш специфічним чином. "Мінімальний промотор" або "стрижневий" опромотор являє собою нуклеотидну послідовність, яка містить сайти зв'язування для комплексу базальних факторів транскрипції і надає можливість здійснення точної ініціації транскрипції РНК-полімеразою ІІ. Характерними мотивами послідовності мінімального промотору є послідовність ТАТА, ініці«аторний елемент (Іпг), "елемент розпізнавання ТЕВІ!" (ВКЕ) і "низхідний елемент стрижневих промоторів" (ОРЕ).
У мінімального промотору ці елементи можуть зустрічатись окремо або в комбінації.
Мінімальний промотор або мотиви його послідовності є доступними, наприклад, з будь-якого 60 рослинного, бактеріального, грибкового або вірусного гена.
"Цис-елементи" являють собою нуклеотидні послідовності, розташовані на тій же самій молекулі нуклеїнової кислоти, що і нуклеотидні послідовності, що кодують білок, які підлягають експресії. Цис-елементи не мають кодувати РНК або білок, і в напрямку транскрипції можуть бути розташованими перед або після нуклеотидної послідовності, що кодує білок, яка підлягає експресії. Цис-елементи, розташовані вище нуклеотидної послідовності, що кодує білок, яка підлягає експресії, часто забезпечують необхідні зв'язувальні мотиви, зокрема, для факторів транскрипції, які залучаються як транс-діючі елементи (від лат. їап5, "за межами") на молекулярному рівні, з іншого боку, для регуляції транскрипції цього гена. Якщо, крім того, цис- елементи сприяють пригніченню транскрипції, вони називаються сайленсерами. Цис-елементи, які сприяють посиленню транскрипції, називаються енхансерами. Сукупність цис/гтранс діяльності в промоторі визначає інтенсивність, з якою РНК-полімераза здійснює транскрипцію.
Крім того, промотор може являти собою химерний промотор і/або промотор, який був модифікований цис-елементами. Модифікація промотора може також означати додаткове включення цис-елементу в промотор, який, наприклад, уже має цис-елемент природним чином.
Крім того, модифікація також включає мультимеризацію цис-елементу, зокрема мультимеризацію наявного в природі цис-елементу. У порівнянні з нативним варіантом такий модифікований промотор може мати змінені властивості, наприклад, щодо специфічності, рівня експресії або фонової активності.
Термінатори являють собою нуклеотидні послідовності на ДНК, які зазвичай відзначають кінець гена і призводять до припинення транскрипції.
Відповідно до альтернативного і/або додаткового варіанту здійснення цього винаходу нуклеотидна послідовність, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, зокрема, нуклеотидна послідовність, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/"антипортер сахарози, і нуклеотидна послідовність щонайменше одного регуляторного елементу є гетерологічними. Це означає, що вони одержані з різних видів або не зустрічаються в природі у видів у передбачуваній комбінації.
Відповідно до третього аспекту цей винахід має відношення до вектора або мобільного генетичного елементу, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка має нуклеотидну послідовність відповідно до першого аспекту цього винаходу або рекомбінантний ген відповідно
З0 до другого аспекту цього винаходу.
У цьому докумені вектор означає транспортний засіб для молекули нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу або для рекомбінантного гена відповідно до другого аспекту цього винаходу, зокрема, для перенесення чужорідної нуклеїнової кислоти в живу клітину-реципієнт. Живою клітиною-реципієнтом може бути еукаріотична клітина або прокаріотична клітина. Вектори включають, наприклад, плазміди, косміди, дріжджові штучні хромосоми (ХУАС), бактеріальні штучні хромосоми (ВАС) або штучні хромосоми РІ (РАС), а також модифіковані віруси, такі як аденовіруси, ретровіруси і фаги.
Мобільні генетичні елементи являють собою нуклеотидні послідовності, положення яких в геномі організму є змінним. Рухливі генетичні елементи включають, наприклад, автономні нуклеотидні послідовності, такі як транспозони, ретроелементи, інсерційні послідовності та інтеіни, а також інтрони групи ІЇ, інсерційні плазміди і деякі бактеріофаги, такі як фаг мю.
Відповідно до ще одного аспекту цей винахід має відношення до еукаріотичної клітини- хазяїна або прокаріотичної клітини-хазяїна, що містить як трансген молекулу нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу, містить як трансген рекомбінантний ген відповідно до другого аспекту цього винаходу, або містить як трансген вектор або мобільний генетичний елемент відповідно до третього аспекту цього винаходу. Це означає, що молекула нуклеїнової кислоти, рекомбінантний ген і/або вектор чи мобільний генетичний елемент були включені в клітину-хазяїна, наприклад, за допомогою трансформації або трансфекції.
Прикладами прокаріотичних клітин-хазяїв є бактерії роду Алштеїасієп5, Е.соїї та В.5иБійі5.
Прикладами еукаріотичних клітин-хазяїв є дріжджові клітини, такі як Засспаготусе5 або
Зеспі2гозасспаготусев, а також клітини тваринного або рослинного походження.
Відповідно до ще одного аспекту цей винахід має відношення до білків, які функціонують як білки, що являють собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози. Цей антипортер є специфічним для сахарози. Переважно цей білок кодується молекулою нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу.
Відповідно до одного з варіантів здійснення цього винаходу білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, вибирають з групи білків, які а) мають амінокислотну послідовність, що відповідає послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1;
БЮ) мають амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 8095 ідентичність з 60 амінокислотною послідовністю, що відповідає послідовності зЕО ІЮ МО: 1;
с) є гомологом, аналогом або ортологом білка, що відповідає послідовності зЕО ІО МО: 1. білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, відповідно до послідовності зЕО ІЮ МО: 1, на який також посилаються як на ВмТ512.1, має амінокислотну послідовність, довжина якої дорівнює 735 амінокислотам. Аналіз гідрофобності свідчить, що
ВУТ5Т12.1, ймовірно, має 12 гідрофобних трансмембранних доменів і велику, розташовану в центрі, гідрофільну петлю, яка з'єднує шостий і сьомий трансмембранні домени. ВмТ5Т2.1 має найвищу ідентичність послідовності транспортного білка моносахаридів в тонопласті 2
Агабрідорзі5 Іпаійапа (АїТМТ2). Ідентичність цих двох амінокислотних послідовностей складає 68 95, причому з урахуванням консервативних і напівконсервативних амінокислотних замін, вони мають 84 95 схожість послідовностей (Фіг. 1).
Відповідно до ще одного аспекту цей винахід має відношення до білків, які функціонують як протонна помпа тонопласта/"антипортер цукру. Цей білок переважно кодується молекулою нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу.
Відповідно до одного з варіантів здійснення цього винаходу білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, вибирають з групи білків, які а) мають амінокислотну послідовність, що відповідає послідовності ЗЕО ІЮО МО: 3, ЗЕО ІЮ
МО: 5 або ЗЕО ІЮ МО: 7;
БЮ) мають амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю, що відповідає послідовності зЗЕО ІЮ МО: 3, ЗЕО ІЮО МО: 5 або
ЗЕОІЮ МО: 7; с) є гомологом, аналогом або ортологом білка, що відповідає послідовності ЗЕО ІЮО МО: 3,
ЗЕО ІЮ МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 7.
На цей білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, відповідно до послідовності ЗЕО ІЮО МО: 3, також посилаються як на ВмМТ5Т1, відповідно до послідовності ЗЕО
ІО МО: 5, - як на ВмТ5Т2.2, і відповідно до послідовності ЗЕО ІЮ МО: 7, - як на ВУТ5Т3.
Оскільки білок ВмТ5Т2.1, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, виявлений у Веїа миїЇдагі5, - так само як інші білки ВМТ5Т1, ВмТ5т12.2 і ВМТ5Т3, які являють собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, - крім того має/мають ідентичність послідовностей з транспортними білками з інших рослин, вказані білки, які являють
Зо собою протонні помпи тонопласта/антипортери цукру, зокрема які являють собою протонні помпи тонопласта/антипортери сахарози, також містять білки, амінокислотна послідовність яких має щонайменше 80 95 ідентичність з амінокислотною послідовністю ЗЕО І МО: 1, БЕО ІЮ МО: 3, ЗЕО ІЮО МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 7, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 9565, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95, так само, як їх гомологи, аналоги або ортологи. У цьому контексті не має значення, у яких видів ці білки зустрічаються в природі, або те, що ці білки у природі не зустрічаються, а їх одержують, наприклад, за допомогою молекулярно-генетичних методів.
Відповідно до ще одного аспекту цей винахід має відношення до трансгенної рослинної клітини, що містить як трансген молекулу нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу, містить як трансген рекомбінантний ген відповідно до другого аспекту цього винаходу, або містить як трансген вектор або мобільний генетичний елемент відповідно до третього аспекту цього винаходу, а також до трансгенної рослини або її частин, що містить(-ять) щонайменше одну таку рослинну клітину. У цьому контексті трансгенна рослина або її частини також містить(-ять) як трансген молекулу нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу, містить(-ять) як трансген рекомбінантний ген відповідно до другого аспекту цього винаходу, або містить(-ять) як трансген вектор чи мобільний генетичний елемент відповідно до третього аспекту цього винаходу.
Відповідно до ще одного аспекту цей винахід має відношення до насіння трансгенної рослини відповідно до попереднього аспекту цього винаходу, причому це насіння і, зокрема, щонайменше ембріональна клітина цього насіння містить як трансген молекулу нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу, містить як трансген рекомбінантний ген відповідно до другого аспекту цього винаходу, або містить вектор чи мобільний генетичний елемент відповідно до третього аспекту цього винаходу.
В одному з варіантів здійснення цього винаходу згадана рослинна клітина є клітиною однодольної рослини. В іншому/додатковому варіанті здійснення цього винаходу згадана рослинна клітина є клітиною двудольної рослини. Відповідно до іншого і/або додаткового варіанту здійснення цього винаходу згадана рослинна клітина є клітиною рослини, яку вибирають з групи видів або батьківських родів, до складу якої входить Веїа миЇдагі5, Засспагит опісіпагит, Агепда 5асспагіїега, Асег засспагит і Зогдапит 5р. Відповідно, за іншим варіантом 60 здійснення цього винаходу трансгенну рослину вибирають з групи, до складу якої входить Веїа мціІдагіх, засспагит ойісіпагит, Агепда засспвагітега, Асег засспагуит і Зогуоапит 5р. Відповідно до іншого варіанту здійснення цього винаходу частини трансгенної рослини або насіння трансгенної рослини одержують з групи рослин, до складу якої входить Веїа миїЇдагі5, засспагит ойпсіпагит, Агепда засспагітега, Асег засспагит і Зогоапит 5р.
У додатковому і/або альтернативному варіанті здійснення цього винаходу трансгенна рослинна клітина, трансгенна рослина або частини трансгенної рослини, які переважно являють собою орган накопичування сахарози рослини, має(-ють) більш високу концентрацію сахарози, ніж ізогенна рослинна клітина або рослина, культивована за таких самих умов. Крім того, частини рослини можуть бути сполучені з цілою, непошкодженою рослиною або бути відокремлені від неї. Такі частини включають, наприклад, органи, тканини, клітини і насіння рослини.
Переважно більш висока концентрація сахарози заснована на більш високій концентрації сахарози у вакуолі рослини, зокрема у вакуолі щонайменше однієї клітини органу накопичування сахарози рослини. Зокрема переважно рослина з більш високою концентрацією сахарози також має підвищений вихід сахарози. У цьому документі вихід означає вихід сахарози з органу накопичування сахарози рослини по відношенню до певної площі орних земель (наприклад, гектару) або по відношенню до маси органу накопичування сахарози рослини з урахуванням вмісту води в органі накопичування сахарози рослини (нормалізація переважно здійснюється по відношенню до маси у вологому стані або маси в сухому стані).
Відповідно до ще одного аспекту цей винахід має відношення до способу одержання трансгенних рослин, причому цей спосіб включає щонайменше такі стадії: (а) введення молекули нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу, рекомбінантного гену відповідно до другого аспекту цього винаходу і/або вектора чи мобільного генетичного елементу відповідно до третього аспекту цього винаходу до щонайменше однієї клітини рослини, і (р) регенерації згаданої трансгенної рослини з рослинної клітини, одержаної на стадії а).
Відповідно до одного з варіантів здійснення цього винаходу трансгенна рослина, одержана за цим способом, здатна концентрувати сахарозу в вакуолях своїх клітин, переважно в вакуолях клітин свого органу накопичування сахарози, на більш високому рівні, аніж ізогенна контрольна
Зо рослина, культивована за таких самих умов.
Для цілей цього винаходу терміни "ізогенні рослини або контрольні рослини" або "ізогенні рослинні клітини" означають ті рослини або рослинні клітини, які були використані як вихідний матеріал для генерації трансгенних рослин або трансгенних рослинних клітин. Таким чином, геном трансгенних рослин і/або рослинних клітин, зважаючи на те, що вони є генетично модифікованими рослинами або рослинними клітинами, не є інакшим, за винятком генів, трансформованих із застосуванням генної технології і/або включених нуклеотидних послідовностей.
Відповідно до додаткового і/або альтернативного варіанту здійснення цього винаходу трансгенна рослина експресує або надекспресує нуклеотидну послідовність, яка кодує щонайменше один білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, щонайменше в одній клітині.
Введення молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, шляхом трансформації, може здійснюватись методами, які в основному відомі фахівцю в цій галузі. Наприклад, молекула нуклеїнової кислоти може бути введена в рослинні клітини зараженням рослинної тканини або рослинної клітини бактеріями вида Адгобасіегішт ішптеїасіеп5, які містять в своїй плазміді послідовність нуклеїнової кислоти, яка призначена до переносу, і яка може бути інтегрована в геном рослини. Введення із застосуванням бомбардування частинками є іншим варіантом, за яким нуклеїнову кислоту, призначену для введення в рослинну клітину, наносять на частинки золота або частинки вольфраму, які потім вистрілюють в клітини з високою швидкістю. Іншим відомим фахівцю в цій галузі методом введення нуклеїнової кислоти в рослинну клітину є трансформація протопластів, де або поліетиленгліколь додають до протопластів у присутності молекул нуклеїнової кислоти, які мають бути введені, або протопласти піддають впливу короткого імпульсу струму, завдяки чому мембрана протопластів стає тимчасово проникною для молекул нуклеїнових кислот. Методи регенерації цілих рослин з трансформованої тканини або клітин також відомі фахівцю в цій галузі з відомого рівня техніки.
Переважно молекула нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу, рекомбінантний ген відповідно до другого аспекту цього винаходу і/або вектор чи мобільний генетичний елемент відповідно до третього аспекту цього винаходу стабільно вводять в геном клітини рослини. Це означає, що після регенерації рослини перенесена послідовність бо нуклеїнової кислоти може стабільно передаватись від цієї рослини до рослини-нащадка.
Переважно трансформація і регенерація цукрового буряку здійснюються методом, описаним
Іпазеу (Ііпазеу, К. (1991) "Недепегайоп апа ігапеіоптайоп ої 5идаг Ббеєеї Бу Адгобасієтгіт їмтеїасієпв" РіІапі Тізвцие Сийиге Мапиаї! В7: 1-13, Кіпмег Асадетіс РибіївНегв5).
Трансгенез рослин може бути перевірений із застосуванням полімеразної ланцюгової реакції з використанням відповідних олігонуклеотидних праймерів. Після регенерації трансформанти можуть вирощуватись і самозапилюватись для одержання насіння в теплиці.
В одному з варіантів здійснення цього винаходу рослинними клітинами, що підлягають трансформації, є клітини однодольних рослин. В іншому варіанті здійснення цього винаходу рослинними клітинами, що підлягають трансформації, є клітини дводольних рослин. Відповідно до іншого і/або додаткового варіанту здійснення цього винаходу рослинними клітинами, що підлягають трансформації, є клітини рослини, яку вибирають з групи видів або родів рослин, від яких пішли інші рослини, до складу якої входить Веїа миЇдагіх, засспагит ойісіпагит, Агепда засопагігега, Асег засспагит і 5огдпит 5р.
Відповідно до іншого аспекту цей винахід має відношення до способів підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослини за рахунок експресії або надекспресії білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, зокрема білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, у щонайменше одній клітині рослини. Експресію або надекспресію можна забезпечити генетичним модифікуванням щонайменше однієї клітини рослини, і вона включає (1) введення молекули нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу, рекомбінантного гену відповідно до другого аспекту цього винаходу і/або вектора чи мобільного генетичного елемента відповідно до третього аспекту цього винаходу в щонайменше одну клітину рослини, викликаючи тим самим додаткову експресію або надекспресію білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, або (2) генетичне модифікування ендогенного регуляторного елемента, такого як промотор, який регулює експресію ендогенного гена, який кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, наприклад, внаслідок вставки додаткових цис-елементів або енхансерів, викликаючи тим самим підвищену експресію регульованого білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру.
Зо Експресія або надекспресія білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, зокрема білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, у щонайменше одній клітині рослини, поліпшує імпорт сахарози у вакуолі генетично модифікованої клітини. Це також підвищує концентрацію сахарози у вакуолях цієї клітини в порівнянні з клітиною ізогенної рослини.
Терміни "підвищення концентрації сахарози" або "підвищена концентрація сахарози" чи "більш висока концентрація сахарози в органі накопичування сахарози рослини" означають підвищення середньої концентрації сахарози в розрахунку на масу органу накопичування сахарози у вологому стані в порівнянні з нетрансгенною (ізогенною) контрольною рослиною, що культивується в таких самих умовах, щонайменше на 0,2 95, 0,4 95, 0,6 90, 0,8 95 або 1 95, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше на 1,2 95, 1,4 95, 1,6 95, 1,8 9о або 2 95, за варіантом, якому віддають особливу перевагу, щонайменше на 2,5 95, З У, 3,5 У, 4 Уо, 4,5 У,
БУ, бю, 7 У», 895 або на 1095, і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше на 15 95.
Для цілей цього винаходу термін "надекспресований" означає, що кількість білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру в рослині, в рослинній клітині або в її тонопластах, є вищою, ніж у ізогенній рослині, ізогенній рослинній клітині або її тонопластах.
Відповідно до одного з варіантів здійснення цього винаходу спосіб підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослини включає експресію і/або надекспресію нуклеотидної послідовності молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру відповідно до першого аспекту цього винаходу.
Для цього трансгенну рослину одержують у відповідності з описаним вище способом, де експресія та/або надекспресія білка(-ків), що являє(-ють) собою протонну(-ї) помпу(-и) тонопласта/антипортер(-и) цукру, в трансгенній рослині, як описано вище, може бути полегшена різними генетичними модифікаціями.
Наприклад, генно-інженерна конструкція, що складається з сильного промотора і нуклеотидної послідовності відповідно до першого аспекту цього винаходу, може бути введена в рослинну клітину, що підлягає трансформації. Альтернативно, ендогенний промотор гена, який кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, зокрема ген, який кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, може бо бути модифікований таким чином, що він є більш активним в трансгенній рослині, ніж в ізогенній контрольній рослині. Засобами для модифікації ендогенного промотора можуть бути, наприклад, ефекторні нуклеази, подібні до активаторів транскрипції (ТАГЕМ), або нуклеази цинкового пальця. Альтернативно, додаткові копії ендогенного гена, який кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, зокрема ендогенного гена, який кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, у тому числі його природний промотор, можуть бути введені в рослинну клітину.
В альтернативному і/або додатковому варіанті здійснення цього винаходу білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, вибирають з групи, до складу якої входять білки ВМТ5Т2.1, їхні гомологи, аналоги і ортологи.
За іншим аспектом цей винахід має відношення до способів виявлення рослини, придатної для утворення підвищеної концентрації сахарози в її органі накопичування сахарози.
Відповідно до одного з варіантів здійснення цього винаходу рослини, які мають бути виявлені, можуть бути піддані виявленню за допомогою маркерів. З цією метою ДНК кожної рослини, що підлягає перевірці, ізолюють, і піддають ланцюговій реакції полімеризації (РСК) з використанням відповідних олігонуклеотидних праймерів, завдяки чому можуть бути виявлені ті рослини, які, унаслідок організації їх генетичного матеріалу, є придатними для утворення підвищеної концентрації сахарози в їх органах накопичування сахарози, із застосуванням аналізу продуктів РОК засобами гель-хроматографії або виявленням флуоресценції, як в КТ-
РСК (полімеразна ланцюгова реакція у реальному часі). Відповідно до додаткового і/або альтернативного варіанту здійснення цього винаходу визначення організації генетичного матеріалу рослини, що підлягає виявленню, може здійснюватись з використанням поліморфізму рестрикційних фрагментів, де виділену ДНК гідролізують різними рестрикційними ендонуклеазами, фрагменти рестрикції відокремлюють засобами гель-хроматографії, піддають блотингу, і гібридизують з відповідним зондом. Приклади олігонуклеотидів, придатних для виявлення трансгенних рослин, придатних для утворення підвищеної концентрації сахарози в своєму органі накопичування сахарози, оскільки вони експресують або надекспресують нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2, можуть бути вибирані з групи олігонуклеотидів, до складу якої входять послідовності зХЕО ІЮ МО: 15-56 ІЮ МО: 26. Фахівець в цій галузі знає, як забезпечити відповідні олігонуклеотиди також для гомологів, аналогів або ортологів
Ко) послідовності зЕО ІЮ МО: 2.
Відповідно до додаткового і/або альтернативного варіанту здійснення цього винаходу виявлення рослин, придатних для утворення підвищеної концентрації сахарози в їх органі накопичування сахарози, здійснюють не на основі організації їх генетичного матеріалу, а за експресією їх білків, які являють собою протонні помпи тонопласта/антипортери сахарози. Це може мати місце, наприклад, на рівні тЕМА шляхом визначення кількості теМА дезоксирибонуклеотидних послідовностей, які кодують білки, які являють собою протонні помпи тонопласта/антипортери цукру, зокрема дезоксирибонуклеотидних послідовностей, які кодують білки, які являють собою протонні помпи тонопласта/антипортери сахарози, наприклад, за допомогою "кількісної РОК у реальному часі". Визначення більшої кількості ТЕМА, яка кодує щонайменше один описаний вище білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру в рослині, в рослинній тканині або рослинній клітині, зокрема в тканині або клітині органу накопичування сахарози рослини, по відношенню до порівняльної рослини того ж виду або її частини, чи по відношенню до іншої рослинної тканини або рослинної клітини тієї ж самої рослини, яка не є частиною органу накопичування сахарози рослини, вважається доказом придатності рослини до утворення підвищеної концентрації сахарози в її органі накопичування сахарози.
Ідентифікація рослин, придатних для утворення підвищеної концентрації сахарози в їх органі накопичування сахарози, може здійснюватись також за допомогою визначення кількості білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, зокрема білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, в частині рослини. Для цього використовують так званий метод Вестерн-блот, в якому електрофоретично розділені білки частини рослини, за варіантом, якому віддають перевагу, вакуолей, за варіантом, якому віддають особливу перевагу, мембрани вакуолей цієї частини, інкубують з антитілом, специфічним для одного або більше описаного(-их) вище білка(-ів), що являє(-ють) собою протонну(-ї) помпу(-и) тонопласта/антипортер(-и) цукру. За допомогою вторинного антитіла, яке зв'язує антитіло, специфічне для одного або більше описаного(-их) вище білкас-ів), що являє(- ють) собою протонну(-ї) помпу(-и) тонопласта/антипортер(-и) цукру, і яке має виявлювану мітку, кількість білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, зокрема білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, може бути визначена в бо частині рослини, і можуть бути виявлені ті рослини, які є придатними для утворення підвищеної концентрації сахарози в їх органі накопичування сахарози. Визначення більшої кількості щонайменше одного білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози, в рослині, в частині рослини або в рослинній клітині, зокрема в тканині або клітині органа накопичування сахарози рослини, по відношенню до порівняльної рослини того ж виду або її частини, чи по відношенню до іншої рослинної тканини або рослинної клітини тієї ж самої рослини, яка не є частиною органа накопичування сахарози рослини, вважається доказом придатності рослини до утворення підвищеної концентрації сахарози в її органі накопичування сахарози.
Отже, у цьому винаході охоплені також рослини, виявлені за допомогою вищезазначеного способу, які є придатними для утворення підвищеної концентрації сахарози в їх органі накопичування сахарози. Відповідно до ще одного аспекту цей винахід має відношення до олігонуклеотидів, які є придатними для використання як молекулярні маркери для діагностичного виявлення молекули нуклеїнової кислоти відповідно до першого аспекту цього винаходу.
Відповідно до одного з варіантів здійснення цього винаходу щонайменше один з придатних олігонуклеотидів вибирають з групи, до складу якої входять олігонуклеотиди, що відповідають послідовностям 5ЕО ІЮ МО: 15, 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІО МО: 17, 5ЕО ІО МО: 18, 5ЕО ІО МО: 19,
ЗЕО ІЮО МО: 20, 5ЕО ІО МО: 21, 5БЕО ІО МО: 22, 5ЕО ІО МО: 23, 5ЕО ІЮ МО: 24, 5ЕО ІЮО МО: 25 і
ЗЕО ІЮ МО: 26. Вони можуть бути використані як молекулярні маркери для діагностичного виявлення молекули нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 2.
Відповідно до іншого аспекту цей винахід має відношення до антитіл, які є діагностичними для білка, який функціонує як протонна помпа тонопласта/антипортер цукру, за варіантом, якому віддають перевагу, як протонна помпа тонопласта/антипортер сахарози.
В одному з варіантів здійснення цього винаходу згадане діагностичне антитіло являє собою моноклональне антитіло. В альтернативному варіанті здійснення цього винаходу згадане діагностичне антитіло є частиною поліклональної антисироватки.
В додатковому і/або альтернативному варіанті здійснення цього винаходу згадане діагностичне антитіло або поліклональна антисироватка є специфічним(-ою) для конкретного білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, такого як білок, який
Зо являє собою протонну помпу тонопласталантипортер сахарози. Переважно згадане діагностичне антитіло розпізнає і зв'язує антигенну детермінанту на петлі між шостим і сьомим трансмембранними доменами білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер сахарози.
Відповідно до ще одного аспекту цей винахід має відношення до застосування білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, для підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослини.
Відповідно до одного з варіантів здійснення цього винаходу використання білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, для підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослини включає підвищення концентрації сахарози внаслідок експресії або надекспресії молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/"антипортер цукру. Молекула нуклеїнової кислоти переважно містить: і молекулу нуклеїнової кислоти, яка має нуклеотидну послідовність, що відповідає послідовностям 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 6, 5ЕБЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІО МО: 10, ЗЕО
ІЮ МО: 12 або 5ЕО ІЮ МО: 14, чи має нуклеотидну послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю з однією з нуклеотидних послідовностей, що відповідає послідовностям ЗЕО ІЮ
МО: 2, ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 8, ЗЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО ІЮО МО: 12 або 5ЕО ІЮ
МО: 14; і. молекулу нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка є комплементарною одній з нуклеотидних послідовностей, що відповідає послідовностям, наведеним у пункті і.: ії. молекулу нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з однією з молекул нуклеїнових кислот, що відповідає послідовностям, наведеним у пунктах і. або ії.; або ім. молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, що відповідає послідовностям ЗЕО ІО МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІЮ
МО: 7, ЗЕБЕО Ір МО: 9, 5ЕБЕО ІЮ МО: 11 або 5ЕО ІЮ МО: 13, чи кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю з однією з амінокислотних послідовностей, що відповідає послідовностям ЗЕО ІО МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІО МО: 5, 5БЕО
ІО МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 9, ЗЕО ІЮ МО: 11 або ЗЕО ІЮ МО: 13.
Молекула нуклеїнової кислоти відповідно до послідовності зЕО ІЮ МО: 2 кодує білок, який бо являє собою протонну помпу тонопласта/"антипортер цукру Т5Т2.1 Веїа мцідагі5, який має амінокислотну послідовність відповідно до послідовності зЕО ІЮ МО: 1.
Молекула нуклеїнової кислоти відповідно до послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4 кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру Т5ЗТ1 Веїа уцідагієх, і який має амінокислотну послідовність відповідно до послідовності зЕО ІЮО МО: 3.
Молекула нуклеїнової кислоти відповідно до послідовності ЗЕО ІЮ МО: 6 кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру Т512.2 Веїа миїЇдагі5, і який має амінокислотну послідовність відповідно до послідовності зЕО ІЮО МО: 5.
Молекула нуклеїнової кислоти відповідно до послідовності ЗЕО ІЮ МО: 8 кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру Т5Т3 Веїа муцдагіх, і який має амінокислотну послідовність відповідно до послідовності зЕО ІЮ МО: 7.
Молекула нуклеїнової кислоти відповідно до послідовності «ЕО ІЮ МО: 10 кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру ТМТ1 Агарідорбвів ІПаїїапа, і який має амінокислотну послідовність відповідно до послідовності зЕО ІЮ МО: 9.
Молекула нуклеїнової кислоти відповідно до послідовності «ЕО ІЮ МО: 12 кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру ТМТ2 Агабідорбзів ІПаїйїапа, який має амінокислотну послідовність відповідно до послідовності зЕО ІЮ МО: 11.
Молекула нуклеїнової кислоти відповідно до послідовності «ЕО ІЮ МО: 14 кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру ТМТЗ Агабідорбвів ІПаїїапа, і який має амінокислотну послідовність відповідно до послідовності зЕО ІЮ МО: 13.
Внаслідок експресії і/або надекспресії в рослині щонайменше однієї з нуклеотидних послідовностей, зазначених в пунктах і.-ім., після її включення в щонайменше одну клітину рослини, кількість білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, в вакуолі цієї рослини може бути збільшена, особливо в мембранах вакуолей органів накопичування сахарози цієї рослини, унаслідок чого більша кількість сахарози може транспортуватись у вакуолі рослини, і концентрація сахарози в органі накопичування сахарози рослини, у порівнянні з ізогенною контрольною рослиною, культивованою в таких самих умовах, підвищується. Це дозволяє підвищити вихід сахарози на рослину, на орган накопичування сахарози та/або на площу землі.
Цей винахід далі буде проілюстрованим за допомогою прикладів здійснення цього винаходу,
Зо де ці приклади здійснення цього винаходу призначені тільки для ілюстративних цілей, і не обмежують обсяг цього винаходу. Обсяг цього винаходу визначається виключно формулою винаходу. Термін, наведений в однині, не слід розуміти як такий, що визначає число.
Приклади здійснення цього винаходу ясно показують, що Т512.1 Веїа миЇдагіє являє собою мембранний білок тонопласту, який може високоспецифічним чином імпортувати сахарозу в вакуолі рослинної клітини як білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру.
Приклад 1: Рослинний матеріал і умови вирощування
Для описаних нижче досліджень були використані сорти цукрових буряків "ВеПадоппа КМУЗ" і "Вгідадіег". Насіння буряку сорту "ВеМйадоппа КУУ5" було надане компанією КУУ5 Зааї Ас,
Еіпреск, ОЕ, насіння буряку сорту "Вгідадіег" було закуплене у місцевого насіннєвого підприємства.
Крім того, були використані рослини і рослинні клітини Місоїйапа Бепіпатіапа і Агабідорвів
Іаійапа. Ці рослини вирощували у вегетаційних камерах на стандартному субстраті ЕЮ 73, одержаному від компанії Еіппейзегаде-апа НитивмеКке Себг. Раїгег СтрН 8. Со. КО, з циклом чергування світла і темряви: 10 год. світло і 14 год. темряви, при температурі 22 "С і освітленні 125 мкмоль квантів мс".
Подвійний нокаутований мутант Т-ДНК Агабідорві5 АН5е1-2 був описаний у відомому рівні техніки (ММоптії, А. еї а!. (2006) "МоІесшціаг ідепійісайоп апа рпузіоіодіса! спагасієгігайоп ої а помеї топозасснагіде ігапзропег їот Агарідорзів іплоїмед іп масисоіаг зидаг ігаперогі" Ріапі Сеї 18, 3476-3490). Для випробувань з вирощування з 2-дезоксиглюкозою, насіння Агабідорвів зі стерилізованою поверхнею висівали в чашки з напівконцентрованим агаризованим середовищем Мурасіге-Скуга (1/2М5), як описано (Кеїзег, «4. еї аї. (2004) "МоїІесшаг рпузіоіодісаї! апаїувів ої Ше їмо ріавійдіс АТР/АОР мапзропегв їот Агарідорвів", Ріапі Рпузіої!. 136: 3524-3536).
Відбір рослин, надекспресуючих ЛОВО:ВУТ5Т2.1-СЕР та 355:ВМТ5Т1, здійснювали на чашках з напівконцентрованим агаризованим середовищем Мурасіге-Скуга (1/2М5), що містили 50 мкг/мл гігроміцину або 40 мкг/мл канаміцину.
Приклад 2: Кількісне визначення цукрів в тканинах цукрового буряку
Тканину головного (стрижневого) кореня цукрового буряку збирали з використанням овочерізки, негайно заморожували в рідкому азоті, і зберігали до кількісного визначення глюкози бо при температурі -80 "С. Для визначення вмісту цукру рослинну тканину подрібнюють в рідкому азоті, і 50 мкг подрібненої тканини двічі екстрагують 80 95 етанолом протягом 20 хв при температурі 80 "С. Супернатанти об'єднують, і випарюють з використанням брееймас (компанія
Еррепаоп, Натбриго, Септапу). Висушені цукри розчиняють у воді, і здійснюють кількісне визначення із застосуванням НАДФ-ферментативного методу аналізу на планшет-рідері, як описано (Вегодітеуег, Н.О. апа Веті, Е. (1974) "Мемйоаз ої Епгутаїййс Апаїувів", мої. З, Вегатеуег",
Н.О. єд., Мепад Спетіє Мем/ МоїК, 5. 1176-1117; І еє, У.0. (1972) "0-Маппозідазе, рД-аІнсовідазе, апа р-даіасіовідазе їот 5угеєвї аїтопа етиївіоп" Меїйод5 Епгутої. 28: 699-702).
Приклад 3: Аналіз експресії генів
Відносне накопичення тЕМА здійснювали за допомогою назерн-блотингу, як описано (Уоипа, В. еї аї. (2011) "Агарідорвзів писієозіде пуагоїазез іпмоїмеа іп іпігасеїІшШаг апа ехігасеїІшаг дедгадацйоп ої ригіпев" Ріапі 3. 65: 703-711). Кількісна КТ-РСЕ була проведена, як описано вище (Гетосі М. еї а! (2005) "Ідепійсайноп апа сНагасієгігайоп ої а помеї ріавійдіс адепіпе писієоїіде ипіропег їот боїапит їшреговит" у). ВіоЇ. Снет. 280: 17992-18000). Геноспецифічні праймери, які були використані, перелічені в Таблиці 1.
Таблиця 1
Геноспецифічні праймери для ампліфікації нуклеотидних послідовностей, що кодують
ВУТ5Тт1 і ВмТ5тТ2.1, а також для кількісної РСК для аналізу експресії чотирьох паралогічних генів
Т5Т Веїа миїЇдагів.
ЗЕ Ю МО:
СООБСАСААОТТТОТАСААААААВСА
ВУТеТІ Оу щу 1 вОСТТААТОААвОоОТОоСТОоТОСсТТ
ООБОАССАСТ ТОТАСААВАААЛОС
ВУТБ ТА тем р ! 16 таоотАСТеСОоССсТТАССООСТТо
БУТОТа МОХ ОСТОСАБАТСАСТОСАВСАЄТАТТАЄ 0000000 | 17
БУТеТ2 тем Храї 0 ТОТАБАЄТООСТТОСТТОТСТТОСАСС їв дРСКМТВТ ОСТ ТОСТАТОАВОСТСАТОСА 18 есе ЩІ ССТТАССООСТТСТААСТОТТТАСО аРСНЛМТО121 000 АЛАБАТОААСАССАСТОТОТАТО аРсветвта ПТ ОтТСАТСАЄТООСТТОоСТТОТеТТо ярої 2.2 ГАЛАСАТСАССАСТАСТОТОСАСО
ЧРокгейт5і2 271 ТСАСТТОТОСТТОТСТ ТСАСААОС М аРовВЯ (ТСТАСТІСТОСТОСТІТЄТСАТОВ ТСТАСТІСТОСТОСТІТОТСАТОЄ
РОВУ ТТОАОСТТСАОСТТОССТТОСА С ши:
Ге уеі ва вх ССАСАТІВСТСТСААСІ ОСТ 0000000
Вей те 00 ч теу ЩІ ОТОСТААССТІВОСАСОВОТО ТОСТААССТТООСАССОоСТТО
Приклад 4: Виділення вакуолей і тонопласту з тканини головного (стрижневого) кореню
Вакуолі виділяли за методом Геїдн і Вгапіоп (І еідп, К.А. апа Вгапіоп, 0. (1976) "ІзоЇайоп ої
Масиоіез їтот Воої 5іогаде Тіввиє ої Веїа мцдагів" І. РіІапі Рнузіо! 58: 656-662) з такими змінами: тканину головного (стрижневого) кореня розрізали на шматочки товщиною від 0,1 мм до 0,2 мм за допомогою овочерізки і відразу ж інкубували в збірному живильному середовищі (1 М розчин сорбіту, 1 мМ розчин ОТТ (дитіотреїтол), 5 мМ розчин ЕОТА (етилендіамінтетраоцтова кислота), мМ розчин Тгтгі5-НСІЇ, рН 7,6) при кімнатній температурі. Після цього тонкі зрізи тканини головного (стрижневого) кореня подрібнювали лезом бритви для гоління в збірному живильному середовищі (1 М розчин сорбіту, 1 мМ розчин ОТТ, 5 мМ розчин ЕОТА, 50 мМ розчин Тті5-НОЇ, рН 7,6), фільтрували через сито з нержавіючої сталі (розмір чарунки сита: 100 мкм), і осаджували центрифугуванням (2000х9, 20 хв, 42С). Осад ресуспендували в збірному живильному середовищі 3095 розчином Мусодепл (компанія Ахіз-ЗНпівій СстрнН, Неїаеїбега,
Септапу), і переносили в 17 мл центрифужні пробірки (ШкгасСієаг, компанія ВесКітап). У процесі подальшого центрифугування у центрифузі з бакет-ротором (1500х9, 15 хв, 8 "С) Мусодеп; утворює градієнт щільності, а вакуолі плавають на верхній фазі градієнта щільності.
Мембрани вакуолей виділяли, як описано у відомому рівні техніки (З5спиці2е, М.Х. еї аї. (2012) "Со ассіїтайоп іпдисе спнападез іп Агарідорвзів Ююпоріаві ргоїєїп арипдапсе апа асіїмну апа ацегв рпозрпогуїайоп ої опоріабї топозасспагіде ШМапз5ропегв", Ріапі У. 69: 529-541). Активність а- манозидази в оброблених ультразвуком вакуолях здійснювалась, як описано в інших джерелах (ВоїІег, Т. апа Кепаеє, Н. (1979) "Нуагоїуїйс епгутев5 іп Ше сепігтаІ! масиоіє ої ріапі сеїІв" Ріапі
РНузіо! 63: 1123-1132; І еє, У.0. (1972) "0-Мапповзідазе, р-діисовзідазе, апа р-даіасіозідаве тот вмевї аїтопа етиївіоп" Меїйоа5 Епгутої. 28: 699-702).
Приклад 5: Рідинна хроматографія і тандемна мас-спектрометрія
Осад виділених тонопластів рослин віком 2 місяці або 5 місяців розчинили в буфері (4 95 5О5 (додецилсульфат натрію), 50 мМ розчин МНАНСО») в концентрації 1 мкг/мл. Розчинені білки осаджували протягом ночі при температурі -20 "С в 80 95 ацетоні, і потім обробляли, як описано МіапіІнациз (МайіНашив, Т. еї аї. (2011) "СОцапійайме зпоїдип ргоїєотісв ивіпд а ипітопт 15М-
Іабеїієд в5іапаага юю топійг ргоїєоте дупатісв іп їїте сошзе ехрегітепів гемеаїЇ5 пему іпвіднів іп
Те Неаї зігез55 гезропзе ої Спіатудотопаз геіпНагайїії, " Мої. СеїЇ. Ргоїєотісв 10: М110 004739).
Екстраговані пептиди ресуспендували у 200 мкл буферу (2 95 ацетонітрилу, 0,4 95 оцтової кислоти).
Зразки (3 мкл кожен) екстрагованих пептидів піддавали рідинній хроматографії-тандемній мас-спектрометрії (аналіз ГС-М5Б/М5). Хроматографічне відокремлення здійснювали на хроматографічній системі папоАдийу ШРІС (компанія УМаїег5, Е5спрогп, Септптапу) із застосуванням колонки "Зуттеїгу С18 їгар соїштп" (розмір частинок 5 мм, розмір колонки 180 мкмх20 мм) і колонки ВЕН 130 С18 (розмір частинок 1,7 мкм, розмір колонки 75 ммх150 мм).
Елюентом слугував подвійний градієнт, спочатку від 100 95 буферу А (0,4 95 оцтової кислоти,
Зо 1 95 2-пропанолу, 2 95 ацетонітрилу) до 40 95 буферу В (0,4 95 оцтової кислоти, 1 95 2-пропанолу, 90 95 ацетонітрилу) протягом 2 год. або З год., потім до 90 95 буферу В протягом 5 хв, і, нарешті, 15 хв 9095 буфер В. Колонку в кінці урівноважували протягом 15 хв 100 95 буфером А.
Гібридний мас-спектрометр ТО ХІ-Огрігар (компанія Тпегтозсіепійіс, Натригод, Септпапу) працював в режимі керування даними з циклом повного сканування мас-спектра 300-1500 т/2 (Огбйгар) при встановленій роздільній здатності 60000 при 400 т/7 з подальшими сімома послідовними залежними від даних скануваннями М52 (ТО) найбільш інтенсивних іонів.
Індивідуально заряджені іони були виключені з аналізу М5-, а іони- попередники для аналізу
М52 були занесені на 20 с до списку виключень. Кожен зразок аналізували в трьох повторностях.
Білки виявляли з використанням програмного забезпечення МахОцапі і Апаготеда Зеагсп
Епдіпе (Сох, у. апа Мапп, М. (2008) "МахОцапі епабіеє5 підн реріїде ідепійісайоп гаїев, іпаїмідцаїйеа р.р.Б.--апде таб5 ассигасіеєє апа ргоївоте-міде ргоївєїп диапійісайоп". Маї.
ВіоїесНнпої. 26: 1367-72) у базі даних білків цукрових буряків, створеній в лабораторії одного з винахідників.
Приклад 6: Генно-інженерні конструкції нуклеїнової кислоти
Комплементарну ДНК (кДНК) Веїа миїЇдагі5 одержали внаслідок зворотної транскрипції РНК, виділеної з головного (стрижневого) кореня або листя. Всі полімеразні ланцюгові реакції (РСК) здійснювали з ДНК-полдімеразою РПшзвіоп НЕ (компанія Тпегто зсіепііс).
Гібридну генно-інженерну конструкцію рОвоО:ВиТЗТ1-ЗЕР одержали з використанням вектора рОвС-сЕР-Юеві (Стеїеп єї аї. (2010) "А цибідийіпй-10 рготоїєг-Ббазей месіог зеї г
ТПиогезсепі ргоївїіп їададіпо Тасіїнатез Тетрогаї! віабіїйу апа паїїме ргоївїп дівійршіоп іп їШшапвієпі апа віарбіє ехргез5іоп віцаїев", Ріапі У. 64: 355-365). З цією метою кКДНК ВмТ5Т1 ампліфікували, і стоп-кодон видалили із застосуванням полімеразної ланцюгової реакції з використанням праймерів ВмТ5Т1, що містять сайти анкві апа анвВ2г. Продукт ампліфікації клонували із застосуванням реакції ВР в РООМКАЕО (компанія Іпмігодеп, НеїдеїІрего, Сегтапу), з подальшою реакцією І ЕЕ в РОВС-СЕР-Оеві.
Генно-інженерну конструкцію ЛЮВО:ВУТ5Т2.1-СЕР одержували таким чином: повну відкриту рамку зчитування гена ВУиТ512.1 ампліфікували З праймерами
ВмиТ5Т2.1йу Хпо!/ВмТ5Т2.1гем Храі. Одержаний продукт полімеразної ланцюгової реакції бо гідролізували з використанням Хпої! та Хваї, і лігували в вектор РОВС-сСсЕР-Оеві, відкритий з використанням ХпоЇ і Зре! (Сгеїеп еї аїІ. (2010)3). Одержана таким чином генно-інженерна конструкція містить ген Баг, наслідком присутності якого в трансформованих рослинах є стійкість до гербіциду Вавзіа. Після цього повну нуклеотидну послідовність, що кодує ВмМТ5Т2.1-
СЕР, вирізали з цієї генно-інженерної конструкції з використанням Хпо1/РЗІІ, і вводили у вектор рОвмМ-пиЕР-Юезі, відповідно відкритий з використанням ХпоЇ і Розі, які опосередковують стійкість трансформованих рослин до гігроміцину. Наслідком гідролізу РОВМ-ПУЕР Оеві з використанням Хпо1/РбїЇ було повне видалення послідовності ПУЕР і властивостей системи рекомбінації типу "Саїем"ау" цільового вектора, так що він є придатним для трансформації подвійних нокаутованих мутантів Ай5И -2 із застосуванням агробактерій (Сіоцоп, 5.9., Вепі, А.Р. (1998) "Ріога! аїр: а вітрійієй теїной ог Адгобасіеєегійт-тедіаїей ігапеіоптайоп ої Агарідорвів
ІШаїїапа" Ріапі У. 16: 735-743). Нуклеотидні послідовності всіх одержаних генно-інженерних конструкцій були перевірені із застосуванням аналізу послідовностей.
Приклад 7: Дослідження вакуолей трансформованих рослин Місопйапа бепіпатіпа методом локальної фіксації потенціала
Для дослідження тимчасової надекспресії білків-транспортерів цукру (ВмТ5Т1-ОСЕР і
ВиТ5тТ2.1-СЕР) їх мітили на С-кінцях зеленим флуоресцентним білком (СЕР) або лише СЕР під контролем промотора убіквітину (РОВО10) в мезофільних клітинах М. репіпатіапа за способом агроінфільтрації 5-7-тижневих рослин, описаним 2007 року Гаї еї а! (Іа еїаї. (2007) "Іп ріапіа
АКТ2 вибрипіїв сопвзійшіе а рН апа Саг--вепвййме іпжага гесійуіпд КасНпаппе!" Ріапіа, 225: 1179- 1191). На противагу способу, описаному у відомому рівні техніки, штам Адгобасіегійт
Іштеїасіеп5 СМ3101 був використаний як носій для нуклеотидної послідовності, що кодує ген 19К, ії для відповідних генно-інженерних конструкцій білка-транспортера цукру/СЕР. Бактерії культивували протягом ночі в 5 мл середовища УЕВ, центрифугировали при 8000х д протягом 1 хв при кімнатній температурі, і двічі промивали Адготіх (і аїх еї а. (2007)). Бактеріальні клітини ресуспендували в З мл Адготіх, і витримували протягом 2-3 год. при температурі 287С у темряві. Для інфільтрації 17 мл суспензії з Адгобрасіега, що містить 19К, змішували з 1 мл суспензії агробактерій, що містить РОВО:ВУТ5ЗТ1-СЕР, рРОВО:ВУТ512.1 СЕР або рОвоО:сОЕР, і додавали 2 мл Адготіх.
Через два дні після агроінфільтрації протопласти мезофільних клітин виділили по суті як
Зо описано Веупйі еї аї. (Веупйі, О. еї а! (2009) "Тпе т0ц2 тшацйоп іп Же та/)ог масиоіаг сайоп спаппеї
ТРСЯ сопієїв ЮіІегапсе о іппібйогу Іштіпа! саїісішт", Ріапі 9). 58: 715-723). Після ферментної інкубації зрізів листя протягом 1 год. вивільнені протопласти промивали 500 мМ розчином сорбіту та 1 мМ розчином Сасі». Вакуолі вивільняли безпосередньо в камері для локальної фіксації потенціала з протопластів внаслідок обробки їх лізисним буфером з осмолярністю 280 мОсмольхкг" (10 мМ розчин ЕСТА, 10 мМ розчин Нерез/Ттгі5, рН 7,4; осмолярність встановлена з використанням Ю-сорбіту). Макроскопічні струми вимірювали в "цільновакуолярній" конфігурації (Веупйі, 0. еї а. (2009) "Тпе т0и2 тшайоп іп (Же тайог масциоіаг сайоп спаппе! ТРС1 соп'іегв5 Іегапсе о іппіріогу Іштіпаї! саісіит" Ріапі 9. 58: 715-723); і піддавали низькочастотному фільтруванню при частоті 100 Гц. Розчини у ванні і піпетці були ідентичні за своїм складом (100
ММ розчин КСІ, 2 мМ розчин Масі», 1 мм розчин Сасі», 450-500 Осмольхкг', встановлена за допомогою ЮО-сорбіту), за винятком рН. Значення рН розчину у ванні було встановлене на рівні 7,4 (НЕРЕЗЛТі5), а значення рН розчину в піпетці було встановлене на рівні 5,5 (Мез/Ігів5). Для вимірювання протонного потоку, індукованого цукром, на цитоплазматичний бік вакуолярної мембрани додавали глюкозу або сахарозу, кожну в кінцевій концентрації 50 мМ.
Приклад 8: Аналіз системи білкового обміну вакуолярних мембран клітин головного (стрижневого) кореня цукрового буряку
Для аналізу системи білкового обміну вакуолярної мембрани клітин головного (стрижневого) кореня цукрових буряків, виділяли вакуолі клітин головного (стрижневого) кореня цукрового буряку (Веїа миЇдагіє) сорту "Вейадоппа КМУ5" на п'ятому місяці росту, і вакуолярні мембрани збагачували високошвидкісним центрифугуванням. Гідрофобні мембранні білки осаджували ацетоном з декілька разів промитої фракції тонопластів, після чого ресуспендували в розчині сечовини (8 М розчин сечовини), і піддавали триптичному гідролізу перед проведенням І С-М5/М5 аналізу.
У кожному зі збагачених препаратів тонопластів було ідентифіковано в цілому приблизно 400 різних білків. Один з цих білків, який позначений у цьому описі як ВмТ51Т2.1 (послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1), був присутній у великих кількостях у всіх незалежно одержаних препаратах, мав сігнатуру білка-транспортера цукру ФІММ5ТАСІ-(ИММЕЗАСІ-(ЗН)-(ВОЕ)-
ІНММ5ЗАЇ-ОЕІ-(«Т0)-ІНММЕМУУ АІ-а-В-І(АКІ-х(4,6)-ІОЗТА|; Мо РБЗО0О216 по базі даних РКОЗІТЕ, пер://ргозіге.ехразу.огод/), і мав найвищий ступінь подібності до вакуолярного білка-транспортера бо моносахаридів ТМТ2 Агарідорзів ІПаїїапа (Фіг. 1)
Приклад 9: Ген білків-транспортерів цукру в тонопласті в геномі цукрових буряків
Під час дослідження геному В.миЇдагіз були ідентифіковані 4 паралогічні гени, які кодують білки-транспортери цукру в тонопласті. Філогенетичний аналіз (Фіг. 2) показав, що білки-транспортери цукру ВмиТ5Т1 і ВмТ5Т3 найтісніше пов'язані з ортологічними генами АЕТМТ1 або АІТМТ3З Агабідорзвів, тоді як ВмТ5Т2.1 і ВмТ512.2, дуже схожа пара генів, мають найбільшу схожість послідовності з ортологом АЇТМТ2 Агабідорзів (Фіг. 1). Амінокислотна послідовність
ВмиТ5тТ2.1 відповідає приблизно на 68 95 послідовності АЕТМТ2, і їх схожість становить 84 95 (Фіг. 1).
Приклад 10: Субклітинна локалізація ВМТ 512.1
Субклітинну локалізацію ВуУТ5тТ2.1 вивчали у подвійних нокаутованих мутантів АК5И -2, стабільно трансформованих РОВО:ВУТ5Т2.1-СЕР.
Виділення протопластів з мезофільних клітин листя і вивільнення вакуолей здійснювали відомим способом (ХМоо, 5.0. еї аї. (2007) "Агарідорзіз5 тезорпуї! ргоїоріабіб: а мегзаце сеї вувівт ог ігапвівпі депе ехргезвіоп апаїувів", Маї. Ргоїосої 1565-1572).
Флуоресцентні мікроскопічні зображення одержували за допомогою конфокального лазерного сканувального мікроскопа (Іеіса ТО5 5Р5, компанія І еіса Місгозуєіетв5, УмеїліІаг,
Септапу). Знімки всіх зображень були зроблені з використанням ГІ еіса НСХ РІ АРО 63Хх/1.20м/ тоїсСОке. С5 Іеп5. Обробку зображень виконували з використанням програмного забезпечення
І віса Арріїсайоп Зийе Адмапсеай Ріпогезсепсе І пе зоймаге.
Після клонування повної тЕеМА ВуТ5Т2.1 субклітинну локалізацію білка визначали шляхом стабільної експресії гібридного білка ВмТ512.1-СЕР в Агарідорвзі5. Зелена флуоресценція, яка спостерігалась в мезофільних клітинах листя мутантів Агарідорз5іб5, що стабільно експресують ВмТ52.1-СЕР, показала, що гібридний білок локалізувався в мембрані вакуолей, які тісно оточували хлоропласти.
Із застосуванням ферментного гідролізу мезофільних тканин рослин, що експресують
ВиТ5Т2.1-СЕР, одержали окремі інтактні протопласти. Подальша гіпоосмотична обробка цих протопластів призвела до вивільнення стабільних зелених флуоресцентних вакуолей, чим була підтверджена локалізація ВмТ5Т2.1 СЕР в тоноплаєсті.
Приклад 11: Кореляція експресії ВмТ5Т2.1 і концентрації сахарози в головних
Зо (стрижневих) коренях цукрових буряків
Для встановлення можливої кореляції між експресією ВмТ512.1 в головних (стрижневих) коренях цукрових буряків і концентрацією сахарози цукрових буряків визначали експресію гена
ВмиТ5т12.1 в цукрових буряках сортів "ВеПадоппа КУУ5" і "Вгідадієег".
Сорт "ВеМПМадоппа КУУ5" відомий як сорт цукрових буряків, який має високу концентрацію сахарози, і вже через два місяці після посадки має концентрацію сахарози близько 160 мкмольхг! сирої маси в головних (стрижневих) коренях (Фіг. 3). Ця висока концентрація сахарози збільшилась протягом наступних трьох місяців розвитку, досягнувши приблизно 450 мкмольхг! сирої маси. Це відповідає триразовому збільшенню порівняно з двомісячними головними (стрижневими) коренями.
На противагу цьому головні (стрижневі) корені сорту "Вгідадіег" містили менше 70 мкмоль сахарози на грам сирої маси після двох місяців вирощування, і вони накопичили лише приблизно 195 мкмоль сахарози на грам сирої маси протягом наступних трьох місяців (Фіг. 3).
При порівнянні концентрації сахарози листя і головних (стрижневих) коренів у головних (стрижневих) коренях був виявлений приблизно у 30 разів більш високий вміст сахарози ніж у листях, тоді як концентрація глюкози в листях була приблизно в 80 разів вище ніж у головних (стрижневих) коренях.
Відмінності в накопиченні сахарози між різними сортами цукрових буряків також відбивалися на кількості ТЕМА, що кодує ВмТ512.1 (фіг. 4). І в головних (стрижневих) коренях сорту "ВейПадоппа КУУ5", і в сорту "Вгідадіеєг" кількість ТЕМА для всіх чотирьох паралогічних білків-транспортерів цукру після двох місяців вирощування була низькою.
Ще через місяць зростання і розвитку кількість ТЕМА ВмТ5Т2.1 в обох сортів була значно вищою ніж кількість ТЕМА, що кодують ВУТМТ1, ВУТМТ2.2 ії ВУТМТЗ3. Крім того, кількість
ТЕМА ВмТ57т2.1 в головних (стрижневих) коренях сорту "ВеМПадоппа КУУ5" було приблизно у 2,6 рази вищою ніж в головних (стрижневих) коренях сорту "Вгідадієг" (Фіг. 4).
При цьому ще через два місяці вирощування кількість текМмА ВмТ5т12.1 у двох сортів істотно не змінилась порівняно з кількістю після З місяців вирощування, так що навіть після п'ятимісячного періоду вирощування і розвитку кількість тЕкМА ВмТ5Т2.1 в головних (стрижневих) коренях сорту "ВеМПадоппа КМУ5" була все ще приблизно у 2,6 рази вищою ніж у головних (стрижневих) коренях сорту "Вгідадіег".
Для того, щоб зібрати більше інформації щодо значущості білка ВмТ512.1 для накопичування сахарози, концентрації глюкози, фруктози і сахарози визначали в листях трьох- і п'ятимісячних цукрових буряків сорту "ВеПадоппа КУУ5" (Фіг. 5), і порівнювали з кількістю тиМА чотирьох Т5Т-паралогів (Фіг. 6). На відміну від головних (стрижневих) коренів, де вміст глюкози і фруктози був дуже низьким, в листях ці два моносахариди накопичувалась. У листях тримісячних цукрових буряків концентрація глюкози і фруктози становила від 33 мкмоль/г сирої маси до 35 мкмоль/г сирої маси, тоді як концентрація сахарози була меншою за 15 мкмоль/г сирої маси. Після вирощування протягом п'яти місяців концентрація кожного з трьох цукрів становила від 6 мкмоль/г сирої маси до 9 мкмоль/г сирої маси (Фіг. 5).
Слід зазначити, що кількість ТЕМА ВмТ5Т2.1 в листях була незмінно нижче ніж кількість пЕМА ВУТМТ1, ВМиТМТ2.2 ії ВУТМТ3, тоді як кількість тЕкМА ВмТ512.1 в головному (стрижневому) корені була завжди вище ніж кількість ТЕМА інших ізоформ (Фіг. 6).
Приклад 12: Опосередковане ВмиТ512.1 транспортування сахарози в тонопласті
Для того, щоб продемонструвати транспортну функцію ВмТ512.1, до ізольованих вакуолей застосовували метод локальної фіксації потенціала. З цією метою в мезофільних клітинах Місойапа Бепіпатіпапа тимчасово експресували гібридний білок ВУТ5Т2.1-СЕР.
Інтактні вакуолі трансформованих протопластов виявляли за їх зеленим кольором після легкого гіпоосмотичного лізису.
Для того, щоб відтворитит фізіологічний протонний градієнт на тонопласті ізольованих вакуолей, середовище в піпетці, яке являло собою просвітний вміст вакуолі, було забуферене до рН 5,5, тоді як середовище в камері (тобто ванні), яке являло собою цитозоль, доводили до рН 7,5. Коли до цього "цитозольного" середовища додавали сахарозу, вакуолі реагували сильним низхідним відхиленням потоку струму. Наслідком додавання сахарози в середовище, яке оточувало ізольовані вакуолі, було виникнення струму, спрямованого досередини, що свідчить про протонний антипорт транспорту сахарози.
За відсутності Вм/5Т2.1 ізольовані вакуолі Н. Бепіпатіпапа не виявили значної активності транспортування сахарози/протонів. На відміну від цього, щодо вакуолей, що містили
ВмиТ512.1, додавання сахарози в середовище камери призводило до виникнення спрямованого досередини потоку струму з величиною майже -1 пА/пФ (Фіг. 7). Ці струми являють собою
Зо біологічний фінгерпринт стимульованого протонами імпорту сахарози через мембрану вакуолі, що містить ВмТ5Т2.1-СЕР, і є явною ознакою того, що ВмТ5Т2.1 поєднує експорт протонів вздовж градієнта протонів на мембрані з імпортом сахарози проти існуючого градієнту сахарози.
Остання функція є біохімічною передумовою здатності цукрових буряків накопичувати велику кількість сахарози в вакуолях їх головних (стрижневих) коренів.
Слід зазначити, що ВмТ512.1 не полегшує жодного опосередкованого глюкозою експорту протонів. На відміну від ВМТ512.1 ізоформа ВмТ5Т1 опосередковує як пов'язаний із сахарозою, так і пов'язаний з глюкозою потік струму порядка приблизно -0,3 пА/пф (фіг. 7; Таблиця 2).
Таблиця 2
Індуковані цукром зміни в щільності струму окремих вакуолей. Ці дані свідчать про специфічність ВмТ512.1 для сахарози.
ПНЯ ПН НАННЯ
А Ст (пА/пф) впав 1 скео1опеене | Н сахароза /глюкоза
ВУтеТ2-ЯРР | -тозжбаю | -бо1880005 | 2 щ- єю (ОЕР(контрольу | би1-0,04 | -0083003.
Приклад 13: Специфічність ВмТ 512.1 для сахарози іп мімо
Для аналізу високої субстратної специфічності ВмТ5Т2.1 в живих рослинних клітинах подвійні нокаутовані мутанти АЄТМТ, що не мають жодного з двох важливих транспортерів моносахаридів в тонопласті, трансформували генно-інженерною конструкцією РОВО:ВмТ5Т2.1-
СЕР або генно-інженерною конструкцією рРОВО:ВУТ5ЗТ1. Ці трансформанти вирощувались у присутності токсичного аналогу глюкози, 2-дезоксиглюкози. У контрольних експериментах без 2- дезоксиглюкози всі рослинні лінії показали аналогічний ріст. У присутності 2-дезоксиглюкози подвійні нокаутовані мутанти ї1511-2 належним чином не розвивались, тоді як рослини дикого типу та лінії, які експресують ВУТ5Т1, показали набагато краще зростання. Рослини дикого типу і подвійний нокаутований мутант, що експресує ВмТ5Т1, зростали краще в присутності 2- дезоксиглюкози, ймовірно тому, що 2-дезоксиглюкоза може транспортуватись у вакуолі для дезінтоксикації. Цей подвійний нокаутований мутант не в змозі зробити це. Ті подвійні нокаутовані рослини, які експресують ВмТ5Т2.1, не могли компенсувати затримки росту подвійного нокаутованого мутанту Ай5И-2 в присутності 2-дезоксиглюкози, незважаючи на те, що у вакуолярних мембранах був присутній гібридний білок ВМТ 5Т2.1-СЕР.
Визначна чутливість рослин Айбі1-2:ВУТ5Т2.1-ЗЕР до 2-дезоксиглюкози іп омімо узгоджується з електрофізіологічними даними і сахарозною специфічністю ВмиТ5т12.1, яка була визначена з використанням ізольованих вакуолей.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«ВО КВ СААТСВ зако АС Мавдпнено Оспаєвійши
Епедпев АМехапаєх Сунустану Епавосв-Могобете
Теспнові КГ Ниуєкану Каіветвівцетв
ТннУєтвну ої Соіовне
Заноє Махнзнавз ОпікетеНу ЖОВ «РО» БЯКИ, ЯКІ ЯВЛЯНУГЬ СОМ ПЕОТОНВІ ПОМНИ ТОНОПЛАСТА:А НТИПОРТЕРИ ПУКРУ,
ЇХ ВИКОВИСТАНИНЯ ДЛЯ ПЕДВЕВЦЕННЯ КОВЦЕНТРАНИ САХАРОЗИ В СНГАНІ НАКОПИЧУВАННЯ
САХАВКИ РОЛИ
«50» Вип «ММ» ОЕЗО2014005332 «152» Я -4-3ї «і» й «ую Раієтів Уствіов 3.5 «СО «Кі» 735 «айв вит І «Жі13» Века чнідатіх «МН»
Мет бек АТа А1а уаї ве ма? їв ЇІїж дів із уйг ма! ФТу АВр ев ї 5 30 15 вве тук чіу тТге Ажр ай АїВ ТВг їі аіз єіу Аїв Узі ев Тут Зв га 5 за мух мух сій ве деп сей ОТ бек беєб ва Те фен бі) біу вв ІЗ
Зх «5 45
Щі дів ТАт 5ег Хі їі біу Аза твгоїею Її ТВе ТВт Сує бек ду 50 55 о
Бгто жтж аї8 АБО Аго іо бі Аж аг вго вет Меї їв ЇЇв Бек дет 55 а 75 що
Уві Суб те кре уді 5ег дів зви 5315 Меї сви тгр бек обго лев Уві
Зо 55
Тут ха! іФци іву Ре діу Аг оіту іс АЗОВ біу ра бік бек Ф1у ву
Ммю ще па с
Аів уаї тТВгоіем Я1у го іє) Тує 316 бек бів їйг о Аїв Кго тТвВг 853
Но 120 125 їїв за ФІ 5ег шМм о АБА ТВ фен Рго бій Бе те Зіу Зег ОЇ Фу ії 1355 155
Меї вне ви ліз туго бує Щек Уа Ре сіу Меф Жег без мех бін ТВг 345 35 155 15 вга БЕЖ ТТ АК вм мех ім Ш3У Хі ів) бе маф го ек ТвК Узі 365 170 375
Тує ве ів ем ТВК Уа РВЕ РВЕ рев о вгОо бів бек РРО Ага Тгр озмем 380 185 і150
Уві ее те «Фіу агО Мет ап сів Ах вуз суч чаї іо Їй Ткр ев 155 20 05
АКЩ Фу АКО ів АБО Ма! рБе ат «1: Мет а) вве мем УВІ дім СУ «о 5 2 зви ака Ві сів біу во Твг Бек ХІТ 51в бі Туг сво ї1К бів га 225 23 235 4
Ажр аїв сіу їв Аїд Біб АБО ів Ахв рго меж ТВг о УЯі вух дер в ха 255
Уві Ага ін Тек біу вт бів яїа Ну Суб Зак ТК» Узі 818 Ага вт
ОО 5 27 чаї твгобіу бів бек омеї іФе Єіу її аїа бегоаго бів біїу 5ввб ох
Ух 280 КУ сів бег РгО Зег УВІ его зжу Меї АБрОРРО цем ча! ТВгоіевз РВа біу 290 295 зо
Зег заі Ні5 ів фу ів Ра бів Зій сіу бег мех зви Бек уві 18 205 330 КІ з тае Рео ТвРг ОбНе Сіу бек Меф Ре Зег меє Шіу біу 5 Фі Рг гук 335 350 355
Аа ші: «1 Ткроабр аяр бін Аха ТВг їі О1У Абр о Ахр Азов Ахр тую
З 345 350 су нів а азр сію дзв туг Аїв 5іу Абе АЇВ язо «ії а5о0 Ав ач 355 ЗВО 355 їв де баг баг ївем Вів хоК або сій Аве їВг обі бго дв ув Ай
Я 375 ЗО
Мехк узі Аїа Бго їВг дет біу Бек мет ре Заг Мет іх Ні ек бер 355 БО 395 50
Ттроіем бів Біу бЯег бів Аа бек Фу 116 біх Біу Ту їгв бій ів «05 ЗО 5
АїВ Тгр Бу Тгр бек сім Ат Фів 5іу івв ар обі Тіт куб бів ві1у 426 4: 4
РУ ВНя руб АБФ фам Тук ім НіБ дій бів сіу дхр діз СТУ баг рух 135 349 445
Ага біу его маії Ї18 бек іо А!в Бі Біу 1» Уві! 1312 о1у Ахр два
М 55 я бі» Тук Уві уз АЗа аї3 813 іже ма! бег бій Рго А ів Тур ЗБК 355 «75 575 «80
АГО АБО РНЕ МЕЖ АБ Аг АЮ баг їі сіу рго дід еф узі Ні БР
ЯК 4953 335
Звг бів Аїяа хек АЇЗ Куб Ак ргб ее Тр ага аАхо вне зо бів ро
Мю Зах 510 ші Уа! аАге АГРО Аїа ів Уві Уді сїу ма? 51У ви бів іс ве бів 55 525 525
Щі вл Аїа сіу Хв Ази Ф2у Уві ів Тук Туг Тр орга бів ків вер 53 535 що сів сій яіз біу ма! бБіу Азр іє) во хег нія мес 01 З15 «1у ді 545 55О 555 5БИ 5ег бек аїв сей іжу ей Кі хег АЇВ же ТВ ОТВР рев обев Мб іже жах 578 575 го Аза ї16 АЇв Уаї Аа Мет аАго іви Мех Ахв іду Звг 01У Аг Ага
ВО БЖ що
Твт єв вв іно ТВгОТВг хів Рг Уві Бво вве без хек без а хаї 535 ща ОЗ іви Хіє ем аїа аза ма? 18 фу Меж дахи бе ТВРоУВі Тук АТ ма
Ів БЕ БО
Узі Бек Твйг УЗ! Аз УЗ! Уді вфез тує ее сух Ре Ба уві мет іх 5Ю 635 го
Кнж бу вге (16 его АшАИ Ї1Є фев Суз АТа бів ХЕ РМе кг ТВг оку - о 655 їі2 дга Фіу У! Су ЖХіє аа Ії8 Суз АЇЗ йшуи Тео вНЄ Тїгор Ї16 Сук
Ба 555 БІО дер хів Хі ді ТВ тує ТВР Бо РКО Ме Меє іже зу АТа уві шу вт Ка 5НХ їе» Аїв оіу іве бе біу Ве Туг АТ Ууді маї їіЇв іви їж) Аїд Тк» а 55 ню це тве їі пе ім гу5 Уаії рго б1ц т щу сіу має Рго се; і маї їТе Тнгобію РВе РВЕ Аїа ви б3іу Аіа Аго стій діа ев нів 725 730 735
І: 2208 п: ва тиідагів «0йх 2 атздтосао сзататіаої с9сзаттест дсзасадтто Явовестоєт всасовато9 50 озхзатостя ттастостоз вестосатєта татастаада ззЗзаоктсза стізозаації 120 їстссвзаксії тоод8а9О5її заїтосоасс асатсзатай їтодассас єстеаїтаса 150 зсацрилісса зассватсує аоатсоістЄ поссоїсусс статовсоах азтстсстев 240
Еге сК тішітадтос сттааіаато фтдтодісте ссазіоїтта хохтетасіс зоа згсоруІсоос їаїтацзатаюз астісосазої атстадсяс тсвстсттвро ссстстстах з ататсаваоа ссестссзає туататаєва чостсасітода асасасктєс їсзас кас 420 пастстобіо заатостсст сосатастоє аєдасттісо дозтоксаїї одзгдозваса «во сетадстода даттазатосі торовеєтстт тїгстоїессат стастоєтта сетістаєта 50 астотаттст їсттаєстоа дІстестсадс тооасттоста одсзазадасо затозатозо БОЮ пжааззацо кестЕсвзаїо пстосварос ароовадато сСіттостоа озтоавсісіс Бо сттаттоадо пісттаразі тоцадотоаї зсаїсзатаз абоаатасєтх озттазвесса ТЕ чатоасточЗас тс9сідазоа їсавовіссу зідзестатса аавозїісвац саздскотаї во сдЧіскавач садустасхс ссдодесосс адассазїсва стоЗїсвово татоассадує 840 аттосатскс босадодазо сатусадаці сстадсєтс стстайсода кссссттта 9 встстсіттЗ згзатасаса гтозазазстї ссзозасваоа Зазотатосї їзохоїсата 9ва тІсссвзастх ттодтватат дсттадтато одадодазад засссазава тозадавтоєй 1020
Чатоатозаа ахастзтео5 доакдасов:і оаїтасодіє аїозсуатоз зозїтатоса 150 дотчасоєто зкоазозкоз сазїттасоє адктсастїа сатстсоіса озатасадуї а ссадасаззав ссатозікоас состаєтіса Зоїзосаіої їсвасатаза дсзіадсадх 1204 кдоттзсаао дзазсогазс таотозтасї здотодковдтх оасадтеізос тевозазтов 1250 восозовеза заростіооа с953їасдаво дазодаровїі їсазааоастї їбваїсстасаїх 1320 сзвздазозїо атостЗазіс тазасоабос зствутаєті стсстастоо соохозвохе 1380 зІіхоосоаса асовататої даадоастосі осастадтаз одісавсстос сстттаєсіса 1440 зазовкскса тодаїсовоа гзоататтауі ссадстатод тесаєссстес соавоастіся 1509 осзазавоос стасттозад здає та вадсстадота тсводсотес актаоєскотх 1550 дакассодає кісвасттст збазсадієс остоодасав зкоосатссї вкаттатсасє 1620 ссїсааатасє сзвозосеаос тозодотодої пассттстті сосасз:ооо татазососі І15б85о «есцкаї состасісаїт сазтосастс асавсісїткї газїустїсс Костаєсазасї 1240 щфівзсайтоа досістатода тстїстоуЗ зузводастт тостастаас сасааєтссо 1800 шостої тст хатсостсв: тоїсттазата сісосзазі) тсатзаводат даасассвсї їкбо дістатоса)з содістссас адісосаодіва оіїстстаст тстосттстІ котсрсатараю 1920 тетвадеста їсссазатат єстаєсотоса разаттттсс свассзаватї ссотвоавте 1980 татастаста їттвтосзеєкх тасттєсіоо вістодїдазта їсатадісас стасасасіс 2940 сстаєдасос сгїазадстаї соазасттаст аджежеміа асттстатає зага 2100 птаахтосаї осатаіїтаї асіїїїЗава оіїсстозаа ссавзодасат оссссттоао 2160 цігассаєта адіїстєсас сстІсСодтоса возсазодсаз дссасіва 2 «2102: З «2112 735 «122 РВХ «2132 Вета чиїдагів «МК» 3 мек ібу5 СТУ АТа Уа! іш ма! дів йіез Аїа АЗіа пак їі О1у Ап Рв ії З 10 15 їец вів 1у тТгроА5р Ап Аа таго оті АТа с1у 5ег ї1е фез тук ї16 ув ух 01 їей бій Бей зеб Твб АТа Ммеї біо б1у їв уві Удаії Аза 25 40 45
Меї 5ег їен їі бім Аза тн о маї 116 тТвК о Твйг Сух век Ту діа уд! 50 5еє дяр Ада маї сім Аг Агу Рго ії6м сем Меї іео бег А1їа 5ег їви 55 70 75 ко
Тут Ра ї1іє біу бек ви ма)! Меї іви Тер бек рго Аза маї п пе 85 Зо 5 іез гри їей Аїа АгО Бер обер Абросіу Ре сіу хіє о1у сем АТа ма! 100 105 по
ТВРобєв маї Рго Уаї Тут 112 бек бій тТйг о бег вго РКО 1 Ії1в Аго 115 120 325 біу ев їец А5п ТВг о івц Рго бій РВе твгоСіу бак обі біу мет ле 130 135 140 ів яег тує Сух мМеї їі Рпе бФіу Мет Бек іви Меї АЗа бег Рго 5ег 145 150 3155 1650
Тер ага ї112е мМеї ів біу уаї се бБіу 116 Рго Бек ма1ї ве Ж і ви 165 170 175 іез Ре Афа РПЄ РБе Туг йем рго бій 5ег Рго АгаО їго Бей Уа! бег 180 185 190 чує б1іу йга меї бег 01 АТа ух у ма! ївр цу5 Аго івги Аг 01у 195 200 209
ТВг ОТО Ар оуаї бег біу б1ц іец б5ег іви без уд! іш бу гей с1у 210 215 220
Уа! 0іу б1у Єв тТвВг о б5ег 116 бій сі туго ї1е маї біб его АТ 1» 275 230 235 240 біб їей діа сіу сіу тк о біш рух б1у іуз маї бух йец Тук бу Аза 245 250 25 а18 бін біу ей бек тир їіє Аіз їу5 РО Ма! тТйк о біу бів бег Аа 25о0 2855 270 чаї біу їви ма! 5ег Агуд ні віх 5ег Мет ма! піу їв Уа! А5р о РгОо 275 28 285 іец уаї тТВгобец РаЄ СТу бегоуаї Ні бій бу бец вго біШ біп су 290 295 300
Ап мес Ага 5ег о АТа ів Ре Рго 5ег їі оіу 5ег Меж бе бег ТВг 305 ЕО 315 320 а1а Ахр о Аїа нів Уа! Ні Ага Ар бій в Азр бів 10 Аа 610 Абр 325 33 335
Уаії д5р біз Абр АБр бій Рго Х1е Аза Абр о Рго Аза Фу І Зі дер 340 345 35
Ре А5р ЕР АБ Або їец ні діа Рго їво хі 5ес асо сій так отве 35 зо 36
Зег мес бій ку5 Ар Меї біу сей Рго Ро Уа! Звегоніз біу Твг Уа! 3979 375 зо
Меї Бег Меб біу тТуг Ні біу бек цви рРВе віп Бі Аїа Єїу бів тйг 385 390 395 400
Т1е твготвг о тТве сіу хів бі Ф1у с1у Тгро бів ієц Аза тер ТВг іги 495 810 415
Ахр обі вух бій Аза біо дв о о1у п їух зЗег Суб АБр йнНе ту Аго 320 425 азо
Ії Тук йо нів ств ар біу віх вго діа бЗег Мет дея сіу 5ег їви 435 «4 44 йец бег зе) Рго 51іу біу А5р РВе йго б1іу А5р о біу Абр Су Уві б1п 450 455 465
Аіа бег Аїа іївц уаї 5ег ап РГО Аїд цей Туг бег суб бір маї Кей 465 473 475 380 сіу бів 5еє вго тіє 51у вго АТа мет ма1ї ні го Аа бів Хі Аа 485 490 495 зег бій бу рРго тб Тгросу5 Аід зви їв Ар о Рго оіу маї уз дго 500 505 зій
А1ів ее іє ма! о1у маї б1іу 11 бій мет іво біп біб пе із су 515 520 525 112 аб5а біу маії сей туг ви Тнег Рг бія 116 гео бір сій АТа бу 530 535 540 маї бій маії сер ігу баг д5р це с1у ї11е 5Зег 5ег ТНг бек дії 5Зег 545 550 555 560
Ре ів Ії118 Заг о АЇа їм Твг ОТ РАВ їв Меб веб Рго Су І16 Аа 565 570 575
Ма1ї діа меє ко цей мет АБро ої) Бог біу Аго Аго бБег Кей сво сви 58 585 590
Аїа Твг ї1е Рго ма! сецй ї1е Аїа бег о іец ма) її беу муаї ї1а 5ег 595 500 605
Су тнг Ууаї 5егомет біу 5ег Уа! Їїіє ніб5 А1а ма! 116 бег їі Ії 510 615 520 ве чаї ї1е ма1ї тує РНе Сух тік о РБе ма) мех Аїа тук сіу го їїв 625 530 6535 5
Рго Ап о ї1е їв Суб б5ег біб 116 Ре Рго тВгоаго маі Ага б1у ма 545 650 655
Суб ї1їе Аїа її6 Су біу бе: уаЗ) Ре тТгр 1і6 Суб д5р тів хе ма
Бо 555 570
ТнгоїТуг его іти рго маї меж бер деп беє Хе сіу бер б1у ту їв 875 ВО 685
Ре АЇа їІ16 тТуг Аїяа маї уаії Су маї 11е Зек рвеу ма) Ре удії туг 690 595 700 їв Бук Уві рго іш Те їуб БіУ МЕ РО ее сів ув) ів ТВК зе
Рне Ре Бак Ма! вав Бге зує ій цем зів Аїв Аза ку АТа Ти 723 735 ших зов
ВЕ вет» Уиідагів «МЮх 4 якозаооцкЗ стос ІЗї оОсстіЗосЬ остзєваттв гватееест зе що дисеатосав савттастда оестаетєт тасвусавов задавстівра астакссв ро декаєсоазцо сзсктвісоє зсзатотса сттатеЗово стасоцетях сисвасатоє 10 хсрзоооєсЯ сеісвовтас зго сов себесектОс тОаТосжсес досстсвее 234 хаскмакто осадсксва: пасоуєтасою бевсстаао тсізЕЗкККЕ зе кта зва «ни твО зізосієс аю звтвооаста осоціваєсс іс сТОї гізтвіВісВ 5 пзцекттссс стссвовоВї саЗосовтта стазатасас стсстсааех сасеоодастех 925 зимова сстжхзксита стусвеВиє кгхооватаЄ Снісасовс Всі уує чо гопрдавваїаа гост етОмНЕЄ есте ТТтаКстІт ато 540 їхстясЕхос стоватсссс ОсецеОВсТІ дтохосзаво озевоакакє савосазаю що зазоїкстоа звадаттвся сурсисжова затв: говаствке сіхостают? що зваауостто ідтсовоо соавасуссз зізозавам асаттасаоа зссаасадая та озоствасза відосастоз звааосава дізазустих зсозазсзис зазазосстї 750 мимо сазавсетеї сасівовсво затостоста кет вкс седксаздуа 830. захо во состава есте ок зе заабкоєсся ховававестх ОО кскпевсвад зазасатово везївсвскї ксссварта хідосвОКа: огтазосасЯ З. ссзоакастс зІзутсвсвв заатсазева озізазпааа зксаЗоаіОє атозадяє 3020 затоасєсва ссвсМесє масова) дозах іксо зкоазааєюва стосу що ссастовтЕх сасоссазас звсзавсеїо дибпааавяса ООН сТес тест ца сацвуиаєто тзятозосяї дроз:зссях Зосадес сісеавосос собозлазкх 1200 аутзсіаста савані цю смак сазікорсої обастїївої тозовезова і260 зсув завсмааес саваанстяс зазори асетосагсв зовн 1320 ес кстз сосековакс Все веса стос ЗІЗактткск сорзаватода Зо засн ахіс зооскстоє поскорізацї азтсктдасяс тітаттсова вага 140 загсвавотс статтю тсє тосола: сатосассо заатівстіє ссавовдаєєсв 3500 зосцюшвава «зе тов сссводеніх зваесоівсві овес зві ащаЗех 3550 «ацетат засво сос Змиатачах сососусекІ вста асесс асаЗаїса Зохо сзаозоссео сла азаачи сскієзаїет звиставози ксозастствс акстосстса іо зЕІссз3са Зіосиїтавс свсстїстта ЗІшсТасссЇ всех сосгізідеЗа 1250 кісаїщоВжя КСО завоссВстВ кстосттоста са аї тоне 3ЗКоВ час кта Хсстазсват састесвех оісвасатао зізототваї саке 1550
Зісткавіїса «стоКуЄтаї заст асїїК сесасаЄета зїжзевасіта содвескака 1952 ксопавзезікі свівгескоВ дежсктКесх зсжсогаксс верста Хатка 3550 ота втов стікскозах зізсвасаїх зетохсасеЕ ясжеккевкс соб ЕН застетатса з одамю саїстксоса асатацко треї сао цю
ЗВТ яксісязацї сскзаззаса азаоціВк сесїзоавав Сас іо зкскткухав ітозїсства зсавтезова ЗссоставоВ соовотаа у «ее 5 «гії» 253 «Зб» ВК хаЩЖх Бета Ууідаків «ЦО 5 мех 5ег біу АТ Уа іс» Уа! Аїа їі дів АЇя вів Уві 1у Ап фев і 5 30 їх іль іп щіу На Бо АшиИ ЇВ ІВгГ кіє вів у АЇВ Уві мем Тут Х1Є р х 3 їу5 їх щію Ве ах іви Бі бі а) вто тн Мех бін б1іу іец хів 35 а 31
УВІ Ай Мет бек ке Хі біу АТ тТнг її 3 тТвг отТнНе Суб Бек Ту 5Е о го зві Зеб Ар аго КВе пі Ага ага Бгто Меї ет її Її бак вт 2 75 о
Те Суб влє вл РМ его яв цец Хе меї без тр 5вг ого яп ув! 5і За 25
Туг Мі ів івь ем бі Ако цен сен Ахр Бі Ме б1У бек є1у мем
КЕе іо 1 діва жаї Твг бен хві ре рен Тут 316 Бак Є; тТВт діа вго тВг Аз що за ї55 її акз Бі ек фен аа Вт фер Рго ців бе тТвг обі 5ег бу іх 150 їі 15 век Блме маі аїа туг Суз Мез. Уа) таж ву Мет Зег о фвм Мет Бім ух ї4х 15 155 о
Рге его Тев АКо Мо Ме гео б1уУ Х12 зіву Уві жа вго бег дів ке ї65 175 375
Туг ме Аів іви тве Ууаії РБе Ре іФв го Зі Зег бга ав ТРи ем зо 155 195
Уві баг пе с1У Ага Мет а5в бів аїа уз кує Узі іс бій Агу і ву 1955 юю в
Ага бі аАгя сів Ахроуаї бек АТа бів веб А оц зем ма? бім су 230 535 225 їз фіу Ууді Сі Є1у аїр хів бек ї1іФ (30 бів ту фен 16 бін вто 525 23 255 248 дер Уві Сіж Хі бек бів бію тук а5р о рго мех дія дів бух 55в БВ 245 250 255 їів ух мем Тук біу Заг ажр ліз ю1у Ні бек Тер уві 814 ага вго з50 ну аж чаї т вх бів Звг вет во вах іви дів Бег аг Бій ТУ Заг їі 775 25 85 сій аха Бгто его УВІ РгОо Без БМ АЖо РРО Мен УВІ ТЙг о з8гм вве дію 9 295 За ег уді Мі5 бів їуб5 ве Рго біз бій 53Уу Бег мес Ага бу Ків 118 я З 315 356 вве вто ТВг вне и 5Вг Мет Ро дег Мет 51У ЯР ву Ар рт Агу 32 339 3235
Аа сім сім Ттр Ар сів бів аб» фев Ні с1у азв або ав АБО Тук 343 345 35В
АТВ ніж ази АБр Ар Ар АЖ Ахо Бр Тут аів8 оз Бо Ар АжВ Ажв 355 то 355 кео між бег го сем Хіж Баг Аго бій Аа Тве іх Тіт АзвВ гу аа 378 375 35
Мет ма! АЇв вгО Уві баг біУу ви меж вМе Зєг МФ бух кго хек БУ 345 380 395 409 іже тів Біб біу таб обі Аза бек Бі Ха біу бБіу Б1Уу тер сів ев
СО 19 455 518 тТгРо бів тгв о Бег оБів їу5 1 о віз вер Біу ага іу5 ої Біу 2 25 430
Яіу Ре вує аг іо Тут іви мі бія сів біу ар Мет Узі Заг руб 435 аа 445 ага біж бек уз) Ж)» баг іо Ро біу шіу хр Уа! Янко біу бію Тне 50 «55 5
Бім тує меж зу5 Аїв Аїя АЇЗ дев ма) 5ег бій Рго дія ко Тук бог 455 ав 75 аБО
Ага бін жи Меє вжа бів ніж те оз1б б3іу рРго Аза мет УЗ! ніх го 485 50 «5
Заг біз тТиг діа АТ ух О1у шег хег їго АгО Ар гіф сг бі: вто що ще 510 су чаї ав Аг АЇа ївес Хі щі 51 Уа! біт ем бів ів їец сій
Кі зав 525 вів вве хек 1У Хе аа Б1у Уві зви Тук Тк УВК Ру бій ЇЇ кв 535 50 сів їв віз біу ді Зк др ман ів бег ва мех Бі хів о1у ав 545 55 5 КО
Зег Заг аїд хег дос іти Хі ЗК о АТа во ТВ ОТвг фев вав Ме ів 555 ЕК 575
Бео Бек 112 дія Уа! із Меж ага івц Мет Ахр Її баг бі Ага Ага
КІ 585 ще
ТВкК іо зе звер о уВг о ТВж Хв бго уз) зв РИЄ фу Як їв уві Уві ща аю ще їжи Хі с-м біж да 318 318 мух вв аек їйг о тве ма? ніх дія мі що віх 5-3
Ї1е 5ег так МЩі бек уві Уві ви Ту Ве Сує БНФ РВЕ ді Мет ЗЕ 53 535 СІК
РВЕ Фіу БР» же бго ав Хі іо Суз віз бів Хх12 ве о вго ТВг Ага
Ба БУВ У
Ї1е го бі ха! Сух хі Аїа Хв Су Ай во ТВЕ РВЕ Тгв Ї16 Їх
БО що вто лер Зіе хів узі ТВР о аБр о тТВг івео Ре Хі мех іве ази Вів УВІ Щіу
Ба Бо 585 зви Аїа біх узі вне Сіу ВВЕ Туг Аза чаї Уші Бог Узі ЖХїв аїв їтгр
Ба ща БЕК
Зо їі вне хів РВе ї5у уз ча) РРО І: їВгоїУ5 Бі веж вге сви 1 дв 730 ТІ5 78В мі Її ТВе 5ів бБе не АЇа іви 0319 Аїа Аго Бін бго 5ег біз АБо) 725 730 735 іу5 ахр АВ «М 5 «її 5250 «3й» ДЕ «Яї3»У бета Уві юдтів «Ще Б І зіозаквази соц ми сосваїтдсї зсросвоїто осззсїтаєї асавозатов Бо деїзакоста стаЇсаство постотакєто сгагаєтазаа аауааїттсва стсриннне 150 дерсзасса соозааосхї застотозсс вівіхасіха бсдозассає саттатсяса що я-кесвскету сзесазіїтє заз осВК звосоісЯсс стзтавтдах заст Кт зуавтостіст тет сстазатавте ЗМОВ сКс севахУєехз фоусствсе ЗО ково ссвах хаїсаозсоа зкутосаВох гі єоосто Ус е фксееІ во медісзовова сззсіссвас тозтасааОа ОДЕЖІ Ва вівсастесс хсаатіжасЕ а чзасссзаото вахта тосегастої тості со оозхохстеї затовазава зо «стФустоди оастовсост топок остоттсКах скостєтктя ФТестасзЕта ща астотаттст сстхасєсюз дестсстсоа гост бБезаасввсв азіозатово 5 шцесвазанує Кесїссазев зістосмюзс зопозатя гстетостоя ЗахЗОстсо о сич ЗссЕтоОВОї Мюеооішис вїасвиіву азойаіактх зассовасса 778 овхзїхОасІ гсзосваоЗа зх озІсско зрост сса зазаксвоах гаавітааі о опоссвавса сзорссястс сеодососє араєсвцієв «єсЗдссаза: катостцацє 84о «етосзтстє шіІсВОоЗааВ сатткававс ссезуєдетк сстіватуоа сссссое а «сасхкїссо вбзещциаса ссаЗавєст ссаовясазо дазасатосо задівтІа яко
Зксссврассї зтоохаотаї вктізосато зозоосаава ассктааива здавовогою 3025 атлзцовса зесітсвіо3 соатзабзаї застаєрсєс асляховіва созсазсоах зво озЕхасєто заваїваещоа саеттсасаї забскастте таїсісовсз пс аАцОї ї15о зсзчасевзз стві щас кссвОсктсй зав ааї хсвасвхова вестаотовЕ з їхзатзсваа ваастозаюєс своїзозаї озсозхозї досвостоа соасаатов 260 ккозовани зо осгаза свродаввавиа Звосрацозї тсазавзаєст бтаствасах ї352о свозаааусо забої хазасоауи стакааКх сестесетва сосках ЗО всіпоувоавов сзозотитях одвацстосх осаскавтаа яксаавсстас секту 355 зоЗоожотсда созаїсваса застаттода ссаєстатов їесатссІтс соВаВсКОсх 5509 зсазавоват стадесетооау зиакестгїв овасссвусо сво осос втік іщ посотевє фссаясісї св : їстооОхзтва ЗоцаЗЕх акаіаеах ї5-о сеісзавїви: хадревсазос сезозоствОкх зассктске сзазсяковро сах зо тсєтсвках свхтосясак саугзсасІс зкасісеке ток ск фхссвХвОся ї830 шстрсзакоз зосктвтоЗа їаїтессоЗО зосваовасіх квстасітає сасвакско з850
Каток ХЕТсрсТсОК соксстваїа стсораната тсатазараї феосассасх ЗО чЧезсгзсосаЗ хавтстєвас закетесока зе тскасї тсіосхуеке Фотавтовок зо
К(тоосссав фсссавеїВї ссоВівсОсо овазікексс сазссввзає сома зо тасастеста сктоїтоасасж їзссетОО зесодаВата катета зоасакас 23550 костатазсос тсзвІвстає тоЗасісвес зага тета сс сті Ка певзткост орахтізаї стітстзаао огісссозаз севарорсак зссгсусвау Бо утсвітаєста звожстісУ сс а зовсавесії сбозаросзя прасавстоа 2225 «ЕІ» У «іх 7-8 «іх ВАТ І «23» вет Уувідагів «НК 7 мех Ага БУ віз маї Ре АїЇЗ АТа ін ів віз ВР НІ Є1у ди що
З 5 10 15 із ів біу тгр Аза аха діа ТВг о узі АВ щік дія Узі її8 Тук Ї12 25 КІ іУ5 АКБ Бі РВЕ 5ег зе ів Твг бів Рго ТВгР оре бів ТУ ев Хв чо 45
УВІ А15 МЕТ его фер 318 бі» Аїя ТВг о УВІ Хіфе ТЯгОоїне Бе ек бїу ща 55 50 рга уві хек АБи ег узі О1у ага АгО Рго Мої ем ХТе Хіє Бек обаг то 75 8
Хі ем ТтТуг Ре зів Бім біу іти жаі Мет із тер о бег Ро Ап ді 85 8 55
Туг Уаії мем іжм би ОТу Ага Без йез Ар сіу КНе сім УВІ Оу кер зо 3195 що
Аїа Уфі твВгоряз ді Рг У те Ї1Ф аг бів аг АЇВ Рг го щі ї35 128 125 їі ага Бі бів бею аса ТВрорБе) Рго БІВ вме Увгоіу бак бі 51У що 16 345
Мет ве ігв ек Тут сув мет узі РЕ біу меж 5вг оіву Ме сти АВ 385 158 155 485 вго Аг тер Аг фвз веб веци сіу уві Хі хег Х16 Рг бек ген вуз й ? 155 й 170 175
Туг ів біу ви мех уві вва Туг зви бко біб бек бго 58 тТтв ви 180 385 і чаї Баг су Су Куб мех ніх бім АТа Суб Куб ча? ем сп Куб фев 195 щю ях ага піУу ага бів Аве уві ТвгоЄту Біб мех Аза ву ев їїів бів Ф1У «30 215 Кк цез біу тТпг о б1іу уз азя ТЕ бак Хе біт бі тує уві х12 біу го 2525 о 235 40 із аа Ахо 13 51 АВ тТВг ОТАК Ахв ру абр бій їі6 Буб гг Туг 745 о у 755 сФіу дів бін бів бі біб Заг Тер що Аз вуз вго жа дев бі вів 250 265 27
Щек ТВг офіси біу ет Ууді бак В Ту" біу бег мет Ав бій бій у 775 Р 255 дет мех Аіз Аха мет мет зар Рко івгз Узі ТВР ів) Ре б1у 5ег уд 290 78 Зо ніз біб бух шву Рго бів бак с1у Заг Має г Бек Аїз дів Ре го 305 з 33 320 аа Ре біу бек Меї Не бег ТВг Аїв Аза Ар оаєр ні маі вує Ні
КУ 330 | 55
Уа! Аа ТР» Зіз Уа бі баг Ага ща? сі: Абр баг Заг ог дер Уві 340 4 55 бік нії взв Азр баг Або Абр Абп ів Ага бег го вец ів Бег во ко 365 ні Аїв вго біу вів ів щу: зр Аїа узі Рго Рго ів Ах» бБіу аА5в
Зо 375 зо сег мас іву Меб бБія кет біу Зіц іеци ма? аа Бак ТВг єїу 316 віх
Зах 398 зх 8 сі Біу тТгр бій іви Афа тує цух ух ів Біз ар Б1уУ б1у їй ев й 405 пк їх 410 | 415 іу5 Ага Уа тує ів ні бій бі: го біх меї сіу Баг Мет дк Б1У 2о 355 30
Заг Мет. В сіу Бег Ме дв 515 аг Уді зез бак ів; Ні рРгОо щег 3 35 «45
АБе дів Рго Бім 5Б1Уу бій бер ма) вто Аза вів віх іжим чаї чек бів 358 855 ЗЕ шу Твт вам біб Її ух дер Ре мух сіу біз бег рго ке б1з «у вх я «75 «ВО бі аАхр ї12 АгОо Бго Заг аїз АїВ Аа Тр офух Б3у Река бак Те Ага «85 395 555 сід ви їеи бів вго щіу ха! фу Ак вів ізо іец узі біу ме оїу 505 53 мес бій хів сем бій із бе хек Є1у 31 де біу Уві цее туго Туг
З 555
ТвВЕ РгО ія ї16 ївез аг вів 5) біу узі вар ма! їец фев ет БІВ 530 5 540
Бен Ту 116 бі ву аа 5ег Ав Бег огво ве Хв ог бу ев тег 545 555 55 ЗБ
Твг іо ее Меї ідо Кго Бек Ті сіу йо АРа Мет АГО ве Меї АЗВ 555 57 5У5
Її бетг щіу вев Бу БНе ем їв іву АФ тТВгофеу рео Узі го Т18 58 ' 585 5 бі бек вез ЖіЖ ї1і8 сви Уві іеи Бе аБа у! Хі б1Ь Вес бу Таг 535 щю Ох
УЗЇ фени Мі віз ТВг їви Бер ТК їв бек узі ха) УВІ Тут РВЕ Кух вів 515 52
Су вне Уві мет і БвФе сі Вго Ї16 рго дхя Х1е фев су 5ег 1 525 530 535 що
Хе РВе ро ТВг Аго ма! Аго 61У во Сує ЖІ Аа 312 Сух бек ів 545 55 555
Тіт овне Тто Ре сіу Азо Хів їв Уві ЗВе тує бек ів Рго Аа вец
БО 5 еВ вен его вк Кіє Біу їси віз Біу ді РЕ біту 318 НЕ діа ма) уві 55 ВО Бах сух їі6 маї бек ТРр рве вне Узї Ту бле веє ужі Рго бію ТВ ує во 595 то
Ф1іу мет го ви бі» Уді їі бег біз Ріє РНе дхв Уа Бім дія Аг то 2 ті5 72 вів дів бій вів зе їж Ав" век «ії» ДиК «833» бета уніатів «щюх й віззозвааО «тоаквеЕтас щиасктост зссзсватоо сквасммї псадозою що затнакинся ссатхадсзов засїщіївІа гасвісаава двавахукав сстсваваса ї2О сазесавсе ходова застосо сс зтзісзсття коор еВе зоба а 15 вссттстсво оісссціттс зозкісадЕх зоссоісовс сазізсізай сатстевІсВ що виаківЕнсх хостсовмов сота стзтаксЕ стазкоїахв МИСТ щю їсзовзаює сс тодатоє сао К достзосяо Кіста есеї ЗБ зтаксзовиз сеокасссск зозаатсава Здасазаттох атассстосе зсзаЕтеВс зо постсвозу зе дестІвстаї зво ката засоЗазаса БЕЗ сставатоЗа Ззаїтоасост соотаттягх зсаахсссвї сасіттциа ссстоваїте 530 зкщотаттех зеІтокстоа щІКкестаро сЗоасксвсв зсзавмиваа засасвЕцав що зсізарзазо їстбасвзваз зітосвсоЗс зовзазЗаїо ссастовізя датросаї хо "Бо сесвІвоза) босттаваас осзаввак всає аа заоватаяої оахзавсса 220 зснесозсєо забзаиссає сасаозказа озссзавеса зостатвїЗо тоссовоаєча тва одссазтстх дозізассав ассавтсвзва Зоїсаавоса суєтевосат зи сесеє 840 тзтдовазса їщостевасз кре зсв сзавсязов сода суккаскто з «тов зотЯ сісзїоваза ЗСтТесСсаа свое сосвозухує заклітессу ЗБ «сс ай зов сво хасіоскокХ детовссацу гізавсатах аваїтооо 32 соозожесс озозсазаоаи стос застосо зтоатвастс їЗаїоатавх Мо схЗззаваЗє састівещхік зктіжзеєс єскоовосаа зазвоазатує важексесса 35 зІзазірося зсзоасВІоОсї сяхосазаві оотвзаїсаз ссвзаїзотає зді авх зва озвовсгтвоє зії сзвозавоса оазвахов за иааа ззазовкитах зо кІссаїсяво азссзсвВаї сао стетя сова Еста касу гаосокоВО 3335 тетдкссттї саєтасатсє тістозтаїх сстозвоЗїє зассізіхсє вастостовї 350 см аввсєс збієсвесст ссзавісава щагієсваою Фара «ітквасвох ї540 юр овізкає зассттстоє зостостасв зазопоссва зсіовавада астісткоай ї1нюЮ ссвороцтта зас макх осока зітре зоаіавсеєз зсавесеї 1550 озон сивто ооо сівсзссскї сааатеских свсзвосаво зазезвсвх зго тісстаксвЗ заїсзоозак сгботісавис сессії ЗІстївваб содкскоВсВ 1550 всасцаогза стврсстісства сєитардссії зсзасаює соатоввевЕ соч ювОоВ 3748
ЗОЗ ссКт хаєтВаВКкас астісскОе Косар вах кто ка актів 10 тссевтаекта ссузовмсои зассокстта сасокувсях тажетастах сазтоєтота зво
ЕсСтвсісх оствККееї сао к оЗєсскиКес сааВкатссї стВстТекВаХ 1925 аісіксссів сткотоєссо сові ВІжщесажах ЩЕТеТЕТІВК ССЦ Ко щдаззасвеса гтвЕсясужа ктстсхсств астІТассст сс ава сісосоВ що зт сзася КебВІве Зак оКатс ЗЕсІСТсОВЄ СТЕТОІКІЗ тест 2300 сствазасва забої «стат вісвотозаї їстїсазї зовстосавю іо кавостазав стозоявааз басекоа 2187 «І З «3їх 734 «а Р І «833» АгайнюювіВ ХВа1ї3Ви «Ва» 5
Мет фу ЄТ1у АТВ Тег о Уві аі8 бен АВ АТа їВг їЇ16 біу йзй вне ї 5 30 35 із бів Зіу ткр Азов Ах" Аа тТвг хів Аа біу ліз Мет Уущі Ту ї1е 2 їй З
ЗЖа зуб авр сео Ажа ів го ТВК о Зек УЗ! бів чіу сво Уві і АВ їх5 «0 35 мес бБег ем ї1о б3у дів Уго ха) тів тт тТвт су хег біу го 16 ща 55
Баг АБИ їгрівм БіУ Аг АГО РгОо Меї бер їі зви жЖеб чего УдДі мет
То 75 що
ТУР РНа чаї Ху бі іФм Хі мех фен ттр бек бго вв маі Туг Уві 55 За 95
Ашм Куб РВЕ АЇа Аг БВ фе» АБ діу клє бік Аї бу бе аїв Уві
КІ 135 310
ТНР омез узі вго Уа? Тут Ї36 Бек бів тВт аі8 вВго рт бів Хі го 435 185 155 біу бів ев яз тв, ен оРго бій Ре бен б3у 5ег б3у б3ію меж вве 355 135 180 ієр бег Ту сСух Меї узі Ре тВг мех щег іш Бек Ахр ет РРО Баг 145 КЯЗІ 155 ї50
Чтр Ага АїЗ МЕ ів Зіу Уші їжи бвг 31 РКО бек фею ве Тут бем 1655 170 їБ не фе те Уаі вне Тут сез ге бір бЗег Бгто Ак Тгр ін Ущі бег їщо 185 150 вух У ев мес 5 ів Вів ях ат УВІ без бів сій зем сСує СТУ о 205
Агеін Авр Уа) ТАК о Ахо біо Мет Аа ів ін уві 535 Ту аз АБИ а тій зо їі ші біу 10 фу тТВК омеї 51» ав їжи оц Уді ТВг мен бів дав 2725 аз 35 40 ніх бін б3іу АБ АБО ТК ви біз ТвгоуВі Ар обів Ар су бів щей 745 25 255 дго ївми Тут Яіу тВг мі Є» Аяп осів Яег тут іву Аїд вся вт мі 250 255 їх
Рго бів бій дж" бог бек ів сСіу сей АКо бек Аге Ні біу 5ег іже 275 о 7585
А18 ап бів бер вет Її2 ім фу дво РКО ів) ші Ба сем рРНе ту о 255 що ег іви ні Зів іуж Меє Рго бі аїа У 5 Аа Тнг Ага бек біу ще ца зу зе
Хі Ве Рго міх не Оіу Бог МЕї Ре заг ТВгОтТЯг аїв ав АВ РКО 375 338 335
Ні іу фу го тів Мія тТгРр бів їу5 а5роїів біз Веб нів туг АВ 340 545 356 ух АБр али АЗроаоІ Тук АТа тТвВг Ахо АЗВ бу Аїд сх Азв а5р А 355 За З вяр аг ази аА5п АБИ ваз вер вег го Бей меб бек ака бів їВкотве
ЗУ Кі ЗВО
Бег мет АФр фу ази меї ї1е Рг ніб5 Бга Так бег бБіу бег ТВг о бво
За 335 00 ак ЩЕ ага ага нів ее ТВг офан ех бій 03у хи 15 бів бет щег 305 щій 315 мет ЩіУу її біу БіУу біу Ткр нія Ме Зіу Туг лга ТУК бід два Аа 428 85 «о жи тує су ага Туг ТуУК іжм уз ів Ахр біу ЇВ бі» 582 Ага АкВ 435 45 з45 і бег Хі Хі Заг (316 РКО шіу СТУ Рго Ар іх ді Біу бек тут в 55 45
І16 нія АТа 5ег АЇз во Уші баг аг бек Уві цем Оу ВРО вух бвг
ЯБ5 Я Я 85
УВІ Ні5 іУу ес Аїд Меї УВІ го Бгто бій уз Її2 АТа Аза вк сїу 485 в 495
Вт ем їгробег Афв ів гемо бів го біу Узі фу Аг АТа вах уд 505 18 уві бБіу маії (і Хі бій 315 ів вій бій Не 5 с1їу Т15 Ажа У 35 Б
Уаіівеи ту тує Тк орго Бій Ї15 веб бів Аго дів Бу узі дев їв 530 535 ад іїам ви бек баг щен БУ Мей 5вг Жек діє Бек Аза бог Ва кву 118 54ї У 55 ЗО
Вес біу дев тТВе тТВе сер іФз Меї ів кго аз Хі Уві Уа! дій МЕ 55 5 575 ага ігц мех хв Узі 5Зег біу ака Аг Бег ів зби бою Тв оїйк ХЕ 58 ях ко бго уві ів» ЖХів ма)ї баг без хаі Уві ів мі Жіє Зек 5) їв Кі 585 Ов 505 ні їі бег муз Уді чаї да АЗа АЇш іви бвг зве Бі Сув маї жа! ож 815 БІ іву Тук РЕ Сузв'яне РН уаї мес Сіу тує біу Рго діє бго А5а хів 525 53 535 Бо ів суб жег дім Зі вне вто Тео аго Ууді АТО шіу ву Суб Х18 аїз 535 Ба 555 її Сух дів ме: УВІ Ре ТУгр оїів віх дхр жі Хі УВІ ТВг тТук аг ово ях о їву Бго уді зви ін Баг Бог Хі Е1у сен узі сію чі ме Заг їв дЕ5 во 585 ту Аїз Аїа та! Суз ма! їіє бек тТгр ХІЕ ріж узі Туг Ме: був уд! 53 Бах Тов го БІВ тТВт вух бу Мет вго іви Бі ха) їі. Уго одхр о Тук вве дія 705 7 15 20
Ве пі дів бів дів бій аі3 5ег АТ БгО бек вує йхр ХїВ тах 730
ОМ: ов ще Завідоркіх твНа!ідна «Же ЗО втоасозІїз зосазсоюсох созспосряс досзосоава гсозахсова засестоосе що зтазатсова зазосоатії сссоазссв зсзтсозтах тстасадсви зсоковесса ца ахвасистсс свссвзазсксв яттсеткове дтсасЗскя матка Зсадсстсаї зо хдсеовсзава сксекаттсоЄ козсвсоуа ассооієс Застава ссср 25 тацстовеий ккзаваових «вс К сова цКаї їзоохитасо клав ане щю шссвесатта таскстстсє зазстсаажк сесітсссва тевістессх строях ЗБ зсзсісоувси сваїсзізаєс сзесостазу ссваїтсааси сзіссозсвоа Ззаїстссааа 850 сзозтзоосо зсїсесвієс кдкустсоєс фгезсснкЗ: Ввавсісв кесевааве що зссоссосах совайіттаз ссесссЗвку сам ясовстаеєв соте тіся 540 «заваттвсоЗ оговссокУс Зазастазіс оЗсавоктяО зозсовтовІ совазсарая БО т-соаваспаої сасоавітах єсазковатє вассзвовсо всасмизин метотіатає 55 зсвесаваїв созсвенеєс оаотаваова зсавкостов вссассоїва сставесоса ТО знмиеизсваа скаїзскезаЄ ссоскжсВсІ са вВас сзаскястоа касвакеся то змузкеса зксїсоваєх сзутоосткс зсвзасорцоє сазесосоєу зоозгіЗакя 58 зЕспстнуєс тЖссувавЕх свсажовст задстсї свососноца звстсвци. во стік КттстсіКох зссЗскаї зосаоста согузасоа зсзавгоао 50 актізатсїсса заїа(раїсї дзассє секосєтеза созствозоЗ зе з заізововою тозсодабав осісовсоно затсаєєсся ядостиване сстасвадає що «ато: стоваксвас доста встав 5ізатвавах обаозставо за зніІзіавВОо сізствостх стос ссв ватахвовао таза овасесвовї ї290 зсоМмссови сттхеозусОї дзвксвавсо дутовоестоє зовхїсоваа тости о 12БО атозззаБех зкгЇсваюуза свавайввасх зстассткта ссаїттовтес зоазцвасва 1328 жав скО озовттсаса свое кОас Фахвашнни ство скЕтОх готово і1385 тхазавовос ХхсвхєваВіб свзеїЗостах сепежкостк свостовасх зазоєаки 1348 хрест тветК шіссвВововЕ сосЕсЗвса Фсевказеве севтссстов свхоаааЗих їх дзосазсихс свя сяка хаїсотазаа азазтмма дівасеквіс сваваокува ї563 зісатевовї хтотсосваз асаооіаїса скЗізсивов ват свева зага ЗБ ттцастІсяа їссссазаза ССстТІсоВИс ЗОВ стяа дазазовазаєт хасВаВасе з550 зсзасітсза застста) їБ9я «3105 3 «23і» 3 су т З ИН й «хі3» аАгавідсзовів «вагізва «ех» 3
Ме кег оту АВ ха! мев маї Аза Хв дів Аїв віз Уві бБІх вв Мей
Х З 5 їз їв віз БіУу Тер Ар ян 8)із тТВг Ті Аа БіУу Аїя Ві вам тує Ї18 23 ї5 38 їУж уз Щі вне Ап ів бів баг а5а руб Заг Уа? біз бі вм хе 35 4 зх чаї їв вет бек іти ХіФ бу АЇв ТВ оівє Зв тн ОТВге Су жек СТУ 5 Ба су УВІ АТаЯ АЖр Тго вве Бі РО АГРО КгО Мек фе Ії іврожек ще
Як то 75 Во
Хі5 зіву тТук вне узі 1у ет вмеи УЗ) Мої зер Тгр бек вго лап уві 85 о 85
Тут узі сви іш із біу аго Це фе) Ав БІ ВВ вію Узі Ту ем
КЕ о Но
Узі узі тВг ке УЗІ РКО 518 М Хів Зег бів Твг АЇВ Бго рго 1 335 а 135 їїє Аг б5іу ем зво Аа ТР оїем о вго бів бе тйг о Оіу бек обіу ТУ 338 335 зо
Мет ква зем же туг Су мех у! ее біу мех бе без Меї Бго ог 345 . з зм ї850
Ттго Звг Тгр аг іо МЕ іо Ф1у Уві їФв вне її Бгто беж ви Уві! 365 170 ЇМ тва ра БНе рем Веб о маі Ве РВв іве Вега би жек ВТО вв Ттв іже іо 385 ІЗ
Уа баг се «Фіу Аго мех ех оо аїв вух аг МаЗ вер осів аг уви 155 230 то :
ага біт ау сій ахр Уа! его сіу сім ве Аза фев оіем УВІ Зв су рити 5 я ібв ої іє шіу бу дів Тготве її Ти бів тТук ї16 Іїє бБіф го 525 236 235 240
Аі« азв бів за? ТВг Або Аяр Мі Ар хів Аїа маі дер ух о бів 245 250 25
Зі зує ву 1 Зі аіа бів їв біу бен бек Ткромиі АТБ Ага РКО 5 278 ма! ук біу Яїу жег Ті Меї 5ег Узі ів Зег ага ніх біу зЗвг З 275 288 285
МеЖ бог АГРО АгЕ бів біу бег сви хї6 ябв ро ву Узі ТВе ев ма 250 235 о віх Звг уді нів іх хг ме го ар ТВ су Бег Ммеї ак бег 4ї3
ЗЕ БЕН КЗ зго
Каб РВЕ РО Мі РВЕ Бі Зв МеФ РЕЖ хат УВІ бі «1у аа бій бго 385 З З35 га ні ом зво тРЮ Авр бів СТВ АБ іо Узі БіуУу єї: 51 Бін я 34 345 З5а
Тук Бга Бек Ази Ні біт хр ар о жог бів й5р Ар ву Ні фев го
ЗЕ Б 5 іго їіє бег Аг бів Тр оїйК 5 МЕ б фу АвО МЕЖ РРО Ні ТР
За 375 Зв дів Мі ЗіУ ТВГ їбоу Зер ТК РВБ Аг нія ту ек вів у! бів бу 385 ЗО 395 33 віз ія ту оз БІ АТа Б3іу Зак не ші жів бі іу Ту Те 5ів 805 515 3 чаї аіз терору Тр ТР ів Ага о15 АБ біз баг діу бід вух 0138 920 ЗІ 30 у б3іу вне бує ато ї12 Туг іс» Ні бів біб б1у РВЕ рез Біу Бек 435 50 345 да ага су Бег Хіт Уа бек сем рга бі щію ав біу тВг ді Бій я 455 ч6о дій Азр ввбж маї шіп діа 5ег АЇв іво Ма! баг ій бга вів їв тує че 355 425 «во жк мух Ахр ан ев вух ОТ МіЗ ТВе ОХ Бі рго Азв не о Уді міх 885 чо 455 тго 5ег Біз тТве о тТВг бух біу бек 3іе ТР Ні АБА 18 нія АЖхо Ко ща 505 ща
Ту Маї іуб Агро АЖ іжо та Уві біж Ув! Бім ібо бів їїє без їв 535 530 55 іп вів Зв є1у ЖХ18 аа у Уаї Бей тує Тук ТВг вго ій х16 цем 530 5 8 сі» Бі АТа с1у УЗ! сіу ХІЄ рей іем бег да мек щіу Ї1ж бег бог 545 550 555 55 тег Бек Аїя ек ів єн Хіє бек аТа ев ТВе ТВгобНе жві| Меї ев зк5 5У0 их
Фго ів їІ1Т2е аї8 Узі АЇз Ше: аАкО Бем БІ йхр ів Зак біу Аго ага
ВО 58х що
Твгобям реу ем ЗВг о ТВе хів Рго 315 зво ї18 АЇ баг ви звю ма 555 ща ІН
Мжв Уші Ії хек АБИ іс УВІ нія меї АБп 5ег хів чаї ніх аіз Ук ща 515 БЕ зши Бек Те о Уді бек уаі Уві ів тує РВЕ Сух рве вне узі мех бу 535 БК 535 Бав бМе БШіу вто аів ве а5а Її2 ів Су 5ег ШТ жі вне Рго ТК АГО
Бех що 55 ча) ага бі Хі Суб Хі дів Ге су АВ іФги ВК вВЖ св ІЗе сСух
БЕ ва 5
Щажр Іїв хів Ущі тТвготуг бек озера Узі сем вес вух беє Хв Ту
ЕХ во 585 їжи лій Біу узі не сіу має Туг ід 116 мвї бух Сух Х1е6 Бек їте
БО 55 МЕ
Уві РВе Уві Рве Хіе тя УВІ РгО ім УВРк обу Є1у меж ро ім 1 705 738 735 72
Уві тів тн бів Ве бе бек мі біу а)і8 ага бів ків бів Аа АК 725 730 735 іт вва ши
«аю п лик «і3» акабініовхі тба3іваа «Ню зкмесюва скоса состатісї стос дсаастхуКх зсвзеоовіцо ЕІ пасзасвая ствутсосвоаЗ зостокоїко сасавтзанваа зодааттева комер 128 «цс гвогаоО хецавовтсї ззскосвока зе свстез скоВІдсеє Ковка їі вквівстсс ЗащофЄ хзасвцаск? здексавксвіс ссатостаєт зітлосстсв ай актекствох КЦКТоОТІ стафевато СтаТодКете сазафоєттв госртост: ж хтздозааос сотсазватоо вер сто тов КоВеВсЕВої хостах ВЕ ЗБ
Іахкідвов «кідкаксасс товка осчастміди зізєосівеє все тсанх «о щкстоовО аск сїх зесітасквх акоФетєтев Зако овхасевта «ЩО ксеавскца паса фЗаТОКсСКІХ БЕсВКсКСЖІ сет КК ІКТ з зссцісктєст Фссфосссва фісссяеваоо збосісВівВ дсввавотко затосетпаг ща щвсзазосвов іссттсадяє асссочх сесозааака со тоЗкаа дес кетеа ка ти ково ЩІК коОВаК фореЗограв ясаассяаа збовнЕВжаї застосо 25 дсзруатовза скаствнкоа зсвідатата зстоїората зедатсязах гзавтеВІвЕ 288 озкодсевразе ажнюостозо кові хасї заоссодіса задозоззав сзссвізаох 5ІО як Щтескє десаїорваб квсзаіЗас висно веесВІЇКаах ев 9 евсаскат стрмнивсек ксасразаза зіва стоцавУєзи заооВотоєх Зк їхасссвс звкіКсеє хз аї сон воа аїсавссаво зсзковаваєх ща чна зозассктех зросвезоак сдаворактаїс сасссевксв ЗзазоваЕ ово ехтоззааїв зкотесаттє тссВекоВІК тсзсотсава савеввасах оразазаавя ЗЯО зкдектсвся сосеаїВо МаСЖЕЕКЕТКЕ ассеткВОвг відозвется звізсапоза ї293 зЗкхсазовцо вопеосозо хзохатоцою зіхоЗадого о3гбасаває засаїодааз 355 зрвсазава овозвовід» зісвоцвсво зазозаовіа пвестввасо сатизаєтт 3525 «вісзадзао оотхсскзов зістсввов: оокісваквоа зкесвЕщоєє чо 3380 зраессцото зевсаратії суасазосо стос КтоВ ктавссвакс зак ах 3440
Хксавацясс тесісвазоз зсвізканех: зїсстаска здуєвевКкс зіжсовааса 300 асаеващнми хеаткіовса соте свї дакосіЗоао зсавОсевас акеВоєсва З550
Фцвоєтоцас ттсВаааст їспосВеєтє фовсюєвіся ЗсфОаріКся Ккастасика 3525 ссодсавятсє фун оратлгсвов зссстастнї севсвтцоз датквогес збо зсстсаеснї сстїзееІаї заомосаєзе зсвасстіхО ат смне звсавтацєх ках
Фккмавва свсткакови тсткесковІ созвозассї гЗсіїсїєвс сковасв ї505а аксстдакаа свісісквк: осока зісссгеватс фтрстсвасах двасаокахє ВЕ)
дссасокоз ссткатсаяс свтажосво дтосестаст зстрсссєї сектоаковвї 1920 ттІсодіссТо стссавасяє ссісєвієва двовегетеє сгаастедает ссосвозате о зкасеаса сстесесасту сассстссво аістохоасєа хазвтсвтсас ствсаве мо сссокестоє тсаватссає таозаствост орі сзатотзсяє зассвтатоє ка тусаєстсаї оаоссістої дітссаттваа оєсесодана стзавовсає сссасеєцнма 25358 уссассзсво закссістс хосхозаросх аЗасавессо взоссостаа ззасовоїова ВИКО «30» 33 «2135 737 «чиї» РЕТ «243» Агабійорхів свміїзва «Нюх 1
Мет Аго Бег уві уаі їгн узі Аз івуи аз аїів А!їз 16 61У да мех 1 5 10 15 їв бій сіу ткр АБЮ ах дів Тит ї18 аіа Бі дів Уві ї3ів туг хів о 35 30
Щух буб бів Ре міх ви бів вк: і его ух хів бім бі сво Ж1е 4 45 чУаії вія Меї бег іец Їі6 б1У АТя ТВтТ вец Її тТНгОїВе РАВ «ет су 50 55 Бо
Бго уві баг Аж суб узі С1у АРО Аго Щек Меї із жів іву бог Бек 55 79 75 ва Е
УЖі без тує те ви Бог хг 3З1їе уд! Меї рве тТко ет рРго Ах чаї 85 за 55
Тут уаії йев іви ейе АЇа Аго ів) іФу Ажр СУ Ре біу її с1у ев мою ! 15 о дід маі тТВгоїев Узі вго хів 15 Ті кехг Єїн Тіг дів веб бак 1 128 125
Те аго с1у ен ів ажА ТМ Ре Рго сів Рв Су С1у бег бу су. 150 у 135 188 у
Меї РВЕ іец бек Тук су ї2ги Уа Ре О1у Моб ек їв Єв ів бек 15 350 155 1650
Рг Зжг ТР АгО ем Мет беу біу Уа! ів бег Хе рго ек ї13Зе АЇїа 355 37 375 тут вне Ууаі зво 818 Зі Ре Ре фец вка Бім Баг Вго за Тез ем 155 385 ї
У 5ег ву С1У Акф МН Бр бів Аїа АгО бій Узі веб бів Аго цев я 05 га 51 АгО Бій аа Узі Хе біу Бій сей АЇїя ів іш уві і оіу 2 щіх 20 їви біу ді іє ув жо ТВг Жег ІТ біз Бім Ту Узі їі бі. ркео
Ка ЗИ 235 чо
Вев ак він Бі) АБ бів біу Б3іу аа Сію ву БгОо Аа гув зве сів 245 5 255 ів ув во туг іх Бго Бі Азв біу бік Бегб Те мех лів Був Рго 350 255 Ка
Уві уз біу біп бБег Берг сво АЇв сви Аїа Бе Ага бів бі бег ох 275 зво Тк; іви рРго ага бі Біу Жак ву Ме АБ; го бер узі ТК фено РБе су тя5 З ет їі ні біз АЖ іду го баг бі аж Мет Ах дія вс ер Ага 05 Зо 335 ве заг от ів Кпе бго Ахаи Мет сіу баг 316 ів) оіу Меї Меї віх Аг
Зах зо 335
Фів бів яеу бій тгв Або РКО Сів ага ах Ах бів аа бег зег ав 330 345 350 сій Аа іш АЖАа фа ди Заг ргО ей іви его рко бТа ТВг ТВК бїМ зу Зо Як
Бко Ажв Ази ТУ Мія біб Аго тВг озаЗ бі ївВг Мет ніх ага ага бій
ЗУ 375 ЗО
Заг щег ібн вва мет із Ап уві біу біб тВг Аїд тт о аїя ТАК хат
З85 зо 595 зо
Те МУ с1у сту НЕ Фів сен АЇВ ТгроБук тук Аа Ажр бує уд Фу 3 5 із
Ав ази шіу у заго Уві Ап СІУ О1У мви бій АКО Ме тує УЖ іх
Яга 425 430
Зв Фів ТВг Аїд аби Ай АЖп ТК о Аява аАха І1в бго Бе аг ага аго а що Б І 5ІіУу баг бен іФгз его вве ні Бго Бім бі Ажр біу ві азв о шів Узі 450 35 ЗБ ап осі тут маї бій АВ АЇВ АЇв їжи ма) бек бів дів баг Ме Моє 455 479 575 Яка га іу «іу муз бік біз Тнг о АЇв меж ми рго бух сів чаї ух А5р
З5 95 95 бі рго біу Ттроаго біз без ух бів ге бі Уві бух ага вія ем 50 ще що мез ма 5 Уа ту без сію Хі8 вен бій сіл Ре дів віх 316 АБВ 55 що 525 біу узі меж Тут Тук ТВР бро бів їі свв біз зів ТК 1 за Бак 535 5о ер ів во ТВг оаби зви сіу ХР бек АТ бів еко АТ бег ів вви 5 550 555 Зо
Хів бек Аїв меи ТВ отв іфвоїеу Мет зву Рео сСуз Хв без уві Зак 555 570 55
Ме аг іви ех Азв очаі ТбгоБіу ага ага Бек ви мех ре) бек ВР
ЗЕо 585 що ї16 Рго Хі ім 510 бо бу збо Уа тик без узі ї16 іх бек во 595 що Ох
Уві ака іо біу «1Уу 5бг ЇЇ АБО АЇВ іо Ті бег ТВтг Аа его ха 5 5 Іо
Твг узі ТУР ви баг су те уві вес фі рве Біу Ааіа Хе вго Ахв
БІ 5юЮ Ба що їі вв су Зак «ім Х16 вве вго ТвгоЗог Ууді аго БТу їм 5 хв ах БІВ 8555
Тит їїє Суб віз мее тТВе оМБе їго Кіз Суб АБО Х15 16 хі тТВк о тТуг ва 555 Ба
ТЕ ее вго УЗ МеЖ івр куб ет хів щіу 316 віз шіу ма? РВа Бі 525 ВО Бах хі це Та Хі Уві Сух віз Узі Аїд Чтр уУуді ке чуаї Туг іши ух
КО ах тю
Узі го бів твг бух бБіу ВБї Рго ів єїв уд) Хі его бін вве вве пе 710 т ША
Зег узі Ту діа ще ів Бій язв Аіа із аАЇв ет вив із 5ег ах ти5 730 235
«у «830» 34
ШКОЛО
«13» агавіборвів тваіїзвх «Же їх авгозозвото задтосттої тастжтадсє зстосВахзо повакаївІї зсвозвстов що ззмсазсєнка ссахкосвОй зіва: свсвІєвВаЗ ваозахіксв товща а 120 ассаааоз їзозаовас ваїсотооса зок стктся стоОзавссас статева 180 зе стстє Зісстоїстс соузєззазтя пдозавоєвраї савтосттах асістостся 240 петстстатк сІєтОаогаз сахтотрато стттщатстс ссватотета соток зо ктсвсваоаВс Фест с торВаїс зоїсузосва овес сссавтєсас 35 нмежоваа ссосвсевсс созозєсзоз пон тясієз зкастісє всех 4320 озахтссозіз сотої оссоїзеос ссСотоеа опаєвесЯсї ссвадвяТеВ 880 севзастоза зостовтяст тозтоссто ссзаветесвї ссаетвсста ствах 530 пвасттісї ссстЗКстоВ зієтєсвазо туасітуїсВ бОсвааоЗєсо гатодитова БЮ шетвавсаце сссіосВоВо зсіссООє зозЗазаато стссВоосве ВстжцЄсО БО сом созво щит срзазазцас асзісезатяо азозахаїях пзегодасса Та овсезасоава зааасозаиЗ брата ссссавоса зазазсв: зазаєтатя уко чатсєвзазво зхзовсавік зІвавтавс зазссаато задово ССО ЩО зво заезвевсао євІЧсїзеєсо ссдосодех сесісаіозЗа сесастівє ВОЮ встстссета шевосятіса Хозоватсте сетссспава асатовакас ВтКаїкескає З висятостсЕ зссскзатаї зоовасіяїз ссздоавсоз сзооазовка везе сссва зо тові ссво зозовазсаз їбазрватаої тствассазо яіовзавасєї аавкизкссї ЗО стостттєте сосвавссви їозассобат писсасєвсс зосаЗвесЯх сщевессато 3350 катсздесзас зозосаосєх сіхтаєувся засотозат звасаосває достасазцє їімю мазесно ватосавтї досотзовао таїзатовса зр васос ззажатаю 15 здавісвако заоозвІїаса заз саї зом зааскоссай сзакавсасє ї350 засзасветс «стттЕсосо зсосозатсв сетстстесї їссассгава зозівакодї 1385 свімихау гозагодшата сосісваВсх астдєветто ховосеаває гесовоаа 3430 «сзоваовій зздесоаваєс сдсаатотто ссавзозаою гезаоовіза ссвоВКтОВ і509 завЧчоацссоа звовзессказв уассавово сік аОО сао аск сво8а 15 тосвзсзаї «іосзозазї зваіщоваху зхоїзЕїаїв сассхсвав: зктвоваЯва ї1530 зсздагвтох сзарссттЕї пзсзазсстт зозатавоаїо садвцієтоєс аісоссксте З58О0 аззасосст таиссасаст сестозтястї єсствсахтє стожстссах вано то ї1730 всестксов ссассссках тскавтаств ссаства ска: зування з ас св верусхсвас зжмжососев нівіслвсва кванта Зако зщщО вуститехсв зак зимує севважавкеє ства ВІВ їі
ВКТКСКаКшК ОсОВЕКІККОВ завссвесикв сего ковВ секс стеки 358 акодісвект вкжеткісск вцссаакїх завесевІв массмквов ис 2038 зсжсакцкав систе: сдесосяВи век ксоє вес зкосвовувов «ЩЕ заоЗовакос сесезвазва: тассткевВев гесххкуско сов осваа Зевса 233 каски саке скс гевховах ов 235 «НЕ 15 «оо а «З» ДНК «АК Мтузна послідонність слі» У «праймер для ПЛР-амплнвікації неуклестидної послідовності, яка кодує білок, якня являє сссою транспортер цукру в тоненнасті І Вей снівокіх «05 15 зннасзаої стесвсвава задсеВОсІ звівазацої сих 48 «ЕН: ів «ЩіїЇ» 48 «зл» дик «ЯР3х Цігтучна послідовність кН» «аа» У-праймер для ПЛРамичніфікації неуклеотидної послідовності, яка кодує білок,
ЯКИЙ являє собою транспортер цукру в тонопласті І Делі умівміх «не 35 й зннмассвсї ссрізсалоз ваза ссср чн є «а «а «ЛЕ» 25 «ма» ДНК «ВРУ» БітУчна послідовнить «ВА «аа» З «праймер для ПЛРамиліфікавії неуклеотидної послідовності, яка холує бідок, який являє собою транспортер вуКру в тононласті 2.1 ей Унівєтіх «ЗЕ З й «ссозаасог стосвосваї вето зх «ВН 18 «же «зл» ДИК «813» БЦітучна послідовність «да
«иа» У-праймер для ПЛР-амиліфіканції пеуклеотидніх послідовності, яка кодує білок,
ЯКИЙ являє соїмно транспортер цукру в товопласті 2.1 Вега тнгнттіх «Ж» 38 зівюцю сани поке 23 «ЕН 19 «аз ДНЕ «РУ» (тузна послідюевність «ДЕ» «шей» У «праймер для кільки ПЛР для амиянікації фрагменту молекули нуклеїнової кислоти, яка колує бик, який являє сойою транстюртер цукру в'тонопласті | Вега кнівагія «Же 38 | І 33 оствутаєте ТОВОеСЕсяХ дов 33 сан що «а 25 «хіх ДиК «гії» Цтузна посиовність аа» У праймер для кількісної ПЛР для ампліфікації фрагменту молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує Білок, який явняє собою транспортер цукру в товоплаєті | Я унінотіх «ве 20 шк зх кстєвосвоє тестах с га «ах зі «дії» ДНК 1 Нреучеа послів увність «зд» «еа3» У праймер для кількісної ПЛР для змпліфікицї фрагменту молекули нуклеїнової каолоти. яка кодує білок, який являє собою транепортєр цукру в'ононяветі 2.1 Дей «даніх «ОП. 24 23 ззаазереве СВО: о «не «а» 2 ха ДНЕ «Я» МЦітучна вослідовнсть «Мр»
ск» З праймер для кількісної ПЛР дях амиліфікатії фрагменту молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, ЯКИЙ являє собою транспортер цукру в тонопласті 2.1 Дей тчнірипх
«Мр Я» 34 сао зем се
«Ак
«ан» 33
«ід» ДНК
«І Цучна поеліловність
«2002
«ді» Ж праймер для кількісної ПЛР для ампвіфікації Фрагменту молекули нуклеїнової кнелоти, яки кодує білок, який являє собою транспортер цукру в тонопласті 2.2 Вей ен
«що | в взараєоаоє зскестотеоє со :З «не 24 «ан м кад ДНК «ЕРА» Штучна послідовність кад «жа» З «праймер для кількісної ПЛР для ампліфікації Фрагменту молекули нуклеїнової кволоти, яка кодує лок. який являє собою транспортер цукру в тонопласті 2.2 Ве тніватіх
«Же 29 тка кс стдтстесяо азоб за «Ма» ДНК Що «РУ Бруузна песзівавніть «АД клей» уУ-праймер для кількісної ПЛР для ампліфікачнії фрагменту молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою транспортер цукру в'товноннасті З Вега свівитія «Ме 55 сеіестето ствстевоє 898 24 «20» 26 ах «і» ДНК «яІ3» Цітучиа посліловиють ках пев у» З праймер дня кількісної ПЛЕ дя» змпліфікації фрагменту молекули нуклегової кислоти, яка кодує білок, який якляє собою: трансцпортев цукру в товопласті З Деу твікаті «ню» ЗЕ І їсввкека стос а 2 чар й свій» дик «ай МЦееучна послідовність
СТЕ ча ра
С Кл хуя киух почує хеї і; мето ГУК судах їх, У 8. с гоже всих зх - же 5 «праймер ляя кількісної ПЕ для амалнфрікації фрагменту молекули нуклернової кислоти, яка кодує фактор елонгації і-альфя | Лету тніватіх «ню» й? «сасзхаєт песавебтта се 3 «ВН о «тм і «о» ДНК «Р Тзучна послідовність «Ву: каа3» У праймер для кількісної ПЛЕ для амиліфіканії фрагменту молекули нуклеТнової кислоти, яка кодує Фактор слонгації Т-альфа І Ледо евівшріх «Ох яв тасізасссї: сосни в гі
Claims (12)
1. Вектор або мобільний генетичний елемент, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, де згаданий білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, є специфічним для сахарози, причому специфічність згаданого білка, який являє собою опротонну помпу тонопласта/"антипортер цукру, для сахарози є у щонайменше 5 разів вищою, ніж для моносахариду, причому згадана молекула нуклеїнової кислоти включає молекулу нуклеїнової кислоти, вибрану з групи, яку складають: а) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка відповідає послідовності ЗЕО 10 МО: 2, або молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 80 95 ідентичність з нуклеотидною послідовністю, яка відповідає послідовності 5ЕО ІЮО МО: 2; БЮ) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка є комплементарною одній з нуклеотидних послідовностей, зазначених у підпункті а); с) молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю, яка відповідає послідовності 5ЕО ІО МО: 1, або молекула нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, амінокислотна послідовність якого має щонайменше 80 95 ідентичність з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1.
2. Еукаріотична або прокаріотична клітина-хазяїн, що містить вектор або мобільний генетичний елемент за п. 1.
3. Трансгенна рослинна клітина, яка містить як трансген молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, що відповідає визначенню за п. 1, або містить вектор або мобільний генетичний елемент за п. 1.
4. Трансгенна рослина або її частина, яка містить щонайменше одну трансгенну рослинну клітину за п. 3.
5. Насінина від трансгенної рослини за п. 4, яка містить як трансген молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, що відповідає визначенню п. 1, або містить вектор або мобільний генетичний елемент за п. 1.
6. Спосіб одержання трансгенної рослини, який включає такі стадії: (а) введення як трансгену молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, що відповідає визначенню за п. 1, або вектора або мобільного генетичного елемента за п. 1 до щонайменше однієї клітини рослини, і (р) регенерування трансгенної рослини з клітини, одержаної на стадії а).
7. Спосіб підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослини, що передбачає надекспресію молекули нуклеїнової кислоти, що відповідає визначенню за п. 1, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, в щонайменше одній клітині згаданої рослини.
8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що надекспресію забезпечують генетичним модифікуванням ендогенного регуляторного елемента, який функціонально зв'язаний зі згаданою нуклеїновою кислотою, яка кодує згаданий білок.
9. Спосіб виявлення рослини, яка є придатною для утворення підвищеної концентрації сахарози в її органі накопичування сахарози, який включає виявлення молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, що відповідає визначенню за п. 1.
10. Олігонуклеотид, придатний для застосування як молекулярного маркера, який є діагностичним для виявлення молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, що відповідає визначенню за п. 1, причому цей олігонуклеотид вибраний з групи, яку складають: ЗЕО ІЮ МО: 15, 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 17, ЗЕО ІО МО: 18, 5ЕО ІО МО: 19, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІО МО: 21, 5ЕО І МО: 22, 5ЕО І МО: 23, ЗЕО ІО МО: 24, 5ЕО ІЮ МО: 25 та 5ЕО ІО МО: 26.
11. Застосування білка, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, для підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослини внаслідок надекспресії молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує даний білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, при цьому згадана молекула нуклеїнової кислоти включає: Зо ї молекулу нуклеїнової кислоти, яка має нуклеотидну послідовність, що відповідає послідовностям 5ЕО ІО МО: 2, 5ЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІО МО: 10, 5ЕО ІО МО: 12 або 5ЕО ІО МО: 14, або має нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 80 95 ідентичність з однією з нуклеотидних послідовностей, що відповідають послідовностям 5ЕО І МО: 2, БЕО ІЮ МО: 4, БЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІО МО: 10, 5ЕО ІО МО: 12 або 5ЕО І МО: 14; і) молекулу нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка є комплементарною одній з нуклеотидних послідовностей, зазначених у підпункті ї); або ії) молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, що відповідає послідовностям 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО ІЮ МО: 11 або 5ЕО ІЮ МО: 13, або кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 80 905 ідентичність з однією 3 амінокислотних послідовностей, що відповідають послідовностям 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІО МО: 5, ЗЕО ІО МО: 7, ЗЕО ІО МО: 9, БЕО ІО МО: 11 або 5ЕО ІО МО: 13.
12. Застосування за п. 11, причому надекспресія забезпечена генетичним модифікуванням ендогенного регуляторного елемента.
ші Бетті АПМТа ВУТ8Тал о ВУТБТ2а | АПМТЗ | ВУт5тЗ ши дише 6925 |) 66167 вра; | БВ ОО) ідентичність оте тва 7, Таж ява 0007235 | Подібність ; ! Бе | 5 ж БТ Б Ідентичність ВУ ше тв тт ті 007495 Пошбність вже | БИ | ТО Бо 6495 01 ідентвчність вима ши ва ва 7510 Подібність ст ва Ба Б 00 ідензичність ком ва ! ідеєжнчність ли шашишщи ї5 7595 0 Подібність ще | БО 00 ідентичність
Фіг. 1 ши ши ш "УТ ! нин ЕН
ФІГ. 2 0 ЯВанадоппа ши -57 «во щАпвраціовг ШЕ по ! й ! ще ! ! ! ок Е Е - ЗО мк | ! ЩО 200 ШЕ. ! 11 ні ЩІ ш Го ! Е ! ! : ШИ ши ШІ Ши ШИ в З 4 5 Місяні
Фіг. З
НА ш ж БУТ ни . ово ВУТВТЗЯ т 0.00 т || ш ВУТ5Т22 ко щи. ї і З ї Є їе 3 ; 15 щ ВОЮ то вовя І То ще 5 ж | є ак Ї у . ; в ям. к - що Кк. аа, НН ї с и Я щ « и ни и 2 З 5 Місяці
Фіг. 4 Бо !
- . - Я Глекоза з. 07 | 02 «Фруктоза в шко Я Пукроза зо Я Бе й 2 2 ! чх " ! тек е4- 3 Шк. З 5 І Місяні
Фіг. 5 Ба вв шо ВУТ5ТІ т | ге ВУт5тг : ши Ще й | |. вом | . А оо --ИЙ. ІЙ ШО й ! І Місяці й
Фіг. 6 вет ВЕР ВИТВТІОЕР ривоене ді тонн нн й и | КЕ Ще - ва «раю ро хо : За вав вий вича пив п пжв
Фіг. 7
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102014005337.7A DE102014005337A1 (de) | 2014-04-11 | 2014-04-11 | Tonoplastidäre Protonen/Zucker-Antiporter-Proteine und deren Verwendung zur Erhöhung der Saccharosekonzentration eines Saccharosespeicherorgans von Pflanzen |
| PCT/DE2015/000170 WO2015154741A1 (de) | 2014-04-11 | 2015-04-10 | Tonoplastidäre protonen/zucker-antiporter-proteine und deren verwendung zur erhöhung der saccharosekonzentration eines saccharosespeicherorgans von pflanzen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA121387C2 true UA121387C2 (uk) | 2020-05-25 |
Family
ID=53610718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201611279A UA121387C2 (uk) | 2014-04-11 | 2015-04-10 | Вектор або мобільний генетичний елемент, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, і його застосування для підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослин |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10961543B2 (uk) |
| EP (1) | EP3129394B1 (uk) |
| JP (1) | JP6789922B2 (uk) |
| CN (1) | CN106471124B (uk) |
| AR (1) | AR100122A1 (uk) |
| AU (1) | AU2015245634B2 (uk) |
| BR (1) | BR112016023624B1 (uk) |
| CA (1) | CA2945416C (uk) |
| CU (1) | CU24477B1 (uk) |
| DE (1) | DE102014005337A1 (uk) |
| DK (1) | DK3129394T3 (uk) |
| EA (1) | EA201691953A1 (uk) |
| ES (1) | ES2778273T3 (uk) |
| HR (1) | HRP20200471T1 (uk) |
| HU (1) | HUE049853T2 (uk) |
| LT (1) | LT3129394T (uk) |
| MX (2) | MX368206B (uk) |
| PH (1) | PH12016502024B1 (uk) |
| PL (1) | PL3129394T3 (uk) |
| PT (1) | PT3129394T (uk) |
| RS (1) | RS60274B1 (uk) |
| UA (1) | UA121387C2 (uk) |
| WO (1) | WO2015154741A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201607612B (uk) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3802811A4 (en) * | 2018-05-29 | 2022-07-13 | Monsanto Technology LLC | TRANSGENIC PLANTS WITH ENHANCED CHARACTERISTICS |
| EP3835309A1 (en) * | 2019-12-13 | 2021-06-16 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Method for increasing cold or frost tolerance in a plant |
| CN111187777B (zh) * | 2020-02-06 | 2023-03-24 | 东北农业大学 | 大豆GmTST2.1基因在大豆育种中的应用 |
| CN112745377B (zh) * | 2020-07-22 | 2021-09-03 | 宁夏农林科学院农业生物技术研究中心（宁夏农业生物技术重点实验室） | 马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因在提高植物光合速率中的应用 |
| CN113025556B (zh) * | 2021-04-26 | 2023-08-29 | 东北师范大学 | 一种小麦原生质体、细胞质和叶绿体的分离方法 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3612384A1 (de) | 1986-04-12 | 1987-10-15 | Krupp Koppers Gmbh | Verfahren zur herstellung eines zur verwendung als blendingkomponente fuer vergaserkraftstoffe geeigneten aromatenkonzentrates |
| US6007086A (en) | 1997-04-18 | 1999-12-28 | Hopkins; Mark D. | Electric ski binding system |
| US5954357A (en) | 1998-04-09 | 1999-09-21 | Golling; Eugene J. | Apparatus for gliding over snow |
| US6383776B1 (en) * | 1998-04-24 | 2002-05-07 | E.I. Du Pont De Nemours & Company | Plant sugar transport proteins |
| AUPP590198A0 (en) | 1998-09-14 | 1998-10-08 | Griplock Pty Limited | Sporting equipment binding apparatus |
| US6528701B1 (en) | 1999-03-02 | 2003-03-04 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Rice ubiquitin-derived promoters |
| US6936467B2 (en) * | 2000-03-27 | 2005-08-30 | University Of Delaware | Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides |
| EP1207204A1 (de) | 2000-11-16 | 2002-05-22 | KWS Saat AG | Gewebespezifische Promotoren aus der Zuckerrübe |
| US6983952B2 (en) | 2001-10-02 | 2006-01-10 | Eugene Golling | Apparatus for gliding over snow |
| US7416191B2 (en) | 2006-01-17 | 2008-08-26 | Tadashi Yoshino | Binding device for snowboard |
| WO2008070179A2 (en) * | 2006-12-06 | 2008-06-12 | Monsanto Technology, Llc | Genes and uses for plant improvement |
| DE102008064184A1 (de) | 2008-12-22 | 2010-08-12 | Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt | Verfahren zur Steigerung des Saccharoseertrages beim landwirtschaftlichen Anbau von Zuckerrüben und Zuckerrohr |
| US20110193323A1 (en) | 2010-01-12 | 2011-08-11 | William Rivard | Temporary binding apparatus |
| KR20110085729A (ko) | 2010-01-21 | 2011-07-27 | 경희대학교 산학협력단 | 당의 액포 내 수송에 관여하는 벼 유래의 ＯｓＴＭＴ1 유전자 |
| KR20110085732A (ko) | 2010-01-21 | 2011-07-27 | 경희대학교 산학협력단 | 당의 액포 내 수송에 관여하는 벼 유래의 ＯｓＴＭＴ2 유전자 |
| DE102010013166B4 (de) * | 2010-03-27 | 2012-08-09 | Technische Universität Kaiserslautern | Verfahren zur Erhöhung des Samenertrages sowie Förderung des Wachstums von Pflanzen |
| WO2012103480A1 (en) | 2011-01-27 | 2012-08-02 | Brendan Walker | Board sport bindings |
-
2014
- 2014-04-11 DE DE102014005337.7A patent/DE102014005337A1/de active Pending
-
2015
- 2015-04-10 PL PL15738237T patent/PL3129394T3/pl unknown
- 2015-04-10 PT PT157382375T patent/PT3129394T/pt unknown
- 2015-04-10 US US15/303,488 patent/US10961543B2/en active Active
- 2015-04-10 CA CA2945416A patent/CA2945416C/en active Active
- 2015-04-10 CU CU2016000153A patent/CU24477B1/es unknown
- 2015-04-10 WO PCT/DE2015/000170 patent/WO2015154741A1/de active Application Filing
- 2015-04-10 MX MX2016013211A patent/MX368206B/es active IP Right Grant
- 2015-04-10 EA EA201691953A patent/EA201691953A1/ru unknown
- 2015-04-10 AU AU2015245634A patent/AU2015245634B2/en active Active
- 2015-04-10 JP JP2017504236A patent/JP6789922B2/ja active Active
- 2015-04-10 EP EP15738237.5A patent/EP3129394B1/de active Active
- 2015-04-10 LT LTEP15738237.5T patent/LT3129394T/lt unknown
- 2015-04-10 ES ES15738237T patent/ES2778273T3/es active Active
- 2015-04-10 BR BR112016023624-6A patent/BR112016023624B1/pt active IP Right Grant
- 2015-04-10 HU HUE15738237A patent/HUE049853T2/hu unknown
- 2015-04-10 AR ARP150101085A patent/AR100122A1/es unknown
- 2015-04-10 RS RS20200358A patent/RS60274B1/sr unknown
- 2015-04-10 DK DK15738237.5T patent/DK3129394T3/da active
- 2015-04-10 CN CN201580031082.9A patent/CN106471124B/zh active Active
- 2015-04-10 UA UAA201611279A patent/UA121387C2/uk unknown
-
2016
- 2016-10-07 MX MX2019011224A patent/MX2019011224A/es unknown
- 2016-10-11 PH PH12016502024A patent/PH12016502024B1/en unknown
- 2016-11-04 ZA ZA2016/07612A patent/ZA201607612B/en unknown
-
2020
- 2020-03-20 HR HRP20200471TT patent/HRP20200471T1/hr unknown
-
2021
- 2021-03-08 US US17/195,154 patent/US20210238620A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6359197B1 (en) | Transgenic plants with altered senescence characteristics | |
| UA121387C2 (uk) | Вектор або мобільний генетичний елемент, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує білок, який являє собою протонну помпу тонопласта/антипортер цукру, і його застосування для підвищення концентрації сахарози в органі накопичування сахарози рослин | |
| EP2552946B1 (en) | Method of enhancing the seed yield and promoting the growth of plants | |
| AU2012354054B2 (en) | Methods of modulating stomata conductance and plant expression constructs for executing same | |
| CN101107364A (zh) | 产率增加的植物及其制备方法 | |
| US11155827B2 (en) | Methods for generating transgenic plants | |
| ES2330649T3 (es) | Plantas que tienen un mayor rendimiento de semillas y metodo para su elaboracion. | |
| JP6224030B2 (ja) | フルクタン生合成の修飾、植物バイオマスの増大、および植物における生化学的経路の生産性を増強する方法 | |
| ES2354259T3 (es) | Plantas que tienen producción de semilla incrementada y método para elaborar las mismas. | |
| WO2004078966A1 (ja) | フラクトオリゴ糖蓄積トランスジェニック植物及びその作出方法 | |
| CN102439030A (zh) | 促进植物生长的蛋白复合物 | |
| CN110818786A (zh) | 一种组成型激活态小g蛋白及其在水稻耐盐方面的应用 | |
| CN114466928A (zh) | 淀粉核样结构 | |
| WO2020038384A1 (zh) | 具有提高的糖含量的植物 | |
| US10227604B2 (en) | Plant synthesizing hypoallergenic paucimannose type N-glycan and uses thereof | |
| Cui et al. | GENOMES UNCOUPLED1: an RNA-binding protein required for early PSII biogenesis | |
| CN116694659B (zh) | GhTPPA2基因在促进植物叶片中可溶性糖和淀粉积累的应用 | |
| CN110387377A (zh) | 油菜耐旱基因BnNAC129及其用于制备耐旱转基因植物的应用 | |
| KR100974302B1 (ko) | 페투인이 발현된 감자 식물체 | |
| CN104894141B (zh) | 棉花的固醇载体蛋白基因及其应用 | |
| CN117327719A (zh) | 一种分离的多核苷酸及其编码的LiCWIN2蛋白与应用 | |
| CN116438194A (zh) | 用于增加植物的寒冷或霜冻耐受的方法 | |
| EA040510B1 (ru) | Белки тонопласта, функционирующие как протон/сахар-антипортеры, и их использование для повышения концентрации сахарозы в запасающем сахарозу органе растений |