CN114456245A

CN114456245A - LrWRKY-R2蛋白及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用

Info

Publication number: CN114456245A
Application number: CN202210168879.5A
Authority: CN
Inventors: 符勇耀; 吴娇; 李娟�; 刘萱; 姜思佳; 焦丽; 徐文姬
Original assignee: Yangtze Normal University
Current assignee: Yangtze Normal University
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2042-02-23
Also published as: CN114456245B

Abstract

本发明公开了LrWRKY‑R2蛋白及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用，所述LrWRKY‑R2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。生化分析表明，LrWRKY‑R2是定位于细胞核的WRKY家族IId簇成员。本发明将LrWRKY‑R2基因在拟南芥或百合中过表达后，通过热激胁迫处理实验和病原菌抑菌实验发现，LrWRKY‑R2转录因子是兼具调节高温胁迫和灰霉病抗性的双重功能的WRKY家族成员，为通过分子手段提高植物抗逆性提供了新的基因资源，同时也为百合的遗传改良提供了一个非常优越的新靶标，为培育兼具耐热和抗病的百合新品种或其它植物新材料提供了有力的技术支持，对农业生产上实现优质、高产育种具有重要理论和应用价值。

Description

LrWRKY-R2蛋白及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别的涉及LrWRKY-R2蛋白及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

在自然界中，植物通常受到各种生物和非生物胁迫，并不断进化发展出了一系列防御机制。百合作为一种名贵的花卉和重要的蔬菜，具有非常可观的经济价值。然而，百合大多喜冷凉湿润气候，最适的百合生长温度约为18-24℃。高温会造成百合植株矮小、病虫害严重和花朵败育，直接影响切花质量，并引起种球退化等(Yin H,Chen Q,Yi M(2008)Effects of short-term heat stress on oxidative damage and responses ofantioxidant system in Lilium longiflorum.Plant Growth Regul 54:45-54.Xin HB,Zhang H,Chen L,et al.(2010)Cloning and characterization of HsfA2 from lily(Lilium longiflorum).Plant Cell Rep 29:875-885.)。我国大部分地区夏季炎热，加之温室效应日趋明显，高温已成为制约我国百合产业发展的重要因素之一。另一方面，由灰霉菌引起的百合灰霉病已成为百合生产和采用各环节中最为常见的病害。一般灰霉病发生时会造成20–40％产量损失，严重时会导致完全失收(Cao X,Shi S,Zhang Z.(2018)Firstreport of Botrytis leaf blight on lily(Lilium longiflorum)caused by Botrytiscinerea in Beijing,China.Plant Dis,102:1033)。总之，高温胁迫和灰霉病害严重限制了我国百合产业的健康和可持续发展。多年的实践表明，选育和推广抗高温和抗病百合品种是解决百合生产实践的最有效、经济和环保的途径。因此，从基因水平上研究百合耐高温和抗灰霉病的分子机理，培育广谱高抗的百合新品种具有重要科学意义和产业前景。

转录因子调控在植物逆境胁迫反应中具有重要作用。WRKY蛋白是植物最大的转录因子家族之一，WRKY转录因子因含有一段高度保守的七肽序列WRKYGQK而被定义，该序列由60多个氨基酸残基组成。研究发现，不同WRKY家族成员在植物各种生物胁迫和非生物逆境胁迫反应发挥重要角色(Zhang Y,and Wang L(2005)The WRKY transcription factorsuperfamily:its origin in eukaryotes and expansion in plants.BMC Evol.Biol.5,1)。然而，目前有关WRKY因子同时调节高温胁迫和灰霉病害的研究未见报道。岷江百合(Lilium regale Wilson)是一种高抗真菌病害，且耐干旱和高温的天然野生百合种质。目前已经从岷江百合中分离多个生物胁迫相关WRKY转录因子基因，包括LrWRKY1(申请号201610001896.4)、LrWRKY2(201911106106.9)、LrWRKY3(201911106095.4)、LrWRKY4(201911105589.0)和LrWRKY11(201911105582.9)等。但是，有关岷江百合耐高温的WRKY家族成员鲜有报道，WRKY调控百合耐高温或抗病的机制还远远未阐明。从岷江百合中分离耐高温同时抗病的WRKY转录因子基因，阐明其功能，为植物特别是百合基因工程改良提供重要的新基因或新靶标。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于提供LrWRKY-R2蛋白及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用，为培育耐高温和抗病百合新品种或其他植物新材料提供一个新基因或新靶点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：LrWRKY-R2蛋白在调控植物抗逆性中的应用，所述LrWRKY-R2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。

作为优选的，编码所述LrWRKY-R2蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。

本发明还提供了一种抗逆相关蛋白或其编码基因在提高植物抗逆性、培育抗逆转基因植物或选育抗逆性提高的植物品种中的应用，所述抗逆相关蛋白为LrWRKY-R2蛋白，编码所述抗逆相关蛋白的基因为LrWRKY-R2基因。

进一步，所述抗逆性为耐热性和/或抗病性。

进一步，所述植物为拟南芥或百合。

本发明还提供了一种提高植物抗逆性的方法，在植物中提高LrWRKY-R2基因的表达量。

进一步，所述抗逆性为耐热性和/或抗病性。

进一步，所述植物为拟南芥或百合。

进一步，通过向植物细胞中导入含有LrWRKY-R2基因的重组载体、表达盒、细胞或者重组菌来提高LrWRKY-R2基因的表达量。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明利用PCR技术首次从岷江百合中克隆了LrWRKY-R2基因的全长序列，获得其编码的蛋白序列，生化实验表明，LrWRKY-R2蛋白定位于细胞核，符合转录因子特征。本发明通过将LrWRKY-R2蛋白在拟南芥/百合中过表达后，通过热激胁迫处理实验和病原菌抑菌实验发现，转基因幼苗耐高温和灰霉病抗性的能力明显提高。通过本发明研究，表明LrWRKY-R2是耐高温和抗病性的正调控因子，为通过分子手段提高植物抗逆性提供了新的基因资源。还为植物的非生物胁迫改良提供了一个关键基因，为培育兼具耐热和抗病的百合新品种或其他植物新材料提供了有力的技术支持，对农业生产上实现优质、高产育种具有重要理论和应用价值。

2、本发明通过系统研究，首次揭示LrWRKY-R2转录因子兼具调节高温胁迫和灰霉病抗性的双重功能的WRKY家族成员，其中LrWRKY-R2过表达通过影响JA和SA信号调节来提高灰霉菌的抗性。本发明是研究百合WRKY因子功能中的一个重要发现，对于培育广谱的百合抗性品种，减少农药使用，提高百合产量和品质具有重要价值。同时为解析一个WRKY转录因子调节生物和非生物胁迫的分子机制奠定了重要理论基础。

附图说明

图1为岷江百合LrWRKY-R2转录因子的亚细胞定位分析；上图从左到右依次分别为LrWRKY-R2-GFP在白光下明场图、激发光下暗场图和组合图，下图从左到右依次分别为35S::GFP对照在白光下明场图、激发光下暗场图和组合图。

图2为PCR扩增转基因拟南芥基因组DNA的Npt II基因电泳图；M为DNAMarker2000，WT为野生型对照，L1～L4为独立的拟南芥转基因株系。

图3为土壤中拟南芥幼苗在45℃、5h热激胁迫处理后幼苗存活情况；A为转基因株系OX-L1，B为转基因株系OX-L2；C为野生型；D为存活幼苗的统计分析，误差线代表3次重复实验±SE值,不同字母代表显著性差异,Duncan检验:p值<0.05。

图4为培养基中拟南芥幼苗在45℃、3h热激胁迫处理后幼苗存活情况；A为转基因株系OX-L1，B为转基因株系OX-L2；C为野生型；D为存活幼苗的统计分析，误差线代表3次重复实验±SE值,不同字母代表显著性差异,Duncan检验:p值<0.05。

图5为野生型和转基因植株对灰霉菌抗性分析；A为叶片发病表型照片，OX-L1和OX-L2为转基因株系，标尺代表8mm；B为灰霉菌腐蚀的拟南芥叶片面积，误差线代表3次重复实验±SE值,不同字母代表显著性差异,Duncan检验:P<0.05。

图6为转基因植株中LrWRKY-R2、JA信号标记基因(AtPDF1.2、AtVSP1、AtLOX2)和SA信号标记基因(AtPR1、AtPR5、AtPAL1)的定量PCR分析；以AtActin基因为内参，误差线代表3次重复实验±SE值，星号代表Student’s T检验：**P<0.01。

图7为转基因植株中LrWRKY-R2基因的半定量PCR分析。

图8为在百合叶片中瞬时过表达LrWRKY-R2对灰霉菌抗性的影响；A为叶片发病表型照片；B为灰霉菌腐蚀百合的叶片面积，误差线代表3次重复实验±SE值，星号代表Student’s T检验：**P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例1岷江百合LrWRKY-R2基因克隆与序列分析

以岷江百合叶片为材料，采用TRIzol^TM Plus RNA Purification Kit(12183555，Invitrogen^TM)，按说明书步骤提取总RNA，利用DNase I(18047019，Invitrogen^TM)去除残余的微量DNA，并用分光光度计测定RNA的浓度，备用。

取约2.0μg岷江百合叶片总RNA，按照PrimeScript II first-strand cDNAsynthesis kit(6210A,Takara)说明书步骤合成第一链cDNA。

PCR扩增体系：高保真扩增酶Prime STAR HS(R010A,TaKaRa)0.25μL，5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)5μL，正向引物(LrWRKY-R2-F,10μM)0.5μL，反向引物(LrWRKY-R2-R,10μM)0.5μL，模板(DNA)1μL，dNTP(2.5mM)2μL，无菌ddH₂O补足至25μL。

正向引物和反向引物为：

LrWRKY-R2-F:5’-CCAAGATGGAAGAGGTTGACTCAG-3’

LrWRKY-R2-R:5’-CCTCTTATGCATGGGCAGATTGTG-3’

PCR反应程序为：预变性95℃，3min；95℃，30s；58℃，40s；72℃，1min，40个循环；72℃，7min。

获得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外光照射下，在900bp左右可以观察到一条特异性的扩增条带。按照胶回收试剂盒(9672，Takara)纯化后备用。

利用平末端加A试剂将纯化的DNA片段加A，通过TA克隆将其与pMD20-Tvector(6019，Takara)相连，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有氨苄霉素(100mg/L)的LB培养板上挑取2个阳性克隆测序进行测序分析，结果表明，岷江百合LrWRKY-R2基因全长序列如SEQID NO.1所示，包括864bp的开放阅读框(含终止密码)。

根据SEQ ID NO.1，通过DNAman软件翻译，获得岷江百合LrWRKY-R2的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示，含有287个氨基酸(*表示终止信号)。将LrWRKY-R2全长序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与经过转录组测序分析获得的序列岷江百合LrWRKY17(MW125562.1)和LrWRKY39(MG149581.1)相似，核苷酸序列相似度为99.65％(861/864)和96.56％(843/873)，氨基酸序列相似度为100％(287/287)和94％(273/290)，但其功能研究仍不清楚。聚类分析表明LrWRKY-R2蛋白含有1个典型的WRKY结构域(WRKYGQK)和Cys2His2(C2H2)锌指结构，属于WRKY家族IId成员。

实施例2GFP融合表达载体构建及亚细胞定位分析

根据pTF101-GFP载体序列和LrWRKY-R2基因全长序列(SEQ ID NO.1)，设计正向引物(LrWRKY-R2-gfp-F)和反向引物(LrWRKY-R2-gfp-R)，引物中引入无缝克隆(In-fusion)载体接头序列和酶切位点序列。以实施例1中TA连接的阳性克隆质粒为模板，PCR扩增LrWRKY-R2基因片段。

所述引物序列如下：

其中，LrWRKY-R2-gfp-F的加粗序列为Hind III酶切位点，LrWRKY-R2-gfp-R的加粗序列为Bam HI酶切位点。下划线处为In-fusion克隆载体接头序列。

PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS(R010A,TaKaRa)0.5μL，5xPrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)10μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板(50倍稀释的质粒)1μL，dNTP(2.5mM)4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，3min；95℃，30s；58℃，40s；72℃，1min，40个循环；72℃,7min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段与预期片段大小相同，按照胶回收试剂盒(9672，Takara)的说明书步骤回收纯化，即获得目的基因片段。

用HindIII和BamHI双酶切处理pTF101-GFP表达载体。酶切体系为：pTF101-GFPvector 5μL；Hind III 0.5μL；BamHI 0.5μL；Buffer 10XK 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pTF101-GFP载体片段。

利用无缝克隆技术(In-fusion HD Cloning Kit，Takara)构建35S::GFP-LrWRKY-R2重组表达载体。

重组反应体系为：

Purifed PCR fragment(回收的LrWRKY-R2目的片段)50ng；Linearized vector(pTF101-GFP载体)100ng；5X In-fusion HD Enzyme Premix 2μL；无菌ddH₂O补足至10μL。然后按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有壮观霉素(Spec，100mg/L)的筛选培养板上，通过阳性克隆测序，获得重组表达载体35S::GFP-LrWRKY-R2。重组表达载体中报告基因GFP与目的基因LrWRKY-R2的5’端融合后，位于组成型启动子35S下游，形成融合表达。报告基因GFP经过蓝光激发，无需辅助因子和底物就能发出绿色荧光，作为报告基因可以检测目的基因表达情况。

通过常规冻融法将重组表达载体35S::GFP-LrWRKY-R2转入农杆菌菌株EHA105中，通过PCR筛选阳性克隆。以含有pTF101-GFP质粒的农杆菌菌株为阳性对照，按照霍琳等(农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化,分子植物育种,2016,14(1):80-85)方法制备农杆菌注射缓冲液。选择光照培养箱中正常生长具有8-10片叶子完全展开的烟草进行注射，用去除针头的注射器将注射缓冲液缓慢推入叶片背面。然后，把转化后的植株重新放回培养箱中，培养36h-48h后进行观察。

用剪刀小心剪下转化后的烟草叶片放在载玻片上，加1滴蒸馏水，制成装片；然后放在荧光显微镜上，在激发光波长488-507nm的蓝光下，进行荧光观察。结果如图1所示，LrWRKY-R2只在烟草表皮细胞的细胞核上特异性表达，对照组在细胞膜和细胞核中均有表达，表明该蛋白是1个核定位的转录因子，符合大部分WRKY转录因子表达定位情况。

实施例3LrWRKY-R2过表达载体构建及拟南芥的遗传转化

(1)构建pBI121-35S::LrWRKY-R2过表达载体

根据pBI121载体序列和LrWRKY-R2基因序列(SEQ ID NO.1)，设计引物LrWRKY-R2-inf-F和LrWRKY-R2-inf-R，引物中引入无缝克隆(In-fusion)载体接头序列和酶切位点序列。以实施例1中TA连接的阳性克隆质粒为模板，进行LrWRKY-R2基因片段的特异性扩增。

所述引物序列如下：

其中，LrWRKY-R2-inf-F引物的加粗序列为BamHI酶切位点，LrWRKY R2-inf-R引物的加粗序列为Sac I酶切位点。下划线处为In-fusion克隆载体接头序列。

PCR反应体系为：高保真扩增酶PrimeSTAR HS(R010A,TaKaRa)0.5μL，5xPrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)10μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板(50倍稀释的质粒)1μL，dNTP(2.5mM)4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，3min；95℃，30s；58℃，40s；72℃，1min，38个循环；72℃,10min。

用Bam HI和Sac I双酶切处理pBI121植物双元表达载体。酶切体系为：pBI121vector 5μL；BamHI 0.5μL；Sac I 0.5μL；Buffer 10XK 1μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pBI121载体大片段。

利用无缝克隆技术(In-fusion HD Cloning Kit，Takara)构建35S::LrWRKY-R2重组表达载体。

重组反应体系为：

Purifed PCR fragment(回收LrWRKY-R2目的片段)50ng；Linearized vector(pBI121)100ng；5X In-fusion HD Enzyme Premix 2μL；无菌ddH₂O补足至10μL。然后按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有卡纳霉素(100mg/L)的筛选培养板上，通过阳性克隆筛选和测序，获得重组表达载体pBI121-35S::LrWRKY-R2。重组表达载体中目的基因LrWRKY-R2的5’端位于组成型启动子35S下游，它能使LrWRKY-R2基因过量表达；LrWRKY-R2 3’端组装有NOS终止子，可以有效终止融合基因的转录。在重组表达载体上组装有Npt II基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡纳霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的表达框架和筛选标记基因Npt II整合至植物受体染色体上。

(2)农杆菌介导的拟南芥遗传转化

拟南芥的遗传转化采用浸花法(Zhang X.,et al.,Nat Protoc.2006,1:641-646)。将携带pBI121-35S::LrWRKY-R2的农杆菌导入哥伦比亚Col-0型拟南芥。用卡那霉素(100mg/L)筛选具抗性的拟南芥再生幼苗，获得转基因植株。采用CTAB法提取基因组DNA，用PCR扩增抗性标记基因检测转基因阳性植株。

PCR扩增引物如下：

Npt II-F:5'-TTGGGTGGAGAGGCTATTCGG-3'

Npt II-R:5'-GCCACAGTCGATGAATCCAG-3'

PCR反应试剂选用大连宝生物(TaKaRa)产品(RR001A)，具体包括：DNA 1μL，10×Buffer(含20mM Mg²⁺)2μL，2.5mM/L dNTP 2μL，10uM/L正反向引物各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，13.8μL ddH₂O；扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，共38个循环；72℃延伸7min。

PCR检测结果如图2所示，在野生型植株(WT)中检测不到Npt II标记基因的存在，只有在L1、L2、L3和L4的4个转基因株系中扩增Npt II标记基因，表明重组表达框已经导入拟南芥转基因株系的基因组上。

实施例4转基因LrWRKY-R2植株对热胁迫的影响

1、以转基因拟南芥种子和野生型种子为材料，进行无菌消毒处理，然后放在MS基本培养基上进行正常光照培养(转基因种子培养基中含卡那霉素100mg/L)，2周以后将幼苗移栽到土壤中正常生长，1周后将拟南芥幼苗在烘箱中进行45℃热处理5h，每个株系处理含30株幼苗，然后放置在光照培养箱中观察幼苗存活情况，结果如图3所示。

从图中可以看出，转基因拟南芥幼苗OX-L1和OX-L2的存活率在80％～90％之间，明显优于野生型拟南芥幼苗(WT)50％左右的存活率。

2、以MS基本培养基上正常生长的2周的转基因拟南芥幼苗和野生型拟南芥幼苗为材料，进行45℃热处理3h，每个株系处理含30株幼苗，然后放置在正常光照条件下观察存活情况，结果如图4所示。

从图中可以看出，转基因拟南芥幼苗(OX-L1和OX-L2)经热处理后仍有部分存活，经3次统计得转基因幼苗存活率约15～17％之间。而野生型幼苗拟南芥幼苗(WT)经热处理后已经全部死亡。

以上结果表明，过表达LrWRKY-R2基因提高了转基因植株的耐热胁迫能力。

实施例5转基因LrWRKY-R2植株灰霉菌抗性分析

将灰霉菌(B.cinerea)接种到PDA培养基(200g/L马铃薯，15g/L琼脂，20g/L葡萄糖)中，在28℃黑暗条件下培养1周。以温室中正常生长4周左右的野生型和转基因拟南芥为材料，利用打孔器将大小相等的新鲜真菌菌丝块分别接种到离体的莲座叶片上，在培养皿中保持湿度，放于光照培养箱正常培养，3天后观察病原真菌的侵染情况。结果如图5所示，野生型(WT)拟南芥叶片在接种灰霉菌后受伤害病斑面积较大，与野生型病斑面积相比，转LrWRKY-R2基因株系(OX-L1、OX-L2)的叶片受伤害的病斑面积从145mm²降低到80～90mm²左右，表现出显著的差异性。表明过表达LrWRKY-R2基因会使转基因材料对灰霉菌抗性显著增加，表现出抗病性。

进一步，采用定量PCR分析LrWRKY-R2基因、JA信号标记基因(AtPDF1.2、AtVSP1、AtLOX2)和SA信号标记基因(AtPR1、AtPR5、AtPAL1)的表达情况。采用Trizol试剂(Invitrogen^TM)提取野生型和转基因拟南芥叶片总RNA，利用DNase I(Invitrogen^TM)去除残余DNA，采用cDNA反转录试剂(6210A，Takara)并按照说明书步骤合成第一链cDNA。用SYBRPremix Ex Taq^TM II(PR820A,TaKaRa)试剂进行定量检测，以AtActin基因为内参，采用

法分析基因相对表达量，结果如6所示。

定量PCR引物如下：

LrWRKY-R2-QF:5'-GTCATTCCTCTCCTCCCTCAG-3'

LrWRKY-R2-QR:5'-ATCTCTTCACCCTCAACTTCCT-3'

AtActin-QF:5'-GTCTGGATTGGAGGATCCAT-3'

AtActin-QR:5'-CCGGTGAACAATCGACGGGC-3'

AtPR1-QF:5'-CCCACAAGATTATCTAAGGGTTCAC-3'

AtPR1-QR:5'-CCCTCTCGTCCCACTGCAT-3'

AtPR5-QF:5'-GGCGATGGAGGATTTGAATTG-3'

AtPR5-QR:5'-GCGTCAAAGTTGCAGCCTGTA-3'

AtPAL1-QF:5'-TTCAAGGGAGCTGAGATTGC-3'

AtPAL1-QR:5'-GCTCTGCTGATTGAACATGG-3'

AtPDF1.2-QF:5'-CCATCATCACCCTTATCTTCGC-3'

At PDF1.2-QR:5'-TGTCCCACTTGGCTTCTCG-3'

AtVSP1-QF:5'-GTTACACCAACAGCCTTGAG-3'

At VSP1-QR:5'-TATGGATATGGGACCGAGA-3'

AtLOX2-QF:5'-CAATCGTAGTTACCACACCAATC-3'

At LOX2-QR:5'-AGTGAAGTGCGGAACATAGG-3'

从图6可以看出，LrWRKY-R2基因在转基因株系(OX-L1和OX-L2)中高水平表达，在野生型(WT)检测不到表达。且抗病激素信号JA标记基因AtPDF1.2、AtVSP1和SA标记基因AtPR1、AtPR5和AtPAL1均上调表达。结果表明，LrWRKY-R2过表达通过影响JA和SA信号调节来提高灰霉菌的抗性。

实施例6LrWRKY-R2基因在百合叶片中瞬时过表达功能验证

将携带pBI121-35S::LrWRKY-R2载体和对照pBI121载体的农杆菌分别转化百合叶片，具体方法参考Fu等(Plant Physiol Bioch,2020,157:380-382)方法。转化4天后进行灰霉菌(B.cinerea)接种，将一致大小(约4mm)菌斑接种到注射叶片背面处，保湿后在光照培养箱正常培养3天。

以转化百合叶片为材料，提取总RNA，利用PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNA Eraser(PR047A,TaKaRa)反转录获得cDNA，以百合18S基因为内参，采用半定量RT-PCR方法验证LrWRKY-R2基因表达，结果如图7所示。

检测18S基因引物为：

18S-F:5’-CGCAAGGCTGAAACTTAAAGG-3’

18S-R:5’-CAGACAAATCGCTCCACCAAC-3’

目的基因检测引物为实施例1中LrWRKY-R2-F和LrWRKY-R2-R。

从图中可以看出，在对照植株(Control)中检测不到LrWRKY-R2的表达，而转基因株系中目的基因LrWRKY-R2表达量增加，表明重组表达框已经成功在转基因百合植株上表达转录。

同时观察转化百合叶片上灰霉菌的侵染情况，结果如图8所示。

从图中可以看出，对照百合叶片(Control)在接种灰霉菌3d后叶片受伤害的病斑面积较大；与野生型病斑面积相比，转LrWRKY-R2基因株系在接种灰霉菌3d后叶片受伤害的病斑面积从120mm²降低到50mm²左右，表现出显著差异性(图8B)。表明过表达LrW RKY-R2基因会使转基因百合对灰葡萄孢抗性显著增加，表现出对灰霉菌的抗病特征，为百合抗病育种提供了新靶标。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 长江师范学院

<120> LrWRKY-R2蛋白及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 864

<212> DNA

<213> 岷江百合(Lilium regale Wilson)

<400> 1

atggaagagg ttgactcagc cagcagagct gctgtgcaga gctgccacag agtcctcact 60

ctcctctctc agcctcatca ccatgatgat ctgcagagca gaaccctcca ggctcaaaca 120

tgggaggctg tttcacagtt taagagagtg gtatccatgc tgggtgacgg tgtgggtcat 180

gctagggtta gagcactcaa cagatctcct cctctcttca atcacaagtt attctccgac 240

aacccattta cttcttctga ttccaacccc aaaatccttc atcaaacttt acatgaaaca 300

ccaaagttca gcccattatc tcaattattt cagcagcagc agcaaatgag ttttcaggct 360

gagatttgta agaagagtaa cagttgcatc aacttcaatt ttgactgcac gccgactgta 420

tcgtcaagca gccggtcatt cctctcctcc ctcagcgtcg acccgatagc tttccgggtg 480

aacgcggggt cgcaattatc cgaacagcca cctccccgga agaagtgttc aggtagagag 540

gagggtggga gcgccaaatg cgcgtctggg ggaagatgcc actgctcgaa gaggaagttg 600

agggtgaaga gatcaattaa ggtggctgca atcagtaaca agcttgctga tatcccctct 660

gacgattatt cttggaggaa atatgggcag aagccaatca agggctctcc acatcccagg 720

ggatactaca aatgcagcag catgagaggt tgtcctgcaa ggaagcatgt ggagagatgc 780

ctcgaagagc cctcgatgct agttgtcact tacgaaggcg accacaacca ccccaagcta 840

ctaacacaat ctgcccatgc ataa 864

<210> 2

<211> 287

<212> PRT

<213> 岷江百合(Lilium regale Wilson)

<400> 2

Met Glu Glu Val Asp Ser Ala Ser Arg Ala Ala Val Gln Ser Cys His

1 5 10 15

Arg Val Leu Thr Leu Leu Ser Gln Pro His His His Asp Asp Leu Gln

20 25 30

Ser Arg Thr Leu Gln Ala Gln Thr Trp Glu Ala Val Ser Gln Phe Lys

35 40 45

Arg Val Val Ser Met Leu Gly Asp Gly Val Gly His Ala Arg Val Arg

50 55 60

Ala Leu Asn Arg Ser Pro Pro Leu Phe Asn His Lys Leu Phe Ser Asp

65 70 75 80

Asn Pro Phe Thr Ser Ser Asp Ser Asn Pro Lys Ile Leu His Gln Thr

85 90 95

Leu His Glu Thr Pro Lys Phe Ser Pro Leu Ser Gln Leu Phe Gln Gln

100 105 110

Gln Gln Gln Met Ser Phe Gln Ala Glu Ile Cys Lys Lys Ser Asn Ser

115 120 125

Cys Ile Asn Phe Asn Phe Asp Cys Thr Pro Thr Val Ser Ser Ser Ser

130 135 140

Arg Ser Phe Leu Ser Ser Leu Ser Val Asp Pro Ile Ala Phe Arg Val

145 150 155 160

Asn Ala Gly Ser Gln Leu Ser Glu Gln Pro Pro Pro Arg Lys Lys Cys

165 170 175

Ser Gly Arg Glu Glu Gly Gly Ser Ala Lys Cys Ala Ser Gly Gly Arg

180 185 190

Cys His Cys Ser Lys Arg Lys Leu Arg Val Lys Arg Ser Ile Lys Val

195 200 205

Ala Ala Ile Ser Asn Lys Leu Ala Asp Ile Pro Ser Asp Asp Tyr Ser

210 215 220

Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Pro Ile Lys Gly Ser Pro His Pro Arg

225 230 235 240

Gly Tyr Tyr Lys Cys Ser Ser Met Arg Gly Cys Pro Ala Arg Lys His

245 250 255

Val Glu Arg Cys Leu Glu Glu Pro Ser Met Leu Val Val Thr Tyr Glu

260 265 270

Gly Asp His Asn His Pro Lys Leu Leu Thr Gln Ser Ala His Ala

275 280 285

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaagatgga agaggttgac tcag 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctcttatgc atgggcagat tgtg 24

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttccccgggc tcgagaagct tatggaagag gttgactcag 40

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttatctagat ccggtggatc cttatgcatg ggcagattgt g 41

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggactctaga ggatccatgg aagaggttga ctcag 35

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatcggggaa attcgagctc ttatgcatgg gcagattgtg 40

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgggtggag aggctattcg g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gccacagtcg atgaatccag 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtcattcctc tcctccctca g 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atctcttcac cctcaacttc ct 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtctggattg gaggatccat 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccggtgaaca atcgacgggc 20

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cccacaagat tatctaaggg ttcac 25

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccctctcgtc ccactgcat 19

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggcgatggag gatttgaatt g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcgtcaaagt tgcagcctgt a 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttcaagggag ctgagattgc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gctctgctga ttgaacatgg 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccatcatcac ccttatcttc gc 22

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgtcccactt ggcttctcg 19

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gttacaccaa cagccttgag 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tatggatatg ggaccgaga 19

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caatcgtagt taccacacca atc 23

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agtgaagtgc ggaacatagg 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cgcaaggctg aaacttaaag g 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cagacaaatc gctccaccaa c 21

Claims

1.LrWRKY-R2蛋白在调控植物抗逆性中的应用，所述LrWRKY-R2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，编码所述LrWRKY-R2蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗逆性为耐热性和/或抗病性。

4.一种抗逆相关蛋白或其编码基因在提高植物抗逆性、培育抗逆转基因植物或选育抗逆性提高的植物品种中的应用，所述抗逆相关蛋白为权利要求1中所述的蛋白，编码所述抗逆相关蛋白的基因为权利要求2中所述的基因。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述抗逆性为耐热性和/或抗病性。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或百合。

7.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，在植物中提高LrWRKY-R2基因的表达量。

8.根据权利要求7所述提高植物抗逆性的方法，其特征在于，所述抗逆性为耐热性和/或抗病性。

9.根据权利要求7所述提高植物抗逆性的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥或百合。

10.根据权利要求7所述提高植物抗逆性的方法，其特征在于，通过向植物细胞中导入含有LrWRKY-R2基因的重组载体、表达盒、细胞或者重组菌来提高LrWRKY-R2基因的表达量。