CN103290003A

CN103290003A - 小麦新寡分蘖基因Ltn1的分子标记及应用

Info

Publication number: CN103290003A
Application number: CN2013101881469A
Authority: CN
Inventors: 刘亚西; 王际睿; 江千涛; 蒲至恩; 魏育明; 郑有良
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-05-20
Also published as: CN103290003B

Abstract

本发明公开了小麦寡分蘖基因Ltn1紧密连锁的分子标记GPW8031，该分子标记与寡分蘖基因Ltn1的遗传距离0.0cM。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪所述寡分蘖基因，预测小麦的分蘖特性，进而方便进行分子设计育种。同时利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对表型的影响。本发明的提供的分子标记GPW8031与小麦寡分蘖基因Ltn1紧密连锁，大大提高寡分蘖基因的分子标记辅助选择效率，加强分蘖预测的准确性，提高特异株型育种的成功率，加速实现增加小麦单产的目标。

Description

小麦新寡分蘖基因Ltn1的分子标记及应用

技术领域

本发明涉及小麦分子育种领域，具体涉及一种小麦新寡分蘖基因Ltn1的分子标记方法及应用。

背景技术

小麦是我国仅次于水稻的第二大粮食作物，常年种植面积在2666.67万公顷以上，约占粮食作物面积的27%；总产量为1亿吨以上，约占粮食作物产量的22%。

小麦产量由三要素构成，即产量=穗数*穗粒数*粒重。分蘖是影响小麦穗数多少并进而影响单产的重要农艺性状之一，又是单子叶植物一种特殊的分枝现象，具有重要的研究价值。

小麦分蘖突变体较少，遗传研究总体进展相对缓慢，现阶段国内外工作主要围绕分蘖基因的分子标记定位及其遗传效应开展。部分寡分蘖突变体由单基因控制，因而一些学者将其作为质量性状来研究（Richards RA.A tiller inhibition gene in wheat and its affect on plantgrowth.Austr J Agric Res.1988,39:749-757;Duggan BL,Richards RA,Tsuyuzaki H.Environmental effects on the expression of the tillerinhibition(tin)gene in wheat.Funct Plant Biol,2002,29:45–53）。同时，也有很多学者将分蘖作为多基因控制的数量性状来研究（Shaha MM,Gilla KS,Baenziger PS,Yen Y,Kaepplerc SM,Ariyarathne HM.Molecular mapping of loci for agronomic traits on chromosome3A ofbread wheat.Crop Sci.1999,39:1728-1732;谢玥，龙海，侯永翠，郑有良.小麦寡分蘖材料H461分蘖性状的遗传分析.麦类作物学报.2006,26:21-23;王岩.小麦永久F2群体构建及株高和分蘖特性的QTL定位.山东农业大学硕士学位论文,2009;温明星.望水白多分蘖、矮秆突变体的鉴定及相关QTL定位.南京农业大学硕士学位论文,2010;Jinpeng Zhang,Jun Wu,Weihua Liu,Xiang Lu,Xinming Yang,Ainong Gao,Xiuquan Li,Yuqing Lu,Lihui Li.Genetic mapping of afertile tiller inhibition gene,ftin,in wheat.Mol Breeding.2013,31:441-449）。迄今为止，已报道的分蘖相关基因位于1A，2A，3A，6A染色体，其中仅1A和3A上的tin基因研究较深入，完成了精细定位工作。

小麦材料H461相对于小麦品种川农16（国审品种）具有寡分蘖、多穗粒数、多小穗数、高千粒重和高穗粒重等特性（侯永翠，郑有良，蒲至恩，魏育明，李伟.穗数型小麦新品种川农16与大穗型寡分蘖品系H461遗传差异研究初报.四川农业大学学报.2003,21:94-9）。同时，小麦地方品种中国春是小麦遗传研究中广泛使用的对照材料，基因组遗传信息资源丰富，而且分蘖显著高于H461和川农16。因此，利用H461和中国春构建遗传研究群体，进一步研究小麦H461的寡分蘖特性，定位控制分蘖基因，寻找紧密连锁的分子标记，促进分蘖基因的图位克隆，同时为小麦特异分蘖材料的创制及株型育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强分蘖预测的准确性，提高株型育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。

分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。简单重复序列（simple sequencerepeats，SSR）是一类广泛存在于基因组上的由几个核苷酸重复单位组成的串联重复序列。由于其在基因组上大量的分布，多态性高，且操作技术简单、费用低廉，在分子标记辅助育种中已被广泛应用。因此，筛选出与分蘖基因紧密连锁的分子标记，利用分子标记对小麦分蘖基因进行选择，有效调控小麦分蘖发生，塑造合理的分蘖发生群体，对提高小麦群体质量和产量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供小麦H461寡分蘖基因Ltn1的紧密连锁分子标记。

本发明的另一目的是提供上述分子标记的引物对。

本发明的第三目的是提供上述寡分蘖基因Ltn1紧密连锁的分子标记的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明的新寡分蘖基因Ltn1来自小麦H461，该基因位于小麦2A染色体中部，如图1所示，显著降低小麦分蘖，LOD值大于3.0，解释约18%的表型变异。

本发明用于鉴定小麦H461新寡分蘖基因Ltn1的分子标记的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

所述分子标记，是以小麦H461的基因组DNA为底物进行的PCR扩增所得的扩增片段，且与之间的遗传距离为0.0cM。

申请人提供一种鉴定寡分蘖基因Ltn1的分子标记方法，包括：以待鉴定材料的DNA作为模板，用上述的分子标记的引物对进行PCR扩增；PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再用银染法检测；能扩增出与H461相同片段的植株为含有寡分蘖基因Ltn1的植株。

申请人提供一种鉴定寡分蘖基因Ltn1的分子标记方法，优选包括如下步骤：

1）以待鉴定材料的DNA作为模板，用上述的分子标记的引物对进行PCR扩增：a）PCR扩增反应体系：5μl10×PCR buffer、1.5UEx Taq^TM DNA聚合酶、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng、100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μl；b）PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；c）PCR产物检测：PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr:Bis=19:1）电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测。

2）鉴定Ltn1的结果：能扩增出与H461相同片段的植株为含有寡分蘖基因Ltn1的植株。

所述的分子标记引物对在小麦特异分蘖材料创制中的应用。

所述的分子标记引物对在分子标记辅助小麦株型育种中的应用。

本发明小麦H461寡分蘖基因Ltn1及其分子标记GPW8031是通过以下方法获得的：

1）利用小麦寡分蘖H461为母本，以小麦中国春为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2随机选取200个单株构成F2遗传作图群体。

2）F2群体分蘖表型鉴定

小麦成熟期田间鉴定F2群体植株的分蘖数。

3）SSR分析

a）DNA提取：用CTAB法提取亲本H461、中国春和F2群体植株DNA。

b）亲本之间多态性分子标记的筛选：选取GrainGenes（http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes）上公布的覆盖六倍体小麦A、B、D基因组的418对SSR引物，以亲本H461和中国春的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得192对多态性SSR分子标记；

c）F2群体的SSR分析：以上述步骤获得的192对多态性标记为引物，利用每对引物同时扩增亲本H461、中国春和F2群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的带型记为A，亲本中国春的带型记为B。F2群体株系带型来源于H461的记为A，来源于中国春的记为B。

d）连锁图谱的构建：根据192对引物的分子标记数据，利用作图软件JoinMap4.0构建遗传图谱。以LOD值3到10依次构建连锁群，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL6.0的区间作图模型（Interval Mapping）和多QTL作图模型（Multiple QTL Model），并结合F2群体分蘖表型数据定位寡分蘖基因Ltn1，计算寡分蘖基因Ltn1的位置和分子标记之间的遗传距离，发现小麦H461染色体2A中部显著存在一个主效寡分蘖基因Ltn1，解释表型变异约18%，其紧密连锁的分子标记为GPW8031，遗传距离为0.0cM。

有益效果：

本发明首次公开了来自小麦H461的寡分蘖基因Ltn1，位于小麦2A染色体中部（如图1所示），显著降低了小麦分蘖，LOD值大于3.0；贡献率大，可解释约18%的表型变异。该基因在小麦株型（调控分蘖）育种中具有较高利用价值。

本发明首次公开的小麦H461新寡分蘖基因Ltn1的分子标记GPW8031为共显性标记，用于鉴定植株中是否含有基因，检测方便、扩增稳定、简便易行。

本发明公开的分子标记GPW8031的扩增产物与Ltn1之间的遗传距离仅为0.0cM，连锁很紧密，利用分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦特定分蘖品种的选择鉴定效率，节约成本。

附图说明

图1.小麦H461寡分蘖基因Ltn1在2A染色体上的位置及与本发明分子标记GPW8031之间的连锁遗传图谱。

图2.H461*良麦4号的F2植株分子标记GPW8031检测的电泳图谱；其中1和2分别为H461和良麦4号，3、5、6、7、10为寡分蘖基因型植株，8、11、12为多分蘖基因型植株，4、9为杂合基因型植株。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明做进一步的说明，但是不对本发明保护范围构成任何限制。下面实施例中所用的方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟悉的常规方法。

实施例1：小麦新寡分蘖基因Ltn1的分子标记GPW8031的获得

2）F2群体分蘖表型鉴定

小麦成熟期田间鉴定F2群体植株的分蘖数。

3）SSR分析

a）DNA提取：用CTAB法提取亲本H461、中国春和F2群体植株DNA。

实施例2：本发明分子标记GPW8031在选择寡分蘖基因Ltn1上的应用试验

1）利用小麦寡分蘖H461为母本，以多分蘖小麦品种良麦4号为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2随机选取12个单株。

2）对所获得的12个F2单株进行GPW8031标记检测，具体方法为：在苗期提取12个F2单株的基因组DNA；以基因组DNA为底物，以分子标记GPW8031的引物对为引物进行PCR扩增，所述引物为：

上游引物：5'AGTGTGCGTGCGTTGTGT3'（SEQ ID No.1），

下游引物：5'CGATTCATTGCCTTGCCTAT3'（SEQ ID No.2）。

PCR扩增反应体系：5μl10×PCR buffer、1.5U Ex Taq^TM DNA聚合酶、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng、100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μl；b）PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；将所得到的PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr:Bis=19:1）电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测。电泳结果（见图2）发现其中5个植株具有H461的GPW8031等位位点，同时扩增出约250bp和255bp的两条带，预测这5个植株在成熟后分蘖数较低；而3个植株具有良麦4号的GPW8031等位位点，扩增出约260bp的条带，预测这3个植株在成熟后分蘖数较高。

3）小麦成熟期田间鉴定12个F2植株的分蘖数，结果（见表1）具有H461的GPW8031等位位点的植株分蘖数（1-3个）显著低于具有良麦4号的GPW8031等位位点的植株分蘖数（8-9个）；实际结果与预期结果一致，说明本发明的寡分蘖基因Ltn1确实有显著降低分蘖数的作用；同时本发明的分子标记GPW8031可以用于选择寡分蘖基因Ltn1。

表1用小麦H461寡分蘖基因Ltn1的分子标记预测衍生后代的分蘖能力对比结果表

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种小麦寡分蘖基因Ltn1的分子标记GPW8031，其特征在于该分子标记的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于所述分子标记是小麦H461的基因组DNA为底物进行PCR扩增所得的扩增片段，且与Ltn1之间的遗传距离为0.0cM。

3.根据权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于该基因位于小麦2A染色体中部，显著降低小麦分蘖，LOD值大于3.0。

4.权利要求1所述的分子标记GPW8031的引物对，其特征在于上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

5.一种鉴定寡分蘖基因Ltn1的分子标记方法，其特征在于包括：以待鉴定材料的DNA作为模板，用权利要求4所述的分子标记的引物对进行PCR扩增；PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再用银染法检测；能扩增出与H461相同片段的植株为含有寡分蘖基因Ltn1的植株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)以待鉴定植株的DNA作为模板，用权利要求4所述的分子标记的引物对进行PCR扩增：a）PCR扩增反应体系：5μl10×PCRbuffer、1.5U Ex Taq^TM DNA聚合酶、2mmol/L MgCl₂、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng、100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μl；b）PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；c）PCR产物检测：PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr:Bis=19:1）电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，恒定功率80W，电压2000伏；凝胶最后用硝酸银染色检测；

2)鉴定Ltn1的结果：能扩增出与H461相同片段的植株为含有寡分蘖基因Ltn1的植株。

7.权利要求1-3任一项所述的分子标记在小麦特异分蘖材料创制中的应用。

8.权利要求4所述的引物对在小麦特异分蘖材料创制中的应用。

9.权利要求1-3任一项所述的分子标记在小麦株型育种中的应用。

10.权利要求4所述的引物对在分子标记辅助小麦株型育种中的应用。