CN117778409A - 一株水稻OsNramp5突变体M41、基因型及其应用 - Google Patents

一株水稻OsNramp5突变体M41、基因型及其应用 Download PDF

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张屹
余应弘
谢红军
汤国华
曾晓珊
朱明东
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Abstract

本发明公开了一种水稻OsNramp5突变体M41、基因型及其应用，水稻诱变育种技术领域。所述OsNramp5突变体M41的核苷酸序列与日本晴水稻的OsNramp5基因序列相比，包含如下碱基置换：在7号染色体8877807位点出现碱基置换G变为A。本发明以丰富低镉积累相关的基因多元化，平衡OsNramp5对水稻生长发育和产量等方面的正、负连锁效应，发挥低镉积累水稻品种社会化效应，具有极为重要的意义。

Description

一株水稻OsNramp5突变体M41、基因型及其应用
技术领域
本发明涉及水稻诱变育种技术领域，具体涉及一株水稻OsNramp5突变体M41、基因型、相关的生物材料及其应用和筛选方法。
背景技术
土壤镉污染导致的稻米镉超标，已成为水稻产业亟待解决的关键问题。然而，稻米镉超标，严重影响着农业经济的持续发展和农民种稻积极性，已成为水稻产业亟待解决的关键问题。因此，培育低镉水稻品种是提高早稻附加值，带动水稻产业新的经济增长点的最经济、最有效的途径。OsNRAMP5是介导水稻吸收镉的主效转运蛋白基因，其突变可使水稻植株的镉含量极显著降低，稻米镉含量降低90％以上，为低镉积累水稻分子育种提供了重要的靶标基因。因此，挖掘新的且有效的与谷粒镉积累有关的遗传位点，找到可直接用于杂交育种新的低镉基因，对低镉水稻的选育具有重要意义。
目前，基因编辑、转基因等技术实现作物品种改良仍然还处于相对保守的现状，物理、化学诱变成为获得稳定遗传的种质创新的不可替代方法。辐射诱变与化学诱变结合，大批量处理优异水稻种质资源，能够在短时间内提高突变率并获得更优异的突变基因类型，采用目标基因液相捕获测序技术对水稻突变体进行基因标记检测，可快速获得OsNramp5位点突变单株，有望创制出更多新的OsNramp5基因突变位点，为水稻低镉品种选育提供新的基因选择。
但是这种突变是随机的，如何高效、精准的鉴定与镉积累相关的目的基因的变异是目前诱变育种的一个难点。目前已有6个OsNramp5突变体专利申请(202111192651.1、202111210318.9、202111412187.2、201911222439.8、CN201810525073、CN202211377945)公开的OsNramp5突变体获得，基本都是集中在重离子诱变导致多个片段缺失。然而，不同的变异类型对水稻植株水稻中金属离子的含量，水稻的生长发育、产量性状及米质的影响均不同，缺失越大导致的负面效应越大。因此，发掘有效的单碱基差异位点可以更好的减少这种负面效应，为水稻低镉基因的高效转育提供了有利支撑。
本发明通过提供一株水稻OsNramp5突变体M41、基因型及其应用，以丰富低镉积累相关的基因多元化，平衡OsNramp5对水稻生长发育和产量等方面的正、负连锁效应，发挥低镉积累水稻品种社会化效应，具有极为重要的意义。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一株水稻OsNramp5突变体M41、突变体基因型，以及相关生物材料，以更好地指导低镉积累水稻品种的选育。
本发明次要目的在于提供利用水稻OsNramp5突变体M41的相关生物材料在水稻育种中的应用，从而获得更为丰富的低镉积累水稻品种。
本发明第三个目的还在于提供一种精准化识别，效率高、能准确获取可遗传的水稻OsNramp5突变体的筛选方法。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一株水稻OsNramp5突变体M41，所述OsNramp5突变体M41的核苷酸序列与日本晴水稻的OsNramp5基因序列相比，包含如下碱基置换：在7号染色体8877807位点出现碱基置换G变为A。
一株水稻OsNramp5突变体M41基因型，所述OsNramp5突变体M41的基因包括如SEQID NO.1所示的核苷酸序列，或包括与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列有95％以上同源性的编码相同功能蛋白的序列，所述的相同功能包括降低水稻镉含量。
本发明提供了与所述的OsNramp5突变体M41相关的生物材料，包括如下任一种：
A)含有如权利要求2所述的核苷酸的重组表达载体；
B)含有如权利要求2所述的核苷酸的生物工程菌，或含有A)所述的重组表达载体的生物工程菌；
C)含有如权利要求2所述的核苷酸的转基因植物细胞，或含有A)所述的重组表达载体的转基因植物；
D)由如权利要求2所述的核苷酸编码的蛋白。
本发明提供了所述的OsNramp5突变体M41或所述的生物材料在植物分子辅助育种中的用途。
本发明提供了所述的OsNramp5突变体M41或所述的生物材料在选育和/或制备低镉积累植物中的应用。
进一步地，是在选育和/或制备低镉积累水稻品种中的应用。
更进一步地，低镉积累水稻产品培育方法为：以水稻OsNramp5突变体M41为供体，以杂交水稻骨干亲本为受体，进行回交改良，采用常规育种与KASP分子标记结合的方法，培育具有所述OsNramp5突变体M41基因型的低镉积累的水稻品种。
本发明还提供了一株水稻OsNramp5突变体的筛选方法，包括如下步骤：
1)选取诱变后的水稻种子进行种植，将M2代的种子育秧的植株分单株进行种植，并取多个单株水稻上的叶片分组混合而得到多组混合样品；对每组混合样品提取混池DNA；
2)通过KASP分子标记对每组混池DNA进行分型鉴定，筛选存在有水稻M41突变型基因的混池样品；
3)将有相同基因型的混池样品对应的水稻分单株提取DNA，进一步通过检测出差异对应的KASP分子标记对单株提取DNA进行分型鉴定，筛选出存在有水稻M41突变型基因的单株，即为含有水稻M41突变型基因。
所述的筛选方法，所述KASP分子标记的分型引物包含以下序列：
F1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAGTTTAATTGCGTGTCATTTAGTCAC
F2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAGTTTAATTGCGTGTCATTTAGTCAT
R：GCTAGCAGCTAATCTTGGAGTGGT。
进一步地，步骤1)中，水稻品种为湘悦丝苗。
优选的，步骤1)中，采用理化方式进行诱变，理化诱变方式包括质子诱变或EMS(甲基磺酸乙酯)诱变等。
进一步地，步骤1)中，每100-200个单株水稻上的叶片分组混合而得到混合样品。
进一步的，回交改良的代数为2-6代。
本发明有益效果：
本发明所述的水稻M41突变体，为首次筛选出来的独特的水稻OsNramp5基因型突变体，能很好地应用于低镉积累水稻品种的选育。
本发明通过独特的KASP分子标记分型鉴定，可以实现诱变M1代即可将水稻OsNramp5突变体精准筛选出来，操作高效精准而简便，显著降低了成本。
本发明所述的水稻M41突变体在选育和创制低镉积累水稻产品时，培育和制备方法简单，且无需基因编辑手段，培育出的含有本发明M41突变体基因型的水稻种植后其根、茎、叶和成熟种子的镉含量显著低于同品种的野生水稻。
附图说明
图1为实施例1中突变型基因突变位点和突变类型的碱基序列对比示意图。
图2为实施例1中利用KASP分型引物对分离群体进行基因分型的散点分布图。
图3为实施例1中M41与镉低积累表型相关的SNP变异分析图。
图4为实施例3中湘早低镉1号与湘早1号的株型比对照片。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。实施例以湘悦丝苗品种为例说明构思及达到的实验结果，实际应用不以湘悦丝苗为限。
实施例1---水稻镉低积累突变体M41的获取与验证
一种水稻M41突变型基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。从华智生物技术有限公司检测结果来看，该水稻M41突变型基因为水稻OsNramp5基因第4外显子与4号内含子的剪切位置8877807位点出现碱基置换G变为A，将编码区翻译过程中的第4号内含子进行了翻译，导致最后的突变体水稻M41突变型基因编码在第4号内含子第6-8个碱基提前出现了终止密码子TAA，致使其代谢活动严重降低，进而实现了水稻籽粒镉低积累。本实施例的水稻M41突变型基因其突变基因OsNRAMP5核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本实施例的水稻M41突变型基因具体是通过以下方法筛选、鉴定得到：
1)选取自有知识产权水稻材料“湘悦丝苗”种子200g，采用质子束辐射诱变处理“湘悦丝苗”的干燥种子，处理剂量200Gy，获得“湘悦丝苗”诱变M1代。
2)将M1代的种子育秧的植株分单株进行种植，采取薄膜隔离方式，严格自交结实，混收收获得M2代种子。
3)将M2代的种子育秧的植株分单株进行种植，以112株秧苗为一个群体，每个群体14行，每行8株，种植96个群体，共10752株，
4)对每个群体编号；以每个样本群为单位，待幼苗生长到四叶一心时，取叶片用6mm的打孔器取等量叶片进行混合，共获得112个样本群。
5)以每个群体为单位，共提取112份DNA，以每份DNA为一个测序样本，针对OsNramp5基因(Os07g0257200)的外显子区域进行靶向高深度测序，测序深度>5000重。
6)将高深度靶向测序数据比对日本晴序列，获得112个样本中OsNramp5基因存在的SNP与Indel数据。经华智生物技术有限公司检测发现第41号样本中，在OsNramp5基因的8877807位点存在[G/A]的碱基置换，该碱基置换位于第4个外显子与第4号内含子剪切位置(见图1)。
7)随即根据该[G/A]碱基置换位点设计KASP分型引物，引物序列为：
>F1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAGTTTAATTGCGTGTCATTTAGTCAC
>F2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAGTTTAATTGCGTGTCATTTAGTCAT
>R：GCTAGCAGCTAATCTTGGAGTGGT
8)利用缺失突变位点的KASP分型引物，对41号群体的112个单株进行分型。经分型后发现41号群体里的13排第4株(41-2-D1)含有OsNramp5基因第4外显子[G/A]单碱基替换基因型(参见图2)，最终获得1株目标基因突变的M2代单株，即OsNramp5基因碱基置换突变杂合株41-2-D1。即存在本发明的水稻M41突变体基因杂合株。
9)将41-2-D1单株混收的种子进行播种，并用上述第8步中设计的KASP引物对单株进行分型，最终在41-2-D1的M3群体中获得OsNramp5突变型基因纯合突变体。即存在本发明的水稻M41突变体基因。
同时，根据分型结果，随机在G/A、G/G、A/A三种基因型单株中各抽取20株分别种植于重度镉污染大田(土壤镉浓度为1.5mg/kg，pH为6.5)和中度镉污染大田(土壤镉浓度为0.4mg/kg，pH为6.0)，为了使稻米尽可能多的积累镉元素，采用干湿交替的形式进行栽培管理。水稻完全成熟后，分单株进行收种、脱粒、糙米磨粉。参照国家标准测定方法(GB/T5009.15-2003)，利用ICP-MS测定糙米中镉含量，结果如下表1所示，M41突变体[A/A]纯合基因型籽粒镉含量0.056mg/kg，显著低于其它基因型，低于国家限量标准0.2mg/kg。
表1各基因型突变体籽粒镉含量表型特征
编号 8877807位点变异特征 籽粒镉平均含量(mg/kg)
M41-纯合 A/A 0.056
M41-杂合 G/A 1.531
M41-野生 G/G 1.795
10)为了验证M41-8877807位点突变效应[G/A],本试验构建了M41与野生型湘悦丝苗的F2分离群体，种植于重度镉污染大田(土壤镉浓度为1.5mg/kg，pH为6.5)，利用佳谱科技XR700高精度X射线荧光光谱仪对籽粒的镉含量进行检测，分别选取10株镉高/低积累F2单株构建DNA混池进行测序，开展SNP染色体分布分析，结果表明7号染色体7.2M-9.1M位置变异很集中，初步认定该区域为水稻镉低积累功能基因区间(参见图3)。
11)进一步利用Trizol(Invitrogen)提取镉低积累突变体M41与湘悦丝苗的RNA。
将RNA反转录为cDNA，反应体系：RNA 30ng，Oligo(dT)23VN(50μM):1μL，HiScriptII Enzyme Mix:2μL，2×RT Mix:10μL，RNase-free Water:to total volume 20μL。
反应程序：25℃5min，37℃45min，85℃10s。
以cDNA为模板，用OsNramp5全长引物进行PCR扩增，
引物序列为：
>TF：ATGGAGATTGAGAGAGAGAGCAGT
>TR：CTACCTTGGGAGCGGGATG
12)将PCR产物进行Sanger测序，获得测序结果后，对镉低积累突变体M41与湘悦丝苗的OsNramp5转录产物进行比对(参见图3)，发现突变体M41在第4号外显子与第4内含子剪切位置8877807出现的碱基置换G变为A，将编码区翻译过程中的第4号内含子进行了翻译，其转录表达序列如SEQ ID No.3。进而导致最后的突变体水稻M41突变型基因编码在第4号内含子第6-8个碱基提前出现了终止密码子TAA其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2---水稻OsNramp5突变体不同基因型的镉低积累表型特征
水稻OsNramp5不同基因型突变体的镉积累表型效应分析，供体对象为突变体lcd1、突变体R001、突变体lcd100以及本发明获得的其他多个不同位点突变体，具体包括以下步骤：
1)本实施例中所述供体突变位点信息如下:
表2不同基因型突变体位点变异特征
2)分别抽取不同差异位点突变体30株种植于中度镉污染大田(土壤镉浓度为0.4mg/kg，pH为6.0)，为了使稻米尽可能多的积累镉元素，采用干湿交替的形式进行栽培管理。水稻完全成熟后，分单株进行收种、脱粒、糙米磨粉。参照国家标准测定方法(GB/T5009.15-2003)，利用ICP-MS测定糙米中镉含量，结果表明不同差异位点突变体对水稻籽粒镉积累呈现出显著差异，其中本实施例中获得的3个稳定遗传突变体中的突变体M41籽粒镉积累抑制效果最好，突变体M54的籽粒镉含量虽然也低于国家标准0.2mg/kg，但是在高镉土壤中无法实现镉低积累表型。于此同时，M78虽然也导致OsNramp5的氨基酸发生了变化，但是其籽粒镉含量与野生型湘悦丝苗籽粒镉含量一致。基于此，本实验获得OsNramp5基因突变型M41是具有镉低积累稳定遗传表型的突变体(表3)。
表3不同基因型突变体位点籽粒镉含量表型特征
突变体名称 籽粒镉平均含量mg/kg
lcd1 0.097
R001 0.040
lcd100 0.051
M41 0.047
M78 0.345
M54 0.159
湘悦丝苗 0.308
实施例3---水稻OsNramp5突变体M41在创制低镉水稻新品种中的应用
为了验证水稻OsNramp5突变体M41在创制低镉水稻新品种中的应用，具体包括以下步骤：
1)以实施例1获得的突变体M41为供体亲本，以早稻核心材料湘早1号为受体亲本，进行杂交转育，获得F1种子；
2)将上述播种F1选取单株，以供试早稻为受体亲本，回交获得BC1F1种子；
3)将上述播种BC1F1，利用KASP标记进行分型检测，获得含有M41杂合基因型位点单株，进行背景选择，以供试早稻为受体亲本，回交获得BC2F1种子；
4)将上述播种BC2F1，利用KASP标记进行分型检测，获得含有M41杂合基因型位点单株，进行背景选择，以供试早稻为受体亲本，回交获得BC3F1种子；
5)将上述播种BC3F1，利用KASP标记进行分型检测，获得含有M41纯合基因型位点单株，进行背景选择，自交获得BC3F2种子；
6)将上述播种BC3F2，利用KASP标记进行分型检测，获得含有M41纯合基因型位点单株，进行背景选择，选择与水稻湘早1号遗传背景一致的单株收种，获得湘早低镉1号。
7)将本实施例获得的湘早低镉1号与湘早1号同时种植在镉含量(0.45mg/kg)超标土壤中，成熟后进行产量、株高、籽粒镉含量等指标检测。结果显示(表4)，湘早低镉1号种子的镉含量，显著低于湘悦丝苗，说明突变体M41的低镉表型具有遗传效应，可以有效应用于低镉水稻分子育种。
表4湘早低镉1号与湘早1号(WT)相关性状对比结果
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1：
ATGGAGATTGAGAGAGAGAGCAGTGAGAGAGGGAGCATCAGCTGGAGAGCTAGTGCGGCACATGATCAAGATGCCAAGAAGCTCGACGCAGATGATCAGCTGCTAATGAAGGTCAGTTGCTACCTTAATTATCACAAAGTTGTCTTCTTGTAAGCACTCCACTGTCACCATGGACAGTTGTTCACTGTAACTGCAGAAGCAAGAGCAGAGCTTAATGTAGATAGATCTTGAGAGTACTTCCTGGCATGGCATTCATTGCTCATGAATGTTCATGTGTGTGTGTGTGTATGTGGTAATTAAGGACTGATGGAACATTGGATCCTCAATTATGTCTGTGTTTCTTTTTGTTAGTTTCTCAGTTTTGGTAAATTGTGTACAGGAGCCTGCATGGAAAAGGTTCCTTGCCCATGTTGGTCCTGGATTCATGGTGTCTTTAGCCTACTTGGATCCTGGCAATTGTGAGAATCTCTGAATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAACTGAAACTTTTATTTTGACAAACTCTGGATTGTAACTGTTAATTTTGTCACAAAATGAAACAGTGGAAACCGATCTGCAAGCCGGAGCCAACCACAGATATGAGGTACGTACAGTCGACTTTATTTTACTGTTTACGCACTGAATGACTGAAAGCATGAGTAACTTTCATGCTTTCTAGGTGTTCGTCCCTTTCCTTGTCCCTCGCAGACTCACACTCCATTAATTCATCTGCTAGCTCCATCAAATTCTCCAAATTGACAAACTTTTCAGAACCACTTTTAATCCCCAGTGCATATGTATCTCACTCTCACATCATCTAGAGAAAAGAGAAAAGTGAATAATCTGCACCATTAATTGATTTCTATGTGCTTTTCTGTCCATTGTGTTGTTTCAATTTGCAGCTGCTCTGGGTGATTCTGATTGGACTCATCTTCGCACTTATCATACAGTCGCTAGCAGCTAATCTTGGAGTGGTTACAGATGACTAAATGACACGCAATTAAACTGTAATTACCAACTTGATAAAGTGCTAATATATGGCCGGCATTAATTTACATCCTAGGGAGGCATCTGGCTGAGATCTGCAAGAGTGAGTACCCCAAGTTCGTCAAGATTTTCCTATGGCTGCTGGCAGAGTTGGCCGTCATCGCTGCAGATATCCCAGAAGGTATATACTTATTAGAACAACTTGACACGGTCCAGCCTGAATAATTAATTTATTAAACTACTTGTGTTTAACAGTGTCACCATCTTTGACTTTGAGCTAATTAATTAATTCAGTTTAAGCTCTCTGACAGTAGAAGAAAACAAGTTGATCTGGCTAGCATATGTAGCTCCAACCGTACGGGCCTACATACTGGAATTCCTAATCCACAAACATAGGCAAATTAATATCTCACCAATCACCATCAAGCCACGTTCTTCTCAGCTACTCACCAGATTATTCTCACATATTATTTCTTTCATGTCTCTAGCTAGTAAATATGTTTTTCTAAAAAAAATATATTCTGCGATATTGCATAGATTACAAGTTCTAAGCCATTTTTTTAAAAAATATTTAATTCATCCATATAATAAGGTAGATAATATGTACCAATAATATATCTGTTGAATAATCTGTTTCAAACATAAGCAAATGCGCGTTTTAGCTGTTTAGAGTAGTGACCACGTCCACAGTAGCTTCCCATAAAATTGTCAATGATGCACATCAAGATTAGATTTTAAACACTGGGTGAGTACGTTCATCATCTTACGCAGATTAGTAAACAACTATTTTGTCACCCTCTTGTCATTTCACATTTGTCCTGTCCTGTATACATCCATGTGTGTTTAAACAATAACAACAATATCTAAATATCTATCTATCTAGCAACATGGAAGATAGATCAGTGGTGTAGCAGTTGCAAAACGGAGCTGCGCGAAGCTTTGCTGATCGGGATTAGTTAACCTCAACCGTTGTAAATTGCCTTTTTAATTGATCATGCATGCAAGTTCTTTTTTAAAAAAATTAAACTAGTTATGGAAGATACCTCACATGATGATAGCAAAGGTGATATATAGATAGATAGATAGATCGATCAACAGATAGAAAGGTACAGATCGATGTGATTATAATTAATTAATTAATTACATGTCGTTTGATGTTGTTAATTTTGGTGGATGCAGTTATAGGGACGGCCTTTGCTTTCAACATATTGTTCCATATTCCGGTGTGGGTCGGCGTCCTCATCACCGGCACCAGCACTCTACTGCTTCTTGGCCTCCAAAAATACGGGGTATAAATTATTTTTTGTAAGTTGTTTTTGTTTAGTATCACAAGCATTAGCGTAGGATGCACTCAAAGAAACGATTATAAAAATGGAATAGTATATGAAATTAGCTAGTTGGATCGATTGTCAAGTACTCAAATGGCATATTATATGTACATTATTCAGTTTTTTTTTCTCTGACTGTGGAACTGCATGAAAATTGATTGATGAATTTTTTTTGAAAAAAAACAGGTGAGGAAGCTGGAGTTTCTGATATCGATGCTGGTGTTCGTGATGGCGGCGTGCTTCTTCGGGGAGCTGAGCATCGTGAAGCCGCCGGCGAAGGAGGTGATGAAGGGGCTCTTCATCCCCAGGCTCAACGGCGACGGCGCCACCGCCGACGCCATTGCCCTCCTCGGAGCTCTTGTCATGCCGTACGCTTTTACATACATACATACATACATACGCAACAATCAATCAATTAATTCATACAACTAATCAGTTAATTAACTACTGCATGCATTTATATATATGCAGCCACAATCTGTTCTTGCATTCTGCCTTGGTGCTATCGAGGAAGACACCGGCATCAGTCAGAGGAATCAAGGTAGCTATCTTCAGCCTGGGCAGATCGAGATAGGTATAGGGTAGCTAGGACATGAACTCGATCTAGTCCTGTCTCTTAAATCTTGTTTAAATTTTATTAAATTAACATGTAAATTTCATAGAAAACCAATACTTTATTAGCTAAGTTTTATTTTAGCACTAATCTTCTATAATTTCGGGCTCCAGTACCACTGGATTCAGCTAAGAATTTTTTCATGCATGGAAAGAAACTGAACAAAGATCCAGGCTAATAATTAATATGTACTATATGGTGTGTGAATTGCCACGTAGGACGGGTGCAGGTTCTTCCTGTACGAGAGCGGGTTCGCGCTGTTCGTGGCGCTGCTGATAAACATCGCCGTCGTCTCCGTCTCCGGCACCGCCTGCTCCTCCGCCAACCTCTCCCAAGAGGACGCCGACAAGTGCGCCAACCTCAGCCTCGACACCTCCTCCTTCCTTCTCAAGGTCATTCATTCATTATTACTTCCTACTCTTTAATATTAAAAGTTTTTAAATGGATTAGACGTATCCTAATACTACAGATATAGGAATTTATTCAGATTCGTAGTACTAGCTTGTATGTGTTCAATTTAATCAATATTTAATTAACCACAATAACACCGAATTAGTCTACACGATTTCTCCGTCCTAAAATATAATAACTTTATTAGATATGTTTATATTTTTGAATAGGAGGAGTAACTAATTTATGGTCAAATTGTGACGTCAATTTTTTATGTGGTTCAGAACGTGCTGGGCAAGTCGAGTGCGATCGTGTACGGCGTGGCACTGTTGGCATCTGGGCAGAGCTCCACTATTACCGGCACATACGCTGGACAGTACATCATGCAGGTAATTAATTAAATTAATTAACTTAACTGTACCTGTACCTGTACATCACCAGCTAGCTTAGCGCGTAATTAAATGATTGAACTATAATTAATTAAACGGCTAGCTGCCACATAATTAATTTGTTAATCCGTTCAATTATGGAGGTTAACTGACGAATTGTAGGGGTGCACACCTAATCCTGTTTACATCACGAATATTTAGTGATATAATATTCCTTTATTAATTAGGTAATCTGGCGATCCTCGTCGGATTTCACCATATGTTTTTGTTAAAGTAAGATCGAATTAAGACGCTACCTTGCTGCCACTACTTACCACTTTCGTCCATATTTCTCCGCTCTTTTGGTCTAGTCCATTTCACGGTGCAGTCTCATCAATAACCAGCGATTTTACTGTTTACATATACTTAGAAAACCAATTGATTAATAAAAATATGCTAACGAAACTCTATAAATTATATTAAAAAAAATAGGATATCCCATCGCACCGTAAAATTTTCTTTCTGAAGTGAACGTTGAGAAAGAGAACAACTAGTTTTCCTAATCTACCTGGCGGGCTAACCGATCTAGTTCGAGTCTCATTCCTCTTAATAATCTATTTATGATATGAAGTGTATTTCAGTTACGGGATAAATCGGACCCGAAAATATATATTTATTTTTTCACTCCAAAGGACTGATCTTCAGGATATACTCACTCCGTCTCTAAATATTTGACGTCGTTGATTTTTTATAAATATGTTTGACCGTTCGTCTTATGCAAAAACTTTTGTGAATATTATTTAAAAAACTTGAGTAGTAGTAGTATATACAACAATGAATTAAATAATAAGAAAAGAATTAATAACTACTTAAATTTATTGAATAAGATGAATGGTTAAATATGTTTAGAAAAATCAATGGTGTCAAATATTTAATGACGGAGGGAGTATATGATAAATCATCATCATGTCGCGTTGATATATATGATATGATCCATGTATGTGCAGGGTTTCTTGGACATCAGGATGAGGAAGTGGCTTCGGAACCTGATGACAAGAACCATCGCCATCGCGCCGAGCCTCATCGTCTCCATCATCGGCGGCTCCAGGGGCGCCGGCCGCCTCATCATCATCGCTTCGGTCAGCATTTTTATTATTACTATTTACTATAGCAAATCTTTACTATTATTACTATTTTACTATATCAAACTGCGTGCGCCATACGGCGGCGCCCGCCGGCGAGCAACCGGCCGGCCGTCGTGTCGCCGATCGATTAAAATTTAATGCGTTTAAATTTTTAATTTTGCACATGCCCAAACAGTCACGTGTGTGCAGTCGATCGTGCGGATTTATGTAGCTAGCTAGGTAGTAGTGGGGTATCCACTAGGTACCTAGTGACATAGTACTAAGAGCATATATATATGTCATTAGAGCAAAAGCACTTTTTCTTCTTTTTTTAGATTATTGCCAAATCAAAGTAGTGATCTGATTAGCAAAATGTCACTGACTAGCTAGGTATCTTTTCTTTTTTTGCAATCTGATCTAAAATAGCACCATGCATATATATAATACAGTGTACCATCTAGCTAGACTAGCTTCCAACTCAATAAGTAAGGACTAATTATATATAATTAAATCAAATCAAAGTAGTGATCTGATCATTGCTAGTTCTTGTTTGCTTAATTACATATATATGATTAATTTGTTCCTAATCCGTACGTGTTGTGTGCATGCAGATGATACTGTCCTTCGAGCTGCCGTTTGCTCTCATCCCTCTTCTCAAGTTCAGCAGCAGTAAGAGCAAGATGGGGCCCCACAAGAACTCTATCTATGTAAGATCGTACACTATATATATGCATTGCTTAATTATAGTTTGTTTCTTAATCTCAAATGGCAGCAAATGTACAAGTAACATAAATATATGCATCTATCTGTCCATGCATGAAATTAGAGTTTCAATAATTGTTGGTAAAGAATATAAATTAATGATGATAGTTGGCTAGCTAGCTGGTCCTTCACCCTGCATGCATGCAACCCCTGCAGGACACCATGTTCTATAGGTCAGTGTGTGCATAATGTAGATCGAGATGTGCAGTGAATTGAATTGAATCATTAGCTACCTAGCTCATGCAATAGTAATATAGCACAGCAGGGGCCAATGCAGGACAGGTATATATATGGTCCAGCCATGCATATAGAGGATCGTCGTACATATGAAAACGACGACCAAGATGTACGTCCTGCATCATTTTTCTGTCTTGCAGTAGTACCAGAGATTAATCATGTATTGCGTCGTCGGCATGATGTGTCAAAATCATGCAGTAACGTACTTGCTTGATCTTTACAGACATCGAAGAGCCAAGTTCTTCAGTACACTATATATATTTTTTCTTGCATGGAAGTAAAATGTAAATATAATTTAACATAGATAATTACGTATATCGTTGTATCTCTACTTAAACATTTCTAGACACATACAAGTCAACATTAGAAAATGTAATTCTTTTTTAAGGACCATAAATAAACTGATCTACAACAAAATTGAGCAAATGTAAATTTATTTCTTATTATTACACACATGGCTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATACACATACTACCTATAAAAATTGCGCATGCTCATCAGTCGATACCCGTTAAAAAGATATATAAGTTACCACCCGTCAAAGATGACTGGTTATTTAGTGACGCTATCAATGAATAAATCAGCGTCATGTATGTCAAAAAATAAATTGAATTGAATTGAATGCAGATAATAGTGTTCTCGTGGTTCCTGGGGCTGCTCATCATCGGCATCAACATGTACTTCCTGAGCACGAGCTTCGTCGGCTGGCTCATCCACAACGACCTCCCCAAGTACGCCAACGTGCTCGTCGGCGCCGCCGTCTTCCCGTTCATGCTCGTCTACATCGTCGCCGTCGTCTACCTCACCATCAGGAAGGACTCCGTCGTCACCTTCGTCGCCGACTCCTCCCTCGCCGCCGTCGTCGACGCCGAGAAGGCCGACGCCGGCGACCTCGCCGTCGACGACGACGAGCCCTTGCCGTACCGCGACGACCTGGCCGACATCCCGCTCCCAAGGTAG
SEQ ID NO.2：
MEIERESSERGSISWRASAAHDQDAKKLDADDQLLMKEPAWKRFLAHVGPGFMVSLAYLDPGNLETDLQAGANHRYELLWVILIGLIFALIIQSLAANLGVVTDD
SEQ ID No.3
ATGGAGATTGAGAGAGAGAGCAGTGAGAGAGGGAGCATCAGCTGGAGAGCTAGTGCGGCACATGATCAAGATGCCAAGAAGCTCGACGCAGATGATCAGCTGCTAATGAAGGAGCCTGCATGGAAAAGGTTCCTTGCCCATGTTGGTCCTGGATTCATGGTGTCTTTAGCCTACTTGGATCCTGGCAATTTGGAAACCGATCTGCAAGCCGGAGCCAACCACAGATATGAGCTGCTCTGGGTGATTCTGATTGGACTCATCTTCGCACTTATCATACAGTCGCTAGCAGCTAATCTTGGAGTGGTTACAGATGACTAAATGACACGCAATTAAACTGTAATTACCAACTTGATAAAGTGCTAATATATGGCCGGCATTAATTTACATCCTAGGGAGGCATCTGGCTGAGATCTGCAAGAGTGAGTACCCCAAGTTCGTCAAGATTTTCCTATGGCTGCTGGCAGAGTTGGCCGTCATCGCTGCAGATATCCCAGAAGTTATAGGGACGGCCTTTGCTTTCAACATATTGTTCCATATTCCGGTGTGGGTCGGCGTCCTCATCACCGGCACCAGCACTCTACTGCTTCTTGGCCTCCAAAAATACGGGGTGAGGAAGCTGGAGTTTCTGATATCGATGCTGGTGTTCGTGATGGCGGCGTGCTTCTTCGGGGAGCTGAGCATCGTGAAGCCGCCGGCGAAGGAGGTGATGAAGGGGCTCTTCATCCCCAGGCTCAACGGCGACGGCGCCACCGCCGACGCCATTGCCCTCCTCGGAGCTCTTGTCATGCCCCACAATCTGTTCTTGCATTCTGCCTTGGTGCTATCGAGGAAGACACCGGCATCAGTCAGAGGAATCAAGGACGGGTGCAGGTTCTTCCTGTACGAGAGCGGGTTCGCGCTGTTCGTGGCGCTGCTGATAAACATCGCCGTCGTCTCCGTCTCCGGCACCGCCTGCTCCTCCGCCAACCTCTCCCAAGAGGACGCCGACAAGTGCGCCAACCTCAGCCTCGACACCTCCTCCTTCCTTCTCAAGAACGTGCTGGGCAAGTCGAGTGCGATCGTGTACGGCGTGGCACTGTTGGCATCTGGGCAGAGCTCCACTATTACCGGCACATACGCTGGACAGTACATCATGCAGGGTTTCTTGGACATCAGGATGAGGAAGTGGCTTCGGAACCTGATGACAAGAACCATCGCCATCGCGCCGAGCCTCATCGTCTCCATCATCGGCGGCTCCAGGGGCGCCGGCCGCCTCATCATCATCGCTTCGATGATACTGTCCTTCGAGCTGCCGTTTGCTCTCATCCCTCTTCTCAAGTTCAGCAGCAGTAAGAGCAAGATGGGGCCCCACAAGAACTCTATCTATATAATAGTGTTCTCGTGGTTCCTGGGGCTGCTCATCATCGGCATCAACATGTACTTCCTGAGCACGAGCTTCGTCGGCTGGCTCATCCACAACGACCTCCCCAAGTACGCCAACGTGCTCGTCGGCGCCGCCGTCTTCCCGTTCATGCTCGTCTACATCGTCGCCGTCGTCTACCTCACCATCAGGAAGGACTCCGTCGTCACCTTCGTCGCCGACTCCTCCCTCGCCGCCGTCGTCGACGCCGAGAAGGCCGACGCCGGCGACCTCGCCGTCGACGACGACGAGCCCTTGCCGTACCGCGACGACCTGGCCGACATCCCGCTCCCAAGGTAG 。

Claims (9)

1.一株水稻OsNramp5突变体M41，其特征在于，所述OsNramp5突变体M41的核苷酸序列与日本晴水稻的OsNramp5基因序列相比，包含如下碱基置换：在7号染色体8877807位点出现碱基置换G变为A。
2.一株水稻OsNramp5突变体M41基因型，其特征在于，所述OsNramp5突变体M41的基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或包括与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列有95％以上同源性的编码相同功能蛋白的序列，所述的相同功能包括降低水稻籽粒镉含量。
3.与如权利要求1所述的OsNramp5突变体M41相关的生物材料，其特征在于，包括如下任一种：
A)含有如权利要求2所述的核苷酸的重组表达载体；
B)含有如权利要求2所述的核苷酸的生物工程菌，或含有A)所述的重组表达载体的生物工程菌；
C)含有如权利要求2所述的核苷酸的转基因植物细胞，或含有A)所述的重组表达载体的转基因植物；
D)由如权利要求2所述的核苷酸编码的蛋白。
4.如权利要求1所述的OsNramp5突变体M41或如权利要求2或3所述的生物材料在植物分子辅助育种中的用途。
5.如权利要求1所述的OsNramp5突变体M41或如权利要求2或3所述的生物材料在选育和/或制备低镉积累植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在选育和/或制备低镉积累水稻品种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，镉低积累水稻产品培育方法为：以水稻OsNramp5突变体M41为供体，以杂交水稻骨干亲本为受体，进行回交改良，采用常规育种与KASP分子标记结合的方法，培育具有所述OsNramp5突变体M41基因型的低镉积累的水稻品种。
8.一株水稻OsNramp5突变体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)选取诱变后的水稻种子进行种植，将M2代的种子育秧的植株分单株进行种植，并取多个单株水稻上的叶片分组混合而得到多组混合样品；对每组混合样品提取混池DNA；
2)通过KASP分子标记对每组混池DNA进行分型鉴定，筛选存在有水稻M41突变型基因的混池样品；
3)将有相同基因型的混池样品对应的水稻分单株提取DNA，进一步通过检测出差异对应的KASP分子标记对单株提取DNA进行分型鉴定，筛选出存在有水稻M41突变型基因的单株，即为含有水稻M41突变型基因。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述KASP分子标记的分型引物包含以下序列：
F1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAGTTTAATTGCGTGTCATTTAGTCAC
F2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAGTTTAATTGCGTGTCATTTAGTCAT
R：GCTAGCAGCTAATCTTGGAGTGGT。
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