CN109266782B

CN109266782B - 甜瓜雌性花调控基因g的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109266782B
Application number: CN201811452264.5A
Authority: CN
Inventors: 王建设; 马建
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2038-11-30
Also published as: CN109266782A

Abstract

本发明公开了甜瓜雌性花调控基因g的分子标记及其应用。本发明引物对，为能扩增靶序列的引物对；所述靶序列为如下1)或2)：1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子。利用本发明所提供的分子标记与其对应的引物对甜瓜基因组总DNA进行聚合酶链式反应,并对扩增产物进行电泳检测后即可判断待检测单株是否携带g基因，条带特异性好，结果准确率高，检测不受环境和遗传背景影响。本发明可在大量的甜瓜种质资源中筛选、鉴定雌性花调控基因g，可用于甜瓜全雌系的培育，以及在分子标记辅助选择育种以及基因聚合育种中应用。

Description

甜瓜雌性花调控基因g的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种甜瓜雌性花调控基因g的分子标记及其应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis)甜瓜种一年生草本植物，因其果实香甜、营养丰富，深受各地人民喜爱。甜瓜存在性别分化，主要花型分三种：雄花、雌花和完全花。不同的花型组合使甜瓜的性型较为丰富，大致分为以下几种：雄花两性花同株(雄全同株，andromonoecious)、雌花两性花同株(雌全同株，gynomonoecious)、雌雄异花同株(单性花，monoecious)、两性花株(完全株，hermaphrodite)、雌花雄花两性花同株(三性混合株，trimonoecious)、全雌株(gynoecious)和全雄株(androecious)(栾非时等，2013)。

研究表明，甜瓜的性型主要受Andromonoecious(A/a)、Gynoecious(G/g)以及修饰基因Gy/gy(M/m)三个位点上的等位基因协同控制(Boualem et al，2008；Kinigsbuch，1987,1990)。a、g、gy均为隐性基因，其中a基因控制雄全同株性状，作用于大多数单性雄花，少数两性完全花；g基因控制雌全同株性状，作用于大多数单性雌花，少数两性完全花；gy基因控制全雌株性状，与a和g存在互作。当位点a、g的基因型为A_G_时，表现为雌雄异花同株；aagg基因型为两性花株；基因型为aaG_时表现为雄全同株；基因型为A_gggygy时，表现为稳定的全雌株。Boualem等(2008)利用图位克隆的方法克隆了两性花A基因CmACS-7，该基因编码乙烯合成的关键基因1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACC合成酶)，由于基因保守区域第170位核苷酸位点C-T的突变，造成编码蛋白第57位丙氨酸突变为缬氨酸，导致ACC合成酶活性丧失，从而解除乙烯在两性花发育时期对雄蕊的抑制，最终产生两性花。Martin等(2009)克隆了雌性g基因CmWIP1，该基因编码C2H2类锌指蛋白转录因子，由于基因下游1.4kb位置插入了一个hAT家族转座子Gyno-hAT，导致CmWIP1基因启动子区域发生甲基化而不表达，从而心皮发育产生雌花。Boualem等(2015)克隆了雄性基因(androecy gene)CmACS-11，也编码1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶，该基因的突变可导致全雄植株的产生。Chen等(2016)图位克隆了黄瓜控制心皮的发育的CsACO2基因，该基因编码1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC氧化酶，ACO)，基因突变后导致酶活降低，茎尖乙烯释放量减少50％基因而产生全雄株，通过同源克隆方法鉴定出甜瓜的同源基因CmACO3，同时证明CmWIP1基因可以直接结合到CmACO3基因的启动子上抑制其表达。

目前，栽培的甜瓜品种大多为雄全同株类型，少数为单性花品种。雄全同株品种在杂交一代制种过程中，需要人工去雄，还必须严格执行摘除雄花、套袋、标记、种子纯度鉴定等操作流程，操作繁琐耗时耗力，若人工去雄或授粉时伤及雌蕊，会造成授粉率低，结实减少，影响杂交种产量。若利用全株无雄花的全雌系做母本，或可采用蜜蜂授粉代替人工，不仅可以降低制种成本，理论上种子纯度可达到100％(吴起顺，2010)。由于甜瓜的性型遗传较为复杂，全雌系基因型为AAgg，在全雌系培育过程中，A基因为显性，尚可通过当代进行表型观察，而g基因为隐性，只能自交观察后代表型，因此，利用常规杂交方法选育全雌系费事费力。开发g基因的特异分子标记，在全雌系选育过程中可提高g基因的后代选择效率，降低育种成本，对通过分子手段加快全雌系的选育进程具有特别重要的意义。

发明内容

本发明一个目的是提供引物对。

本发明提供的引物对，为甜瓜雌性花调控基因g的分子标记，为能扩增靶序列的引物对；

所述靶序列为如下1)或2)：

1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。

上述引物对由引物F和引物R组成；

所述引物F为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物R为如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。

上述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。

上述引物对中，所述引物甲和所述引物乙的摩尔比为1：1。

含有上述引物对的PCR试剂也是本发明保护的范围。

上述PCR试剂中，所述引物对中的引物F和引物R的在所述PCR试剂中的浓度均为0.5μmol/L。

含有上述引物对或上述的PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在检测待测甜瓜是否含有g基因中的应用也是本发明保护的范围；

或上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在筛选含有g基因的甜瓜中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种检测待测甜瓜是否含有g基因的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

用上述引物对扩增待测甜瓜，检测扩增产物；

若所述扩增产物得到100-200bp的片段，则所述待测甜瓜含有或候选含有g基因；若所述扩增产物未得到100-200bp的片段，则所述待测甜瓜不含有或候选不含有g基因。

上述本发明的实施例中，所述100-200bp的片段为160bp目的片段；和/或，所述160bp目的片段的核苷酸序列为序列3。

上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒或上述的方法在如下1)-4)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

1)用于甜瓜基因g的分子标记辅助育种；

2)基因聚合育种；

3)全雌系培育；

4)鉴定或辅助鉴定雌性花调控基因的基因型。

本发明第3个目的是提供一种甜瓜全雌系培育方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用全两性花甜瓜(甜瓜B15)作为父本，雌雄异花同株甜瓜(B24)作为母本，进行有性杂交获得F_1-A代；再从上述F_1-A代中选取表现为单性花株的单株与雄花两性花甜瓜(B8)杂交，得到F_1-B代；

2)从所述F_1-B代中选取表现为单性花株且含有g基因的F_1-B代单株与所述雄花两性花甜瓜回交4代，得到BC₄F₁代植株；

所述回交4代中，均是从第一次、第二次和第三次回交的后代中选取表现为单性花株且含有g基因的单株作为下一次回交的轮回亲本；

3)从所述BC₄F₁代植株选取表现为单性花株且含有g基因的BC₄F₁代单株自交，得到甜瓜全雌系；

所述选取表现为单性花株且含有g基因的单株均为将表现为单性花株的单株用权利要求1-3中任一所述引物对鉴定，选取含有g基因的作为表现为单性花株且含有g基因的单株。

雌性花调控基因g基因是一个隐性基因，可解除对心皮的抑制导致雌蕊产生，在甜瓜全雌系培育中具有重要的应用价值。

本发明通过g基因设计特异性分子标记g-FR，以常规的PCR技术为基础，能够快捷有效地从育种群体中筛选到携带g基因的个体。这套分子标记遗传稳定，不受环境及遗传背景因素的影响，可以100％的鉴定出g基因。

另外，可以应用本发明的g基因位点特异性分子标记g-FR对目标基因g进行常规杂交或回交转育，以及与A基因(CmACS-7)基因聚合，可快速获得基因型为AAgg的全雌系，其育种选择目标明确，可以大大节约时间和成本，提高全雌系育种效果。本发明的分子标记由于源自基因功能性位点之多态性，不存在不良性状的遗传重组问题。因此，本发明提供的分子标记，对于加速甜瓜全雌系培育进程具有重要意义。

附图说明

图1为标记g-FR对亲本和F₂代的基因型分析。

图2为标记C5-9(a)和C5-10(b)对亲本及F₂代的基因型分析。

图3为标记g-FR对36份甜瓜材料的基因型分析。

图4为标记g-as和g-s对10份甜瓜材料的基因型分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、g基因特异标记开发及对后代群体的检测

一、g基因特异标记开发

根据g基因所在位置设计标记g-FR，该标记由序列1所示的引物和序列2所示的引物组成，即为g基因特异标记。

引物F：AAGGTACTCCAAATGAATGGCT(序列1)；

引物R：TTAAATCGGGTCGGTTCGGT(序列2)。

二、g基因特异标记检测方法的建立

甜瓜材料B15为全两性花株类型，全株只着生完全花一种类型，已鉴定基因型为aagg，即含有g基因。

甜瓜材料054为雄全株类型，主蔓着生雄花，侧枝着生雄花和完全花，已鉴定基因型为aaGG，即含有G基因。

1、F₂代植株的获得

为了验证标记g-FR的准确性和特异性，以母本B15(一窝猴，郑州邢源种业有限公司)和父本054(伊丽莎白，国家蔬菜工程技术研究中心利得公司)为亲本配制F₁并自交产生F₂代。

在田间逐一调查统计F₂代植株花的性型，去除个别发育畸形花单株，统计结果表明：141个性型明显F₂单株中，雄全株类型109株，全两性花株类型32株，经卡方测验(109:32)χ² _0.05＝0.29<3.84(p＝0.59)，符合孟德尔遗传单基因分离比。

2、标记g-FR进行PCR扩增

随后，利用g-FR标记的引物对亲本及上述141个F₂代单株(雄全株类型109株，全两性花株类型32株)进行基因型分析，具体如下：

CTAB方法提取单株基因组DNA作为模板，用上述一的引物F和上述一的引物R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

上述PCR扩增的反应体系如下：0.8μL Buffer、0.8μL dNTPs(2mmol/L each)、1μLPrimers(10μmol/L，F+R(每条引物的反应终浓度均为0.5μmol/L)、1μL基因组DNA(50ng/μL)、0.1μL

DNA Polymerase for PAGE(购自北京全式金生物技术有限公司)和6.3μL ddH₂O。

上述PCR扩增的反应程序为94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；72℃延伸5min。

8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。

结果如图1所示，标记g-FR对亲本和部分F₂代单株PCR扩增产物检测；P₁：B15；P₂：054；1-22：全两性花F₂单株；23-34：雄全花F₂单株；M：100bp DNA ladder；

可以看出，

亲本B15的PCR扩增产物为大小100-200bp的目的片段，经过测序，该目的片段的核苷酸序列为序列3，大小为160bp；

亲本054无扩增产物检出；

1-22所示的全两性花F₂单株均有目的条带扩出，与亲本B15带型一致；23-34所示的雄全花F₂单株部分有目的条带扩出。

统计141个F₂代单株中，全两性花株类型32株全部有目的条带扩出，与亲本B15带型一致，即含有g基因；雄全株类型109株中，80个雄全同株单株有目的条带扩出，与亲本B15带型一致，即含有g基因；而其余29个雄全同株单株未检测出目的条带，即不含有g基因。

3、g基因附近连锁标记对g-FR标记检测结果的验证

为了进一步验证标记g-FR检测结果的准确性，根据甜瓜基因组数据库(https://www.melonomics.net/)基因组注释获得基因G位点上游13kb及下游39kb处参考基因组序列，利用NCBI网站在线引物设计程序Primer-BLAST设计两对InDel标记C5-9和C5-10。

InDel标记C5-9由如下两条引物组成：

gctttcaaaatgcacaaaaccc(序列4)

acattgtcctaacagaggcaaa(序列5)

InDel标记C5-10由如下两条引物组成：

ttggtacagaaattgggacaga(序列6)

gctatagtttagcaaagcgaagatg(序列7)

利用上述2个引物对分别对亲本B15、054和上述1获得的141个F₂单株的基因组DNA进行PCR扩增检测，PCR扩增的反应体系如下：0.8μL Buffer、0.8μL dNTPs(2mmol/L each)、1μL Primers(10μmol/L，每条引物反应终浓度为0.5μmol/L)、1μL基因组DNA(50ng/μL)、0.1μL

DNA Polymerase for PAGE(购自北京全式金生物技术有限公司)和6.3μLddH₂O。

上述扩增反应程序为94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；72℃延伸5min。

电泳检测方法为8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后硝酸银染色。

部分结果如图2所示，其中所用34个F₂代单株编号与图1一致，其中，a为标记C5-9对亲本和部分F₂代PCR扩增产物检测；b.为标记C5-10对亲本和部分F₂代PCR扩增产物检测；P₁：B15；P₂：054；1-22：全两性花F₂单株；23-34：雄全花F₂单株；M：100bp DNA ladder；用两对标记对141个F₂代单株进行基因型分析，结果表明：两对标记扩增结果类似，141个F₂代单株中，32个全两性花单株扩增目的条带与亲本B15一致(基因型gg)，29个雄全同株单株扩增目的条带与亲本054一致(基因型GG)，其余80个雄全同株单株目的条带为杂合型(基因型Gg)。

上述结果可以看出，g基因紧密连锁标记C5-9和C5-10与g-FR检测结果一致性100％，进一步表明标记g-FR对F₂代群体检测结果可靠。

根据图1和图2的结果表明，标记g-FR可以在g基因亲本后代群体中特异检测出g基因，具体方法如下：

用标记g-FR对含有g基因的甜瓜后代进行PCR扩增，若得到100-200bp的PCR扩增产物(具体为160bp，尤其优选为序列3)，则待测甜瓜后代含有或候选含有g基因(genbank号为GQ870275，提交日期为2009年10月)；若未得到100-200bp的PCR扩增产物(具体为160bp，尤其优选为序列3)，则待测甜瓜后代不含有或候选不含有g基因。

实施例2、标记g-FR在鉴定g基因在甜瓜种质资源的分布中的应用

为了鉴定出新的全两性花资源，了解g基因的分布情况，利用g-FR标记对表1所示的34份甜瓜资源进行了PCR检测。以单性花材料1520A和B24(合肥庞氏农产品有限公司)(已知基因型为GG)为对照。

若得到100-200bp的PCR扩增产物，则待测甜瓜后代含有或候选含有g基因；若未得到100-200bp的PCR扩增产物，则待测甜瓜后代不含有或候选不含有g基因。

结果如图3和表1所示，图3中，泳道1-36分别为：甜瓜材料B15、B18、054、B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、B11、B12、B13、B14、B16、B17、B19、HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9、HP10、HP11、HP12、H71、H72、1520A、B24；M：100bp DNA ladder；可以看出，单性花材料1520A和B24(基因型为AAGG)无扩增条带，其不含有g基因；其余除B15外，仅B18可特异地扩增出一条160bp的目的片段，其含有g基因。

已知B18源于薄皮甜瓜资源白梨，也为全两性花株类型，基因型与B15一致，含有g基因；而其余的雄花两性花株材料均未有目的条带扩出，不含有g基因(图3，表1)。

这些结果表明本发明所提供的特异鉴定g基因的位点特异性性分子标记g-FR可以在不同的甜瓜材料中准确鉴定出g基因。

表1 g-FR标记对36份甜瓜材料的g基因鉴定结果

“+”:含有g基因；“-”:不含有g基因。

实施例3、标记g-FR在培育甜瓜全雌系中的应用

为了快速培育出基因型为AAgg的甜瓜全雌系，采用常规有性杂交及回交选育方法，辅以g基因的分子标记选择。

1、亲本选择

甜瓜B15(一窝猴，郑州邢源种业有限公司)，全两性花材料，基因型为aagg，提供g基因；B8(羊角脆，京研益农(北京)种业科技有限公司)，雄花两性花材料，基因型为aaGG，轮回亲本；B24(黄子金玉，合肥庞氏农产品有限公司)，雌雄异花同株(单性花)材料，基因型为AaGG，提供A基因。

2、以甜瓜B8为遗传背景的全雌系选育方法

首先以甜瓜B15作父本、B24作母本进行有性杂交获得F₁代种子，种植F₁代植株，拔除雄花两性花株，留单性花株(此时基因型为AaGg)；利用获得的单性花株与B8杂交获得F₁代种子，种植F₁代植株，拔除雄花两性花株，此时利用实施例1中的标记g-FR标记及方法对剩余的单性花株进行分子标记检测，选择带g基因的单株继续与轮回亲本B8回交获得BC₁F₁代；种植BC₁F₁代植株，拔除雄花两性花株，利用实施例1中的标记g-FR标记及方法对剩余的单性花株进行分子标记检测，选择带g基因的单株继续与轮回亲本B8回交获得BC₂F₁代；重复此操作直至获得BC₄F₁代；种植BC₄F₁代植株，拔除雄花两性花株，利用实施例1中的标记g-FR标记及方法对剩余的单性花株进行分子标记检测，选择带g基因的单株进行自交获得BC₄F₂代；选取果形美观单瓜种植BC₄F₂代植株，在田间观察即可得到基因型为AAgg的全雌系。

上述实施例仅为本发明示例性的描述，但本发明的实施方式并不受上述实施例中品种或材料的限制，其他的任何未违背本发明精神实质及原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均落入本发明的保护范围之内。

对比例：

采用已经报道的g基因的SCAR标记g-as和g-s进行对比试验，

SCAR标记g-as和g-s序列如下：

g-as：AACACGCAACTGAAACGA

g-s：ATGATAATAAGGAGAAAGGGAC

用上述SCAR标记g-as和g-s扩增表1所示的部分甜瓜材料B15、B18、B1、B2、B3、B4、B5、B6、1520A和B24。

结果如图4所示，可以看出，两性花材料B18可扩增1169bp目的片段，而两性花材料B15中未能检测。表明其准确率不高。

另外，SCAR标记对DNA聚合酶以及T甜瓜基因组DNA质量要求很高，需1％琼脂糖凝胶电泳检测，效率较低。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>甜瓜雌性花调控基因g的分子标记及其方法与应用

<160>7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

aaggtactcc aaatgaatgg ct 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

ttaaatcggg tcggttcggt 20

<210> 3

<211>160

<212> DNA

<213>甜瓜（Cucumis melo L.）

<400> 3

aaggtactcc aaatgaatgg ctttgattta acacaacact caaaattagg ggtgaaaaaa 60

accgacccga cccgatgacc cgacccgacc cgattcggtt cggtttgggt tggatcggtt 120

agtaacaaca atgttactgg accgaaccga cccgatttaa 160

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

gctttcaaaa tgcacaaaac cc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

acattgtcct aacagaggca aa 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

ttggtacaga aattgggaca ga 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

gctatagttt agcaaagcga agatg 25

Claims

1.一种甜瓜全雌系培育方法，包括如下步骤：

1）用全两性花甜瓜作为父本，雌雄异花同株甜瓜作为母本，进行有性杂交获得F_1-A代；再从上述F_1-A代中选取表现为单性花株的单株与雄花两性花甜瓜杂交，得到F_1-B代；

2）从所述F_1-B代中选取表现为单性花株且含有g基因的F_1-B代单株与所述雄花两性花甜瓜回交4代，得到BC₄F₁代植株；

3）从所述BC₄F₁代植株选取表现为单性花株且含有g基因的BC₄F₁代单株自交，得到甜瓜全雌系；

所述选取表现为单性花株且含有g基因的单株均为将表现为单性花株的单株用引物对鉴定，选取含有g基因的单株作为表现为单性花株且含有g基因的单株；

所述引物对由引物F和引物R组成；

所述引物F为序列表中序列1所示的单链DNA分子；

所述引物R为序列表中序列2所示的单链DNA分子。