CN109266782B - 甜瓜雌性花调控基因g的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了甜瓜雌性花调控基因g的分子标记及其应用。本发明引物对,为能扩增靶序列的引物对;所述靶序列为如下1)或2):1)序列表的序列3所示的单链DNA分子;2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子。利用本发明所提供的分子标记与其对应的引物对甜瓜基因组总DNA进行聚合酶链式反应,并对扩增产物进行电泳检测后即可判断待检测单株是否携带g基因,条带特异性好,结果准确率高,检测不受环境和遗传背景影响。本发明可在大量的甜瓜种质资源中筛选、鉴定雌性花调控基因g,可用于甜瓜全雌系的培育,以及在分子标记辅助选择育种以及基因聚合育种中应用。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域,具体涉及一种甜瓜雌性花调控基因g的分子标记及其应用。
背景技术
甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis)甜瓜种一年生草本植物,因其果实香甜、营养丰富,深受各地人民喜爱。甜瓜存在性别分化,主要花型分三种:雄花、雌花和完全花。不同的花型组合使甜瓜的性型较为丰富,大致分为以下几种:雄花两性花同株(雄全同株,andromonoecious)、雌花两性花同株(雌全同株,gynomonoecious)、雌雄异花同株(单性花,monoecious)、两性花株(完全株,hermaphrodite)、雌花雄花两性花同株(三性混合株,trimonoecious)、全雌株(gynoecious)和全雄株(androecious)(栾非时等,2013)。
研究表明,甜瓜的性型主要受Andromonoecious(A/a)、Gynoecious(G/g)以及修饰基因Gy/gy(M/m)三个位点上的等位基因协同控制(Boualem et al,2008;Kinigsbuch,1987,1990)。a、g、gy均为隐性基因,其中a基因控制雄全同株性状,作用于大多数单性雄花,少数两性完全花;g基因控制雌全同株性状,作用于大多数单性雌花,少数两性完全花;gy基因控制全雌株性状,与a和g存在互作。当位点a、g的基因型为A_G_时,表现为雌雄异花同株;aagg基因型为两性花株;基因型为aaG_时表现为雄全同株;基因型为A_gggygy时,表现为稳定的全雌株。Boualem等(2008)利用图位克隆的方法克隆了两性花A基因CmACS-7,该基因编码乙烯合成的关键基因1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACC合成酶),由于基因保守区域第170位核苷酸位点C-T的突变,造成编码蛋白第57位丙氨酸突变为缬氨酸,导致ACC合成酶活性丧失,从而解除乙烯在两性花发育时期对雄蕊的抑制,最终产生两性花。Martin等(2009)克隆了雌性g基因CmWIP1,该基因编码C2H2类锌指蛋白转录因子,由于基因下游1.4kb位置插入了一个hAT家族转座子Gyno-hAT,导致CmWIP1基因启动子区域发生甲基化而不表达,从而心皮发育产生雌花。Boualem等(2015)克隆了雄性基因(androecy gene)CmACS-11,也编码1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶,该基因的突变可导致全雄植株的产生。Chen等(2016)图位克隆了黄瓜控制心皮的发育的CsACO2基因,该基因编码1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC氧化酶,ACO),基因突变后导致酶活降低,茎尖乙烯释放量减少50%基因而产生全雄株,通过同源克隆方法鉴定出甜瓜的同源基因CmACO3,同时证明CmWIP1基因可以直接结合到CmACO3基因的启动子上抑制其表达。
目前,栽培的甜瓜品种大多为雄全同株类型,少数为单性花品种。雄全同株品种在杂交一代制种过程中,需要人工去雄,还必须严格执行摘除雄花、套袋、标记、种子纯度鉴定等操作流程,操作繁琐耗时耗力,若人工去雄或授粉时伤及雌蕊,会造成授粉率低,结实减少,影响杂交种产量。若利用全株无雄花的全雌系做母本,或可采用蜜蜂授粉代替人工,不仅可以降低制种成本,理论上种子纯度可达到100%(吴起顺,2010)。由于甜瓜的性型遗传较为复杂,全雌系基因型为AAgg,在全雌系培育过程中,A基因为显性,尚可通过当代进行表型观察,而g基因为隐性,只能自交观察后代表型,因此,利用常规杂交方法选育全雌系费事费力。开发g基因的特异分子标记,在全雌系选育过程中可提高g基因的后代选择效率,降低育种成本,对通过分子手段加快全雌系的选育进程具有特别重要的意义。
发明内容
本发明一个目的是提供引物对。
本发明提供的引物对,为甜瓜雌性花调控基因g的分子标记,为能扩增靶序列的引物对;
所述靶序列为如下1)或2):
1)序列表的序列3所示的单链DNA分子;
2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。
上述引物对由引物F和引物R组成;
所述引物F为如下a1)或a2):
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子;
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子;
所述引物R为如下b1)或b2):
b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子;
b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
上述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。
上述引物对中,所述引物甲和所述引物乙的摩尔比为1:1。
含有上述引物对的PCR试剂也是本发明保护的范围。
上述PCR试剂中,所述引物对中的引物F和引物R的在所述PCR试剂中的浓度均为0.5μmol/L。
含有上述引物对或上述的PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。
上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在检测待测甜瓜是否含有g基因中的应用也是本发明保护的范围;
或上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在筛选含有g基因的甜瓜中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种检测待测甜瓜是否含有g基因的方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:
用上述引物对扩增待测甜瓜,检测扩增产物;
若所述扩增产物得到100-200bp的片段,则所述待测甜瓜含有或候选含有g基因;若所述扩增产物未得到100-200bp的片段,则所述待测甜瓜不含有或候选不含有g基因。
上述本发明的实施例中,所述100-200bp的片段为160bp目的片段;和/或,所述160bp目的片段的核苷酸序列为序列3。
上述引物对或上述的PCR试剂或上述的试剂盒或上述的方法在如下1)-4)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围:
1)用于甜瓜基因g的分子标记辅助育种;
2)基因聚合育种;
3)全雌系培育;
4)鉴定或辅助鉴定雌性花调控基因的基因型。
本发明第3个目的是提供一种甜瓜全雌系培育方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:
1)用全两性花甜瓜(甜瓜B15)作为父本,雌雄异花同株甜瓜(B24)作为母本,进行有性杂交获得F1-A代;再从上述F1-A代中选取表现为单性花株的单株与雄花两性花甜瓜(B8)杂交,得到F1-B代;
2)从所述F1-B代中选取表现为单性花株且含有g基因的F1-B代单株与所述雄花两性花甜瓜回交4代,得到BC4F1代植株;
所述回交4代中,均是从第一次、第二次和第三次回交的后代中选取表现为单性花株且含有g基因的单株作为下一次回交的轮回亲本;
3)从所述BC4F1代植株选取表现为单性花株且含有g基因的BC4F1代单株自交,得到甜瓜全雌系;
所述选取表现为单性花株且含有g基因的单株均为将表现为单性花株的单株用权利要求1-3中任一所述引物对鉴定,选取含有g基因的作为表现为单性花株且含有g基因的单株。
雌性花调控基因g基因是一个隐性基因,可解除对心皮的抑制导致雌蕊产生,在甜瓜全雌系培育中具有重要的应用价值。
本发明通过g基因设计特异性分子标记g-FR,以常规的PCR技术为基础,能够快捷有效地从育种群体中筛选到携带g基因的个体。这套分子标记遗传稳定,不受环境及遗传背景因素的影响,可以100%的鉴定出g基因。
另外,可以应用本发明的g基因位点特异性分子标记g-FR对目标基因g进行常规杂交或回交转育,以及与A基因(CmACS-7)基因聚合,可快速获得基因型为AAgg的全雌系,其育种选择目标明确,可以大大节约时间和成本,提高全雌系育种效果。本发明的分子标记由于源自基因功能性位点之多态性,不存在不良性状的遗传重组问题。因此,本发明提供的分子标记,对于加速甜瓜全雌系培育进程具有重要意义。
附图说明
图1为标记g-FR对亲本和F2代的基因型分析。
图2为标记C5-9(a)和C5-10(b)对亲本及F2代的基因型分析。
图3为标记g-FR对36份甜瓜材料的基因型分析。
图4为标记g-as和g-s对10份甜瓜材料的基因型分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料,公众可从北京市农林科学院获得,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。
实施例1、g基因特异标记开发及对后代群体的检测
一、g基因特异标记开发
根据g基因所在位置设计标记g-FR,该标记由序列1所示的引物和序列2所示的引物组成,即为g基因特异标记。
引物F:AAGGTACTCCAAATGAATGGCT(序列1);
引物R:TTAAATCGGGTCGGTTCGGT(序列2)。
二、g基因特异标记检测方法的建立
甜瓜材料B15为全两性花株类型,全株只着生完全花一种类型,已鉴定基因型为aagg,即含有g基因。
甜瓜材料054为雄全株类型,主蔓着生雄花,侧枝着生雄花和完全花,已鉴定基因型为aaGG,即含有G基因。
1、F2代植株的获得
为了验证标记g-FR的准确性和特异性,以母本B15(一窝猴,郑州邢源种业有限公司)和父本054(伊丽莎白,国家蔬菜工程技术研究中心利得公司)为亲本配制F1并自交产生F2代。
在田间逐一调查统计F2代植株花的性型,去除个别发育畸形花单株,统计结果表明:141个性型明显F2单株中,雄全株类型109株,全两性花株类型32株,经卡方测验(109:32)χ2 0.05=0.29<3.84(p=0.59),符合孟德尔遗传单基因分离比。
2、标记g-FR进行PCR扩增
随后,利用g-FR标记的引物对亲本及上述141个F2代单株(雄全株类型109株,全两性花株类型32株)进行基因型分析,具体如下:
CTAB方法提取单株基因组DNA作为模板,用上述一的引物F和上述一的引物R进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
上述PCR扩增的反应体系如下:0.8μL Buffer、0.8μL dNTPs(2mmol/L each)、1μLPrimers(10μmol/L,F+R(每条引物的反应终浓度均为0.5μmol/L)、1μL基因组DNA(50ng/μL)、0.1μLDNA Polymerase for PAGE(购自北京全式金生物技术有限公司)和6.3μL ddH2O。
上述PCR扩增的反应程序为94℃预变性4min;94℃变性30s,59℃退火30s,72℃延伸30s,运行35个循环;72℃延伸5min。
8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。
结果如图1所示,标记g-FR对亲本和部分F2代单株PCR扩增产物检测;P1:B15;P2:054;1-22:全两性花F2单株;23-34:雄全花F2单株;M:100bp DNA ladder;
可以看出,
亲本B15的PCR扩增产物为大小100-200bp的目的片段,经过测序,该目的片段的核苷酸序列为序列3,大小为160bp;
亲本054无扩增产物检出;
1-22所示的全两性花F2单株均有目的条带扩出,与亲本B15带型一致;23-34所示的雄全花F2单株部分有目的条带扩出。
统计141个F2代单株中,全两性花株类型32株全部有目的条带扩出,与亲本B15带型一致,即含有g基因;雄全株类型109株中,80个雄全同株单株有目的条带扩出,与亲本B15带型一致,即含有g基因;而其余29个雄全同株单株未检测出目的条带,即不含有g基因。
3、g基因附近连锁标记对g-FR标记检测结果的验证
为了进一步验证标记g-FR检测结果的准确性,根据甜瓜基因组数据库(https://www.melonomics.net/)基因组注释获得基因G位点上游13kb及下游39kb处参考基因组序列,利用NCBI网站在线引物设计程序Primer-BLAST设计两对InDel标记C5-9和C5-10。
InDel标记C5-9由如下两条引物组成:
gctttcaaaatgcacaaaaccc(序列4)
acattgtcctaacagaggcaaa(序列5)
InDel标记C5-10由如下两条引物组成:
ttggtacagaaattgggacaga(序列6)
gctatagtttagcaaagcgaagatg(序列7)
利用上述2个引物对分别对亲本B15、054和上述1获得的141个F2单株的基因组DNA进行PCR扩增检测,PCR扩增的反应体系如下:0.8μL Buffer、0.8μL dNTPs(2mmol/L each)、1μL Primers(10μmol/L,每条引物反应终浓度为0.5μmol/L)、1μL基因组DNA(50ng/μL)、0.1μLDNA Polymerase for PAGE(购自北京全式金生物技术有限公司)和6.3μLddH2O。
上述扩增反应程序为94℃预变性4min;94℃变性30s,59℃退火30s,72℃延伸30s,运行35个循环;72℃延伸5min。
电泳检测方法为8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳完毕后硝酸银染色。
部分结果如图2所示,其中所用34个F2代单株编号与图1一致,其中,a为标记C5-9对亲本和部分F2代PCR扩增产物检测;b.为标记C5-10对亲本和部分F2代PCR扩增产物检测;P1:B15;P2:054;1-22:全两性花F2单株;23-34:雄全花F2单株;M:100bp DNA ladder;用两对标记对141个F2代单株进行基因型分析,结果表明:两对标记扩增结果类似,141个F2代单株中,32个全两性花单株扩增目的条带与亲本B15一致(基因型gg),29个雄全同株单株扩增目的条带与亲本054一致(基因型GG),其余80个雄全同株单株目的条带为杂合型(基因型Gg)。
上述结果可以看出,g基因紧密连锁标记C5-9和C5-10与g-FR检测结果一致性100%,进一步表明标记g-FR对F2代群体检测结果可靠。
根据图1和图2的结果表明,标记g-FR可以在g基因亲本后代群体中特异检测出g基因,具体方法如下:
用标记g-FR对含有g基因的甜瓜后代进行PCR扩增,若得到100-200bp的PCR扩增产物(具体为160bp,尤其优选为序列3),则待测甜瓜后代含有或候选含有g基因(genbank号为GQ870275,提交日期为2009年10月);若未得到100-200bp的PCR扩增产物(具体为160bp,尤其优选为序列3),则待测甜瓜后代不含有或候选不含有g基因。
实施例2、标记g-FR在鉴定g基因在甜瓜种质资源的分布中的应用
为了鉴定出新的全两性花资源,了解g基因的分布情况,利用g-FR标记对表1所示的34份甜瓜资源进行了PCR检测。以单性花材料1520A和B24(合肥庞氏农产品有限公司)(已知基因型为GG)为对照。
若得到100-200bp的PCR扩增产物,则待测甜瓜后代含有或候选含有g基因;若未得到100-200bp的PCR扩增产物,则待测甜瓜后代不含有或候选不含有g基因。
结果如图3和表1所示,图3中,泳道1-36分别为:甜瓜材料B15、B18、054、B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、B11、B12、B13、B14、B16、B17、B19、HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9、HP10、HP11、HP12、H71、H72、1520A、B24;M:100bp DNA ladder;可以看出,单性花材料1520A和B24(基因型为AAGG)无扩增条带,其不含有g基因;其余除B15外,仅B18可特异地扩增出一条160bp的目的片段,其含有g基因。
已知B18源于薄皮甜瓜资源白梨,也为全两性花株类型,基因型与B15一致,含有g基因;而其余的雄花两性花株材料均未有目的条带扩出,不含有g基因(图3,表1)。
这些结果表明本发明所提供的特异鉴定g基因的位点特异性性分子标记g-FR可以在不同的甜瓜材料中准确鉴定出g基因。
表1 g-FR标记对36份甜瓜材料的g基因鉴定结果
“+”:含有g基因;“-”:不含有g基因。
实施例3、标记g-FR在培育甜瓜全雌系中的应用
为了快速培育出基因型为AAgg的甜瓜全雌系,采用常规有性杂交及回交选育方法,辅以g基因的分子标记选择。
1、亲本选择
甜瓜B15(一窝猴,郑州邢源种业有限公司),全两性花材料,基因型为aagg,提供g基因;B8(羊角脆,京研益农(北京)种业科技有限公司),雄花两性花材料,基因型为aaGG,轮回亲本;B24(黄子金玉,合肥庞氏农产品有限公司),雌雄异花同株(单性花)材料,基因型为AaGG,提供A基因。
2、以甜瓜B8为遗传背景的全雌系选育方法
首先以甜瓜B15作父本、B24作母本进行有性杂交获得F1代种子,种植F1代植株,拔除雄花两性花株,留单性花株(此时基因型为AaGg);利用获得的单性花株与B8杂交获得F1代种子,种植F1代植株,拔除雄花两性花株,此时利用实施例1中的标记g-FR标记及方法对剩余的单性花株进行分子标记检测,选择带g基因的单株继续与轮回亲本B8回交获得BC1F1代;种植BC1F1代植株,拔除雄花两性花株,利用实施例1中的标记g-FR标记及方法对剩余的单性花株进行分子标记检测,选择带g基因的单株继续与轮回亲本B8回交获得BC2F1代;重复此操作直至获得BC4F1代;种植BC4F1代植株,拔除雄花两性花株,利用实施例1中的标记g-FR标记及方法对剩余的单性花株进行分子标记检测,选择带g基因的单株进行自交获得BC4F2代;选取果形美观单瓜种植BC4F2代植株,在田间观察即可得到基因型为AAgg的全雌系。
上述实施例仅为本发明示例性的描述,但本发明的实施方式并不受上述实施例中品种或材料的限制,其他的任何未违背本发明精神实质及原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,均落入本发明的保护范围之内。
对比例:
采用已经报道的g基因的SCAR标记g-as和g-s进行对比试验,
SCAR标记g-as和g-s序列如下:
g-as:AACACGCAACTGAAACGA
g-s:ATGATAATAAGGAGAAAGGGAC
用上述SCAR标记g-as和g-s扩增表1所示的部分甜瓜材料B15、B18、B1、B2、B3、B4、B5、B6、1520A和B24。
结果如图4所示,可以看出,两性花材料B18可扩增1169bp目的片段,而两性花材料B15中未能检测。表明其准确率不高。
另外,SCAR标记对DNA聚合酶以及T甜瓜基因组DNA质量要求很高,需1%琼脂糖凝胶电泳检测,效率较低。
序列表
<110>北京市农林科学院
<120>甜瓜雌性花调控基因g的分子标记及其方法与应用
<160>7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
aaggtactcc aaatgaatgg ct 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
ttaaatcggg tcggttcggt 20
<210> 3
<211>160
<212> DNA
<213>甜瓜 (Cucumis melo L.)
<400> 3
aaggtactcc aaatgaatgg ctttgattta acacaacact caaaattagg ggtgaaaaaa 60
accgacccga cccgatgacc cgacccgacc cgattcggtt cggtttgggt tggatcggtt 120
agtaacaaca atgttactgg accgaaccga cccgatttaa 160
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
gctttcaaaa tgcacaaaac cc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
acattgtcct aacagaggca aa 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
ttggtacaga aattgggaca ga 22
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 7
gctatagttt agcaaagcga agatg 25
Claims (1)
1.一种甜瓜全雌系培育方法,包括如下步骤:
1)用全两性花甜瓜作为父本,雌雄异花同株甜瓜作为母本,进行有性杂交获得F1-A代;再从上述F1-A代中选取表现为单性花株的单株与雄花两性花甜瓜杂交,得到F1-B代;
2)从所述F1-B代中选取表现为单性花株且含有g基因的F1-B代单株与所述雄花两性花甜瓜回交4代,得到BC4F1代植株;
所述回交4代中,均是从第一次、第二次和第三次回交的后代中选取表现为单性花株且含有g基因的单株作为下一次回交的轮回亲本;
3)从所述BC4F1代植株选取表现为单性花株且含有g基因的BC4F1代单株自交,得到甜瓜全雌系;
所述选取表现为单性花株且含有g基因的单株均为将表现为单性花株的单株用引物对鉴定,选取含有g基因的单株作为表现为单性花株且含有g基因的单株;
所述引物对由引物F和引物R组成;
所述引物F为序列表中序列1所示的单链DNA分子;
所述引物R为序列表中序列2所示的单链DNA分子。
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