CN116806694A - 一种茄子一倍单倍体花药培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茄子一倍单倍体花药培养方法，包括采集花蕾、花药培养前的花蕾预处理、花药预培养、胚状体诱导、胚状体萌发、壮苗和移栽炼苗等操作。与现有的二倍体茄子花药培养技术相比，本发明花蕾的取材范围宽，不需要对花粉细胞发育阶段进行鉴别；获得的再生植株无需鉴定细胞起源，只要是二倍体就可以直接自交建成DH系；延长供试花蕾的低温处理时间，整个过程中无需秋水仙素等化学药剂处理即可获得二倍体植株，提高了产生二倍体植株的频率，实现了茄子一倍单倍体植株的加倍，解决了单倍体植株加倍困难的问题。获得的7株再生植株，经过流式细胞法鉴定，其中2株为单倍体，其余5株为二倍体。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种茄子一倍单倍体花药培养方法。
背景技术
茄子(Solarium melongena L)，原产亚洲热带，我国各省均有栽培。草本或亚灌木状，果可供蔬食，根、茎、叶、种子皆可入药。自然界中以二倍体为主，单倍体和多倍体植株主要由花药培养获得。茄子具有明显的杂种优势，生产上应用的F1代杂交种品种主要是单交种，其育种过程是首先选育纯合亲本自交系，再根据配合力测试的结果组配产量和品质等方面具有杂种优势的杂交种。
茄子属于常自花授粉植物，一般异交率3-7％，甚至达到100％(不同基因型的植株互相靠近密植时，由于蓟马、白粉虱和红蜘蛛的活动等导致异交率极高，2022年测试的结果)。因此采用常规的连续多代自交法选育自交系，不仅需要严格隔离，而且需要自交4代及以上，育种周期长。而采用花药或小孢子培养，能够从二倍体茄子植株获得一倍单倍体，一倍单倍体成功加倍后，可快速得到二倍体自交系。但该技术存在一系列的问题，除了无反应的基因型的影响外，敏感基因型的花药培养，也经常诱导不出加倍单倍体植株和纯合二倍体植株。
70年代初，Riana等成功地通过二倍体茄子花药培养经愈伤组织途径成苗，目前不论是茄子花药还是花粉(小孢子)培养，都已有成功的报道，但国内文献中关于利用花药或花粉培养获得的亲本选育出茄子新品种的报道却并不多。究其原因，主要包括(1)茄子花药或花粉培养产生再生植株的频率不高；(2)受到花药壁细胞等体细胞的影响，二倍体杂种茄子花药培养的再生植株中，基因型纯合的二倍体植株频率低；(3)一倍单倍体植株，尤其是成熟的一倍单倍体植株直接诱导加倍困难，表现为周期长、加倍率极低。但由于利用二倍体花药培养获得加倍单倍体植株的技术(DH育种技术)可缩短育种年限至少3年，前景诱人，很多研究者仍旧致力于二倍体茄子花药培养和再生一倍单倍体茄子的加倍研究。比如，采用无菌的秋水仙素溶液(含二甲基亚砜)对无菌单倍体苗进行加倍，虽然加倍率可以达到60％-100％(一种辣椒或茄子单倍体植株DNA加倍的方法CN 111374048A)，但再生苗加倍处理过程需要无菌条件，加倍处理后植株移栽成活率未见说明，因此获得二倍体自交系的数量和效率未知。而茄子一倍单倍体植株的花药培养国内外未见研究和报道，更未见一倍单倍体茄子植株的花药培养诱导产生二倍体植株，从而实现加倍的报道。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有杂种二倍体花药培养后代群体的基因型复杂、常规物理或化学法诱导一倍单倍体植株加倍形成二倍体纯合自交系的技术难题，提供一种茄子一倍单倍体植株花药培养的方法，避免杂合二倍体茄子花药再生植株基因型复杂、获得纯合二倍体植株或自交系困难的问题，实现成熟一倍单倍体植株的加倍。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种茄子一倍单倍体花药培养方法，包括如下步骤：
(1)采集茄子一倍单倍体植株上发育健壮、无病虫、花瓣包裹紧密的花蕾，将其密封保存，然后于4℃下低温处理2d至5d；
(2)将步骤(1)中低温处理后的花蕾取出，剥去萼裂片，带入无菌室进行表面消毒，然后在无菌条件下剥出完整的花药，接种到预备培养基中封口后放入35℃培养箱中黑暗条件下培养1-3d，然后取出放到25℃培养箱中光暗交替条件下继续培养7-20d；
(3)将步骤(2)预备培养基中的花药转入胚状体诱导培养基中，同样的光暗交替条件下培养10-30d，直至出现胚状体；
(4)将步骤(3)胚状体及花药转入萌发培养基中，同样的条件下继续培养，每20d左右更换1次新鲜培养基；待胚状体发育出完整的根和芽后，再转入壮苗培养基中，直至叶片变厚、水渍化状态改善，株高达到2cm以上，及时炼苗移栽；
(5)将步骤(4)的生根壮苗取出，不伤根的情况下洗掉根部所沾染的培养基，然后在多菌灵溶液中浸泡10-30min，取出后将根系点蘸IBA或NAA溶液，然后栽入未用过的育苗基质中，浇透而不积水，用薄膜覆盖苗盘，将苗盘放入以上光暗交替的培养箱中，7-15天逐步揭除薄膜，保持苗叶片不萎蔫，植株成活，叶片逐步增大。
优选地，步骤(1)中，所述的茄子单倍体植株的花蕾在4℃下低温处理4d。
具体地，步骤(2)中，所述的表面消毒采用二步法，先将整理好的花蕾浸泡于70％-75％的酒精，酒精深度没过花蕾，手摇或振荡1-5min，倒掉酒精；然后加入1-3滴吐温-80，再倒入6.5％的次氯酸钠溶液，手摇或振荡5-15min，然后倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗3-5次，最后用灭菌的吸水纸或滤纸吸干花蕾表面的液体。
具体地，步骤(2)～(5)中，所述的光暗交替培养条件为温度为25℃，光周期为12～16h，暗周期为8～12h，光照强度为1000～1500lx。
具体地，步骤(2)中，所述的预备培养基为MS固体培养基添加0.1-2mg/L的NAA和6-BA。
具体地，步骤(3)中，所述的胚状体诱导培养基为NLN固体培养基添加IAA或NAA0.1-0.5mg/L和6-BA或ZT0.1-0.5mg/L。
具体地，步骤(4)中，所述的萌发培养基为NLN或B5固体培养基添加0.1-1mg/L的生长素、分裂素和赤霉素，每20d更换1次新鲜培养基，为节省工作量，最多更换2次新鲜培养基，未产生胚状体的花药全部丢弃。
具体地，步骤(4)中，所述的壮苗培养基为B5固体培养基，根据苗的生长状态，添加或不添加0.1mg/L的生长素。
具体地，步骤(5)中，所述的多菌灵溶液由有效成分含量为50wt％的多菌灵可湿性粉剂与水按照1:500～800的质量比稀释得到，将根系基部浸入多菌灵溶液，浸泡时间为5-30min；所述的IBA或NAA溶液的浓度为200-1000ppm，苗根部在溶液中的点蘸时间为10s-20min；所述的育苗基质为常见的蔬菜播种用的育苗基质、蛭石或由蛭石、草灰和珍珠岩以5：4：1的体积比混合而成，厚度不小于10cm，浇透但不积水；苗的根系垂直栽入基质中，叶片全部露出基质，株行距为8cm。
具体地，步骤(5)中，塑料薄膜密封后1周内不打开薄膜，1周后可打开薄膜，拔除死亡植株并浇水或喷水后，重新盖好薄膜。第10d将薄膜向上提升，与苗盘之间留出1cm间隙，逐步降湿，至第15d薄膜全部揭开。期间出现叶片萎蔫，则向叶面喷施清水，直至叶片明显生长，植株成活并实现自养。
最后，取步骤(5)的成活植株上部第3片叶的一部分，采用流式细胞法测定其DNA含量，并以二倍体种子实生苗的第三片嫩叶为对照，样本峰值的荧光强度X-Mean(横坐标)与细胞DNA含量成正比，所以由各样本X-Mean之间的比例关系判断倍性。例如，将对照的二倍体峰调整在横坐标100位置，则单倍体峰值会出现在50，峰值在200位置的为四倍体。图形的纵坐标代表细胞数量，峰的高低反应了细胞比例的不同。
有益效果：
(1)本发明茄子一倍单倍体花药培养方法，包括采集花蕾、花药培养前的花蕾预处理、花药预培养、胚状体诱导、胚状体萌发、壮苗和炼苗移栽等操作。与现有的二倍体茄子花药培养技术相比，本发明花蕾的取材范围宽，不需要对花粉细胞发育阶段进行鉴别；获得的再生植株无需鉴定小孢子起源还是体细胞起源，只要是二倍体就可以直接自交建成DH系；延长对供体植株或供试花蕾的低温处理时间，提高了再生植株的二倍体频率，实现了茄子一倍单倍体植株的加倍，解决了移栽成活的成熟茄子一倍单倍体植株加倍极其困难的问题。
(2)采用本发明方法，从无性繁殖保存4年的成熟单倍体植株上采集的花蕾，花药培养后，得到7株再生植株，其中5株为二倍体，获得的二倍体植株不需要进行基因型纯合度检测，自交后即可获得加倍单倍体株系(DH系)。该技术能够实现茄子单倍体植株的加倍。
(3)本发明培养方法与常规的秋水仙素直接处理单倍体植株的生长点诱导加倍方法不同，常规处理方法会导致处理部位的组织或器官死亡、处理后的苗移栽成活率低、处理后产生嵌合体而难以获得二倍体纯合自交系。采用本发明的低温处理方法，花蕾中的花药保持活力又能避免杂菌污染，培养后产生的5个二倍体植株全部为正常的二倍体植株而非嵌合体。整个培养过程中可以仅用低温处理花蕾，完全不用秋水仙素溶液处理，不仅节省成本、安全，而且时间更短、加倍效率更高。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为用于培养的各种大小的茄子花蕾。
图2为4℃低温预处理2天花蕾后，产生的胚状体苗或胚状体用无菌的0.2％秋水仙素溶液浸泡1d，然后继续培养，产生的苗根系发育不良而生长缓慢，去根后诱导生根二次成苗，然后移栽成活的二倍体植株。
图3为4℃低温预处理4天花蕾后，花药培养产生移栽成活的二倍体植株。
图4是采用秋水仙素溶液处理胚状体后，诱导出苗的照片。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
试验在2023年1月-2023年8月，于金陵科技学院遗传育种实验室中进行。茄子单倍体植株来源于2018年二倍体植株“春晓”花药培养产生的一倍单倍体再生植株，通过扦插和/或嫁接保存至今的植株。2020年春季测定该植株的花粉活力为15.6％，能够座果，但果实内的种子发育不成熟，不能萌发成苗。50％wp多菌灵粉剂为上海悦联化工有限公司生产，其有效成分含量为50wt％，每升自来水中含有1.25克粉剂，配置成为稀释800倍的混悬液；吲哚-3-丁酸(IBA,分子量为203.24)或萘乙酸(NAA)，由中国医药集团上海化学试剂公司生产，粉剂先用少量100％酒精溶解，再用超纯水稀释到1000ppm。
本发明茄子一倍单倍体花药培养方法，包括采集花蕾、花药培养前的花蕾预处理、花药预培养、胚状体诱导、胚状体萌发、壮苗和移栽炼苗等操作。
(1)采集单倍体植株上的花蕾：于晴好天气采集单倍体植株上的花蕾，放入塑料袋中封口或扎严，防止水分散失。立即放入冰盒中，带回实验室备用。
(2)花蕾预处理：表面消毒之前的花蕾，a、4℃低温预处理2天(后续产生的胚状体和苗发育缓慢，需要用2％秋水仙素水溶液浸泡1d，随后诱导苗二次生根才能产生可移栽的完整植株)；b、4℃低温4天，然后按照花蕾长度和宽度分大、中、小三级(图1)，将萼裂片剥去，这样有利于提高消毒效果。
(3)花药表面消毒和培养：采用二步法消毒，用灭菌的吸水纸或滤纸吸干消毒后的花蕾表面的液体，在无菌条件下剥出完整的花药，接种到直径为5cm的培养皿中的预备培养基中，封口后放入35℃培养箱中黑暗条件下培养1-3d，然后取出放到25℃、12h/12h光暗交替、光照强度1500lx条件下，继续培养7-20d；将花药转入胚状体诱导培养基中培养10-30d，直至出现胚状体；然后将胚状体及花药转入萌发培养基中，同样的条件下继续培养，每20d左右更换1次新鲜培养基，最多更换2次，未产生胚状体的花药全部丢弃。胚状体发育出完整的根和芽后，再转入三角瓶或罐头瓶中的壮苗培养基中，直至叶片变厚、水渍化状态改善，株高达到2cm以上，及时炼苗移栽。预备培养基为MS固体培养基添加0.1-2mg/L的NAA和6-BA；胚状体诱导培养基为NLN固体培养基添加IAA/NAA和6-BA/ZT各0.1-0.5mg/L；萌发培养基为NLN或B5固体培养基添加0.1-1mg/L的生长素、分裂素和赤霉素，壮苗培养基为B5固体培养基，根据苗的生长状态，添加或不添加0.1mg/L的生长素。
(4)炼苗移栽：适宜移栽的生根壮苗用镊子从培养瓶中轻轻夹出，不伤根的情况下小心洗掉根部所沾染的培养基，在800倍的多菌灵溶液中浸泡30min，取出后将根系用1000ppm的IBA或NAA蘸一下，约10s，然后栽入未使用过的育苗基质中，浇透而不积水，用塑料袋或塑料薄膜覆盖苗盘，将苗盘放入以上25℃光照培养箱中，7-15天逐步揭除薄膜，保持苗叶片不萎蔫，植株成活，叶片逐步增大即可。
育苗基质为由蛭石、草灰和珍珠岩以5：4：1的体积比混合而成，厚度不小于10cm，浇透但不积水；根系全部栽入基质，叶片全部露出基质，株行距为8cm。塑料薄膜密封后1周内不打开薄膜，1周后可打开薄膜，拔除干枯死亡的植株并浇水后，重新盖好薄膜。第10d开始薄膜与苗盘之间留1cm缝隙降湿，至第15d全部揭开。降湿后喷水保证叶片不萎蔫即可。
以上各步骤中，光暗交替培养条件为温度为25℃，光周期为12h，暗周期为12h，光照强度为1500lx。
(5)植株倍性检测：当再生苗生长至3-4片真叶时用流式细胞仪鉴定植株的倍性。流式细胞仪鉴定方法为采集新鲜幼嫩叶片，叶片编号同植株编号一一对应，试验提供的二倍体对照为“84-1株系”(该株系为课题组花药培养获得，经细胞学鉴定染色体数24，为二倍体)，每一个测试需要的叶片大约小拇指甲盖大小。准备测试的叶片应为此量的4倍以上，以备重复实验用。
测试机构：北京金迪未来生物科技有限公司
检测仪器：Partec CyFlow Space
试剂盒：Partec CyStain UV Precise P
结果判定方法：样本峰值的荧光强度X-Mean(横坐标)与细胞DNA含量成正比，所以由各样本X-Mean之间的比例关系判断倍性。例如，将对照的二倍体峰值调整在横坐标100位置，则单倍体会出现在50，峰值在200位置的为四倍体。图形的纵坐标代表细胞数量，峰的高低反应了细胞比例的不同。
采用a方法进行预处理的花蕾进行花药培养，从接种到产生移栽成活的二倍体植株需要6个月(图2)，而采用b方法进行预处理的花蕾，从接种到产生移栽成活的二倍体植株仅需要4个月(图3)。获得的7株再生植株，经过流式细胞仪鉴定，其中2株为单倍体，其余5株为二倍体。5个二倍体植株全部为正常的二倍体植株而非嵌合体。
表1不同花蕾预处理方法的一倍单倍体花药培养产生移栽成活二倍体的过程对比
图2为4℃低温预处理2天花蕾后，花药培养产生移栽成活的二倍体植株。1月13号接种，7月14号移栽。图中，A为培养21天的花药，红框中的花药产生胚状体。B为A红框中的花药及其产生的胚状体。C为培养36天的花药及胚状体。D为C箭头所指的胚状体发育成的完整植株。E为D中的植株移栽成活照片。F为E中的植株叶片DNA含量鉴定结果为二倍体植株。G为C红框中的花药培养36天产生的胚状体。H为G中胚状体发育的完整植株，经DNA含量鉴定为二倍体植株。其中C中的胚状体和苗因发育停滞，2月25日将其浸泡在无菌的0.2％的秋水仙素水溶液中1d，取出后继续接种到萌发培养基，待苗明显生长后，重新诱导生根，二次成苗(图4)。D和H中的苗均为二次成苗。
图3为4℃低温预处理4天花蕾后，花药培养产生移栽成活的二倍体植株。3月15日接种，7月14号移栽。图中，A为培养50天的单倍体花药及其产生的胚状体和苗。B为A中的苗转入三角瓶中发育成丛生植株。C为B丛生植株中分离出的最大的完整植株。D为C中的植株移栽成活照片。E为D中的植株叶片DNA含量，鉴定为二倍体植株。整个培养过程未采用秋水仙素等化学试剂处理，周期短且更安全，加倍效率更高。
本发明提供了一种茄子一倍单倍体花药培养方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种茄子一倍单倍体花药培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采集茄子一倍单倍体植株上发育健壮、无病虫、花瓣包裹紧密的花蕾，将其密封保存，然后于4℃下低温处理2d至5d；
(2)将步骤(1)中低温处理后的花蕾取出，剥去萼裂片，带入无菌室进行表面消毒，然后在无菌条件下剥出完整的花药，接种到预备培养基中封口后放入35℃培养箱中黑暗条件下培养1-3d，然后取出放到25℃培养箱中光暗交替条件下继续培养7-20d；
(3)将步骤(2)预备培养基中的花药转入胚状体诱导培养基中，同样的光暗交替条件下培养10-30d，直至出现胚状体；
(4)将步骤(3)胚状体及花药转入萌发培养基中，同样的条件下继续培养，每20d左右更换1次新鲜培养基；待胚状体发育出完整的根和芽后，再转入壮苗培养基中，直至叶片变厚，水渍化状态改善，株高达到2cm以上，及时炼苗移栽；
(5)将步骤(4)的生根壮苗取出，不伤根的情况下洗掉根部所沾染的培养基，然后在多菌灵溶液中浸泡10-30min，取出后将根系点蘸IBA或NAA溶液，然后栽入未用过的育苗基质中，浇透而不积水，用薄膜覆盖苗盘，将苗盘放入以上光暗交替的培养箱中，7-15天逐步揭除薄膜，保持苗叶片不萎蔫，植株成活，叶片逐步增大。
2.根据权利要求1所述的茄子一倍单倍体花药培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的茄子一倍单倍体的花蕾在4℃下低温处理4d。
3.根据权利要求1所述的茄子一倍单倍体花药培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的表面消毒采用二步法，先将整理好的花蕾浸泡于70％-75％的酒精，酒精深度没过花蕾，手摇或振荡1-5min，倒掉酒精；然后加入1-3滴吐温-80，再倒入6.5％的次氯酸钠溶液，手摇或振荡5-15min，然后倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗3-5次，最后用灭菌的吸水纸或滤纸吸干花蕾表面的液体。
4.根据权利要求1所述的茄子一倍单倍体花药培养方法，其特征在于，步骤(2)～(5)中，所述的光暗交替培养条件为温度为25℃，光周期为12-16h，暗周期为8-12h，光照强度为1000-1500lx。
5.根据权利要求1所述的茄子一倍单倍体花药培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的预备培养基为MS固体培养基添加0.1-2mg/L的NAA和6-BA。
6.根据权利要求1所述的茄子一倍单倍体花药培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的胚状体诱导培养基为NLN固体培养基添加IAA/NAA和6-BA/ZT各0.1-0.5mg/L。
7.根据权利要求1所述的茄子一倍单倍体花药培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的萌发培养基为NLN或B5固体培养基添加0.1-1mg/L的生长素、分裂素和赤霉素，每20d更换1次新鲜培养基，最多更换2次，未产生胚状体的花药全部丢弃。
8.根据权利要求1所述的茄子一倍单倍体花药培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的壮苗培养基为B5固体培养基，根据苗的生长状态，添加或不添加0.1mg/L的生长素。
9.根据权利要求1所述的茄子一倍单倍体花药培养方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的多菌灵溶液由有效成分含量为50wt％的多菌灵可湿性粉剂与自来水按照1:500-800的质量比稀释得到，将根系基部浸入多菌灵溶液，浸泡时间为5-30min；所述的IBA或NAA溶液的浓度为200～1000ppm，苗根部在溶液中的点蘸时间为10s-20min；所述的育苗基质为常见的蔬菜播种用的育苗基质、蛭石或由蛭石、草灰和珍珠岩以5：4：1的体积比混合而成，厚度不小于10cm，浇透但不积水；根系全部栽入基质，叶片全部露出基质，株行距为8cm左右。
10.根据权利要求1所述的茄子一倍单倍体花药培养方法，其特征在于，步骤(5)中，塑料薄膜密封后1周内不打开薄膜，1周后打开薄膜，拔除干枯死亡的苗，并浇水或喷水后，重新盖好薄膜；10天后薄膜向上提升，下部与苗盘顶部留出1cm的空隙，期间观察苗的状态，叶片出现萎蔫时，向叶面喷施自来水即可，15天后可完全揭掉薄膜。
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