CN111903520A

CN111903520A - 一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法

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Publication number: CN111903520A
Application number: CN202010764084.1A
Authority: CN
Inventors: 梁江
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-08-01
Filing date: 2020-08-01
Publication date: 2020-11-10

Abstract

本发明提供了一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，将发育到适宜时期的游离小孢子胚状体转入成苗培养基，先在10℃低温下诱导处理，再在正常光照条件下培养形成再生幼苗；切取再生幼苗转入生根培养基，连续光照培养使其壮苗生根；当再生植株长到3~5片真叶并具有健壮根时，置于密封的塑料小拱棚进行驯化，成活后移栽到温室。本发明还提供了一种胚状体成苗培养基，在该培养基上人参小孢子胚状体能很好地萌发并直接、快速地再生幼苗。本发明从培养条件、培养基成分等方面，初步研究了若干因素对胚状体发育成苗的影响，成功获得了人参单倍体再生植株，为游离小孢子培养在人参育种方面的应用奠定基础。

Description

一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法

技术领域

本发明涉及一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，属于中药植物培育技术领域。

背景技术

人参（Panax ginseng C. A. Mey）为五加科人参属多年生草本植物，主根肥大，肉质黄白色，圆柱形或纺锤形，下部常带有分支，须根长且多。人参通常3年开花，5~6年结果，花期7~8月，果期6~9月，种子可阴干贮藏，种胚有后熟特性，没有完成生理后熟的种子不发芽。人参怕晒、怕热、怕旱、耐寒，喜阴凉、湿润的气候，多生长在杂木林或针阔混交林中。人参在我国主要分布于辽宁东部、吉林东半部和黑龙江东部，其中主产区为吉林省抚松、靖宇、长白朝鲜族自治县，有“人参故乡”之称。作为我国传统名贵中药材之一，人参根、茎、叶、花及果实均可入药，具有大补元气、益气生津、延年益寿等诸多功效。我国现存最早的药物学专著《神农本草经》中对人参的药理学作用有这样的描述：“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，明目，开心益智”，“久服轻身延年”。目前对人参成分研究主要集中在皂苷类、多糖类和挥发性成分，其中人参皂苷是人参中主要的活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗心肌缺血、抗衰老、改善记忆力等广谱的药理活性。

在我国，人参育种工作虽然起步较早，但发展缓慢。育种周期长、变异类型不稳定、混杂程度高是影响其发展的主要瓶颈。若采用单倍体育种和常规育种相结合的方法，势必能大大缩短育种年限，加快人参育种进程，满足人们的用参需求。

单倍体材料可以通过自然发生和人工诱导获得。自然产生单倍体一般突变数量少，频率低，难以在生产实践中应用。人工诱导单倍体的方法主要有：一是雄核途径，包括花药培养、小孢子培养等；二是雌核途径，包括未授粉子房（或胚珠）培养、化学药剂诱导、辐射花粉授粉等。其中花药或小孢子培养应用最为广泛。

花药培养是指在适宜培养基上进行花药诱导培养，使花粉由配子体途径转为孢子体途径发育，诱导分化形成再生植株。在花药培养过程中，由于受体细胞因子（花药壁、药膈、绒毡层）的影响，培养物混倍现象普遍存在。特别是由愈伤组织分化而来的植株，往往是单倍体、二倍体、三倍体、四倍体、多倍体、杂合体等组成的混合群体。而游离小孢子培养是由分离的单细胞直接发育成胚胎，因此是快速获取植物纯合单倍体的最有效途径，可在短期内得到大量高度纯合的单倍体植株，能快速纯合基因型，增加选择机率，加快育种进程，并为下一步的杂种优势利用打下基础。Chuong等发现油菜小孢子培养比其花药培养的胚状体发生率高 20倍以上；栗根义等发现大白菜小孢子培养胚胎的诱导效率比花药培养高出10倍以上；Davies等比较了大麦的游离小孢子培养和花药培养，发现前者较后者产生更多的正常再生植株。游离小孢子培养可剔除体细胞的影响，培育出的是纯合的单倍体植株，再通过加倍易于获得纯合的二倍体，同时其胚胎发生率可能会比花药培养更高，因此在植物育种和遗传改良中具有诱人的前景。

游离小孢子培养是在离体培养的条件下改变作物花粉的正常发育方向而形成单倍体植株。在这个过程中，小孢子容易受到各种因素的影响和控制。其中，内因主要包括供体植株的基因型，取材时期等；外因主要包括环境条件、材料预处理、培养基类型、培养基添加物、培养密度等。目前游离小孢子培养在育种中取得较好进展的有芸薹属作物（大白菜、甘蓝、油菜等）、禾本科作物（小麦、大麦、水稻）等，而人参游离小孢子再生体系还未建立，这表明人参游离小孢子培养难度较大，同时也说明其小孢子培养技术较滞后。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，为建立完整的人参游离小孢子培养体系，以及加快人参育种进程提供方法指导和物质基础。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、胚状体的成苗培养：将发育到适宜时期的人参游离小孢子胚状体转入成苗培养基，先在10℃低温下诱导处理 5~15d，再在温度24~26℃，光照强度1000~2000lx，每天光照14~16h的条件下培养形成再生幼苗；培养过程中每月继代一次；

S2、壮苗生根培养：切取再生幼苗转入生根培养基中，在温度22~26℃、光照强度2000~3000lx、连续光照条件下培养，使幼苗生长粗壮；

S3、再生植株驯化移栽：当再生植株长到 3~5片真叶并具有健壮根时，将其从培养瓶中取出，用无菌水洗去根部残余培养基，移植到含有灭菌蛭石的塑料苗钵中，压紧根部，将其放置在密封的塑料小拱棚内，逐渐进行通风，使其适应外界环境，并定期浇水或营养液，待再生植株成活后再移栽到温室。

所述步骤S1中，发育到适宜时期是指鱼雷期或子叶期，以子叶期为最好。

所述步骤S1中，成苗培养基的成分为：KNO₃ 900-1100mg/L，NH₄NO₃500-700mg/L，K₂SO₄150-190mg/L，KH₂PO₄ 136-178mg/L，CaCl₂·2H₂O 290-330mg/L，MgSO₄·7H₂O 175-215mg/L，FeSO₄·7H₂O 26.2-29.4mg/L，Na₂-EDTA 35.5-38.3mg/L，KI 0.8-0.9mg/L，H₃BO₃5.4-6.8mg/L，MnSO₄·4H₂O 20.1-23.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7.8-9.0mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.2-0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02-0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg/L，维生素B1 0.4-0.6mg/L，维生素B6 0.4-0.6mg/L，生物素0.01-0.03mg/L，核黄素0.6-0.8mg/L，D-泛酸钙1.3-1.5mg/L，天冬氨酸4.0-5.0mg/L，甘氨酸1.5-2.5mg/L，左旋肉碱0.3-0.5mg/L，延胡索酸26-38mg/L，水解干酪素110-150mg/L，肌醇100-140mg/L，氨基氧乙酸5.0-7.0mg/L，GA₃0.08-0.12mg/L，6-BA 0.08-0.12mg/L，5-氨基乙酰丙酸0.7-1.3mg/L，人参茎叶提取液4.0-6.0g/L，聚乙烯醇0.7-1.3g/L，蔗糖20-30g/L，植物凝胶8-10g/L。

所述步骤S1中，10℃低温下诱导处理最佳时间为10d。

步骤S2中，生根培养基的成分为：1/2MS+6-BA0.1mg/L+IBA0.01mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L+聚乙烯醇2g/L。

所述成苗培养基中人参茎叶提取液通过以下方法制备：取25g人参茎叶切碎，加入少量蒸馏水浸泡24h，然后煮沸30min，用滤网过滤后取滤液定容至500mL，即配成0.05g/mL的人参茎叶提取液。

本发明具有以下有益效果：

本发明对影响人参小孢子胚状体发育及植株再生的因素进行研究，通过对胚状体进10℃低温处理，优化成苗培养基成分如添加左旋肉碱、水解干酪素、氨基氧乙酸、5-氨基乙酰丙酸、人参茎叶提取液、聚乙烯醇等物质，提高培养基琼脂浓度，来达到提高胚状体成苗率的目的。

通过本发明的方法成功获得了人参小孢子胚状体再生植株，经过细胞学鉴定，再生植株中单倍体比例为67.2%，二倍体比例为30.3%。本发明为建立稳定、高效的人参游离小孢子培养技术体系，以及发挥游离小孢子培养技术在人参育种中的作用奠定基础。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明的有益效果作进一步说明，而非限制本发明。

实施例1

试验材料：2个人参品种“大马牙”和“竹节芦”经过游离小孢子诱导培养得到的胚状体，在发明人的前期试验中已经获得。

试验方法：

S1、胚状体的成苗培养：将发育到子叶期的人参游离小孢子胚状体转入成苗培养基，先在10℃低温下诱导处理 10d，再在温度25℃，光照强度1500lx，每天光照15h的条件下培养形成再生幼苗；培养过程中每月继代一次；

成苗培养基的成分为：KNO₃ 1000mg/L，NH₄NO₃600mg/L，K₂SO₄170mg/L，KH₂PO₄ 157mg/L，CaCl₂·2H₂O 310mg/L，MgSO₄·7H₂O 195mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，Na₂-EDTA 36.9mg/L，KI 0.85mg/L，H₃BO₃ 6.1mg/L，MnSO₄·4H₂O 21.8mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.4mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，维生素B1 0.5mg/L，维生素B6 0.5mg/L，生物素0.02mg/L，核黄素0.7mg/L，D-泛酸钙1.4mg/L，天冬氨酸4.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L，左旋肉碱0.4mg/L，延胡索酸34mg/L，水解干酪素130mg/L，肌醇120mg/L，氨基氧乙酸6.0mg/L，GA₃0.1mg/L，6-BA 0.1mg/L，5-氨基乙酰丙酸1.0mg/L，人参茎叶提取液5.0g/L，聚乙烯醇1.0g/L，蔗糖25g/L，植物凝胶9g/L。

人参茎叶提取液通过以下方法制备：取25g人参茎叶切碎，加入少量蒸馏水浸泡24h，然后煮沸30min，用滤网过滤后取滤液定容至500mL，即配成0.05g/mL的人参茎叶提取液。

S2、壮苗生根培养：切取再生幼苗转入生根培养基中，在温度24℃、光照强度2500lx、连续光照条件下培养，使幼苗生长粗壮。

生根培养基的成分为：1/2MS+6-BA0.1mg/L+IBA0.01mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L+聚乙烯醇2g/L。

实施例2 低温诱导处理对胚状体成苗的影响

按照实施例1的方法，将发育到子叶期的人参游离小孢子胚状体转入成苗培养基，在10℃低温下诱导处理 0（CK）、5d、10d、15d，再在温度25℃，光照强度1500lx，每天光照15h的条件下培养形成再生幼苗，统计胚状体成苗率，结果如表1所示。

从表1可以看出，对人参小孢子胚状体进行低温诱导处理5~15d，其成苗率与对照相比均有提高。其中低温处理10d时效果最好，“大马牙”和“竹节芦”胚状体的成苗率分别达到64.7%和54.8%，与对照差异显著，而低温处理5d和15d的效果不及处理10d时好。

实施例3 氨基氧乙酸对胚状体成苗的影响

按照实施例1的方法，将发育到子叶期的人参游离小孢子胚状体转入成苗培养基，培养基中氨基氧乙酸设定 0、2.0、4.0、6.0和8.0mg/L 5个浓度处理，其它成分不变，在10℃低温下诱导处理10d，再在温度25℃，光照强度1500lx，每天光照15h的条件下培养形成再生幼苗，统计胚状体成苗率，结果如表2所示。

从表2可以看出，与对照相比，添加试验浓度的氨基氧乙酸，人参小孢子胚状体的成苗率均有所提高，并且随着氨基氧乙酸浓度的增加，成苗率呈现先升后降的趋势。在氨基氧乙酸浓度为6.0mg/L的成苗培养基中，2种试验材料的成苗率最高，“大马牙”的成苗率为62.9%，“竹节芦”的成苗率为53.2%；其次为氨基氧乙酸浓度为8.0mg/L的处理，“大马牙”的成苗率为59.5%，“竹节芦”的成苗率为48.9%。因此，在人参小孢子胚状体成苗培养时，氨基氧乙酸有利于促进胚状体发育，以加入6.0mg/L氨基氧乙酸为宜。

实施例4 5-氨基乙酰丙酸对胚状体成苗的影响

按照实施例1的方法，将发育到子叶期的人参游离小孢子胚状体转入成苗培养基，培养基中5-氨基乙酰丙酸设定 0、0.5、1.0、2.0和4.0mg/L 5个浓度处理，其它成分不变，在10℃低温下诱导处理10d，再在温度25℃，光照强度1500lx，每天光照15h的条件下培养形成再生幼苗，统计胚状体成苗率，结果如表3所示。

从表3可以看出，随着5-氨基乙酰丙酸浓度的增加，人参小孢子胚状体成苗率呈现先升后降的趋势。在5-氨基乙酰丙酸浓度为1.0mg/L的成苗培养基中，2种试验材料的成苗率最高，“大马牙”的成苗率为64.0%，“竹节芦”的成苗率为55.5%；其次为5-氨基乙酰丙酸浓度为0.5mg/L的处理，“大马牙”的成苗率为57.2%，“竹节芦”的成苗率为48.5%；5-氨基乙酰丙酸浓度为4.0mg/L的处理与对照组接近。因此，在人参小孢子胚状体成苗培养时，加入5-氨基乙酰丙酸的浓度以1.0mg/L为宜。

实施例5 再生植株细胞学鉴定

选取实施例1中驯化移栽成活的再生植株进行染色体倍性鉴定。具体方法：取植株1cm左右的幼嫩根尖，用0.002mol/L的 8-羟基喹啉溶液处理3h后，放入卡诺溶液（无水乙醇∶冰醋酸=3∶1）中处理24h，用蒸馏水清洗3次后放入酶液（4%纤维素酶和1%果胶酶，用柠檬酸缓冲液溶解）中，37℃水浴锅中酶解60min。将根尖放在载玻片上，用卡宝品红溶液染色，敲片，在显微镜下观察照相，分析各再生植株的染色体倍性。

人参染色体数目是48条（2N=4X=48），单倍体植株是24条染色体。从表4的结果可以看出，在检测的119株再生植株中，有单倍体80株，二倍体36株，多倍体3株，单倍体、二倍体及多倍体的比例分别为 67.2%、30.3%及 2.5%。不同品种类型的人参再生植株的倍性组成有所差异，大马牙的单倍体比例为57.8%，而竹节芦的单倍体比例为78.2%。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，其特征在于，所述步骤S1中，发育到适宜时期是指鱼雷期或子叶期，以子叶期为最好。

3.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，其特征在于，所述步骤S1中，成苗培养基的成分为：KNO₃ 900-1100mg/L，NH₄NO₃500-700mg/L，K₂SO₄150-190mg/L，KH₂PO₄ 136-178mg/L，CaCl₂·2H₂O 290-330mg/L，MgSO₄·7H₂O 175-215mg/L，FeSO₄·7H₂O 26.2-29.4mg/L，Na₂-EDTA 35.5-38.3mg/L，KI 0.8-0.9mg/L，H₃BO₃ 5.4-6.8mg/L，MnSO₄·4H₂O 20.1-23.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7.8-9.0mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02-0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg/L，维生素B1 0.4-0.6mg/L，维生素B6 0.4-0.6mg/L，生物素0.01-0.03mg/L，核黄素0.6-0.8mg/L，D-泛酸钙1.3-1.5mg/L，天冬氨酸4.0-5.0mg/L，甘氨酸1.5-2.5mg/L，左旋肉碱0.3-0.5mg/L，延胡索酸26-38mg/L，水解干酪素110-150mg/L，肌醇100-140mg/L，氨基氧乙酸5.0-7.0mg/L，GA₃0.08-0.12mg/L，6-BA 0.08-0.12mg/L，5-氨基乙酰丙酸0.7-1.3mg/L，人参茎叶提取液4.0-6.0g/L，聚乙烯醇0.7-1.3g/L，蔗糖20-30g/L，植物凝胶8-10g/L。

4.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，其特征在于，所述步骤S1中，10℃低温下诱导处理最佳时间为10d。

5.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，其特征在于，步骤S2中，生根培养基的成分为：1/2MS+6-BA0.1mg/L+IBA0.01mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L+聚乙烯醇2g/L。

6.根据权利要求3所述的一种人参游离小孢子胚状体再生植株的方法，其特征在于，所述成苗培养基中人参茎叶提取液通过以下方法制备：取25g人参茎叶切碎，加入少量蒸馏水浸泡24h，然后煮沸30min，用滤网过滤后取滤液定容至500mL，即配成0.05g/mL的人参茎叶提取液。