CN100998318A - 一种高效优质南瓜离体快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种南瓜离体快速繁殖的方法，所述的方法按如下步骤：(1)制备南瓜无菌苗；(2)愈伤组织的诱导：愈伤诱导培养基为：MS+1.0～6.0mg/L 6BA+0.1～0.5mg/L NAA；(3)芽的分化：芽分化培养基为：MS+0.1～2.0mg/L BA+0.05～1.0mg/L NAA；(4)芽的生根：生根培养基为1/2MS+0.05～0.5mg/L NAA。以组织培养的方法可加速繁殖速度，并且在无菌苗的培养、愈伤组织的诱导、芽的分化、生根培养中可以控制它的生长周期，更适合将来的南瓜细胞培养，南瓜育种和利用南瓜细胞培养生产次生代谢物。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种南瓜离体快速繁殖的方法，通过这种方法，可以进行优良种苗规模生产。
(二)背景技术
南瓜，学名Cucurbita spp，葫芦科南瓜属的一年生蔓性草本植物。根据它的产地和性状的不同，分为中国南瓜(俗称窝瓜、番瓜等)、印度南瓜(俗称笋瓜、搅瓜等)和美洲南瓜(俗称西葫芦)。近几年来，发现南瓜在营养、保健、医疗方面具有重大价值。南瓜富含淀粉、脂肪、还原糖、多种氨基酸、维生素及矿物质等。现代研究表明，南瓜还含有防癌、治病等多种功效因子，因此受到越来越广泛的关注，南瓜的栽培和常规育种等取得较大进展，但是常规育种无法满足生产需求，许多南瓜的优良基因资源得不到利用，特别是在抗逆和高含量次生代谢物育种方面，研究比较薄弱。生物技术的快速发展，特别是组织和细胞培养技术，为南瓜的次生代谢物育种研究提供了重要基础。目前南瓜的繁殖常采用种子繁殖，繁殖时间长，繁殖系数低。中国专利CN118233C公开了南瓜组培工厂化种苗快速繁殖方法，但是该方法有品种基因型的局限性，其次受品种基因型的限制，芽的分化率相对较低，而污染率比较高，并且易出现外植体褐化问题，在后期的利用愈伤组织进行细胞培养过程中，细胞生物量不太高，这些对于利用南瓜组织进行细胞培养，生产次生代谢物等均有局限性。
(三)发明内容
本发明目的在于提供一种新的南瓜离体快速繁殖的方法，为了实现本发明目的，采用的技术方案如下：
一种南瓜离体快速繁殖的方法，所述的方法按如下步骤：
(1)制备南瓜无菌苗；
(2)愈伤组织的诱导：将已萌发的种子进行6h黑暗，16～20h光照，光照度为80％，在无菌苗子叶刚转绿时取其子叶、下胚轴或胚根，接种在愈伤诱导培养基上；在25±1℃温度条件下培养20～40天得愈伤组织，所述的愈伤诱导培养基：MS+1.0～6.0mg/L 6BA+0.1～0.5mg/L NAA；
(3)芽的分化：选生长较好的愈伤组织切成体积约为0.5～1.0cm3的切块并转入芽分化培养基中25±1℃进行培养20～40天，每两周更换一次培养基，愈伤组织逐步分化成芽，所述的芽分化培养基为：MS+0.1～2.0mg/LBA+0.05～1.0mg/L NAA；
(4)芽的生根：将分化的芽从基部切下，插入生根培养基中25±1℃培养至芽生根，所述的生根培养基为：1/2MS+0.05～0.5mg/L NAA；
本发明所述的方法，步骤(2)中所述的的愈伤诱导培养基推荐为：MS+2.0mg/L 6BA+0.2mg/L NAA。步骤(3)中所述的芽分化培养基推荐为：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA。步骤(4)中所述的生根培养基推荐为：1/2MS+0.1mg/L NAA。
在无菌苗子叶刚转绿时取其子叶、下胚轴、胚根做外植体诱导愈伤组织。具体的，取子叶为诱导愈伤组织时诱导步骤为：取用子叶接种在愈伤诱导培养基上，先去掉子叶边缘；将剩下的横切为二，取其近叶柄端，再纵切为二，每片子叶得两块约3mm×5mm的外植体；将得到的外植体表面朝上接种在愈伤诱导培养基中培养。取下胚轴为诱导愈伤组织时，诱导步骤为取用下胚轴接种在愈伤诱导培养基上，下胚轴取子叶下约0.3cm部位，切成0.5cm～1.0cm的切段；由下胚轴得到的外植体分水平放置或下端插入愈伤诱导培养基中培养。取为胚根诱导愈伤组织时，诱导步骤为：取用胚根接种在愈伤诱导培养基上，胚根取靠近胚轴的区段，切成0.5cm～1.0cm的切段，由胚根得到的外植体分水平放置和下端插入愈伤诱导培养基中培养。接种之后，放在培养箱中25±1℃培养，观察愈伤组织的发生情况，MS+2.0mg/L 6BA+0.2mg/L NAA是诱导愈伤组织的最佳培养基。
本发明推荐的南瓜无菌苗的制备方法为：选取南瓜种子，在25℃的恒温水中浸种7h～8h。然后用70％的酒精表面消毒，置0.1％的HgCl2溶液中分别消毒，然后用无菌水冲后在无菌条件下将种子放入种子萌发培养基中，温度25±1℃条件下黑暗培养1-2天。萌发培养基按每1LMS中加入琼脂8g、蔗糖20g组方，pH值调到5.8。
进一步，南瓜离体快速繁殖方法的方法，所述的制备南瓜无菌苗步骤为：
(1)无菌苗的获得：选取饱满、大小一致的南瓜种子，在25℃的恒温水中浸种7h～8h。然后在超净台上，用70％的酒精表面消毒30s，置0.1％的HgCl2溶液中分别消毒4～8min、观察不同消毒时间对无菌苗萌发的影响。消毒期间要不停摇动，然后用无菌水冲洗4～5次，种子消毒之后在无菌条件下将其分别放入无菌苗萌发培养基上培养，所述萌发培养基按每1LMS中加入琼脂8g、蔗糖20g组方，pH值调到5.8，培养箱温度25±1℃，黑暗培养1～2天。
(2)愈伤组织的诱导：将已萌发的种子进行6h黑暗，16～20h光照，光照度为80％，在无菌苗子叶刚转绿时取其子叶、下胚轴、胚根做外植体诱导愈伤组织，将子叶、下胚轴、胚根接种在愈伤诱导培养基上，接种之后，放在培养箱在25±1℃温度中培养12～16天。所述的愈伤组织的最佳培养基组成为：在MS加入2.0mg/L 6BA和0.2mg/L NAA，即MS+2.0mg/L 6BA+0.2mg/L NAA。
(3)芽的分化：将培养好的愈伤组织作为进一步分化培养的材料，将其切成体积约为0.5cm3左右的切块，并转入芽分化培养基中，在25±1℃温度下进行培养28～32天，每两周更换一次培养基，愈伤组织分化成芽，所述的芽分化培养基组成为：在MS加入1.0mg/L BA和0.1mg/L NAA，即MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA。
(4)芽的生根：将分化的芽从基部切下，插入生根培养基中，在25±1℃温度下培养。所述生根培养基为：在1/2MS加入0.1mg/L NAA母液，即：1/2MS+0.1mg/ LNAA。
本发明与现有技术相比，以组织培养的方法可加速繁殖速度，在本发明的培养条件下，在无菌苗的培养、愈伤组织的诱导、芽的分化、生根培养中大大缩短的南瓜的生理周期，更重要的是所获得的愈伤组织适合进一步进行南瓜细胞培养，进行南瓜细胞次生代谢产物研究。另外其重要意义还表现在：一，为南瓜进行分子育种奠定组培基础；二，为一些南瓜品种的快速繁殖奠定基础；三是获得南瓜有用次生代谢产物。
(四)具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1
材料：南瓜种子锦栗，红栗王，圣栗。
选取饱满、大小一致的南瓜种子锦栗，红栗王，圣栗分别进行如下操作：1.1外植体材料的消毒方法：在25℃的恒温水中浸种7h～8h。然后在超净台上，用70％的酒精表面消毒30s，置0.1％的HgCl2溶液中分别消毒4-8min，观察不同消毒时间对无菌苗萌发的影响。消毒期间要不停摇动，然后用无菌水冲洗4～5次。种子消毒之后在无菌条件下将种子分别插入种子萌发培养基上培养。基本培养基为MS中加入琼脂0.8％、蔗糖2％，pH值调到5.8。培养箱温度25±1℃，黑暗培养1-2天。
1.2愈伤组织的诱导
将已萌发的种子进行6h黑暗，18h光照培养，在无菌苗子叶刚转绿时可取其子叶、下胚轴、胚根做外植体诱导愈伤组织。南瓜种子锦栗取用子叶做外植体诱导愈伤组织：去掉子叶边缘；将剩下的横切为二，取其近叶柄端，再纵切为二，每片子叶得两块约3mm×5mm的外植体；由子叶得到的外植体表面朝上接种在愈伤诱导培养基上。
南瓜种子红栗王取下胚轴做外植体诱导愈伤组织：取子叶下约0.3cm部位，切成0.5cm～1.0cm的切段；将由下胚轴得到的外植体水平放置在培养基中。
南瓜种子圣栗胚根做外植体诱导愈伤组织：胚根取靠近胚轴的区段，切成0.5cm～1.0cm的切段，将由胚根得到的外植体下端插入培养基中。
接种之后，放在培养箱中培养，观察愈伤组织的发生情况，MS+2.0mg/L6BA+0.2mg/L NAA是诱导愈伤组织的最佳培养基。
1.3芽的分化
选择生长较好的愈伤组织作为进一步分化培养的材料，将其切成体积约为0.5cm3左右的切块，并转入芽分化培养基中25℃进行培养，每两周更换一次培养基，按时观察愈伤分化情况。在芽分化培养基上培养一月左右，愈伤组织逐步分化成芽，一般40天为1个继代增殖周期，每个继代周期由1个芽可增殖形成2-5个芽。所述的培养基为：MS+1.0mg/LBA+0.1mg/L NAA，即芽分化培养基在MS培养基中加入1.0mg/L BA和0.1mg/LNAA是南瓜芽分化的最适培养基。
1.4芽的生根
将高约3-4厘米的分化的芽从基部切下，插入生根培养基中，培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA，25℃培养。
1.5结论
南瓜种子锦栗，红栗王，圣栗在生根培养基中分别培养15天、14天、16天，切口处长出1.5厘米、1.7厘米、2厘米的根系。
实施例2
选取南瓜种子锦栗为材料，操作步骤如实施例1，各培养基也与实施例1中相同，只是在步骤(2)愈伤组织诱导时取不同部位的外植体子叶、下胚轴、胚根对愈伤组织的诱导，结果见表1。
表1不同部位的外植体对愈伤组织的诱导
| 取材部位 | 接种数 | 诱导数 | 诱导率(％) |
| 子叶 | 123 | 119 | 96.75 |
| 胚轴 | 41 | 20 | 48.78 |
| 胚根 | 32 | 5 | 15.63 |
实施例3
取南瓜种子锦栗为材料，操作步骤如实施例1，愈伤组织诱导时取子叶做外植体诱导愈伤组织，步骤(2)中愈伤组织的诱导培养基组成如表2所示，其它培养基组成同实施例1，结果见表2.
表2不同激素浓度对愈伤组织的诱导
| 培养基组成 | 接种数 | 诱导数 | 诱导率(％) |
| MS+6-BA 1.0+NAA 0.1 | 38 | 31 | 81.58 |
| MS+6-BA 1.0+NAA 0.5 | 48 | 43 | 89.58 |
| MS+6-BA 1.0+NAA 1.0 | 58 | 50 | 86.21 |
| MS+6-BA 2.0+NAA 0.2 | 52 | 50 | 96.15 |
| MS+6-BA 2.5.+NAA 0.1 | 35 | 30 | 85.71 |
| MS+6-BA 2.5+NAA 0.2 | 34 | 27 | 79.41 |
| MS+6-BA 3.0+NAA 0.2 | 36 | 25 | 69.44 |
| MS+6-BA 4.0+NAA 0.2 | 36 | 20 | 55.55 |
从表中可见，NAA和6-BA的组合诱导南瓜愈伤组织时，诱导率以MS+6-BA2.0+NAA 0.2最高。
实施例4
取南瓜种子锦栗为材料，操作步骤如实施例1，步骤(2)愈伤组织诱导时取不同部位的外植体做外植体诱导愈伤组织，观察不同部位的外植体产生的愈伤组织对芽的分化，所用各培养基组成与实施例1相同，结表见表3。
表3.不同部位的外植体产生的愈伤组织对芽的分化
| 外植体 | 愈伤数 | 芽分化数 | 分化率(％) |
| 子叶与胚轴衔接的部分 | 20 | 15 | 75 |
| 子叶 | 20 | 12 | 60 |
| 胚轴 | 20 | 8 | 40 |
实施例5
取南瓜种子锦栗为材料，操作步骤如实施例1，步骤(3)中所述的芽分化培养基见表4，其它培养基组成同实施例1，结果见表4。
表4 6-BA对愈伤组织芽分化的影响
| 培养基成分 | 分化率(％) | 每个愈伤组织分化平均芽数 |
| MS+6-BA 0.1+0.1mg/LNAA | 60.1 | 5.2 |
| MS+6-BA 0.5+0.1mg/LNAA | 66.4 | 6.2 |
| MS+6-BA 1.0+0.1mg/LNAA | 82.7 | 13.3 |
| MS+6-BA 2.0+0.1mg/LNAA | 54.1 | 8.0 |
实施例6
取南瓜种子锦栗为材料，操作步骤如实施例1，步骤(4)中所述的生根培养基见表5，其它培养基组成同实施例1，生根培养20天时测定结果见表5。
表5 NAA对芽生根的影响培养20天
| 培养基成分 | 生根数(％) | 平均根长度(cm) |
| 1/2MS+6-NAA 0.05 | 78.6 | 3.0 |
| 1/2MS+6-NAA 0.1 | 96.4 | 4.8 |
| 1/2MS+6-NAA 0.2 | 82.7 | 3.5 |
| 1/2MS+6-NAA 0.5 | 74.1 | 1.5 |
实施例7
分别选取材料：南瓜种子圣玉、无蔓四号、黄狼、锦栗二号、红栗王、圣栗。
选取饱满、大小一致上述各品种20粒分别进行如下操作：
1.1外植体材料的消毒方法：在25℃的恒温水中浸种7h～8h。然后在超净台上，用70％的酒精表面消毒30s，置0.1％的HgCl2溶液中分别消毒4-8min、观察不同消毒时间对无菌苗萌发的影响。消毒期间要不停摇动，然后用无菌水冲洗4～5次。种子消毒之后在无菌条件下将种子分别插入种子萌发培养基上培养。基本培养基为MS中加入琼脂0.8％、蔗糖2％，pH值调到5.8。培养箱温度25±1℃，24h黑暗培养1-2天。
1.2愈伤组织的诱导
将已萌发的种子进行6h黑暗，18h光照培养，在无菌苗子叶刚转绿时分别取其子叶、下胚轴、胚根做外植体诱导愈伤组织。
南瓜种子取子叶做外植体诱导愈伤组织：去掉子叶边缘；将剩下的横切为二，取其近叶柄端，再纵切为二，每片子叶得两块约3mm×5mm的外植体；由子叶得到的外植体表面朝上接种在愈伤诱导培养基上。
南瓜种子取下胚轴做外植体诱导愈伤组织：取子叶下约0.3cm部位，切成0.5cm～1.0cm的切段；将由下胚轴得到的外植体水平放置在培养基中。
南瓜种子取胚根做外植体诱导愈伤组织：胚根取靠近胚轴的区段，切成0.5cm～1.0cm的切段，将由胚根得到的外植体下端插入培养基中。
取子叶、下胚轴、胚根做外植体诱导愈伤组织所用的培养基MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA，接种之后，放在培养箱中培养，观察愈伤组织的发生情况见表6。
1.3芽的分化
选择生长较好的愈伤组织作为进一步分化培养的材料，将其切成体积约为0.5cm3左右的切块并转入芽分化培养基中25℃进行培养，每两周更换一次培养基，按时观察愈伤分化情况。在芽分化培养基上培养一月左右，愈伤组织逐步分化成芽，所述的培养基为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，愈伤组织诱导芽的分化率见表6。
1.4芽的生根
将高约3-4厘米的分化的芽从基部切下，插入生根培养基中，培养基为1/2MS+0.1mg/LNAA，25℃培养。
1.5结论
南瓜种子圣玉、无蔓四号、黄狼、锦栗二号、红栗王、圣栗在生根培养基中分别培养20天，观察到的不定芽的生根情况见表6。
表6
| 南瓜品种 | 浸泡种子数(个) | 0.1％HgC12消毒8min的发芽率(％) | 种子萌发5天后平均苗长(cm) | 子叶诱导愈伤组织的诱导率(％) | 胚根诱导愈伤组织的诱导率(％) | 胚轴诱导愈伤组织的诱导率(％) | 愈伤组织诱导芽的分化率(％) | 不定芽的生根(20天) |
| 圣玉 | 20 | 95.00 | 3.58 | 80.08 | 62.12 | 32.42 | 53.78 | 1.8 |
| 无蔓四号 | 20 | 90.00 | 4.13 | 91.23 | 75.23 | 34.21 | 65.64 | 2.3 |
| 黄狼 | 20 | 90.00 | 4.32 | 92.18 | 76.12 | 48.44 | 75.23 | 3.5 |
| 锦栗二号 | 20 | 100.00 | 4.29 | 98.08 | 88.56 | 60.12 | 86.53 | 4.8 |
| 红栗王 | 20 | 90.00 | 4.31 | 90.54 | 78.42 | 46.54 | 73.24 | 3.6 |
| 圣栗 | 20 | 100.00 | 5.02 | 60.02 | 40.51 | 20.12 | 33.62 | 3.2 |
Claims (9)
1.一种高效优质南瓜离体快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法按如下步骤：
(1)制备南瓜无菌苗；
(2)愈伤组织的诱导：将已萌发的种子进行6h黑暗，16～20h光照，光照度为80％，在无菌苗子叶刚转绿时取其子叶、下胚轴或胚根，接种在愈伤诱导培养基上；在25±1℃培养20～40天得愈伤组织，所述的愈伤诱导培养基为：MS+1.0～6.0mg/L 6BA+0.1～0.5mg/L NAA；
(3)芽的分化：选生长较好的愈伤组织切成体积约为0.5～1.0cm3的切块并转入芽分化培养基中在25±1℃进行培养20～40天，每两周更换一次培养基，愈伤组织逐步分化成芽，所述的芽分化培养基为：MS+0.1～2.0mg/L BA+0.05～1.0mg/L NAA；
(4)芽的生根：将分化的芽从基部切下，插入生根培养基中在25±1℃培养至芽生根，所述的生根培养基为：1/2MS+0.05～0.5mg/L NAA。
2.如权利要求1所述的高效优质南瓜离体快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法步骤(2)中所述的的愈伤诱导培养基为：MS+2.0mg/L6BA+0.2mg/L NAA。
3.如权利要求1所述的南瓜离体快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法步骤(3)中所述的芽分化培养基为：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/LNAA。
4.如权利要求1所述的高效优质南瓜离体快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法步骤(4)中所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA。
5.如权利要求1所述的高效优质南瓜离体快速繁殖的方法，其特征在于所述的愈伤组织的诱导：取用子叶接种在愈伤诱导培养基上，先去掉子叶边缘；将剩下的横切为二，取其近叶柄端，再纵切为二，每片子叶得两块约3mm×5mm的外植体；将得到的外植体表面朝上接种在愈伤诱导培养基中培养。
6.如权利要求1所述的高效优质南瓜离体快速繁殖的方法，其特征在于所述的愈伤组织的诱导：取用下胚轴接种在愈伤诱导培养基上，下胚轴取子叶下约0.3cm部位，切成0.5cm～1.0cm的切段；由下胚轴得到的外植体分水平放置或下端插入愈伤诱导培养基中培养。
7.如权利要求1所述的高效优质南瓜离体快速繁殖的方法，其特征在于所述的愈伤组织的诱导：取用胚根接种在愈伤诱导培养基上，胚根取靠近胚轴的区段，切成0.5cm～1.0cm的切段，由胚根得到的外植体分水平放置和下端插入愈伤诱导培养基中培养。
8.如权利要求1～7之一所述的高效优质南瓜离体快速繁殖的方法，其特征在于所述的制备南瓜无菌苗制备方法为：选取南瓜种子，在25℃的恒温水中浸种7h～8h。然后用70％的酒精表面消毒，置0.1％的HgCl2溶液中分别消毒，然后用无菌水冲洗后在无菌条件下将种子放入无菌苗萌发培养基，温度25±1℃条件下黑暗培养1-2天，萌发培养基按每1LMS中加入琼脂8g、蔗糖20g组方，pH值调到5.8。
9.如权利要求1所述的的高效优质南瓜离体快速繁殖的方法，其特征在于所述的制备南瓜无菌苗的步骤为：
(1)无菌苗的获得：选取饱满、大小一致的南瓜种子，在25℃的恒温水中浸种7h～8h。然后在超净台上，用70％的酒精表面消毒30s，置0.1％的HgCl2溶液中分别消毒4-8min、观察不同消毒时间对无菌苗萌发的影响。消毒期间要不停摇动，然后用无菌水冲洗4～5次，种子消毒之后在无菌条件下将种子放入种子萌发培养基上培养，所述萌发培养基按每1LMS中加入琼脂8g、蔗糖20g组方，pH值调到5.8，培养箱温度25±1℃，黑暗培养1-2天；
(2)愈伤组织的诱导：将已萌发的种子进行6h黑暗，16～20h光照，光照度为80％，在无菌苗子叶刚转绿时取其子叶、下胚轴、胚根做外植体诱导愈伤组织，将子叶、下胚轴、胚根接种在愈伤诱导培养基上，接种之后，放在培养箱中25±1℃培养12～16天。所述的愈伤组织的最佳培养基为：MS+2.0mg/L 6BA+0.2mg/L NAA；
(3)芽的分化：将培养好的愈伤组织作为进一步分化培养的材料，将其切成体积约为0.5cm3左右的切块并转入芽分化培养基中，25±1℃进行培养28～32天，每两周更换一次培养基，愈伤组织分化成芽，所述的芽分化培养基为：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；
(4)芽的生根：将分化的芽从基部切下，插入生根培养基中，在25±1℃培养，所述生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA。
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