CN102668978B - 罗汉果多倍体的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗汉果多倍体的诱导方法，采用Oryzalin浸泡处理授粉后的罗汉果雌花，然后用清水清洗解除，通过新型化学诱导剂Oryzalin诱导合子染色体加倍，从而获得多倍体。本发明解决了罗汉果多倍体的嵌合体问题，简化了诱导的操作程序，提高了罗汉果多倍体诱导效率，便于实际应用。
Description
技术领域
本发明属于植物遗传育种领域，涉及诱导植物多倍体的方法，尤其是一种罗汉果多倍体的诱导方法。
背景技术
多倍体（polyploid）是指体细胞具有2个以上染色体组的植物。自1937年发现秋水仙素 (colchicine)可诱导染色体加倍后，人们开始植物多倍体诱导的研究。目前，采用秋水仙素离体诱导同源四倍体是获得多倍体植株的主要途径。罗汉果（葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)植物罗汉果（Siraitia grosvenorii））选育中，蒋水元等也主要采用一定浓度的秋水仙素处理离体组培苗获得多倍体（无籽罗汉果选育的初步研究[J].广西植物，2009，29(4):506-509）。然而，采用秋水仙素处理毒性大；在离体条件进行处理，需要具备较高的组织培养条件；组培苗处理后普遍存在嵌合体，需要多代鉴定和倍性纯化，操作程序复杂，工作量大。
微管抑制剂Oryzalin（氨磺灵）是诱导四倍体的新型化学诱导剂，诱导机理与秋水仙素相似，具有植物多倍体诱导效率高、毒性小的特点，是替代秋水仙素的新产品，现已用于百合、西瓜等植物多倍体诱导中。然而，不同植物特性不同，采用Oryzalin处理的方式和效果也存在很大差异。
未见Oryzalin在诱导罗汉果多倍体方面的研究和报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作程序简便、诱导效率高、不产生嵌合体的罗汉果多倍体的诱导方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：罗汉果多倍体的诱导方法，采用Oryzalin浸泡处理授粉后的罗汉果雌花，然后用清水清洗解除。
授粉是罗汉果雌花开放的第1天，采用新鲜开放雄花花粉进行。
授粉后是罗汉果雌花授粉后24h～48h。
Oryzalin浸泡处理使用30μM的Oryzalin水溶液。
Oryzalin浸泡处理持续24h。
该方法还包括收获处理果实、播种育苗及染色体鉴定步骤。
收获处理果实是待雌花膨大形成果实且果实颜色由绿色转变为黄绿色时采摘果实。
播种育苗及染色体鉴定是剥取果实中的种子，人工去除种壳，播种出苗后鉴定植株染色体倍性。
罗汉果生殖生物研究表明，受精后48小时内, 花粉管伸长通过花柱进入胚囊（薛妙男，杨小华.罗汉果双受精过程的细胞学观察[J].广西植物，1995，15(4):358-362）。由此，发明人通过采用微管抑制剂Oryzalin田间浸泡处理授粉后一定时间的罗汉果雌花，再用清水清洗解除及收获处理果实、播种育苗、染色体鉴定等步骤，诱导合子染色体加倍，从而获得多倍体。本发明解决了罗汉果多倍体的嵌合体问题，简化了诱导的操作程序，提高了罗汉果多倍体诱导效率，便于实际应用。
具体实施方式
以下实施例中30μM Oryzalin水溶液按照如下方法事先配制：首先采用少量DMSO(二甲基亚砜)溶解所需质量的Oryzalin药剂，然后将DMSO溶液滴加入蒸馏水中，滴加过程中不断摇匀蒸馏水，保证无药剂析出，液体为黄色，DMSO用量为最终配制水溶液的1%。
实施例1
<1>田间选择罗汉果品种类型“青皮果”无病虫害发生、生长健壮的雌株为诱导植株。
<2>进入开花期，雌花开放的第1天，采用开放雄花花粉进行授粉。
<3>罗汉果雌花授粉后24h，将雌花放入装有30μM Oryzalin水溶液的离心管中进行浸泡处理24h。
<4>处理结束后，取出雌花，用清水清洗，去除Oryzalin。
<5>收获处理果实：待雌花膨大形成果实且果实颜色由绿色转变为黄绿色时，采摘果实。与对照相比，处理后，雌花正常膨大，形成果实的比率明显下降，授粉后24h处理，果实成熟率下降41.11%。
<6>播种育苗及染色体鉴定：剥取果实中的种子，人工去除种壳，播种出苗后鉴定植株染色体倍性。
授粉后24h处理获得的122个后代植株中，四倍体比率为10.66%,无嵌合体发生。
实施例2
<1>田间选择罗汉果品种类型“青皮果”无病虫害发生、生长健壮的雌株为诱导植株。
<2>进入开花期，雌花开放的第1天，采用开放雄花花粉进行授粉。
<3>罗汉果雌花授粉后48h，将雌花放入装有30μM Oryzalin水溶液的离心管中进行浸泡处理24h。
<4>处理结束后，取出雌花，用清水清洗，去除Oryzalin。
<5>收获处理果实：待雌花膨大形成果实且果实颜色由绿色转变为黄绿色时，采摘果实。与对照相比，处理后，雌花正常膨大，形成果实的比率明显下降，授粉后48h处理，果实成熟率下降9.17%。
<6>播种育苗及染色体鉴定：剥取果实中的种子，人工去除种壳，播种出苗后鉴定植株染色体倍性。
授粉后48h处理获得的490个后代植株中，四倍体比率为2.45%,无嵌合体发生。
Claims (4)
1.一种罗汉果多倍体的诱导方法，其特征在于：罗汉果雌花开放的第1天，采用新鲜开放雄花花粉进行授粉，授粉后24h～48h，采用30μM的Oryzalin水溶液浸泡处理授粉后的罗汉果雌花持续24h，然后用清水清洗解除。
2.根据权利要求1所述的罗汉果多倍体的诱导方法，其特征在于：该方法还包括收获处理果实、播种育苗及染色体鉴定步骤。
3.根据权利要求2所述的罗汉果多倍体的诱导方法，其特征在于：所述收获处理果实是待雌花膨大形成果实且果实颜色由绿色转变为黄绿色时采摘果实。
4.根据权利要求2所述的罗汉果多倍体的诱导方法，其特征在于：所述播种育苗及染色体鉴定是剥取果实中的种子，人工去除种壳，播种出苗后鉴定植株染色体倍性。
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