CN105145349B - 多倍体千斤拔及其培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多倍体千斤拔及其培育方法。具体包括四倍体千斤拔的培育方法、三倍体千斤拔的培育方法，以及由上述方法培育得到的四倍体千斤拔和三倍体千斤拔。本发明所述方法以特定浓度的秋水仙素为诱导剂，通过人工诱导获得千斤拔同源四倍体品种；再将四倍体与常规二倍体进行杂交授粉，继而获得三倍体千斤拔。所得多倍体千斤拔的根、茎、叶、花及其有效成分明显大于或高于二倍体亲本，不仅有效提高了千斤拔药物的产量，且由于有效成分含量的提高还可获得更高的出膏率(即提高千斤拔提取物中有效成分的含量)。

Description

多倍体千斤拔及其培育方法

技术领域

本发明涉及生物技术育种领域，具体涉及多倍体千斤拔及其培育方法。

背景技术

千斤拔Moghania philippinens(Merr.et Rolfe)Li.为豆科千斤拔属植物，别名蔓千斤拔、吊马桩、吊马墩、一条根、老鼠尾、钻地风(四川)等，以根入药，主要分布于云南、四川、贵州、湖北、湖南、广西、广东、海南、江西、福建和台湾。已有的研究表明，千斤拔皂苷对修复神经损伤、治疗老年性痴呆、抗炎镇痛、增强免疫、抗疲劳、抗缺氧有明显作用，中国医科院、中国药科大学等都设置了专门的新药研究课题，澳大利亚等国已进入药理实验阶段。千斤拔还是国内制药企业用于生产治疗妇科炎症、风湿骨痛、跌打损伤、壮腰健肾类药品不可或缺的原料。现有常规二倍体千斤拔药材的单株产量较低，根部纤维含量较高，不利于其中有效成分的提取。

通过倍数性育种手段使千斤拔基因组多倍化，可以获得株型大、药材产量高、出膏率高的品种。目前尚未发现有多倍体千斤拔及其培育方法的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种多倍体千斤拔及其培育方法。该方法以特定浓度的秋水仙素为诱导剂，通过人工诱导获得千斤拔同源四倍体品种，继而再获得三倍体千斤拔。

本发明所述多倍体千斤拔及其培育方法包括四倍体千斤拔以及它的培育方法、三倍体千斤拔以及它的培育方法。

具体地，本发明包括四倍体千斤拔的培育方法，包括以下步骤：

1)获取二倍体千斤拔的种子苗；

2)选取生长势强的种子苗经暗培养后，以秋水仙素为诱导剂，采用液体或固体法诱导种子苗产生染色体基因组倍数性变化，之后转入分化培养基中进行光照培养，获得丛生芽；其中：

所述采用固体法诱导种子苗产生染色体基因组倍数性变化是指：将经暗培养的种子苗转接到含有0.015～0.035％质量秋水仙素的MS固体培养基中，于5～10℃条件下培养2～5d；

所述采用液体法诱导种子苗产生染色体基因组倍数性变化是指：在无菌条件下，将经暗培养的种子苗浸泡于经过灭菌的质量浓度为0.05～0.1％秋水仙素溶液中8～10h；

3)切取丛生芽转入生根培养基中培养成根茎叶完整的植株；

4)对所得植株进行染色体数目检测，筛选出四倍体植株(染色体数目2n＝4x＝44的植株)；

5)所得四倍体植株按常规技术种植，得到四倍体千斤拔。

上述方法的步骤1)中，可以按现有常规技术将二倍体千斤拔的种子培养成种子苗，这里不再详述。

上述方法的步骤2)中，所述的分化培养基配方为：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L+蔗糖2～5％+琼脂0.4～0.5％，更优选的分化培养基配方为：MS+6-BA0.53mg/L+NAA 0.12mg/L+蔗糖3％+琼脂0.5％。在分化培养基中进行光照培养的培养条件与现有技术相同，优选为：温度为20～28℃，光照时间为10～12h/d，光照强度为1000～2000lx。该步骤中，所述暗培养的操作及培养条件与现有技术相同。

上述方法的步骤2)中，在用液体法诱导种子苗产生染色体基因组倍数性变化时的操作温度与现有技术相同，通常是在18～25℃条件下进行。

上述方法的步骤3)中，所述的生根培养基配方为：1/2MS+6-BA 0.01～0.1mg/L+NAA 0.4～1.0mg/L+蔗糖2～5％+琼脂0.4～0.5％+活性炭0.2～0.5％，优选的生根培养基配方为：1/2MS+6-BA 0.05mg/L+NAA 0.45mg/L+蔗糖2％+琼脂0.5％+活性炭0.5％。在生根培养基中的培养条件与现有技术相同，优选为：所述光照培养的条件为：温度为20～28℃，光照时间为10～12h/d，光照强度为1000～2000lx。

上述方法的步骤4)中，为了减少染色体数目检测的工作量，可以将步骤3)获得的根茎叶完整的植株与常规二倍体植株对照，以叶片大小、颜色，茎干作为指标，筛选出有明显变化的植株作为染色体倍数性加倍的候选植株，再检测这些候选植株的染色体数目，以筛选得到四倍体植株。对植株进行染色体数目检测的方法与现有技术相同，具体可以是：剪取目标株幼嫩根尖或茎尖0.5cm，用卡诺固定液(无水乙醇：冰乙酸＝3：1)固定15min以上，流水下冲洗15min,解离液(浓盐酸：甲醇＝1：1)解离2～30min，清水冲洗15min，切取根尖、茎尖0.1mm，用卡宝品红染色液染色，压片观察统计根尖或茎尖染色体。

本发明还包括由上述方法培育得到的四倍体千斤拔。

本发明进一步包括三倍体千斤拔的培育方法，包括以下步骤：

a)按权利要求1所述方法培育得到四倍体千斤拔；

b)将四倍体千斤拔和二倍体千斤拔进行人工授粉杂交，得到杂交千斤拔种子；

c)将杂交千斤拔种子繁殖成完整植株，筛选出三倍体植株；

d)所得三倍体植株按常规技术种植，得到三倍体千斤拔。

上述方法的步骤a)中的操作与前述四倍体千斤拔的培育方法相同。

上述方法的步骤b)中，是将培养得到的四倍体植株和二倍体植株按常规技术进行大田种植，开花时人工授粉杂交(♀4N×♂2N,♂4N×♀2N)，得到杂交千斤拔种子。

上述方法的步骤c)中，筛选三倍体植株的方法与现有技术相同，在此不再详述。

本发明还包括由上述方法培育得到的三倍体千斤拔。

与现有技术相比，本发明提供了四倍体千斤拔的培育方法、三倍体千斤拔的培育方法，以及由上述方法培育得到的四倍体千斤拔和三倍体千斤拔。本发明所述方法以特定浓度的秋水仙素为诱导剂，通过人工诱导获得千斤拔同源四倍体品种；再将四倍体与常规二倍体进行杂交授粉，继而获得三倍体千斤拔。所得多倍体千斤拔的根、茎、叶、花及其有效成分明显大于或高于二倍体亲本，不仅有效提高了千斤拔药物的产量，且由于有效成分含量的提高还可获得更高的出膏率(即提高千斤拔提取物中有效成分的含量)。

附图说明

图1为常规二倍体千斤拔染色体图片；

图2为四倍体千斤拔染色体图片；

图3为所得四倍体千斤拔植株与常规二倍体千斤拔植株的对比图片，其中右侧图为四倍体千斤拔植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：四倍体千斤拔的培育

1)选取优良二倍体植株所结实的成熟、饱满、颗粒大的种子，用清水冲洗2～4次，在无菌条件下用0.1％升汞处理5min，无菌水洗6次；之后分别接到萌芽培养基(MS固体培养基)中进行催芽培养得到种子苗；

2)选取生长势强的种子苗暗培养5d后，在无菌条件下将其完全浸泡在灭菌好的质量浓度为0.05％的秋水仙素溶液中,于10℃下培养8h，取出后用无菌水洗净，转到分化培养基(MS+6-BA 0.53mg/L+NAA 0.12mg/L+蔗糖3％+琼脂0.5％)中进行光照培养，每天光照10h，光照强度为1000～1500lx，培养温度为25℃，直到长出新芽(即丛生芽)；

3)切取经分化培养长出的新芽转入生根培养基(1/2MS+6-BA 0.05mg/L+NAA0.45mg/L+蔗糖2％+琼脂0.5％+活性炭0.5％)中进行光照培养，每天光照10h，光照强度为2000lx，培养温度为25℃，直到培养得到根、茎、叶完整的植株；

4)将步骤3)获得的植株与二倍体植株进行对照，将叶片大小、颜色有明显变化的植株作为基因组可能加倍的候选植株，并对候选植株的染色体数目进行检测，以筛选出四倍体植株；染色体数目的检测方法如下(下同)：剪取植株的根尖0.5cm，用卡诺固定液固定15min以上，流水下冲洗15min,解离液解离10～20min，清水冲洗15min，切取根尖0.1mm，卡宝品红染色液染色，压片观察统计根尖染色体数目，进而筛选出四倍体植株(图2为四倍体千斤拔染色体图片，图1为常规二倍体千斤拔染色体图片，图3为所得四倍体千斤拔植株与常规二倍体千斤拔植株的对比图片，其中右侧图为四倍体千斤拔植株，由图3可见，四倍体千斤拔植株的根、茎、叶均大于常规二倍体千斤拔植株)；

5)将步骤4)筛选出的四倍体植株按常规技术种植，得到四倍体千斤拔。

实施例2：三倍体千斤拔的培育

a)按实施例1所述方法培育得到四倍体千斤拔植株；

b)将四倍体千斤拔植株和二倍体千斤拔植株进行大田种植，开花时人工授粉杂交(♀4N×♂2N或♂4N×♀2N)，得到杂交千斤拔种子；

c)将杂交千斤拔种子按现有常规技术繁殖成完整植株，再按现有常规方法对所得植株的染色体数目进行检测，筛选出三倍体植株；

d)所得三倍体植株按常规技术种植，得到三倍体千斤拔。

实施例3：三倍体千斤拔的培育

1)选取优良二倍体植株所结实的成熟、饱满、颗粒大的种子，用清水冲洗2～4次，在无菌条件下用0.1％升汞处理5min，无菌水洗6次；之后分别接到萌芽培养基(MS固体培养基)中进行催芽培养得到种子苗；

2)选取生长势强的种子苗暗培养3d后，在无菌条件下将其转接到含有0.025％质量秋水仙素的MS固体培养基中，于10℃条件下培养5d，取出后转到分化培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖4％+琼脂0.4％)中进行光照培养，每天光照8h，光照强度为2000lx，培养温度为20℃，直到长出新芽(即丛生芽)；

3)切取经分化培养长出的新芽转入生根培养基(1/2MS+6-BA 0.01mg/L+NAA0.8mg/L+蔗糖3％+琼脂0.45％+活性炭0.2％)中进行光照培养，每天光照8h，光照强度为2000lx，培养温度为20℃，直到培养得到根、茎、叶完整的植株；

4)将步骤3)获得的植株与二倍体植株进行对照，将叶片大小、颜色有明显变化的植株作为基因组可能加倍的候选植株，并对候选植株的染色体数目进行检测，以筛选出四倍体植株；

5)将步骤4)筛选出的四倍体植株和二倍体千斤拔植株进行大田种植，开花时人工授粉杂交(♀4N×♂2N或♂4N×♀2N)，得到杂交千斤拔种子；

6)将杂交千斤拔种子按现有常规技术繁殖成完整植株，再按现有常规方法对所得植株的染色体数目进行检测，筛选出三倍体植株；

7)所得三倍体植株按常规技术种植，得到三倍体千斤拔。

实施例4：三倍体千斤拔的培育

1)选取优良二倍体植株所结实的成熟、饱满、颗粒大的种子，用清水冲洗2～4次，在无菌条件下用0.1％升汞处理5min，无菌水洗6次；之后分别接到萌芽培养基(MS固体培养基)中进行催芽培养得到种子苗；

2)选取生长势强的种子苗暗培养5d后，在无菌条件下将其转接到含有0.015％质量秋水仙素的MS固体培养基中，于5℃条件下培养3d，取出后转到分化培养基(MS+6-BA0.8mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖2％+琼脂0.45％)中进行光照培养，每天光照12h，光照强度为1000lx，培养温度为30℃，直到长出新芽(即丛生芽)；

3)切取经分化培养长出的新芽转入生根培养基(1/2MS+6-BA 0.1mg/L+NAA0.4mg/L+蔗糖5％+琼脂0.4％+活性炭0.3％)中进行光照培养，每天光照12h，光照强度为1000lx，培养温度为30℃，直到培养得到根、茎、叶完整的植株；

4)将步骤3)获得的植株与二倍体植株进行对照，将叶片大小、颜色有明显变化的植株作为基因组可能加倍的候选植株，并对候选植株的染色体数目进行检测，以筛选出四倍体植株；

5)将步骤4)筛选出的四倍体植株和二倍体千斤拔植株进行大田种植，开花时人工授粉杂交(♀4N×♂2N或♂4N×♀2N)，得到杂交千斤拔种子；

6)将杂交千斤拔种子按现有常规技术繁殖成完整植株，再按现有常规方法对所得植株的染色体数目进行检测，筛选出三倍体植株；

7)所得三倍体植株按常规技术种植，得到三倍体千斤拔。

实施例5：三倍体千斤拔的培育

1)选取优良二倍体植株所结实的成熟、饱满、颗粒大的种子，用清水冲洗2～4次，在无菌条件下用0.1％升汞处理5min，无菌水洗6次；之后分别接到萌芽培养基(MS固体培养基)中进行催芽培养得到种子苗；

2)选取生长势强的种子苗暗培养4d后，在无菌条件下将其完全浸泡在灭菌好的质量浓度为0.1％的秋水仙素溶液中,于8℃下培养10h，取出后用无菌水洗净，转到分化培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖5％+琼脂0.42％)中进行光照培养，每天光照10h，光照强度为1500～2000lx，培养温度为25℃，直到长出新芽(即丛生芽)；

3)切取经分化培养长出的新芽转入生根培养基(1/2MS+6-BA 0.06mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖4％+琼脂0.5％+活性炭0.4％)中进行光照培养，每天光照10h，光照强度为2000lx，培养温度为25℃，直到培养得到根、茎、叶完整的植株；

4)将步骤3)获得的植株的染色体数目进行检测，以筛选出四倍体植株；

5)将步骤4)筛选出的四倍体植株和二倍体千斤拔植株进行大田种植，开花时人工授粉杂交(♀4N×♂2N或♂4N×♀2N)，得到杂交千斤拔种子；

6)将杂交千斤拔种子按现有常规技术繁殖成完整植株，再按现有常规方法对所得植株的染色体数目进行检测，筛选出三倍体植株；

7)所得三倍体植株按常规技术种植，得到三倍体千斤拔。

实施例6：三倍体千斤拔的培育

重复实施例5，不同的是，将选取生长势强的种子苗暗培养3d后，在无菌条件下将其完全浸泡在灭菌好的质量浓度为0.08％的秋水仙素溶液中,于58℃下培养9h。

实施例7：三倍体千斤拔的培育

重复实施例4，不同的是，将经过暗培养的种子苗在无菌条件下将其转接到含有0.0035％质量秋水仙素的MS固体培养基中，于8℃条件下培养4d。

Claims (6)

1.四倍体千斤拔的培育方法，包括以下步骤：

1)获取二倍体千斤拔的种子苗；

2)选取生长势强的种子苗经暗培养后，以秋水仙素为诱导剂，采用液体或固体法诱导种子苗产生染色体基因组倍数性变化，之后转入分化培养基中进行光照培养，获得丛生芽；其中：

所述采用固体法诱导种子苗产生染色体基因组倍数性变化是指：将经暗培养的种子苗转接到含有0.015～0.035％质量秋水仙素的MS固体培养基中，于5～10℃条件下培养2～5d；

所述采用液体法诱导种子苗产生染色体基因组倍数性变化是指：在无菌条件下，将经暗培养的种子苗浸泡于经过灭菌的质量浓度为0.05～0.1％秋水仙素溶液中8～10h；

所述的分化培养基配方为：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+蔗糖2～5％+琼脂0.4～0.5％；

3)切取丛生芽转入生根培养基中培养成根茎叶完整的植株；所述的生根培养基配方为：1/2MS+6-BA 0.01～0.1mg/L+NAA 0.4～1.0mg/L+蔗糖2～5％+琼脂0.4～0.5％+活性炭0.2～0.5％；

4)对所得植株进行染色体数目检测，筛选出四倍体植株；

5)所得四倍体植株按常规技术种植，得到四倍体千斤拔。

2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤2)中，所述的分化培养基配方为：MS+6-BA 0.53mg/L+NAA 0.12mg/L+蔗糖3％+琼脂0.5％。

3.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤2)中，在分化培养基中进行光照培养的培养条件为：温度为20～28℃，光照时间为10～12h/d，光照强度为1000～2000lx。

4.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤3)中，所述的生根培养基配方为：1/2MS+6-BA 0.05mg/L+NAA 0.45mg/L+蔗糖2％+琼脂0.5％+活性炭0.5％。

5.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤3)中，在生根培养基中的培养条件为：所述光照培养的条件为：温度为20～28℃，光照时间为10～12h/d，光照强度为1000～2000lx。

6.三倍体千斤拔的培育方法，包括以下步骤：

a)按权利要求1所述方法培育得到四倍体千斤拔；

b)将四倍体千斤拔和二倍体千斤拔进行人工授粉杂交，得到杂交千斤拔种子；

c)将杂交千斤拔种子繁殖成完整植株，筛选出三倍体植株；

d)所得三倍体植株按常规技术种植，得到三倍体千斤拔。