CN107027623A - 一种多倍体牛大力品种的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多倍体牛大力品种的培育方法，所述方法包括以下步骤：1)培育二倍体牛大力种子，得到牛大力种子苗；2)选取生长势强的牛大力苗浸泡在二甲基亚砜混和秋水仙素合溶液中进行多倍体诱导；3)对诱导后的牛大力苗进行增殖培养；4)将增殖得到的丛生芽剪成单芽并转接，进行生根培养，培养得到根茎叶完整的组培苗；5)筛选所述组培苗，得到多倍体植株。
Description
技术领域
本发明涉及植物领域，具体而言，涉及一种多倍体牛大力品种的培育方法。
背景技术
牛大力为豆科植物美丽崖豆藤(Millettia speciosa Champ.)的块根。又名山莲藕、大力薯。主产于广西，分布于广东、海南以及越南北部，素有南方高丽参之称，为《广西中药材标准》所收载。归肺、肾经，具有平肝、润肺，养肾补虚，强筋活络之功效，中医临床用于清肺止咳、滋阴壮阳，风湿骨痛、急慢性肝炎等，饮片年需求量折合鲜品达1200多吨。全国有二十多个制药企业用于生产治疗风湿骨痛、腰肌劳损、妇科炎症、心脑血管疾病等中成药在全国广泛应用，原料年需求量折合鲜品达8000多吨。牛大力味甘、性平，补而不燥。长期以来，桂、粤、港、澳、台地区民间普遍用牛大力煲汤。现代研究发现：牛大力多糖具有增强免疫的作用，且对正常细胞没有毒副作用；生物碱和香豆素具有镇痛、镇静、解痉、镇咳的作用。在开发抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒等健康食品、天然药物方面有特殊优势。吸引了多家企业开发饮料、口服液、保健茶、超微粉等产品。
多倍体植株一般具有根、茎、叶、花、果的巨型性，抗逆性强，药用成分含量高，安全可靠等特性，这正是药材优质、高产育种所希望达到的目标。利用试管苗进行多倍体诱导，容易控制实验条件、实验结果重复性好、工作效率高、减少嵌合体、诱变效果好，变异类型多，选择余地大，可以在短期内迅速组培繁育大量纯度高、质量好，没有病虫害的试管苗，这对提高药材产量和质量十分有利。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种多倍体牛大力品种的培育方法，所述培育方法采用刚萌发的种子苗作为诱导材料，刚萌发的种子苗分生能力强。秋水仙素可抑制纺锤丝的合成，从而使染色体加倍，二甲基亚砜是渗透型细胞保护剂，起到保护细胞的作用。本发明以特定的浓度的秋水仙素溶液对种子苗浸泡特定的时间，经过从培养后得到的植株中，筛选即可得到多倍体牛大力植株，诱导率在70％-85％之间，得到的多倍体植株性状优良。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明的一个方面涉及一种多倍体牛大力品种的培育方法，所述方法包括以下步骤：
1)培育二倍体牛大力种子，得到牛大力种子苗；
2)选取生长势强的牛大力苗浸泡在二甲基亚砜混和秋水仙素合溶液中进行多倍体诱导；
3)对诱导后的牛大力苗进行增殖培养；
4)将增殖得到的丛生芽剪成单芽并转接，进行生根培养，培养得到根茎叶完整的组培苗；
5)筛选所述组培苗，得到多倍体植株。
采用刚萌发的种子苗作为诱导材料，刚萌发的种子苗分生能力强。秋水仙素可抑制纺锤丝的合成，从而使染色体加倍，二甲基亚砜是渗透型细胞保护剂，起到保护细胞的作用。
本发明以特定的浓度的秋水仙素溶液对种子苗浸泡特定的时间，经过从培养后得到的植株中，筛选即可得到多倍体牛大力植株，诱导率高，得到的多倍体植株性状优良。
优选地，所述步骤1)中，培育种子的具体过程包括，选取成熟、饱满的二倍体牛大力种子，剥去种皮，用升汞消毒处理3-5min，无菌水清洗4-6次，转接到1/2MS培养基中，暗培养3-8d。
优选地，所述二甲基亚砜的质量百分浓度为0.05-0.15％。
优选地，所述二甲基亚砜的质量百分浓度为0.08-0.12％。
优选地，所述秋水仙素的质量浓度为0.01-0.2％。
优选地，所述秋水仙素的质量浓度为0.05-0.15％。
优选地，所述步骤2)中，浸泡处理的时间为12-72h。
优选地，所述步骤2)中，浸泡处理的温度为15-20℃。
优选地，所述增殖培养和所述生根培养均在23-27℃的条件下进行。
优选地，所述增殖培养和所述生根培养均在光照强度1300-1700LX的条件下进行，优选地，光照时间为8-12h/d。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的方法中选用刚萌发的牛大力种子苗作为诱导材料，刚萌发的牛大力种子苗具有很强的分生能力，经过秋水仙素诱导处理，可使细胞中的染色体成倍数性变化，本发明经过多次试验，诱导率70％-85％之间，得到的多倍体牛大力植株形状优良。
(2)本发明在诱导过程中还添加了二甲基亚砜，起到保护细胞的作用，从而减少了秋水仙素对细胞的毒害，提高了诱导率。
(3)本发明选择了特定的秋水仙素浓度，该浓度能够提高对于牛大力的诱导成功率。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明涉及一种多倍体牛大力品种的培育方法，所述方法包括以下步骤：
1)培育二倍体牛大力种子，得到牛大力种子苗；
2)选取生长势强的牛大力苗浸泡在二甲基亚砜混和秋水仙素合溶液中进行多倍体诱导；
3)对诱导后的牛大力苗进行增殖培养；
4)将增殖得到的丛生芽剪成单芽并转接，进行生根培养，培养得到根茎叶完整的组培苗；
5)筛选所述组培苗，得到多倍体植株。
采用刚萌发的种子苗作为诱导材料，刚萌发的种子苗分生能力强。秋水仙素可抑制纺锤丝的合成，从而使染色体加倍，二甲基亚砜是渗透型细胞保护剂，起到保护细胞的作用。
本发明以特定的浓度的秋水仙素溶液对种子苗浸泡特定的时间，经过从培养后得到的植株中，筛选即可得到多倍体牛大力植株，诱导率高，得到的多倍体植株性状优良。
在本发明的一个优选实施方式中，所述步骤1)中，培育种子的具体过程包括，选取成熟、饱满的二倍体牛大力种子，剥去种皮，用升汞消毒处理3-5min，无菌水清洗4-6次，转接到1/2MS培养基中，暗培养3-8d。
在本发明的一个优选实施方式中，所述二甲基亚砜的质量百分浓度为0.05-0.15％。
在本发明的一个优选实施方式中，所述二甲基亚砜的质量百分浓度为0.08-0.12％。
在本发明的一个优选实施方式中，所述秋水仙素的质量浓度为0.01-0.2％。
在本发明的一个优选实施方式中，所述秋水仙素的质量浓度为0.05-0.15％。
在本发明的一个优选实施方式中，所述步骤2)中，浸泡处理的时间为12-72h。
在本发明的一个优选实施方式中，所述步骤2)中，浸泡处理的温度为15-20℃。
在本发明的一个优选实施方式中，所述增殖培养和所述生根培养均在23-27℃的条件下进行。
在本发明的一个优选实施方式中，所述增殖培养和所述生根培养均在光照强度1300-1700LX的条件下进行，优选地，光照时间为8-12h/d。
实施例1
按照以下步骤培育多倍体牛大力：
(1)选取成熟、饱满的二倍体牛大力种子，在超净工作台上，用手术刀剥去种皮，放入灭菌瓶中，用0.1％升汞消毒处理3min，无菌水清洗4次，转接到1/2MS培养基中，暗培养诱导3d后开始萌芽；
(2)将步骤1)刚萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亚砜和0.01％秋水仙素的混合溶液中进行处理72h，处理温度15℃；
(3)将步骤2)中经过诱导的牛大力苗用无菌水清洗1次，转接到常规的增殖培养基中进行增殖培养，培养温度25±2℃，光照强度1300LX,光照时间10h/d，培养40d后开形成丛生芽；
(4)将步骤3)丛生芽剪切成单芽，转接到常规的生根培养基中，暗培养5-7d后进行光照培养，培养温度25±2℃，光照强度1700LX,光照时间10h/d，培育成完整植株；
(5)切取步骤4)筛选的目标植株的茎尖、根尖0.5mm，用咔喏固定液(无水乙醇：乙酸体积比＝3:1)固定15min，清水洗净，用解离液(浓盐酸：甲醇体积比＝1:1)解离1min，清水洗净，切取分生组织0.1mm，用卡宝品红染色，压片观察，计算染色体数目，确定多倍体植株，诱导率为70％。
实施例2
按照以下步骤培育多倍体牛大力：
(1)选取成熟、饱满的二倍体牛大力种子，在超净工作台上，用手术刀剥去种皮，放入灭菌瓶中，用0.1％升汞消毒处理5min，无菌水清洗6次，转接到1/2MS培养基中，暗培养诱导5d；
(2)将步骤1)刚萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亚砜和0.1％秋水仙素的混合溶液中进行处理24h，处理温度20℃；
(3)将步骤2)中经过诱导的牛大力苗用无菌水清洗2次，转接到常规的增殖培养基中进行增殖培养，培养温度25±2℃，光照强度1500LX,光照时间12h/d，培养45d后形成丛生芽；
(4)将步骤3)丛生芽剪切成单芽，转接到常规的生根培养基中，暗培养5-7d后进行光照培养，培养温度25±2℃，光照强度1300LX,光照时间10h/d，培育成完整植株；
(5)切取步骤4)筛选的目标植株的茎尖、根尖1mm，用咔喏固定液(无水乙醇：乙酸体积比＝3:1)固定10min，清水洗净，用解离液(浓盐酸：甲醇体积比＝1:1)解离3min，清水洗净，切取分生组织0.1mm，用卡宝品红染色，压片观察，计算染色体数目，确定多倍体植株，诱导率为78.5％。
实施例3
(1)选取成熟、饱满的二倍体牛大力种子，无菌条件下，剥去种皮，用0.1％升汞消毒处理3min，无菌水清洗5次，转接到1/2MS培养基中，暗培养诱导8d；
(2)将步骤1)刚萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亚砜和0.15％秋水仙素的混合溶液中进行处理20h，处理温度15℃；
(3)将步骤2)中诱导的牛大力苗用无菌水清洗2次，转接到常规的增殖培养基中进行增殖培养，培养温度25±2℃，光照强度1700LX,光照时间10h/d；
(4)将步骤3)丛生芽剪切成单芽，转接到常规的生根培养基中，暗培养5-7d后进行光照培养，培养温度25±2℃，光照强度1500LX,光照时间12h/d，培育成完整植株；
(5)切取步骤4)筛选的目标植株的茎尖、根尖0.5mm，用咔喏固定液(无水乙醇：乙酸体积比＝3:1)固定20min以上，清水洗净后，用解离液(浓盐酸：甲醇体积比＝1:1)解离3min，清水洗净，切取分生组织0.1mm，用卡宝品红染色，压片观察，计算染色体数目，确定多倍体植株，诱导率为85％。
实施例4
(1)选取成熟、饱满的二倍体牛大力种子，无菌条件下，剥去种皮，用0.1％升汞消毒处理3min，无菌水清洗5次，转接到1/2MS培养基中，暗培养诱导8d；
(2)将步骤1)刚萌芽的牛大力苗完全浸泡在1％二甲基亚砜和0.15％秋水仙素的混合溶液中进行处理20h，处理温度15℃；
(3)将步骤2)中诱导的牛大力苗用无菌水清洗2次，转接到常规的增殖培养基中进行增殖培养，培养温度25±2℃，光照强度1500LX,光照时间10h/d；
(4)将步骤3)丛生芽剪切成单芽，转接到常规的生根培养基中，暗培养5-7d后进行光照培养，培养温度25±2℃，光照强度1500LX,光照时间8h/d，培育成完整植株；
(5)切取步骤4)筛选的目标植株的茎尖、根尖0.5mm，用咔喏固定液(无水乙醇：乙酸体积比＝3:1)固定20min以上，清水洗净后，用解离液(浓盐酸：甲醇体积比＝1:1)解离3min，清水洗净，切取分生组织0.1mm，用卡宝品红染色，压片观察，计算染色体数目，确定多倍体植株，诱导率为85％。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种多倍体牛大力品种的培育方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)培育二倍体牛大力种子，得到牛大力种子苗；
2)选取生长势强的牛大力苗浸泡在二甲基亚砜混和秋水仙素合溶液中进行多倍体诱导；
3)对诱导后的牛大力苗进行增殖培养；
4)将增殖得到的丛生芽剪成单芽并转接，进行生根培养，培养得到根茎叶完整的组培苗；
5)筛选所述组培苗，得到多倍体植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，培育种子的具体过程包括，选取成熟、饱满的二倍体牛大力种子，剥去种皮，用升汞消毒处理3-5min，无菌水清洗4-6次，转接到1/2MS培养基中，暗培养3-8d。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二甲基亚砜的质量百分浓度为0.05-0.15％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二甲基亚砜的质量百分浓度为0.08-0.12％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述秋水仙素的质量浓度为0.01-0.2％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述秋水仙素的质量浓度为0.05-0.15％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，浸泡处理的时间为12-72h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，浸泡处理的温度为15-20℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养和所述生根培养均在23-27℃的条件下进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养和所述生根培养均在光照强度1300-1700LX的条件下进行，优选地，光照时间为8-12h/d。
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2017
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