CN103210835B - 利用四倍体罗汉果雌株直接培育无籽罗汉果的技术 - Google Patents
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Abstract
本发明结合植物组织培养、多倍体诱导和遗传育种杂交技术，培育无籽罗汉果，属现代生物技术领域。本发明技术获得的罗汉果果形大、甜苷含量高、整果利用率高，彻底改变了罗汉果种植业的现状，解决了罗汉果甜苷成本高难以广泛应用的难题，推动了罗汉果在食品、饮料、医药等行业的应用，加快了罗汉果产业的发展。
Description
技术领域
本发明结合植物组织培养、多倍体诱导和遗传育种杂交技术，培育无籽罗汉果，属现代生物技术领域。
背景技术
罗汉果[Siraitia grosvenorii(Swingle)C．Jeffrey]属葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)，为多年生草质藤本植物，雌雄异株，是我国特有的经济、药用植物。罗汉果甜苷属葫芦烷三萜类，罗汉果苷V是世界最强甜味物质之一，甜度是甜菊苷的2倍，甘草甜素的6倍，蔗糖甜度的300倍；不含热量，无任何毒副作用，适宜所有人群，特别是糖尿病、肥胖症和高血压等特殊人群，是国际公认综合性状最佳的天然功能型甜味剂。
罗汉果甜苷存在于果实的果肉和果皮中，但是不含甜苷成分的种子占整果的50%，种子内的油脂增加了罗汉果甜苷提取、纯化的难度和成本。罗汉果种籽多的缺陷造成了甜苷得率低的问题，且很难通过改进提取工艺来解决，使得甜.苷价格昂贵，仅能在高端产品中使用。这一问题制约了罗汉果种植业及其加工业的发展。采用现代生物技术培育结籽减少或无籽、甜苷含量高的优良罗汉果品种对于推动罗汉果产业的发展具有里程碑意义。
植物多倍体中含有较多的染色体组数，往往在体型上表现出巨大性和高抗逆境能力，而且多倍体植物在品质和生物量上，都较二倍体优越。特别是植物三倍体具有不育的特性，是解决罗汉果多籽缺陷的最有效途径。无籽罗汉果的培育，将大幅提高甜苷含量和整果利用率，有效解决甜苷价格昂贵的问题，使罗汉果更广泛的应用于饮料、食品、保健品、药品等行业。
目前的无籽罗汉果技术都是用二倍体罗汉果雄株与三倍体罗汉果雌株进行杂交，获得无籽罗汉果，该技术获得的罗汉果果实严重变小、变短，目前市场上罗汉果的价格以其性状和大小来区分，因此该技术在生产中无法应用。培育果形大、甜苷含量高的无籽罗汉果是解决目前无籽罗汉果推广应用的根本方法。
本发明用四倍体罗汉果雌株直接培育优质无籽的罗汉果，获得的无籽罗汉果具有果形大、甜苷含量高的特性。本发明直接将田间表型好的罗汉果雌株制成脱毒苗，省去了用其种籽萌发、鉴定雌雄才能获得罗汉果脱毒雌株的步骤，省去了一代的时间，缩短了育种周期；同时用果实较大的四倍体雌株为母本，花粉活力高的三倍体雄株为父本进行杂交，使其果实不仅表现为无籽，同时果实具有果形大且甜苷含量高的特性，解决了无籽罗汉果果形小、实际生产无法应用的问题。本发明技术获得的罗汉果果形大、甜苷含量高、整果利用率高，彻底改变了罗汉果种植业的现状，解决了罗汉果甜苷成本高难以广泛应用的难题，推动了罗汉果在食品、饮料、医药等行业的应用，加快了罗汉果产业的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种用四倍体罗汉果雌株直接培育果形大、甜苷含量高的无籽罗汉果技术。该技术利用四倍体雌株与二倍体雄株杂交，获得子代中占50%的三倍体雄株，从高度不育的三倍体雄株中筛选花粉活力高的株系，从500个株系中获得了2个花粉活力高的三倍体雄株，与优良的四倍体雌株杂交，该技术充分结合了三倍体不育、四倍体果实增大的特性，获得的无籽罗汉果果形大且甜苷含量高。
本发明提供了一种无籽罗汉果的培育方法，其特征是所述培育方法通过三倍体雄株与四倍体雌株进行杂交获得无籽罗汉果。具体地，其中所述的三倍体雄株由四倍体雌株与二倍体雄株杂交获得。
更具体地，本发明中所述的四倍体雌株通过以下步骤获得：
a）选取田间表型好的罗汉果雌株茎尖，制成脱毒苗;
b）将消毒完毕的罗汉果茎尖放置于MS培养基中光照培养，诱导出芽;
c）用秋水仙素进行诱导培养；
d）分析诱导培养后的苗，选取鉴定为四倍体的株系继续培养,即获得所述的四倍体雌株。
其中，上述的罗汉果茎尖是在诱导出芽后15天左右，再切取嫩芽茎尖，用0.2%的秋水仙素诱导36-48小时，诱导后于MS培养基上继续培养。
本发明还提出了一种无籽罗汉果的田间培育方法，其步骤依次如下：
a）田间按罗汉果常规种植方法种植四倍体罗汉果雌株，每亩种植90-150株；
b）田间种植三倍体罗汉果结实诱导雄株系，按每100棵雌株种植1-5株雄株进行配种。
c）在田间三倍体雄株和四倍体雌株开花时，取三倍体雄株花粉与四倍体雌株杂交，挂果后即得到无籽罗汉果。
其中，上述培育方法的特征在于：田间种植三倍体雄株与四倍体雌株种植比例为1-5:100；用三倍体雄株花粉与四倍体雌株杂交诱导结实；所结果实为无籽罗汉果。
其中所述的三倍体罗汉果结实诱导雄株系是指从三倍体的雄株里筛选花粉诱导结实性好的雄株并扩繁产生。
本发明还包含一种无籽罗汉果，由上述方法培育而成。
本发明还包含一种无籽罗汉果的细胞、组织和器官，所述无籽罗汉果由上述方法培育而成。
更具体的，本发明的技术方案如下：
选取田间表型好的罗汉果雌株茎尖，制成脱毒苗，待脱毒苗出芽15天左右，切取嫩芽茎尖，用0.2%秋水仙素诱导染色体加倍，诱导后于MS培养基上继续培养。切取诱导25天左右的嫩芽叶片1-2片，进行细胞流式分析，重复3次以上均鉴定为四倍体的株系继续培养。将获得的表型粗壮的四倍体罗汉果雌株与品质优良的二倍体雄株杂交，秋季收获果实并将果实内种籽播种于营养钵内，45天左右，采集幼叶用流式细胞仪分析染色体倍性，并用PCR技术鉴定雌雄。
将获得的三倍体雄株脱毒苗于次年春天种植，用TTC染色法选取花粉活力高的三倍体罗汉果雄株，与品质优良的四倍体雌株杂交，挂果后即得到无籽罗汉果。果实与对照相比表现为高度不育，果实内结几颗种籽至无籽，果形大、甜苷含量高。
本发明与现有的无籽罗汉果技术相比具有以下优势：本发明直接用田间表型好的罗汉果雌株茎尖获得脱毒罗汉果雌株，而不是用其种籽繁殖、鉴定雌雄后获得二倍体罗汉果脱毒苗，省去了一代的时间，缩短了育种周期；用果实大的四倍体罗汉果雌株为母本，三倍体雄株为父本进行杂交，获得的无籽罗汉果果形大且甜苷含量高，克服了目前无籽罗汉果果形严重变小的问题，解决了目前无籽罗汉果不能应用于生产的根本问题；本发明获得的无籽罗汉果中罗汉果皂苷V的含量可达到3%，比二倍体罗汉果中甜苷V含量提高52%以上，且整果利用率增加45%以上。
下面通过具体实施方式，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1为罗汉果细胞流式图。
图2为三倍体罗汉果细胞流式图。
图3为罗汉果PCR鉴定雌雄图。
图4为三倍体罗汉果花粉TTC染色图。
图5为四倍体母本来源的无籽罗汉果。
图6为无籽罗汉果中皂苷V含量测定HPLC图。
具体实施方式
实施例1.四倍体母本来源的高甜度无籽罗汉果培育
1、取田间表型好的罗汉果雌株茎尖，流动水冲洗2h，超净台中75%乙醇消毒30s，再用0.1%HgCl2消毒5min，最后用无菌水冲洗3次。
2、将消毒完毕的罗汉果茎尖放置于MS培养基中光照培养，诱导出芽。
3、待出芽15天，切取嫩芽茎尖，0.2%秋水仙素诱导48小时，诱导后于MS培养基上继续培养。
4、分别切取二倍体罗汉果、秋水仙素诱导30天的嫩芽叶片1片，进行细胞流式分析并且重复3次，均鉴定为四倍体的株系继续培养，二倍体、四倍体罗汉果细胞流式结果见图1。
流式细胞术检测方法如下：
（1）配制缓冲液：
A.缓冲液Ⅰ（配制后室温保存）：45mmol/L MgCl2；30mmol/L柠檬酸三钠；20mmol/LMOPS；0.1%（w/v）TritonX-100；pH7.0。
100ml缓冲液Ⅰ：
B.PI染液：50ug/ml PI和50ug/ml Rnase（RNA酶）的缓冲液Ⅰ。
（2）取1片嫩叶，加入1ml冰冷缓冲液于培养皿，用刀片快速切碎，过40μm细胞过滤器到1.5ml离心管，放置冰上，500rpm离心5min，弃上清至0.1ml刻度（即留少量液体），加入500ulPI染液，放置冰上，避光。用流式细胞仪进行检测。
5、将获得的四倍体雌株与商品性质优良的二倍体雄株杂交，秋季收获果实并将果实内种籽播种于营养钵内，45天时采集幼叶用流式细胞仪分析其染色体倍性，三倍体罗汉果细胞流式结果见图3。同时用PCR法鉴定罗汉果雌雄。
所述PCR引物序列如SEQ ID NO.1和2所示
引物F1：5’GAGTTCAAACAAGGTCGGGGTGGGA3’(SEQ ID NO：1)
引物R1：5’GCTAAATTCCACCGCTTGCTTGCTC3’(SEQ ID NO：2)
CTAB法提取罗汉果基因组DNA方法如下：
A.1//2、1/3片叶在液氮中研成粉末（或用打样机）；
B.将样品放入液氮冻过的EP管中，加65℃预热2×CTAB1ml；
C.65℃水浴1h；
D.加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，离心10000rpm，10min，取上清；
E.加入等体积异丙醇，-20℃沉淀20-30min；
F.10000rpm离心10min，倒掉上清，70%乙醇，10000rpm，10min，倒掉上清，晾干；
G.加30-50ul dd H2O水溶解，-20℃保存;
PCR扩增反应体系（20ul）如下：
PCR扩增程序：95℃3min，94℃30sec，32-36℃60sec，72℃90sec，30个循环，72℃10min，4℃。
将上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析，结果如图3所示。图3是用引物F1与R1，扩增罗汉果基因组DNA结果电泳图，扩增目的片段大小为811bp，图中从左向右依次为：1、2泳道分别为雄雌性单株对照；3-19泳道为鉴定雌雄的罗汉果单株，其中1、2、5、11、12、14、15、16号样品鉴定为雄性，其它为雌性；20泳道为水负对照；21泳道为Marker。
6、将三倍体雄株的脱毒苗于次年春天种植，待其开花后采集花粉，用TTC染色法检测花粉活力，见图4，凡被染为红色的花粉活力强，淡红次之，无色者为没有活力或不育花粉，筛选花粉活力高于25%的三倍体罗汉果雄株，与品质优良的四倍体雌株杂交，挂果后得到高甜苷无籽罗汉果，见图5，获得的罗汉果表现为高度不育，果实内结几颗种籽至无籽。
花粉活力TTC染色检测方法如下：
采集三倍体罗汉果的花粉，取少许放在干洁的载玻片上，加1～2滴0.5%TTC溶液，搅匀后盖上盖玻片，置35℃恒温箱中，10～15min后镜检，凡被染为红色的花粉活力强，淡红次之，无色者为没有活力或不育花粉。观察2～3张片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。
7、罗汉果中甜苷V含量测定：分别精密吸取无籽罗汉果、市售罗汉果大果样品液10μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，结果见图6，并根据标准曲线计算出罗汉果中甜苷V含量，含量结果见表1。由表1可知无籽罗汉果中甜苷V平均含量达3.04%，而市售的罗汉果大果中甜苷V含量为2.00%，无籽罗汉果中甜苷V含量提高了52.00%，该方法获得的罗汉果不仅无籽，且甜度高。
表1罗汉果中皂苷V含量结果表
罗汉果中甜苷V含量测定方法如下：
（1）标准溶液配制：取罗汉果皂苷V对照品2.2mg，精密称定，加流动相制成每lml含0.22mg的溶液，0.45μm滤膜过滤，备用。
（2）样品溶液配制：取烘干后罗汉果，粉碎，粉末(过60目筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液20ml，回收溶剂至干，加水10ml溶解，通过大孔吸附树脂柱AB-8(内径为lcm，柱高为10cm)，以水100ml洗脱，弃去水液，再用20％乙醇l00ml洗脱，弃去洗脱液，继用稀乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至于，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤，备用。
（3）色谱条件：Kromasil C18色谱柱（250×4.6mm，5μm）；检测波长：203nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；
（4）标准曲线：按上述色谱条件，分别精密吸取罗汉果皂苷V标准溶液5、10、20、30、40ul注入高效液相色谱仪，以峰面积积分值对罗汉果皂苷V进样量（μg）作线性回归曲线，求得回归方程为Y=186159X-3609.1（R2=1）
（4）罗汉果中甜苷V含量测定：精密吸取样品液10μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，并根据标准曲线计算出罗汉果中甜苷V含量。
实施例2.四倍体母本来源的无籽大罗汉果培育
取田间表型好的罗汉果雌株茎尖，流动水冲洗3h，超净台中先用75%乙醇消毒30s，再用0.1%HgCl2消毒5min，无菌水冲洗5次。将消毒完毕的罗汉果茎尖放置于MS培养基中光照培养，诱导出芽。待芽长至21天，切取嫩芽茎尖，0.2%秋水仙素诱导36小时，诱导后于MS培养基上继续培养。切取秋水仙素诱导30天左右的嫩芽叶片2片，进行细胞流式分析并且重复3次以上均鉴定为四倍体的株系继续培养，流式细胞检测技术同实施例1。
将获得的四倍体雌株与商品性质优良的二倍体雄株杂交，秋季收获果实并将果实内种籽播种于营养钵内，50天时，采集幼叶用流式细胞仪分析其染色体倍性，并用PCR技术鉴定雌雄,流式细胞检测技术、PCR鉴定雌雄技术同实施例1。
分别种植流式细胞仪和PCR分析为三倍体雄株、雌株的脱毒苗于次年春天种植，待其开花后，采集其花粉用TTC染色法测定其花粉活力（方法同实施例1），选取花粉活力高于25%的三倍体罗汉果雄株与品质优良的四倍体雌株杂交，挂果后即得到高甜苷无籽罗汉果1；用商品二倍体罗汉果雄株与三倍体罗汉果雌株杂交，挂果后得到无籽罗汉果2。分别测定不同来源的无籽罗汉果的长、宽及烘干后的重量，并与商品的二倍体罗汉果进行比较，结果见表2。由表2可知用二倍体雄株与三倍体雌株杂交获得的罗汉果严重缩小，尺寸只有商品大果的1/3，严重影响了罗汉果的产量和价格，而用四倍体雌株与三倍体雄株杂交得到的无籽罗汉果与市售的商品罗汉果大果尺寸无显著差异，是品质优良的无籽罗汉果。
表2不同方法来源的无籽罗汉果尺寸比较表
| 罗汉果来源 | 长（mm） | 宽（mm） | 干果重量（g） |
| 无籽罗汉果1 | 53 | 46 | 21.5 |
| 无籽罗汉果2 | 18 | 15 | 6.5 |
| 市售商品罗汉果大果 | 52 | 48 | 22.1 |
SEQUENCE LISTING
<110> 怀化博雅惠农科技有限公司
<120> 利用四倍体罗汉果雌株直接培育无籽罗汉果的技术
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gagttcaaac aaggtcgggg tggga 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gctaaattcc accgcttgct tgctc 25
Claims (6)
1.一种无籽罗汉果的培育方法，其特征是所述培育方法通过三倍体雄株与四倍体雌株进行杂交获得无籽罗汉果。
2.权利要求1所述的培育方法，其中所述的三倍体雄株由四倍体雌株与二倍体雄株杂交获得。
3.权利要求1或2所述的培育方法，其中所述的四倍体雌株通过以下步骤获得：
a）选取田间表型好的罗汉果雌株茎尖，制成脱毒苗;
b）对罗汉果脱毒苗进行多倍体诱导，并筛选出所述的四倍体雌株。
4.权利要求3所述的培育方法，其中所述的多倍体诱导是用0.2%的秋水仙素诱导36-48小时。
5.一种无籽罗汉果的培育方法，其步骤依次如下：
a）田间按罗汉果常规种植方法种植四倍体罗汉果雌株，每亩种植90-150株；
b）田间种植三倍体罗汉果结实诱导雄株系，按每100棵雌株种植1-5株雄株进行配种；以及
c）在田间三倍体雄株和四倍体雌株开花时，取三倍体雄株花粉与四倍体雌株杂交，挂果后即得到无籽罗汉果；
其特征在于所述的三倍体罗汉果结实诱导雄株系是指从三倍体的雄株里筛选花粉诱导结实性好的雄株并扩繁产生得到的雄株系。
6.权利要求5所述的培育方法，其特征在于：田间种植三倍体雄株与四倍体雌株种植比例为1-5:100；用三倍体雄株花粉与四倍体雌株杂交诱导结实；所结果实为无籽罗汉果。
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