CN104542278B - 一种多倍体罗汉果植株的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物遗传育种领域，提供了一种多倍体罗汉果植株的培育方法，应用MS诱导丛芽液体培养基培养罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部获得罗汉果丛芽，以用于制备多倍体罗汉果植株，其中，在培养之前，需要将罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部进行表皮细胞划伤处理。本发明能够快速、高效获得具有优良母性遗传性状的多倍体罗汉果植株，成本低、效率高、品种好，实现罗汉果雌/雄株染色体加倍，获得的多倍体罗汉果植株多为制备四倍体，其与二倍体罗汉果雄/雌株杂交获得三倍体无籽品种，具有重要的农业、医药指导意义。
Description
技术领域
本发明属于植物遗传育种领域，具体涉及一种多倍体罗汉果植株的培育方法。
背景技术
罗汉果是卫生部首批公布的药食两用名贵中药材，果实营养价值很高，含丰富的维生素C以及糖甙、果糖、葡萄糖、蛋白质、脂类等，罗汉果甜苷是一种低热量高甜度的天然甜味剂，其甜度堪称世界之最，且低热、无毒，可为糖尿病和肥胖病患者等食用。罗汉果甘、酸、性凉，具有清热凉血、生津止咳、滑肠排毒、嫩肤益颜、润肺化痰等功效，是广西著名的道地药材。广西罗汉果产量占世界的90％以上，成为桂北重要的特色产业，已获国家地理标志产品保护。
罗汉果种子数量多、所占比率大，几乎不含甜苷，但影响贮运、加工、风味和品质；人工剥除种子，成本高，得不偿失。无籽果实通常果皮厚、硬度强，利于运输、贮藏、保鲜和加工，有较高的果实利用率和提取得率，能降低生产成本，无后苦味，品质好。培育无籽罗汉果新品种是实现罗汉果果实无籽化最经济和有效的措施。因此，如何去除种子长期以来是罗汉果开发利用中需要解决的重大问题。
多倍体具有器官巨大性、果实少籽或无籽、抗逆性强、产量高、品质优等诸多优点。多倍体种质资源创新是育种的重要目标之一。近年来，我国越来越多的企业加入到生产罗汉果的行列，组织培养是罗汉果产业化发展的重要手段。但目前罗汉果研究中采用秋水仙碱滴于田间植株芽尖的染色体加倍方法，诱变效率和植株成活率非常低。因此，如何快速有效地获得多倍体罗汉果品种是急需要解决的技术难题。
发明内容
本发明提供了一种多倍体罗汉果植株的培育方法，利用优化的包含植物生长调节剂TDZ和赤霉素的MS诱导丛芽液体培养基诱导雌/雄株的叶片或者茎部快速产生大量丛芽，振荡培养，将加倍处理后的丛芽芽尖切下进行转接培养、生根培养，根据组培苗形态表现，结合根尖染色体的鉴定，用于确定诱导获得的多倍体罗汉果的染色体数目，进一步纯化培养和扩大培养，可以快速获得大量多倍体罗汉果植株。
本发明提供的技术方案为：
一种多倍体罗汉果植株的培育方法，应用MS诱导丛芽液体培养基振荡培养罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部，获得罗汉果丛芽，以用于制备多倍体罗汉果植株，其中，在培养之前，需要将罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部进行表皮细胞划伤处理。
优选的是，所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述MS诱导丛芽液体培养基中添加有植物生长调节剂TDZ、赤霉素和秋水仙碱。
优选的是，所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述MS诱导培养中，所述植物生长调节剂TDZ、所述赤霉素和秋水仙碱的添加量分别为：0.5～1.5mg/L、1.2～2.2mg/L和0.8～1.5g/L。
优选的是，所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述植物生长调节剂TDZ和所述赤霉素的添加量分别为：1.2mg/L、1.5mg/L和1.0g/L。
优选的是，所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述MS诱导丛芽液体培养基中还包括：0.2～1.0mg/L吲哚丁酸和15～30g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.5～5.8。
优选的是，所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述茎部包括带有腋芽的茎段和茎尖。
优选的是，所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，将罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部在MS诱导丛芽液体培养基中培养的条件为：温度为24～26℃、光照强度为1500～2000lux、光照时间为12～16h/d和15～23天，诱导产生大量丛芽。
优选的是，所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，还包括转接培养、生根培养、纯化培养和扩大培养；
在所述诱导培养之后进行所述转接培养，所述转接培养在MS转接液体培养基中进行，将经过所述诱导培养得到的丛芽在温度为22～26℃，光照强度为1500～2000lux，及光照时间为12～16h/d的条件下培养28～35天，以产生苗形态变异，得到幼芽；
所述MS转接液体培养基包含：MS，0.08～0.3mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.05～0.15mg/L吲哚乙酸和15～30g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.5～5.8；
在所述转接培养之后进行所述生根培养，所述生根培养在MS生根培养基中进行，将经过所述转接培养得到的幼芽在温度为22～26℃，光照强度为1500～2000lux，及光照时间为12～16h/d的条件下继代2～3次，得到多倍体；
所述MS生根培养基包含：MS，0.05～0.15mg/L萘乙酸，8～20g/L蔗糖和4～5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.5～5.8；
在所述生根培养之后进行所述纯化培养，所述纯化培养在MS纯化培养基中进行，将经过所述生根培养得到的多倍体在温度为22～26℃，光照强度为1500～2000lux，及光照时间为12～16h/d的条件下纯化2～3代，得到多倍体苗；
所述MS纯化培养基包含：MS，0.08～0.3mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.05～0.15mg/L萘乙酸，15～30g/L蔗糖和4～5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.5～5.8；
在所述纯化培养之后进行所述扩大培养，所述扩大培养在MS扩大培养基中进行，将经过所述纯化培养得到的多倍体苗在温度为22～26℃，光照强度为1500～2000lux，及光照时间为12～16h/d的条件下扩繁培养下28～35天，得到大量染色体加倍的罗汉果种质；
所述MS扩大培养基包含：MS，0.4～0.6mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1～0.3mg/L吲哚丁酸，15～30g/L蔗糖和4～5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.5～5.8。
优选的是，所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述转接培养在MS转接液体培养基中进行，将经过所述诱导培养得到的丛芽在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为15h/d的条件下培养30天，以产生苗形态变异，得到幼芽；
所述MS转接液体培养基包含：MS，0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1mg/L吲哚乙酸和30g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.8；
所述生根培养在MS生根培养基中进行，将经过所述转接培养得到的幼芽在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为15h/d的条件下继代2～3次，得到多倍体；
所述MS生根培养基包含：MS，0.1mg/L萘乙酸，15g/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8；
所述纯化培养在MS纯化培养基中进行，将经过所述生根培养得到的多倍体在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为15h/d的条件下纯化2～3代，得到多倍体苗；
所述MS纯化培养基包含：MS，0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8；
所述扩大培养在MS扩大液体培养基中进行，将经过所述纯化培养得到的多倍体苗在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为15h/d的条件下扩繁培养下30天，得到大量染色体加倍的罗汉果种质；
所述MS扩大培养基包含：MS，0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.2mg/L吲哚丁酸，30mg/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8。
优选的是，所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，在所述纯化培养之前还包括染色体倍性鉴定。
本发明的有益效果是：
第一、选择罗汉果雌/雄株叶片或者茎部为培养部位，出芽多且快，具有好的培养效果，克服了基于未授粉子房、幼胚、种子(苗)等加倍处理所得后代还要进行性别鉴定、育种周期长等的不足；
第二、诱导培养采用MS诱导丛芽液体培养基，转接培养采用MS转换液体培养基，均为液体培养基，与叶片接触面积更大，使叶片吸收更多的营养物质，使营养成分的分布比较均匀，更容易得到多倍体，获得好的培养效果；
第三、MS诱导丛芽液体培养基加入了植物生长调节剂TDZ、赤霉素，TDZ是一种新型作用力很强的植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进组织萌发和生长，赤霉素促进叶片或者茎部的生长，提高结实率，其中，0.5～1.5mg/L TDZ和1.2～2.2mg/L赤霉素具有显著的快速丛芽生成效果；
第四、MS诱导丛芽液体培养基加入了秋水仙碱，较之传统多倍体育种中利用秋水仙碱滴于田间植株芽尖的处理方法，降低了死亡比率并提高了染色体加倍的效率，由于秋水仙碱有剧毒，故选择0.8～1.5g/L秋水仙碱，兼具好的细胞分裂抑制效果；
第五、MS转换液体培养基添加细胞分裂素6-苄基腺嘌呤和生长素吲哚乙酸培养具有好的苗形态的幼芽，MS生根培养基添加生长素萘乙酸获得完整的带根苗，切成带腋芽的茎段，MS纯化培养基添加细胞分裂素6-苄基腺嘌呤和生长素萘乙酸纯化2～3代获得多倍体苗，MS扩大培养基添加细胞分裂素6-苄基腺嘌呤和生长促进剂吲哚丁酸，获得大量无嵌合体多倍体罗汉果雌/雄植株；
第六、MS诱导丛芽液体培养基诱导培养后，每片叶片可获得20～30个芽，MS转换液体培养基转接培养后，丛芽团有60％的芽符合形态学鉴定，多倍体苗生根后成活率达90％。
本发明所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，能够快速、高效获得具有优良母性遗传性状的多倍体罗汉果植株，成本低、效率高、品种好，实现罗汉果雌/雄株染色体加倍，获得的多倍体罗汉果植株多为制备四倍体，其与二倍体罗汉果雄/雌株杂交获得三倍体无籽品种，具有重要的农业、医药指导意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：
一种多倍体罗汉果植株的培育方法，取罗汉果雌株无菌试管苗茎尖，进行叶片表皮细胞划伤处理，正面向上，平贴接种于MS诱导丛芽液体培养基培养，获得罗汉果丛芽。
选择罗汉果茎尖为培养部位，出芽多且快，具有好的培养效果，克服了基于未授粉子房、幼胚、种子(苗)等加倍处理所得后代还要进行性别鉴定、育种周期长等的不足。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述MS诱导丛芽液体培养基中添加有植物生长调节剂TDZ、赤霉素和秋水仙碱，添加量分别为：0.5mg/L、1.2mg/L和0.8g/L，其中，每片叶片获得20～25个芽。
TDZ是一种新型作用力很强的植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进组织萌发和生长，赤霉素促进叶片或者茎部的生长，提高结实率，0.5mg/L和1.2mg/L的添加量具有显著的快速丛芽生成效果。
MS诱导丛芽液体培养基加入了秋水仙碱，较之传统多倍体育种中利用秋水仙碱滴于田间植株芽尖的处理方法，降低了死亡比率并提高了染色体加倍的效率，由于秋水仙碱有剧毒，故选择0.8g/L秋水仙碱，兼具好的细胞分裂抑制效果。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述MS诱导丛芽液体培养基中还包括：0.2mg/L吲哚丁酸和15g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.5。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，MS诱导丛芽液体培养基中培养的条件为：温度为24℃、光照强度为1500lux、光照时间为12h/d和15天，诱导产生大量丛芽。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，还包括转接培养、生根培养、纯化培养和扩大培养；
在所述诱导培养之后进行所述转接培养，所述转接培养在MS转接液体培养基中进行，将经过所述诱导培养得到的丛芽取出用无菌水洗3次，接种于MS转接液体培养基，所述MS转换液体培养基包含：MS，0.08mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.05mg/L吲哚乙酸和15g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.5，在温度为22℃，光照强度为1500lux，及光照时间为12h/d的条件下培养28天，观察苗形态，叶片变厚、反卷，叶脉变深，叶表皮毛变粗、变长，切割下来得到发生形态变异的幼芽，其中，有60％的芽符合形态学鉴定；
在所述转接培养之后进行所述生根培养，所述生根培养在MS生根培养基中进行，所述MS生根培养基包含：MS，0.05mg/L萘乙酸，8g/L蔗糖和4g/L琼脂，并调节初始pH值为5.5，在温度为22℃，光照强度为1500lux，及光照时间为12h/d的条件下继代2次，得到多倍体；
在所述生根培养之后进行染色体倍性鉴定，体细胞染色体计数，切取茎增粗，叶片增大变厚，叶色浓绿，叶形圆钝，表皮毛变粗变长植株的根尖5mm，置于饱和对二氯苯溶液中处理2h，移入改良卡诺氏固定液中固定12h，然后于1mol/L盐酸60℃水浴中解10min，用清水洗3次，再用卡宝品红染色30min，压片，镜检；
将鉴定合格的苗切成带腋芽的茎段接种于MS纯化培养基进行纯化培养，所述MS纯化培养基包含：MS，0.08mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.05mg/L萘乙酸，15g/L蔗糖和4g/L琼脂，并调节初始pH值为5.5，在温度为22～26℃，光照强度为1500lux，及光照时间为12h/d的条件下纯化2代，得到多倍体苗；
在所述纯化培养之后进行所述扩大培养，所述扩大培养在MS扩大培养基中进行，所述MS扩大培养基包含：MS，0.4mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1mg/L吲哚丁酸，15g/L蔗糖和4g/L琼脂，并调节初始pH值为5.5，在温度为22℃，光照强度为1500lux，及光照时间为12h/d的条件下扩繁培养下28天，得到大量无嵌合体多倍体罗汉果雌株。
其中，诱导培养中采用的MS诱导丛芽液体培养基和转接培养中采用的MS转换液体培养基都是液体培养基，与叶片接触面积更大，使叶片吸收更多的营养物质，使营养成分的分布比较均匀，更容易得到多倍体，获得好的培养效果。
经鉴定，多倍体苗生根后成活率达90％。
实施例2：
一种多倍体罗汉果植株的培育方法，取罗汉果雌株无菌试管苗带有腋芽的茎段，进行茎段表皮细胞划伤处理，正面向上，平贴接种于MS诱导丛芽液体培养基培养，获得罗汉果丛芽。
选择罗汉果茎段为培养部位，出芽多且快，具有好的培养效果，克服了基于未授粉子房、幼胚、种子(苗)等加倍处理所得后代还要进行性别鉴定、育种周期长等的不足。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述MS诱导丛芽液体培养基中添加有植物生长调节剂TDZ、赤霉素和秋水仙碱和，添加量分别为：1.5mg/L、2.2mg/L和1.5g/L，其中，每片叶片获得22～26个芽。
TDZ是一种新型作用力很强的植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进组织萌发和生长，赤霉素促进叶片或者茎部的生长，提高结实率，1.5mg/L和2.2mg/L的添加量具有显著的快速丛芽生成效果。
MS诱导丛芽液体培养基加入了秋水仙碱，较之传统多倍体育种中利用秋水仙碱滴于田间植株芽尖的处理方法，降低了死亡比率并提高了染色体加倍的效率，由于秋水仙碱有剧毒，故选择1.5g/L秋水仙碱，兼具好的细胞分裂抑制效果。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述MS诱导丛芽液体培养基中还包括：1.0mg/L吲哚丁酸和30g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.8。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，MS诱导丛芽液体培养基中培养的条件为：温度为26℃、光照强度为2000lux、光照时间为16h/d和23天，诱导产生大量丛芽。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，还包括转接培养、生根培养、纯化培养和扩大培养；
在所述诱导培养之后进行所述转接培养，所述转接培养在MS转接液体培养基中进行，将经过所述诱导培养得到的丛芽取出用无菌水洗3次，接种于MS转接液体培养基，所述MS转换液体培养基包含：MS，0.3mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.15mg/L吲哚乙酸和30g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.8，在温度为26℃，光照强度为2000lux，及光照时间为16h/d的条件下培养35天，观察苗形态，叶片变厚、反卷，叶脉变深，叶表皮毛变粗、变长，切割下来得到发生形态变异的幼芽，其中，有62％的芽符合形态学鉴定；
在所述转接培养之后进行所述生根培养，所述生根培养在MS生根培养基中进行，所述MS生根培养基包含：MS，0.15mg/L萘乙酸，20g/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8，在温度为26℃，光照强度为2000lux，及光照时间为16h/d的条件下继代3次，得到多倍体；
在所述生根培养之后进行染色体倍性鉴定，体细胞染色体计数，切取茎增粗，叶片增大变厚，叶色浓绿，叶形圆钝，表皮毛变粗变长植株的根尖5mm，置于饱和对二氯苯溶液中处理2h，移入改良卡诺氏固定液中固定12h，然后于1mol/L盐酸60℃水浴中解10min，用清水洗3次，再用卡宝品红染色30min，压片，镜检；
将鉴定合格的苗切成带腋芽的茎段接种于MS纯化培养基进行纯化培养，所述MS纯化培养基包含：MS，0.3mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.15mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8，在温度为26℃，光照强度为2000lux，及光照时间为16h/d的条件下纯化3代，得到多倍体苗；
在所述纯化培养之后进行所述扩大培养，所述扩大培养在MS扩大培养基中进行，所述MS扩大培养基包含：MS，0.6mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.3mg/L吲哚丁酸，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8，在温度为26℃，光照强度为2000lux，及光照时间为16h/d的条件下扩繁培养下35天，得到大量无嵌合体多倍体罗汉果雌株。
其中，诱导培养中采用的MS诱导丛芽液体培养基和转接培养中采用的MS转换液体培养基都是液体培养基，与叶片接触面积更大，使叶片吸收更多的营养物质，使营养成分的分布比较均匀，更容易得到多倍体，获得好的培养效果。
经鉴定，多倍体苗生根后成活率达92％。
实施例3：
一种多倍体罗汉果植株的培育方法，取罗汉果雌株无菌试管苗嫩叶片，进行叶片表皮细胞划伤处理，正面向上，平贴接种于MS诱导丛芽液体培养基培养，获得罗汉果丛芽。
选择罗汉果雌株无菌试管苗叶片为培养部位，出芽多且快，具有好的培养效果，克服了基于未授粉子房、幼胚、种子(苗)等加倍处理所得后代还要进行性别鉴定、育种周期长等的不足。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述MS诱导丛芽液体培养基中添加有植物生长调节剂TDZ、赤霉素和秋水仙碱，添加量分别为：1.0mg/L、1.0mg/L和1.0g/L，其中，每片叶片获得24～30个芽。
TDZ是一种新型作用力很强的植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进组织萌发和生长，赤霉素促进叶片或者茎部的生长，提高结实率，1.2mg/L和1.5mg/L的添加量具有显著的快速丛芽生成效果。
MS诱导丛芽液体培养基加入了秋水仙碱，较之传统多倍体育种中利用秋水仙碱滴于田间植株芽尖的处理方法，降低了死亡比率并提高了染色体加倍的效率，由于秋水仙碱有剧毒，故选择1.0g/L秋水仙碱，兼具好的细胞分裂抑制效果。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，所述MS诱导丛芽液体培养基中还包括：0.4mg/L吲哚丁酸和30g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.8。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，MS诱导丛芽液体培养基中培养的条件为：温度为24℃、光照强度为1500lux、光照时间为14h/d和20天，诱导产生大量丛芽。
所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，还包括转接培养、生根培养、纯化培养和扩大培养；
在所述诱导培养之后进行所述转接培养，所述转接培养在MS转接液体培养基中进行，将经过所述诱导培养得到的丛芽取出用无菌水洗3次，接种于MS转接液体培养基，所述MS转换液体培养基包含：MS，0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚乙酸和30g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.8，在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为14h/d的条件下培养30天，观察苗形态，叶片变厚、反卷，叶脉变深，叶表皮毛变粗、变长，切割下来得到发生形态变异的幼芽，其中，有65％的芽符合形态学鉴定；
在所述转接培养之后进行所述生根培养，所述生根培养在MS生根培养基中进行，所述MS生根培养基包含：MS，0.1mg/L萘乙酸，15g/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8，在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为14h/d的条件下继代3次，得到多倍体；
在所述生根培养之后进行染色体倍性鉴定，体细胞染色体计数，切取茎增粗，叶片增大变厚，叶色浓绿，叶形圆钝，表皮毛变粗变长植株的根尖5mm，置于饱和对二氯苯溶液中处理2h，移入改良卡诺氏固定液中固定12h，然后于1mol/L盐酸60℃水浴中解10min，用清水洗3次，再用卡宝品红染色30min，压片，镜检；
将鉴定合格的苗切成带腋芽的茎段接种于MS纯化培养基进行纯化培养，所述MS纯化培养基包含：MS，0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8，在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为14h/d的条件下纯化3代，得到多倍体苗；
在所述纯化培养之后进行所述扩大培养，所述扩大培养在MS扩大培养基中进行，所述MS扩大培养基包含：MS，0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.2mg/L吲哚丁酸，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8，在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为14h/d的条件下扩繁培养下30天，得到大量无嵌合体多倍体罗汉果雌株。
其中，诱导培养中采用的MS诱导丛芽液体培养基和转接培养中采用的MS转换液体培养基都是液体培养基，与叶片接触面积更大，使叶片吸收更多的营养物质，使营养成分的分布比较均匀，更容易得到多倍体，获得好的培养效果。
经鉴定，多倍体苗生根后成活率达93％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (3)
1.一种多倍体罗汉果植株的培育方法，其特征在于，应用MS诱导丛芽液体培养基振荡培养罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部，所述茎部包括带有腋芽的茎段和茎尖，获得罗汉果丛芽，以用于制备多倍体罗汉果植株，其中，在培养之前，需要将罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部进行表皮细胞划伤处理；
所述MS诱导丛芽液体培养基中添加有植物生长调节剂TDZ 0.5～1.5mg/L、赤霉素1.2～2.2mg/L、秋水仙碱0.8～1.5g/L、0.2～1.0mg/L吲哚丁酸和15～30g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.5～5.8；
将罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部在MS诱导丛芽液体培养基中培养的条件为：温度为24～26℃、光照强度为1500～2000lux、光照时间为12～16h/d和15～23天，诱导产生大量丛芽；
在所述诱导培养之后进行转接培养，所述转接培养在MS转接液体培养基中进行，将经过所述诱导培养得到的丛芽在温度为22～26℃，光照强度为1500～2000lux，及光照时间为12～16h/d的条件下培养28～35天，以产生苗形态变异，得到幼芽；
所述MS转接液体培养基包含：MS，0.08～0.3mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.05～0.15mg/L吲哚乙酸和15～30g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.5～5.8；
在所述转接培养之后进行生根培养，所述生根培养在MS生根培养基中进行，将经过所述转接培养得到的幼芽在温度为22～26℃，光照强度为1500～2000lux，及光照时间为12～16h/d的条件下继代2～3次，得到多倍体；
所述MS生根培养基包含：MS，0.05～0.15mg/L萘乙酸，8～20g/L蔗糖和4～5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.5～5.8；
在所述生根培养之后进行染色体倍性鉴定，然后进行纯化培养，所述纯化培养在MS纯化培养基中进行，将经过所述生根培养得到的多倍体在温度为22～26℃，光照强度为1500～2000lux，及光照时间为12～16h/d的条件下纯化2～3代，得到多倍体苗；
所述MS纯化培养基包含：MS，0.08～0.3mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.05～0.15mg/L萘乙酸，15～30g/L蔗糖和4～5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.5～5.8；
在所述纯化培养之后进行所述扩大培养，所述扩大培养在MS扩大培养基中进行，将经过所述纯化培养得到的多倍体苗在温度为22～26℃，光照强度为1500～2000lux，及光照时间为12～16h/d的条件下扩繁培养下28～35天，得到大量染色体加倍的罗汉果种质；
所述MS扩大培养基包含：MS，0.4～0.6mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1～0.3mg/L吲哚丁酸，15～30g/L蔗糖和4～5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.5～5.8。
2.如权利要求1所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，其特征在于，所述植物生长调节剂TDZ和所述赤霉素的添加量分别为：1.2mg/L、1.5mg/L和1.0g/L。
3.如权利要求1所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，其特征在于，
所述转接培养在MS转接液体培养基中进行，将经过所述诱导培养得到的丛芽在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为15h/d的条件下培养30天，以产生苗形态变异，得到幼芽；
所述MS转接液体培养基包含：MS，0.2mg/L6-苄基腺嘌呤，0.1mg/L吲哚乙酸和30g/L蔗糖，并调节初始pH值为5.8；
所述生根培养在MS生根培养基中进行，将经过所述转接培养得到的幼芽在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为15h/d的条件下继代2～3次，得到多倍体；
所述MS生根培养基包含：MS，0.1mg/L萘乙酸，15g/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8；
所述纯化培养在MS纯化培养基中进行，将经过所述生根培养得到的多倍体在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为15h/d的条件下纯化2～3代，得到多倍体苗；
所述MS纯化培养基包含：MS，0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8；
所述扩大培养在MS扩大液体培养基中进行，将经过所述纯化培养得到的多倍体苗在温度为24℃，光照强度为1500lux，及光照时间为15h/d的条件下扩繁培养下30天，得到大量染色体加倍的罗汉果种质；
所述MS扩大培养基包含：MS，0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.2mg/L吲哚丁酸，30mg/L蔗糖和5g/L琼脂，并调节初始pH值为5.8。
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