CN109042315A - 多倍体罗汉果植株的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多倍体罗汉果植株的培育方法，包括诱导培养、转接培养、生根培养、纯化培养、扩大培养，选取取罗汉果雌株无菌试管苗茎尖，接种于含有甘露醇的诱导培养基中培养得丛芽，其中甘露醇中含有L‑甘露醇；将丛芽在转接液体培养基中培养得到幼芽；将幼芽放入生根培养基中培养获得完整的带根苗，进行染色体倍性鉴定，将鉴定合格的苗切成带腋芽的茎段；将茎段接种于纯化培养基中纯化2‑3代，得到多倍体苗；将多倍体苗培养扩大液体培养基中扩繁培养得多倍体罗汉果雌株。有益效果为：本发明配乐方法能够快速、高效获得具有优良母性遗传性状的多倍体罗汉果植株，成本低、诱导速率和诱导率高、培育周期短，得到质量较高的多倍体苗。

Description

多倍体罗汉果植株的培育方法

技术领域

本发明涉及植株培育技术领域，尤其是涉及多倍体罗汉果植株的培育方法。

背景技术

罗汉果隶属于葫芦科，罗汉果属，为多年生草质藤本植物，是我国特有的药用和甜料植物，不仅是药典收载的中药品种，也是卫生部、国家中医药管理局列入第一批既是食品又是药品名录的中药。果实营养价值很高，含丰富的维生素C以及糖甙、果糖、葡萄糖、蛋白质、脂类等，罗汉果甜苷是一种低热量高甜度的天然甜味剂，其甜度堪称世界之最，且低热、无毒，可为糖尿病和肥胖病患者等食用。罗汉果甘、酸、性凉，具有清热凉血、生津止咳、滑肠排毒、嫩肤益颜、润肺化痰等功效，是广西著名的道地药材。罗汉果甜苷存在于果实的果肉和果皮中，但是不含甜苷成分的种子占整果的50%，种子内的油脂增加了罗汉果甜苷提取、纯化的难度和成本。罗汉果种籽多的缺陷造成了甜苷得率低的问题，且很难通过改进提取工艺来解决，使得甜苷价格昂贵，仅能在高端产品中使用。这一问题制约了罗汉果种植业及其加工业的发展。采用现代生物技术培育结籽减少或无籽、甜苷含量高的优良罗汉果品种对于推动罗汉果产业的发展具有里程碑意义。

植物多倍体中含有较多的染色体组数，往往在体型上表现出巨大性和高抗逆境能力，而且多倍体植物在品质和生物量上，都较二倍体优越。特别是植物三倍体具有不育的特性，是解决罗汉果多籽缺陷的最有效途径。无籽罗汉果的培育，将大幅提高甜苷含量和整果利用率，有效解决甜苷价格昂贵的问题，使罗汉果更广泛的应用于饮料、食品、保健品、药品等行业。目前的无籽罗汉果技术都是用二倍体罗汉果雄株与三倍体罗汉果雌株进行杂交，获得无籽罗汉果，该技术获得的罗汉果果实严重变小、变短，目前市场上罗汉果的价格以其性状和大小来区分，因此该技术在生产中无法应用。培育果形大、甜苷含量高的无籽罗汉果是解决目前无籽罗汉果推广应用的根本方法。

现有技术如授权公告号为CN 104542278 B的中国发明专利，公开了一种多倍体罗汉果植株的培育方法，应用MS诱导丛芽液体培养基培养罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部获得罗汉果丛芽，以用于制备多倍体罗汉果植株，其中，在培养之前，需要将罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部进行表皮细胞划伤处理。上述培育方法能够快速、高效获得具有优良母性遗传性状的多倍体罗汉果植株，成本低、效率高、品种好，实现罗汉果雌/雄株染色体加倍，获得的多倍体罗汉果植株多为制备四倍体，其与二倍体罗汉果雄/雌株杂交获得三倍体无籽品种，具有重要的农业、医药指导意义。但是该培养方法用MS诱导丛芽液体培养基对罗汉果组织的渗透作用稍弱，使得多倍体的诱导率不太理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速、高效获得具有优良母性遗传性状的多倍体罗汉果植株，成本低、诱导速率和诱导率高、培育周期短，得到质量较高的多倍体苗的多倍体罗汉果植株的培育方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

多倍体罗汉果植株的培育方法，包括诱导培养、转接培养、生根培养、纯化培养、扩大培养，其中诱导培养用培养基中含有甘露醇，甘露醇中含有L-甘露醇。该特殊甘露醇的使用一方面可维持薄壁细胞的稳定，避免破裂，且促进薄壁细胞再生细胞壁并继续分裂，能够保证薄壁细胞的成活率，提高诱导成功率和所得罗汉果丛芽的数量，另一方面还能引起基因组的核苷酸碱基序列改变，形成可与引物杂交的新位点，使后续得到的多倍体罗汉果雌株在抗逆性及光合能力方面更优于其二倍体植株，且能提高MS诱导培养基对罗汉果茎尖组织的渗透性强，提高多倍体的诱导速率和诱导率。

作为优选，甘露醇中含有6.4-7.8%的L-甘露醇。

上述多倍体罗汉果植株的培育方法的具体步骤为：

诱导培养：选取取罗汉果雌株无菌试管苗茎尖，进行表皮细胞划伤处理，正面向上，平贴接种于MS诱导培养基中，在温度为24-26℃、光照强度为1500-2000Lux、光照时间为12-16h/d的条件下诱导培养8-15d，获得罗汉果丛芽，然后将丛芽用无菌水洗2-4次，备用，该步骤选择罗汉果茎尖为培养部位，出芽多且快，具有好的培养效果，克服了基于未授粉子房、幼胚、种子(苗)等加倍处理所得后代还要进行性别鉴定、育种周期长等的不足，采取离体诱导的方式对罗汉果茎尖进行诱导培养，具有环境容易控制、重复性强、工作效率高、诱导率高、所得罗汉果丛芽的数量多的优势；

转接培养：将诱导培养得到的丛芽转接到含0.05-0.1mg/L吲哚丁酸、0.05-0.1mg/L细胞分裂素和15-30g/L蔗糖的MS转接液体培养基中，在温度为22-26℃、光照强度为1500-2000Lux、光照时间为12-16h/d的条件下转接培养25-30d，以产生苗形态变异，得到幼芽，该步骤采取的培养基与丛芽的接触面积更大，能使丛芽吸收更多的营养物质，使营养成分的分布比较均匀，更容易得到多倍体，增殖效果好，增殖系数高且获得具有好的苗形态的幼芽；

生根培养：将转接培养得到的幼芽放入含0.05-0.1mg/L萘乙酸、0.05-0.1mg/L吲哚丁酸、10-20g/L蔗糖和4-5g/L琼脂的MS生根培养基中，在温度为22-26℃、光照强度为1500-2000Lux、光照时间为12-16h/d的条件下继代2-3次，获得完整的带根苗，进行染色体倍性鉴定，将鉴定合格的苗切成带腋芽的茎段，备用，该步骤可使幼芽的叶片变厚、反卷，叶脉变深，叶表皮毛变粗、变长，然后切割发生形态变异的幼芽苗，其中有65-73%的芽符合形态学鉴定，得到的茎段有利于多倍体苗的遗传稳定性、具有良好的再生能力；

纯化培养：将带腋芽的茎段接种于含0.03-0.08mg/L萘乙酸、0.05-0.1mg/L吲哚丁酸、0.1-0.2mg/L细胞分裂素、18-22mg/L光甾醇、10-20g/L蔗糖、23-29mg/L氨基葡萄糖和4-5g/L琼脂的MS纯化培养基中，在温度为22-26℃、光照强度为1500-2000Lux、光照时间为12-16h/d的条件下纯化2-3代，得到多倍体苗，该步骤用培养基中光甾醇和氨基葡萄糖的特殊存在能够增大培养基中各有效成分间的增益作用，为茎段的生长和增殖提供充足的营养成分，保证细胞分裂的顺利进行，提高罗汉果多倍体苗的发育质量和稳定性，同时光甾醇和氨基葡萄糖更易于进入细胞内部而被茎段吸收利用，先为茎段提供充足的碳氮而进行光合作用，提高茎段的生长速度和增殖倍数，缩短纯化培养需要的时间，得到质量较高的多倍体苗；

扩大培养：将纯化培养得到的多倍体苗培养在含0.02-0.03mg/L萘乙酸、0.02-0.03mg/L吲哚丁酸、0.15-0.25mg/L细胞分裂素、20-30g/L蔗糖和4-5g/L琼脂的MS扩大液体培养基中，在温度为22-26℃、光照强度为1500-2000Lux、光照时间为12-16h/d的条件下扩繁培养25-30d，得到多倍体罗汉果雌株，该步骤得到的多倍体罗汉果雌株具有生长速度快、光合能力强、抗病能力强、抗逆性强等优点，其炼苗与移栽成活率能达93%以上，所结果实为无籽罗汉果，罗汉果果形大，其中有效组分尤其是甜苷的含量高。

作为优选，诱导培养用MS诱导培养基含有20-25g/L甘露醇、0.05-0.1mg/L吲哚丁酸、0.05-0.1mg/L细胞分裂素、0.05-0.1g/L秋水仙素。该MS诱导培养基在秋水仙素的含量低特别低的条件下也能特异性的与植物细胞中的微管蛋白结合，使纺锤丝合成受阻，导致复制后的染色体无法被拉向两级，干扰了正常的细胞分裂过程使染色体都留在同一细胞核中，形成染色体加倍的细胞，最终形成非嵌合体多倍体植株，大大降低秋水仙素的用量和秋水仙素对茎尖的毒害，提高丛芽数量的同时也能降低培育成本，此外该培养基对罗汉果茎尖组织的渗透性强，多倍体的诱导率高。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明培育方法能够快速、高效获得具有优良母性遗传性状的多倍体罗汉果植株，成本低、效率高、品种好；该培育方法用MS诱导培养基大大降低秋水仙素的用量和秋水仙素对茎尖的毒害，提高丛芽数量的同时也能降低培育成本，此外该培养基对罗汉果茎尖组织的渗透性强，多倍体的诱导速率和诱导率高；该培育方法用纯化培养基为茎段的生长和增殖提供充足的营养成分，提高罗汉果多倍体苗的发育质量和稳定性，先为茎段提供充足的碳氮而进行光合作用，提高茎段的生长速度和增殖倍数，缩短纯化培养需要的时间，得到质量较高的多倍体苗。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

多倍体罗汉果植株的培育方法，包括诱导培养、转接培养、生根培养、纯化培养、扩大培养，其中诱导培养用培养基中含有甘露醇，甘露醇中含有7.8%的L-甘露醇。该特殊甘露醇的使用一方面可维持薄壁细胞的稳定，避免破裂，且促进薄壁细胞再生细胞壁并继续分裂，能够保证薄壁细胞的成活率，提高诱导成功率和所得罗汉果丛芽的数量，另一方面还能引起基因组的核苷酸碱基序列改变，形成可与引物杂交的新位点，使后续得到的多倍体罗汉果雌株在抗逆性及光合能力方面更优于其二倍体植株，且能提高MS诱导培养基对罗汉果茎尖组织的渗透性强，提高多倍体的诱导速率和诱导率。

上述多倍体罗汉果植株的培育方法的具体步骤为：

1）诱导培养：选取取罗汉果雌株无菌试管苗茎尖，进行表皮细胞划伤处理，正面向上，平贴接种于MS诱导培养基中，在温度为26℃、光照强度为2000Lux、光照时间为16h/d的条件下诱导培养15d，获得罗汉果丛芽，然后将丛芽用无菌水洗4次，备用，该步骤选择罗汉果茎尖为培养部位，出芽多且快，具有好的培养效果，克服了基于未授粉子房、幼胚、种子(苗)等加倍处理所得后代还要进行性别鉴定、育种周期长等的不足，采取离体诱导的方式对罗汉果茎尖进行诱导培养，具有环境容易控制、重复性强、工作效率高、诱导率高、所得罗汉果丛芽的数量多的优势；

2）转接培养：将诱导培养得到的丛芽转接到含0.1mg/L吲哚丁酸、0.1mg/L细胞分裂素和30g/L蔗糖的MS转接液体培养基中，在温度为26℃、光照强度为2000Lux、光照时间为16h/d的条件下转接培养30d，以产生苗形态变异，得到幼芽，该步骤采取的培养基与丛芽的接触面积更大，能使丛芽吸收更多的营养物质，使营养成分的分布比较均匀，更容易得到多倍体，增殖效果好，增殖系数高且获得具有好的苗形态的幼芽；

3）生根培养：将转接培养得到的幼芽放入含0.1mg/L萘乙酸、0.1mg/L吲哚丁酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的MS生根培养基中，在温度为26℃、光照强度为2000Lux、光照时间为16h/d的条件下继代3次，获得完整的带根苗，进行染色体倍性鉴定，将鉴定合格的苗切成带腋芽的茎段，备用，该步骤可使幼芽的叶片变厚、反卷，叶脉变深，叶表皮毛变粗、变长，然后切割发生形态变异的幼芽苗，其中有68％的芽符合形态学鉴定，得到的茎段有利于多倍体苗的遗传稳定性、具有良好的再生能力；

4）纯化培养：将带腋芽的茎段接种于含0.08mg/L萘乙酸、0.1mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L细胞分裂素、22mg/L光甾醇、20g/L蔗糖、29mg/L氨基葡萄糖和5g/L琼脂的MS纯化培养基中，在温度为26℃、光照强度为2000Lux、光照时间为16h/d的条件下纯化3代，得到多倍体苗，该步骤用培养基中光甾醇和氨基葡萄糖的特殊存在能够增大培养基中各有效成分间的增益作用，为茎段的生长和增殖提供充足的营养成分，保证细胞分裂的顺利进行，提高罗汉果多倍体苗的发育质量和稳定性，同时光甾醇和氨基葡萄糖更易于进入细胞内部而被茎段吸收利用，先为茎段提供充足的碳氮而进行光合作用，提高茎段的生长速度和增殖倍数，缩短纯化培养需要的时间，得到质量较高的多倍体苗；

5）扩大培养：将纯化培养得到的多倍体苗培养在含0.03mg/L萘乙酸、0.03mg/L吲哚丁酸、0.25mg/L细胞分裂素、30g/L蔗糖和5g/L琼脂的MS扩大液体培养基中，在温度为26℃、光照强度为2000Lux、光照时间为16h/d的条件下扩繁培养30d，得到多倍体罗汉果雌株，该步骤得到的多倍体罗汉果雌株具有生长速度快、光合能力强、抗病能力强、抗逆性强等优点，其炼苗与移栽成活率能达93%以上，所结果实为无籽罗汉果，罗汉果果形大，其中有效组分尤其是甜苷的含量高。

诱导培养用MS诱导培养基含有25g/L甘露醇、0.1mg/L吲哚丁酸、0.1mg/L细胞分裂素、0.1g/L秋水仙素。该MS诱导培养基在秋水仙素的含量低特别低的条件下也能特异性的与植物细胞中的微管蛋白结合，使纺锤丝合成受阻，导致复制后的染色体无法被拉向两级，干扰了正常的细胞分裂过程使染色体都留在同一细胞核中，形成染色体加倍的细胞，最终形成非嵌合体多倍体植株，大大降低秋水仙素的用量和秋水仙素对茎尖的毒害，提高丛芽数量的同时也能降低培育成本，此外该培养基对罗汉果茎尖组织的渗透性强，多倍体的诱导率高。

实施例2：

多倍体罗汉果植株的培育方法，包括诱导培养、转接培养、生根培养、纯化培养、扩大培养，其中具体步骤为：

1）诱导培养：选取取罗汉果雌株无菌试管苗茎尖，进行表皮细胞划伤处理，正面向上，平贴接种于含有22g/L甘露醇、0.08mg/L吲哚丁酸、0.07mg/L细胞分裂素、0.07g/L秋水仙素的MS诱导培养基中，在温度为25℃、光照强度为1800Lux、光照时间为14h/d的条件下诱导培养12d，获得罗汉果丛芽，然后将丛芽用无菌水洗3次，备用，上述甘露醇中含有7.1%的L-甘露醇；

2）转接培养：将诱导培养得到的丛芽转接到含0.08mg/L吲哚丁酸、0.08mg/L细胞分裂素和18g/L蔗糖的MS转接液体培养基中，在温度为24℃、光照强度为1800Lux、光照时间为14h/d的条件下转接培养28d，以产生苗形态变异，得到幼芽，其中有73%的芽符合形态学鉴定；

3）生根培养：将转接培养得到的幼芽放入含0.07mg/L萘乙酸、0.08mg/L吲哚丁酸、15g/L蔗糖和4.5g/L琼脂的MS生根培养基中，在温度为24℃、光照强度为1800Lux、光照时间为14h/d的条件下继代2次，获得完整的带根苗，进行染色体倍性鉴定，将鉴定合格的苗切成带腋芽的茎段，备用；

4）纯化培养：将带腋芽的茎段接种于含0.05mg/L萘乙酸、0.07mg/L吲哚丁酸、0.15mg/L细胞分裂素、20mg/L光甾醇、15g/L蔗糖、26mg/L氨基葡萄糖和4.5g/L琼脂的MS纯化培养基中，在温度为24℃、光照强度为1800Lux、光照时间为14h/d的条件下纯化2代，得到多倍体苗；

5）扩大培养：将纯化培养得到的多倍体苗培养在含0.025mg/L萘乙酸、0.025mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L细胞分裂素、25g/L蔗糖和4.5g/L琼脂的MS扩大液体培养基中，在温度为24℃、光照强度为1800Lux、光照时间为14h/d的条件下扩繁培养28d，得到多倍体罗汉果雌株。

实施例3：

多倍体罗汉果植株的培育方法，包括诱导培养、转接培养、生根培养、纯化培养、扩大培养，其中具体步骤为：

1）诱导培养：选取取罗汉果雌株无菌试管苗茎尖，进行表皮细胞划伤处理，正面向上，平贴接种于含有20g/L甘露醇、0.05mg/L吲哚丁酸、0.05mg/L细胞分裂素、0.05g/L秋水仙素的MS诱导培养基中，在温度为24℃、光照强度为1500Lux、光照时间为12h/d的条件下诱导培养8d，获得罗汉果丛芽，然后将丛芽用无菌水洗2次，备用，上述甘露醇中含有6.4%的L-甘露醇；

2）转接培养：将诱导培养得到的丛芽转接到含0.05mg/L吲哚丁酸、0.05mg/L细胞分裂素和15g/L蔗糖的MS转接液体培养基中，在温度为22℃、光照强度为1500Lux、光照时间为12h/d的条件下转接培养25d，以产生苗形态变异，得到幼芽，其中有70%的芽符合形态学鉴定；

3）生根培养：将转接培养得到的幼芽放入含0.05mg/L萘乙酸、0.05mg/L吲哚丁酸、10g/L蔗糖和4g/L琼脂的MS生根培养基中，在温度为22℃、光照强度为1500Lux、光照时间为12h/d的条件下继代2次，获得完整的带根苗，进行染色体倍性鉴定，将鉴定合格的苗切成带腋芽的茎段，备用；

4）纯化培养：将带腋芽的茎段接种于含0.03mg/L萘乙酸、0.05mg/L吲哚丁酸、0.1mg/L细胞分裂素、18mg/L光甾醇、10g/L蔗糖、23mg/L氨基葡萄糖和4g/L琼脂的MS纯化培养基中，在温度为22℃、光照强度为1500Lux、光照时间为12h/d的条件下纯化2代，得到多倍体苗；

5）扩大培养：将纯化培养得到的多倍体苗培养在含0.02mg/L萘乙酸、0.02mg/L吲哚丁酸、0.15mg/L细胞分裂素、20g/L蔗糖和4g/L琼脂的MS扩大液体培养基中，在温度为22℃、光照强度为1500Lux、光照时间为12h/d的条件下扩繁培养25d，得到多倍体罗汉果雌株。

对比例1：

诱导培养步骤中甘露醇中不含有L-甘露醇，其余部分和实施例2完全一致，其中有62%的芽符合形态学鉴定。说明甘露醇中L-甘露醇的存在能够提高诱导成功率。

对比例2：

纯化培养步骤用培养基中不含光甾醇、氨基葡萄糖，其余部分和实施例2完全一致。该纯化2-3代得到多倍体苗的时间要大于实施例2，且得到的多倍体苗的成活率远低于实施例2，这说明光甾醇和氨基葡萄糖的特殊存在能够缩短纯化培养需要的时间，得到质量较高的多倍体苗。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.多倍体罗汉果植株的培育方法，包括诱导培养、转接培养、生根培养、纯化培养、扩大培养，其特征在于：所述诱导培养用培养基中含有甘露醇，所述甘露醇中含有L-甘露醇。

2.根据权利要求1所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，其特征在于：所述甘露醇中含有6.4-7.8%的L-甘露醇。

3.根据权利要求1所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，其特征在于：所述诱导培养的具体步骤为：选取取罗汉果雌株无菌试管苗茎尖，进行表皮细胞划伤处理，正面向上，平贴接种于MS诱导培养基中，在温度为24-26℃、光照强度为1500-2000Lux、光照时间为12-16h/d的条件下诱导培养8-15d，获得罗汉果丛芽，然后将丛芽用无菌水洗2-4次，备用。

4.根据权利要求1所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，其特征在于：所述MS诱导培养基含有20-25g/L甘露醇、0.05-0.1mg/L吲哚丁酸、0.05-0.1mg/L细胞分裂素、0.05-0.1g/L秋水仙素。

5.根据权利要求1所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，其特征在于：所述转接培养步骤为：将诱导培养得到的丛芽转接到含0.05-0.1mg/L吲哚丁酸、0.05-0.1mg/L细胞分裂素和15-30g/L蔗糖的MS转接液体培养基中，在温度为22-26℃、光照强度为1500-2000Lux、光照时间为12-16h/d的条件下转接培养25-30d，以产生苗形态变异，得到幼芽。

6.根据权利要求1所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，其特征在于：所述生根培养步骤为：将转接培养得到的幼芽放入含0.05-0.1mg/L萘乙酸、0.05-0.1mg/L吲哚丁酸、10-20g/L蔗糖和4-5g/L琼脂的MS生根培养基中，在温度为22-26℃、光照强度为1500-2000Lux、光照时间为12-16h/d的条件下继代2-3次，获得完整的带根苗，进行染色体倍性鉴定，将鉴定合格的苗切成带腋芽的茎段，备用。

7.根据权利要求1所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，其特征在于：所述纯化培养步骤为：将带腋芽的茎段接种于含0.03-0.08mg/L萘乙酸、0.05-0.1mg/L吲哚丁酸、0.1-0.2mg/L细胞分裂素、18-22mg/L光甾醇、10-20g/L蔗糖、23-29mg/L氨基葡萄糖和4-5g/L琼脂的MS纯化培养基中，在温度为22-26℃、光照强度为1500-2000Lux、光照时间为12-16h/d的条件下纯化2-3代，得到多倍体苗。

8.根据权利要求1所述的多倍体罗汉果植株的培育方法，其特征在于：所述扩大培养步骤为：将纯化培养得到的多倍体苗培养在含0.02-0.03mg/L萘乙酸、0.02-0.03mg/L吲哚丁酸、0.15-0.25mg/L细胞分裂素、20-30g/L蔗糖和4-5g/L琼脂的MS扩大液体培养基中，在温度为22-26℃、光照强度为1500-2000Lux、光照时间为12-16h/d的条件下扩繁培养25-30d，得到多倍体罗汉果雌株。