CN108077069B - 一种柠檬的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种柠檬的组培快繁方法，包括：(1)启动培养：切取柠檬枝条带芽茎段作为外植体，灭菌处理后接种到启动培养基中，培养4—5周，直至所述外植体上萌发出腋芽并生长至一定长度；(2)增殖培养：切取步骤(1)所述腋芽，接种到增殖培养基中，培养4—6周，直至所述腋芽基部形成丛生芽并生长至一定长度；(3)生根培养：将步骤(2)所述丛生芽切成单芽，将所述单芽接种到生根培养基中，培养4—5周，直至生根且根长至一定长度，即得柠檬组培苗。所述方法得到的幼苗培养时间短，与传统嫁接、扦插相比，能明显提高柠檬的增殖系数，提高成活率，同时保证了其遗传稳定性，便于后期统一的移栽和种植管理，实现柠檬的快速繁殖。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培快繁方法，具体涉及一种柠檬的组培快繁方法。
背景技术
柠檬，芸香科柑橘属植物，柠檬又称柠果、洋柠檬、益母果等。枝少刺或近于无刺，嫩叶及花芽暗紫红色，叶片厚纸质，卵形或椭圆形。单花腋生或少花簇生。果椭圆形或卵形，果皮厚，通常粗糙，果汁酸至甚酸，种子小，卵形，端尖；种皮平滑，子叶乳白色，通常单或兼有多胚。花期4—5月，果期9—11月。柠檬是重要的天然香料、食品和工业原料，在食品、医药、化妆品、日用化工等行业均有应用。现有的柠檬栽培方式一般是扦插或嫁接，其繁殖系数较低，生长较慢，成活率较低，此外，也不利于其遗传稳定性的保持。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种柠檬的组培快繁方法，所述方法得到的幼苗培养时间短，与传统嫁接、扦插相比，能明显提高柠檬的增殖系数，提高成活率，同时保证了其遗传稳定性，便于后期统一的移栽和种植管理，实现柠檬的快速繁殖。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种柠檬的组培快繁方法，所述组培快繁方法包括以下步骤：
(1)启动培养：切取柠檬枝条带芽茎段作为外植体，灭菌处理后接种到启动培养基中，培养4—5周，直至所述外植体上萌发出腋芽并生长至一定长度；
(2)增殖培养：切取步骤(1)所述腋芽，接种到增殖培养基中，培养4—6周，直至所述腋芽基部形成丛生芽并生长至一定长度；
(3)生根培养：将步骤(2)所述丛生芽切成单芽，将所述单芽接种到生根培养基中，培养4—5周，直至生根且根长至一定长度，即得柠檬组培苗。
其中升汞处理的处理的时间根据外植体的幼嫩程度确定。
其中，步骤(1)腋芽生长至1—4cm；步骤(2)丛生芽生长至2—5cm；步骤(3)根长至2—5cm。
优选的，步骤(1)所述外植体的灭菌处理为：将所述外植体用消毒液与吐温20的组合物清洗并冲洗干净后，在超净工作台上，先用75％酒精处理20—40s，无菌水清洗3—4次，再用0.1％的升汞处理8—12min，无菌水冲洗5—6次，晾干即可。
优选的，步骤(1)所述启动培养基的组成包括：MS基本培养基，补充5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖。
更为优选的，步骤(1)所述启动培养基的组成还包括：补充0.5—2.0mg/L 6-BA、0.1—1.0mg/L KT、0.1—1.0mg/L NAA。
更为优选的，补充1.0mg/L 6-BA、0.2mg/L KT、0.2mg/L NAA。
优选的，步骤(2)所述增殖培养基的组成包括：MS基本培养基，补充0.5—2.0mg/LKT、5.5g/L琼脂、30g/L蔗糖。
更为优选的，步骤(2)所述增殖培养基的组成包括：MS基本培养基，补充1.0mg/LKT、5.5g/L琼脂、30g/L蔗糖。
更为优选的，步骤(2)所述增殖培养基的组成还包括补充0.1—0.5mg/L NAA。
更为优选的，步骤(2)所述增殖培养基的组成还包括补充0.2mg/L NAA。
优选的，步骤(3)所述生根培养基的组成包括：1/2MS基本培养基，补充0.2—1.0mg/L NAA、5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖。
更为优选的，步骤(3)所述生根培养基的组成包括：1/2MS基本培养基，补充0.5mg/L NAA、5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖。
更为优选的，步骤(3)所述生根培养基的组成还包括补充0.1—0.5mg/L IBA。
更为优选的，步骤(3)所述生根培养基的组成还包括补充0.2mg/L IBA。
优选的，所述启动培养、增殖培养、生根培养的条件均为：温度23—27℃，光照强度1800—2200Lx，光周期14/10h。
更为优选的，所述启动培养、增殖培养、生根培养的条件均为：温度25℃，光照强度2000Lx，光周期14/10h。
本申请所述的MS基本培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
所述的1/2MS基本培养基为MS基本培养基中，大量元素减半，其余不变形成的培养基。
所述的6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，是一种植物生长调节剂，其主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生，促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进生物体内物质的积累，促进侧芽发生，防止老化，是植物组织和细胞培养常用中的细胞分裂素。
所述的KT为氯吡脲，是一种具有细胞分裂素活性的苯脲类植物生长调节剂，其生物活性较6-苄氨基嘌呤高10—100倍。它能够影响植物芽的发育、加速细胞有丝分裂、促进细胞增大和分化，防止果实和花的脱落。
所述的NAA为萘乙酸，是一种植物生长素类似物，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组织培养，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
所述的IBA为吲哚丁酸，是一种植物生长素类似物，主要用于插条生根，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成。
本申请技术方案采用柠檬枝条的带芽茎段作为外植体，通过启动培养得到腋芽，再将腋芽进行增殖培养，使腋芽基部形成丛生芽，再将丛生芽切成单芽，将单芽用于生根培养，得到柠檬组培苗，通过以上方法实现柠檬的组培快繁。通过对启动培养基、增殖培养基、生根培养基的筛选，得到最佳的培养基组分和配比，利用KT、6-BA、NAA促进侧芽发生及生长发育的能力，设置适当的KT、6-BA与NAA的配比，诱导腋芽萌发；再根据细胞分裂素类似物(6-BA)能促进细胞分裂、分化，NAA可促进细胞生长，设置适当的6-BA、NAA配比，诱导腋芽增殖；最后利用IBA、NAA可诱导根原体的形成的能力从而诱导丛生芽苗生根，形成完整植株。
采用前述附加植物生长调节剂的培养基，得到的幼苗培养时间短，能够促进生长，与传统嫁接、扦插相比，能明显提高柠檬的增殖系数，提高成活率，同时保证了其遗传稳定性，便于后期统一的移栽和种植管理，实现柠檬的快速繁殖。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例所述的一种柠檬的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)启动培养：切取柠檬枝条带芽茎段作为外植体，用消毒液与吐温20的组合物清洗并冲洗干净后，在超净工作台上，先用75％酒精处理30s，无菌水清洗3次，再用0.1％的升汞处理10min，无菌水冲洗5次，晾干后，接种到启动培养基中，培养至所述外植体上萌发出腋芽并生长至一定长度，所述启动培养基的组成包括：MS基本培养基，补充1.0mg/L 6-BA、0.2mg/L KT、0.2mg/L NAA、5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖；
(2)增殖培养：切取步骤(1)所述腋芽，接种到增殖培养基中，培养至所述腋芽基部形成丛生芽并生长一定长度，所述增殖培养基的组成包括：MS基本培养基，补充1.0mg/LKT、0.2mg/L NAA、5.5g/L琼脂、30g/L蔗糖；
(3)生根培养：将步骤(2)所述丛生芽切成单芽，将所述单芽接种到生根培养基中，培养至生根且根长至一定长度，即得柠檬组培苗，所述生根培养基的组成包括：1/2MS基本培养基，补充0.5mg/L NAA、0.2mg/L IBA、5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖。
其中，启动培养、增殖培养、生根培养的条件均为：温度25℃，光照强度2000Lx，光周期14/10h。
在本实施例中，步骤(1)启动培养2周后，外植体上萌发出腋芽，4周后，腋芽生长至3—4cm；步骤(2)增殖培养2周后，腋芽基部形成丛生芽，4周后，丛生芽长到3—5cm，增殖系数为3.5；步骤(3)生根培养18天后，开始萌生根，4周后，生根完成，每株平均根数在4—5根，根长在3—5cm。
实施例2
本实施例所述的一种柠檬的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(1)启动培养基的组成包括：MS基本培养基，补充0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L KT、0.1mg/L NAA、5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖；
步骤(2)增殖培养基的组成包括：MS基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.1mg/L NAA、5.5g/L琼脂、30g/L蔗糖；
步骤(3)生根培养基的组成包括：1/2MS基本培养基，补充0.2mg/L NAA、0.1mg/LIBA、5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖。
在本实施例中，步骤(1)启动培养17天后，外植体上萌发出腋芽，30天后，腋芽生长至2—3cm；步骤(2)增殖培养3周后，腋芽基部形成丛生芽，5周后，丛生芽长到2—4cm，增殖系数为2.8；步骤(3)生根培养3周后，开始萌生根，30天后，生根完成，每株平均根数在3—4根，根长在2—3cm。
实施例3
本实施例所述的一种柠檬的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(1)启动培养基的组成包括：MS基本培养基，补充2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L KT、1.0mg/L NAA、5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖；
步骤(2)增殖培养基的组成包括：MS基本培养基，补充2.0mg/L KT、0.5mg/L NAA、5.5g/L琼脂、30g/L蔗糖；
步骤(3)生根培养基的组成包括：1/2MS基本培养基，补充1.0mg/L NAA、0.5mg/LIBA、5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖。
在本实施例中，步骤(1)启动培养24天后，外植体上萌发出腋芽，5周后，腋芽生长至1—3cm；步骤(2)增殖培养3周后，腋芽基部形成丛生芽，5周后，丛生芽长到2—3cm，增殖系数为2.7；步骤(3)生根培养3周后，开始萌生根，5周后，生根完成，每株平均根数在3—5根，根长在2—3cm。
实施例4
启动培养基中植物生长调节剂成分和浓度对外植体培养的影响
切取柠檬枝条带芽茎段若干作为外植体，用消毒液与吐温20的组合物清洗并冲洗干净后，在超净工作台上，先用75％酒精处理30s，无菌水清洗3次，再用0.1％的升汞处理10min，无菌水冲洗5次，晾干后，接种到启动培养基中，培养至所述外植体上萌发出腋芽并生长至2—3cm，所述启动培养基的组成包括：MS基本培养基，补充5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖、植物生长调节剂，并根据植物生长调节剂的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中外植体的培养情况，具体分组及培养结果见表1。
表1启动培养基中植物生长调节剂成分和浓度对芽萌发的影响
从上表可以看出，6-BA、KT、NAA两两组合使用或三者同时使用，其萌发率要比任一单用时好得多，开始萌发时间更短，其中三者同时使用，且6-BA为1.0mg/L，KT为0.2mg/L，NAA为0.2mg/L时，萌发率最高，开始萌发时间最短，为启动培养基的最适合的植物生长调节剂组成条件。
实施例5
增殖培养基中植物生长调节剂成分和浓度对腋芽培养的影响
切取经过启动培养得到的腋芽若干，接种到增殖培养基中，培养至所述腋芽基部形成丛生芽并生长至2—4cm，所述增殖培养基的组成包括：MS基本培养基，蔗糖、琼脂，补充植物生长调节剂，在MS基本培养基、蔗糖、琼脂均相同的条件下，根据植物生长调节剂的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中腋芽的培养情况，具体分组及培养结果见表2。
表2KT、NAA对柠檬腋芽增殖的影响
| 分组 | KT(mg/L) | NAA(mg/L) | 增殖周期/天 | 增殖系数 |
| 1 | 0.5 | -- | 42 | 1.8 |
| 2 | 1.0 | -- | 35 | 2.1 |
| 3 | 2.0 | -- | 42 | 1.6 |
| 4 | 0.5 | 0.2 | 28 | 2.8 |
| 5 | 1.0 | 0.2 | 28 | 3.5 |
| 6 | 2.0 | 0.2 | 35 | 2.4 |
| 7 | 0.5 | 0.5 | 42 | 2.5 |
| 8 | 1.0 | 0.5 | 35 | 3.1 |
| 9 | 2.0 | 0.5 | 35 | 2.7 |
从上表可以看出，KT和NAA同时使用比二者任一单用时的增殖系数要高，两者同时使用，KT为1.0mg/L，NAA为0.2mg/L时，增殖系数最高，为增殖培养基的最适合的植物生长调节剂组成条件。
实施例6
生根培养基中植物生长调节剂成分和浓度对单芽生根培养的影响
将增殖培养得到的丛生芽切成若干单芽，将所述单芽接种到生根培养基中，培养至生根且根长至2—3cm，即得柠檬组培苗，所述生根培养基的组成包括：1/2MS基本培养基，补充生长素类似物、蔗糖、琼脂，在1/2MS基本培养基、蔗糖、琼脂均相同的条件下，根据生长素类似物的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中单芽的培养情况，具体分组及培养结果见表3。
表3NAA、IBA浓度对单芽生根培养的影响结果
| 分组 | NAA(mg/L) | IBA(mg/L) | 开始生根时间/天 | 生根率 |
| 1 | 0.2 | -- | 24 | 21.3％ |
| 2 | 0.5 | -- | 21 | 36.7％ |
| 3 | 1.0 | -- | 24 | 36.7％ |
| 4 | 0.2 | 0.2 | 21 | 68.3％ |
| 5 | 0.5 | 0.2 | 18 | 86.7％ |
| 6 | 1.0 | 0.2 | 18 | 80 |
| 7 | 0.2 | 0.5 | 18 | 76.7％ |
| 8 | 0.5 | 0.5 | 21 | 71.7％ |
| 9 | 1.0 | 0.5 | 21 | 60％ |
从上表可以看出，NAA和IBA同时使用比二者任一单用时的生根率要高得多，两者同时使用，NAA为0.5mg/L，IBA为0.2mg/L时，生根率最高，为生根培养基的最适合的植物生长调节剂组成条件。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种柠檬的组培快繁方法，其特征在于：所述组培快繁方法包括以下步骤：
（1）启动培养：切取柠檬枝条带芽茎段作为外植体，灭菌处理后接种到启动培养基中，培养4—5周，直至所述外植体上萌发出腋芽并生长至一定长度；
（2）增殖培养：切取步骤（1）所述腋芽，接种到增殖培养基中，培养4—6周，直至所述腋芽基部形成丛生芽并生长至一定长度；
（3）生根培养：将步骤（2）所述丛生芽切成单芽，将所述单芽接种到生根培养基中，培养4—5周，直至生根且根长至一定长度，即得柠檬组培苗；
其中，步骤（1）腋芽生长至1—4cm，步骤（2）丛生芽生长至2—5cm，步骤（3）根长至2—5cm；
步骤（1）所述启动培养基的组成为：MS基本培养基，补充5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖、1.0mg/L 6-BA、0.2 mg/L KT、0.2mg/L NAA；
步骤（2）所述增殖培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.0mg/L KT、0.2mg/L NAA、5.5g/L琼脂、30g/L蔗糖；
步骤（3）所述生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.5mg/L NAA、5.5g/L琼脂、25g/L蔗糖、0.2 mg/L IBA。
2.根据权利要求1所述的一种柠檬的组培快繁方法，其特征在于：步骤（1）所述外植体的灭菌处理为：将所述外植体用消毒液与吐温20的组合物清洗并冲洗干净后，在超净工作台上，先用75%酒精处理20—40s，无菌水清洗3—4次，再用0.1%的升汞处理8—12min，无菌水冲洗5—6次，晾干即可。
3.根据权利要求1所述的一种柠檬的组培快繁方法，其特征在于：所述启动培养、增殖培养、生根培养的条件均为：温度23—27℃，光照强度1800—2200Lx，光周期14/10h。
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