CN105638461B - 一种野漆愈伤组织防褐化的方法 - Google Patents

一种野漆愈伤组织防褐化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种野漆愈伤组织防褐化的方法，所述方法包括以下步骤：(1)外植体选取及灭菌：切取野漆茎段或叶柄，清洗干净，灭菌处理后，得外植体；(2)愈伤组织诱导培养：将步骤(1)所得外植体接种到诱导培养基中培养2—5周，愈伤组织生成，所述诱导培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充KT、NAA、IBA、2,4‑D中的至少2种；(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)所得愈伤组织，接种到增殖培养基中培养4—5周，所述增殖培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充TDZ、6‑BA、IAA中的至少1种，所述方法能够保证诱导或增殖过程中，愈伤组织不褐化死亡，始终为绿色，为不定芽的诱导以及次生代谢物质的产生提供基础。

Description

一种野漆愈伤组织防褐化的方法
技术领域
本发明涉及生物组培育苗技术领域，具体涉及一种野漆愈伤组织防褐化的方法。
背景技术
野漆是优良的木本油料树种，其根、叶及果入药，有清热解毒、散瘀生肌、止血、杀虫之效，治跌打骨折、湿疹疮毒、毒蛇咬伤，又可治尿血、血崩、白带、外伤出血、子宫下垂等症；种子油可制皂或掺合干性油作油漆；中果皮之漆蜡可制蜡烛、膏药、发蜡等；树皮可提栲胶；树干乳液可代生漆用；其木材坚硬致密，可作细工用材，具有较高的药用、工业以及园林价值。
目前主要通过播种、嫁接、组培技术繁殖，其中在采用组培技术进行繁殖时，采用野漆叶柄和茎段进行愈伤组织诱导培养，因野漆中的单宁含量较高，外植体容易褐化死亡，造成培养失败，增加了繁殖成本，因此，野漆组培中的防褐化成为亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种野漆愈伤组织防褐化的方法，所述方法能够保证诱导或增殖过程中，愈伤组织不褐化死亡，始终为绿色，为不定芽的诱导以及次生代谢物质的产生提供基础，其配方简单，培养基成本低，培养流程简便，具有很好的应用前景。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种野漆愈伤组织防褐化的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)外植体选取及灭菌：切取野漆茎段或叶柄，清洗干净，灭菌处理后，得外植体；
(2)愈伤组织诱导培养：将步骤(1)所得外植体接种到诱导培养基中培养2—5周，愈伤组织生成，所述诱导培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充KT、NAA、IBA、2,4-D中的至少2种；
(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)所得愈伤组织，接种到增殖培养基中培养4—5周，所述增殖培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充TDZ、6-BA、IAA中的至少1种。
优选的，所述诱导培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充0.1—0.8mg/L KT、0.1—0.8mg/L NAA、0.02—0.15mg/L IBA、0.1—0.8mg/L 2,4-D。
更为优选的，所述诱导培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充0.3—0.6mg/LKT、0.3—0.6mg/L NAA、0.05—0.12mg/L IBA、0.4—0.6mg/L 2,4-D。
更为优选的，所述诱导培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.5mg/L NAA、0.1mg/L IBA、0.5mg/L 2,4-D。
优选的，所述增殖培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充0.1—0.8mg/L TDZ、0.1—0.8mg/L 6-BA、0.1—0.6mg/L IAA。
更为优选的，所述增殖培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充0.3—0.6mg/LTDZ、0.4—0.7mg/L 6-BA、0.2—0.4mg/L IAA。
更为优选的，所述增殖培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.5mg/L 6-BA、0.3mg/L IAA。
优选的，所述诱导培养基与所述增殖培养基中还补充1—10g/L蔗糖、8—20g/L葡萄糖。
更为优选的，所述诱导培养基与所述增殖培养基中还补充3—6g/L蔗糖、12—18g/L葡萄糖。
更为优选的，所述诱导培养基与所述增殖培养基中还补充5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖，还补充5.5g/L琼脂。
本申请所述WPM基本培养基为木本植物培养基，适用于多种木本植物的组培快繁。
所述KT为氯吡脲，是一种具有细胞分裂素活性的苯脲类植物生长调节剂，其生物活性较6-苄氨基嘌呤高10—100倍。它能够影响植物芽的发育、加速细胞有丝分裂、促进细胞增大和分化，防止果实和花的脱落，也能作为植物组织培养的细胞分裂素。
所述NAA为萘乙酸，是一种植物生长激素，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组织培养，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
所述IBA为吲哚丁酸，是一种植物生长激素，主要用于插条生根，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成。
所述2，4-D是用于诱导愈伤组织形成的生长素类似物的一种，可作为植物生长调节激素，用于组织培养。
所述TDZ是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等，可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，可用作植物组织培养。
所述6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，是一种植物生长激素，其主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生，促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进生物体内物质的积累，促进侧芽发生，防止老化，是植物组织和细胞培养中的细胞分裂素。
所述IAA为吲哚乙酸，是一种植物生长激素，能够调节植物的生长，不仅能促进生长，而且具有抑制生长和器官建成的作用。在细胞水平上，可刺激形成层细胞分裂、刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长、促进木质部、韧皮部细胞分化、促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成，因此可用作植物组织培养。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：本申请技术方案提供了一种野漆愈伤组织防褐化的方法，包括外植体的选取及灭菌、愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养的步骤，通过对诱导培养基、增殖培养基的筛选，通过控制诱导培养基和增殖培养基中不同的植物生长激素的种类及其糖的种类，通过上述组分的配比筛选，得到最佳的培养基组分和配比，采用前述植物生长激素和糖类配比形成的培养基，能够保证诱导或增殖过程中，愈伤组织不褐化死亡，始终为绿色，为不定芽的诱导以及次生代谢物质的产生提供基础。其培养基配方简单，培养基成本低，培养流程简便，具有很好的应用前景。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取及灭菌：切取野漆茎段或叶柄，清洗干净，灭菌处理后，得外植体；
(2)愈伤组织诱导培养：将步骤(1)所得外植体接种到诱导培养基中培养2—5周，愈伤组织生成，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.5mg/L NAA、0.1mg/L IBA、0.5mg/L 2,4-D、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂；
(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)所得愈伤组织，接种到增殖培养基中培养4—5周，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/LTDZ、0.5mg/L 6-BA、0.3mg/L IAA、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例2
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.1mg/L KT、0.1mg/LNAA、0.02mg/L IBA、0.1mg/L 2,4-D、1g/L蔗糖、8g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例3
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.8mg/L KT、0.8mg/LNAA、0.15mg/L IBA、0.8mg/L 2,4-D、10g/L蔗糖、20g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例4
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.3mg/L KT、0.3mg/LNAA、0.05mg/L IBA、0.4mg/L 2,4-D、3g/L蔗糖、12g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例5
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.6mg/L KT、0.6mg/LNAA、0.12mg/L IBA、0.6mg/L 2,4-D、6g/L蔗糖、18g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例6
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(3)中，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.1mg/L TDZ、0.1mg/L 6-BA、0.1mg/L IAA、1g/L蔗糖、8g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例7
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(3)中，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.8mg/L TDZ、0.8mg/L 6-BA、0.6mg/L IAA、10g/L蔗糖、20g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例8
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(3)中，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.3mg/L TDZ、0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L IAA、3g/L蔗糖、12g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例9
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(3)中，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.6mg/L TDZ、0.7mg/L 6-BA、0.4mg/L IAA、6g/L蔗糖、18g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例10
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.5mg/LNAA、0.1mg/L IBA、0.5mg/L 2,4-D、5g/L蔗糖、5.5g/L琼脂；
步骤(3)中，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.5mg/L 6-BA、0.3mg/L IAA、5g/L蔗糖、5.5g/L琼脂。
实施例11
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.5mg/LNAA、0.1mg/L IBA、0.5mg/L 2,4-D、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂；
步骤(3)中，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.5mg/L 6-BA、0.3mg/L IAA、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例12
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.5mg/LNAA、0.1mg/L IBA、0.5mg/L 2,4-D、5.5g/L琼脂；
步骤(3)中，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.5mg/L 6-BA、0.3mg/L IAA、5.5g/L琼脂。
实施例13
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(3)中，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.5mg/L 6-BA、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例14
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(3)中，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.3mg/L IAA、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例15
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(3)中，所述增殖培养基的组成为：所述增殖培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L 6-BA、0.3mg/L IAA、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例16
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L NAA、0.1mg/L IBA、0.5mg/L 2,4-D、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例17
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.1mg/LIBA、0.5mg/L 2,4-D、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例18
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.5mg/LNAA、0.5mg/L 2,4-D、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例19
本实施例所述的一种野漆愈伤组织防褐化的方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：WPM基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.5mg/LNAA、0.1mg/L IBA、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
实施例20
观察实施例1—19中的愈伤组织样本外观褐化程度，同时测定统计每个实施例中愈伤组织诱导时间、增殖率，结果见表1。
表1实施例1—19中的愈伤组织样本褐化程度及诱导增殖结果
样本 褐化程度 诱导时间(天) 增殖时间(天) 增殖率(％)
实施例1 - 15 15 100
实施例2 ++ 15 15 85
实施例3 ++ 15 15 90
实施例4 + 15 15 92
实施例5 + 15 15 95
实施例6 ++ 15 15 80
实施例7 ++ 15 15 80
实施例8 + 15 15 85
实施例9 + 15 15 85
实施例10 ++ 20 15 55
实施例11 ++ 20 15 60
实施例12 +++ 20 25 30
实施例13 ++ 15 25 55
实施例14 ++ 15 25 55
实施例15 ++ 15 25 50
实施例16 ++ 20 20 55
实施例17 ++ 20 20 70
实施例18 ++ 20 20 70
实施例19 +++ 20 25 30
注：未褐化：-；褐化轻：+；褐化一般：++；褐化严重：+++。
从上表中可以看出实施例1—19的愈伤组织在培养过程中的褐化程度结果，实施例1—9中，实施例1的技术方案得到的愈伤组织未发生褐化，同时其诱导时间最短，增殖率最高，为本申请的最优选技术方案。同时，从实施例10—12可以看出，在培养基中不加入葡萄糖或蔗糖时，褐化程度严重，当单独加入葡萄糖和蔗糖时，褐化程度较高，而加入了葡萄糖和蔗糖两种之后，褐化程度降低。而从实施例13—15以及实施例16—19可以看出，诱导培养基中补充KT、NAA、IBA、2,4-D四种植物生长激素，以及增殖培养基中补充TDZ、6-BA、IAA三种植物生长激素，其褐化程度更低，为本申请的优选方案。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种野漆愈伤组织防褐化的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)外植体选取及灭菌：切取野漆茎段或叶柄，清洗干净，灭菌处理后，得外植体；
(2)愈伤组织诱导培养：将步骤(1)所得外植体接种到诱导培养基中培养2—5周，愈伤组织生成，所述诱导培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.5mg/L NAA、0.1mg/L IBA、0.5mg/L 2,4-D、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂；
(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)所得愈伤组织，接种到增殖培养基中培养4—5周，所述增殖培养基的组成包括：WPM基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.5mg/L 6-BA、0.3mg/LIAA、5g/L蔗糖、15g/L葡萄糖、5.5g/L琼脂。
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Address after: Six agency 635600 Dong Yu Zhen Huai Shu Cun, Bazhong city of Sichuan province Nanjiang County

Applicant after: SICHUAN QICAI FORESTRY INDUSTRY DEVELOPMENT CO., LTD.

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Applicant before: Sichuan this industry of grass tree agriculture and forestry science and technology Co., Ltd

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Patentee after: Sichuan Qicai Forestry Co., Ltd.

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Patentee before: SICHUAN QICAI FORESTRY INDUSTRY DEVELOPMENT CO., LTD.

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Patentee after: Sichuan Qicai Forestry Co., Ltd.

Address before: 635600 Six Societies of Huaishu Village, Dongyu Town, Nanjiang County, Bazhong City, Sichuan Province

Patentee before: Sichuan Qicai Forestry Co., Ltd.