CN108450334A

CN108450334A - 一种阳光狭冠冬青组织培养方法

Info

Publication number: CN108450334A
Application number: CN201810407698.7A
Authority: CN
Inventors: 杨良斌; 田冬梅
Original assignee: Sichuan Qicai Forestry Industry Development Co Ltd
Current assignee: Sichuan Qicai Forestry Industry Development Co Ltd
Priority date: 2018-05-02
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2038-05-02
Also published as: CN108450334B

Abstract

本发明公开了一种阳光狭冠冬青组织培养方法，包括以下步骤：预处理：取阳光狭冠冬青顶芽或腋芽茎段，进行消毒灭菌处理，得到消毒灭菌后的外植体；初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于初代培养基中进行初代培养，得到腋芽；增殖培养：取所述腋芽接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到增殖苗；生根培养：取所述增殖苗的单株接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗；所述组织培养方法炼苗成活率高，繁殖系数高，组织培养流程简便，繁殖时间短，不受季节限制，满足市场对阳光狭冠冬青的需求。

Description

一种阳光狭冠冬青组织培养方法

技术领域

本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及一种阳光狭冠冬青组织培养方法。

背景技术

阳光狭冠冬青是冬青科冬青属的常绿灌木，一年叶色有三次变化，新叶金黄色逐渐变为深绿色,冬季暗红色，颇为美观，为优良的色块和绿篱植物。阳光狭冠冬青常规培养方法包括：半硬枝扦插法和嫁接繁殖方法，半硬枝扦插法和嫁接繁殖方法存在，繁殖系数小，速度慢,不能满足市场对阳光狭冠冬青的需求问题。

发明内容

鉴于此，本申请提供了一种阳光狭冠冬青组织培养方法，所述组织培养方法炼苗成活率高，繁殖系数高，组织培养流程简便，繁殖时间短，不受季节限制，满足市场对阳光狭冠冬青的需求。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种阳光狭冠冬青组织培养方法，包括以下步骤：

预处理：取阳光狭冠冬青顶芽或腋芽茎段，进行消毒灭菌处理，得到消毒灭菌后的外植体；

初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于初代培养基中进行初代培养，得到腋芽；所述初代培养基包括：NN69基本培养基，补充0.5～2mg/LCPPU，0.01～0.1mg/LTDZ；

增殖培养：取所述腋芽接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到增殖苗；所述增殖培养基包括：NN69基本培养基，补充1.0～2.0mg/LCPPU，0.01～0.1mg/LTDZ，0.1～0.2mg/L2，4-D；

生根培养：取所述增殖苗的单株接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗；所述生根培养基包括：1/2NN69基本培养基，补充0.1～0.4mg/LIAA，0.1～0.5mg/L2,4-D，0.1～0.3mg/L活性炭。

优选的，所述阳光狭冠冬青顶芽为一年生阳光狭冠冬青顶芽，所述阳光狭冠冬青腋芽茎段为一年生阳光狭冠冬青茎段。

优选的，所述进行消毒灭菌处理具体包括：75％酒精处理10s，无菌水清洗1～3次,再用10％次氯酸钠溶液处理8～12min，无菌水清洗4～5次，晾干。

优选的，所述初代培养基包括：NN69基本培养基，补充1.0mg/LCPPU，0.01mg/LTDZ。

优选的，所述增殖培养基包括：NN69基本培养基，补充1.0mg/LCPPU，0.01mg/LTDZ，0.1mg/L2，4-D。

优选的，所述生根培养基包括：1/2NN69基本培养基，补充0.2mg/LIAA，0.3mg/L2,4-D，0.2mg/L活性炭。

优选的，所述初代培养基还包括：30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述增殖培养基还包括：25～30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述生根培养基还包括：20g/L蔗糖，6.5g/L琼脂。

优选的，所述初代培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基pH值为5.8～6.2。

优选的，所述初代培养过程、增殖培养过程和生根培养过程培养条件为：培养温度为23～27℃，光照强度为2400～2600Lx，光照时间为14h/d。

优选的，所述组织培养方法还包括：炼苗移栽过程，所述炼苗移栽过程包括：将所述生根苗经闭瓶炼苗，开瓶炼苗后移至荫棚的苗床中培养；所述苗床的基质包括：泥炭和珍珠岩；所述泥炭和所述珍珠岩体积比为1:1。

优选的，所述炼苗移栽过程具体包括：将所述生根苗置于玻璃温室中闭瓶炼苗4～7天，玻璃温室中闭瓶炼苗条件为温度30℃以下，遮阴度70％；玻璃温室中开瓶炼苗培养2～4天，开瓶炼苗条件为温度25～28℃；开瓶炼苗后移至拱棚穴盘内，搭建拱棚培养10～20天，拱棚中培养温度25～28℃，湿度95％；后移至荫棚的苗床中培养。

本申请与现有技术相比，其详细说明如下：一种阳光狭冠冬青的组织培养方法，包括外植体的选取及灭菌、初代培养、增殖培养、生根培养的步骤，通过对诱导初代培养基、增殖培养基、生根培养基的筛选，得到最佳的培养基组分和配比，配比形成的培养基，配方简单，培养基成本低，配合各阶段的培养条件，得到的生根苗培养时间短，培养流程简便，提高了阳光狭冠冬青繁殖的效率，增殖系数较高为8；能快速获得遗传性状一致的阳光狭冠冬青组培生根苗，生根苗炼苗成活率高，为95％以上。利用组织培养技术，进行外植体培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响，可进行大规模的工业化育苗及深加工。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了本发明实施例1中初代培养过程生长情况；

图2示出了本发明实施例1中增殖培养过程生长情况；

图3示出了本发明实施例1中生根培养过程生长情况；

图4示出了本发明实施例1中闭瓶炼苗过程生长情况；

图5示出了本发明实施例1中开瓶炼苗过程生长情况；

图6示出了本发明实施例1中生根苗炼苗移栽培过程苗床中的生长情况。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

一种阳光狭冠冬青组织培养方法，包括以下步骤：

预处理：取一年生阳光狭冠冬青顶芽或腋芽茎段，在无菌的操作台上，先用75％酒精处理10s，无菌水清洗1～3次，再用10％次氯酸钠溶液处理8～12min，无菌水清洗4～5次，晾干，得到消毒灭菌后的外植体；

初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于初代培养基中进行初代培养，如图1，得到腋芽；所述初代培养基包括：NN69基本培养基，补充1.0mg/LCPPU，0.01mg/LTDZ，30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述初代培养基pH值为5.8～6.2；

增殖培养：取所述腋芽接种于增殖培养基中进行增殖培养，如图2，得到壮苗；所述增殖培养基包括：NN69基本培养基，补充1.0mg/LCPPU，0.01mg/LTDZ，0.1mg/L2，4-D，25～30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述增殖培养基pH值为5.8～6.2；

生根培养：取所述生根苗的单株接种于生根培养基中进行生根培养，如图3，得到生根苗；所述生根培养基包括：1/2NN69基本培养基，补充0.2mg/LIAA，0.3mg/L2,4-D，0.2mg/L活性炭，20g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述生根培养基pH值为5.8～6.2；

炼苗移栽：将所述生根苗置于玻璃温室中如图4闭瓶炼苗4～7天，玻璃温室中闭瓶炼苗条件为温度30℃以下，遮阴度70％；玻璃温室中开瓶炼苗培养2～4天，开瓶炼苗条件为温度25～28℃；开瓶炼苗后移至拱棚穴盘内，搭建拱棚，在拱棚中培养10～20天，拱棚中培养温度25～28℃，湿度95％；后移至荫棚的苗床中培养，生长情况如图5。

其中，所述初代培养过程、增殖培养过程和生根培养过程培养条件为：培养温度为23～27℃，光照强度为2400～2600Lx，光照时间为14h/d。

初代培养1周腋芽萌发；增殖培养1个月，增殖系数平均在5以上，将芽分离成单株，接种在增殖培养基上，一周有愈伤组织出现，增殖1个月，增殖系数在6以上；生根培养2周开始生根，1个月后生根率达98％以上，且平均生根系数为8，根长3cm以上；生根苗炼苗成活率高，为95％以上。

实施例2

一种阳光狭冠冬青组织培养方法，包括以下步骤：

预处理：取一年生阳光狭冠冬青顶芽或腋芽茎段，在无菌的操作台上，先用75％酒精处理10s，无菌水清洗1～3次,再用10％次氯酸钠溶液处理8～12min，无菌水清洗4～5次，晾干，得到消毒灭菌后的外植体；

初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于初代培养基中进行初代培养，得到腋芽；所述初代培养基包括：NN69基本培养基，补充0.5mg/LCPPU，0.05mg/LTDZ，30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述初代培养基pH值为5.8～6.2；

增殖培养：取所述腋芽接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到增殖苗；所述增殖培养基包括：NN69基本培养基，补充0.15mg/LCPPU，0.05mg/LTDZ，0.15mg/L2，4-D，25～30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述增殖培养基pH值为5.8～6.2；

生根培养：取所述增殖苗的单株接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗；所述生根培养基包括：1/2NN69基本培养基，补充0.1mg/LIAA，0.1mg/L2,4-D，0.1mg/L活性炭，20g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述生根培养基pH值为5.8～6.2；

炼苗移栽：将所述生根苗置于玻璃温室中闭瓶炼苗4～7天，玻璃温室中闭瓶炼苗条件为温度30℃以下，遮阴度70％；玻璃温室中开瓶炼苗培养10～20天，玻璃温室中开瓶炼苗条件为温度25～30℃，湿度95％；开瓶炼苗后移至拱棚穴盘内培养10～20天，拱棚中培养温度25～28℃，湿度95％；后移至荫棚的苗床中培养。

其中，所述初代培养过程、增殖培养过程和生根培养过程培养条件为：培养温度为23～27℃，光照强度为2400～2600Lx，光照时间为14h/d。生根苗炼苗成活率高，为95％以上。

实施例3

一种阳光狭冠冬青组织培养方法，包括以下步骤：

初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于初代培养基中进行初代培养，得到腋芽；所述初代培养基包括：NN69基本培养基，补充2.0mg/LCPPU，0.1mg/LTDZ，30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述初代培养基pH值为5.8～6.2；

增殖培养：取所述腋芽接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到增殖苗；所述增殖培养基包括：NN69基本培养基，补充2.0mg/LCPPU，0.1mg/LTDZ，0.2mg/L2，4-D，25～30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述增殖培养基pH值为5.8～6.2；

生根培养：取所述增殖苗的单株接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗；所述生根培养基包括：1/2NN69基本培养基，补充0.4mg/LIAA，0.5mg/L2,4-D，0.3mg/L活性炭，20g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述生根培养基pH值为5.8～6.2；

实施例4

初代培养基组分对阳光狭冠冬青组织培养腋芽生长的影响

初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于初代培养基中进行初代培养，得到腋芽；所述初代培养基包括：NN69基本培养基，补充CPPU，TDZ，30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述初代培养基pH值为5.8～6.2；

所述初代培养过程过程培养条件为：培养温度为23～27℃，光照强度为2400～2600Lx，光照时间为14h/d。

根据初代培养基中基本培养基，CPPU浓度，TDZ浓度进行分组，观察并记录初代培养过程的培养情况，具体分组及培养结果见表1。实验组1～6中，接种后7d，腋芽开始膨大；15d可见冒出的腋芽，25d腋芽伸长且有叶片展开，以单株生长为主，培养35d后嫩茎可达1.5-2.0cm，但有些茎段外植体腋芽虽然膨大，但不能继续伸长，最终干枯死亡。

表1

从上表可以看出，初代培养基包括：NN69基本培养基，补充0.5～2mg/LCPPU，0.01～0.1mg/LTDZ；CPPU浓度为1.0mg/L，TDZ浓度为0.1mg/L时，萌动率和成活率最高，为初代培养基的最适合的生长激素组成条件；CPPU，TDZ两种组分共同作用，保证了本发明初代培养过程的进行。

实施例5

增殖培养基组分对阳光狭冠冬青组织培养增殖苗生长的影响

初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于初代培养基中进行初代培养，得到腋芽；所述初代培养基包括：NN69基本培养基，补充1.0mg/LCPPU，0.01mg/LTDZ，30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述初代培养基pH值为5.8～6.2；

增殖培养：取所述腋芽接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到增殖苗；所述增殖培养基包括：NN69基本培养基，补充CPPU，TDZ，2，4-D，蔗糖，6.5g/L琼脂；所述增殖培养基pH值为5.8～6.2；

其中，所述初代培养过程、增殖培养过程培养条件为：培养温度为23～27℃，光照强度为2400～2600Lx，光照时间为14h/d。

根据增殖培养基中基本培养基，CPPU浓度，TDZ浓度和2，4-D浓度进行分组，观察并记录增殖培养过程的培养情况，具体分组及培养结果见表2。

表2

从上表可以看出，增殖培养基包括：补充1.0～2.0mg/LCPPU，0.01～0.1mg/LTDZ，0.1～0.2mg/L2，4-D；CPPU浓度为1.0mg/L，TDZ浓度为0.01mg/L，2，4-D浓度为0.1mg/L时，增殖系数最高，为增殖培养基的最适合的生长激素组成条件；CPPU，TDZ和2，4-D三种组分共同作用，保证了本发明增殖培养过程的进行。

实施例6

生根培养基组分对阳光狭冠冬青组织培养生根苗生长的影响

增殖培养：取所述腋芽接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到增殖苗；所述增殖培养基包括：NN69基本培养基，补充1.0mg/LCPPU，0.01mg/LTDZ，0.1mg/L2，4-D，25～30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述增殖培养基pH值为5.8～6.2；

生根培养：取所述增殖苗的单株接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗；所述生根培养基包括：1/2NN69基本培养基，补充IAA，2,4-D，活性炭，20g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述生根培养基pH值为5.8～6.2；

根据生根培养基中基本培养基，IAA，2，4-D浓度和活性炭浓度进行分组，观察并记录生根培养过程的培养情况，具体分组及培养结果见表3。

表3

从上表可以看出，生根培养基包括：1/2NN69基本培养基，补充0.1～0.4mg/LIAA，0.1～0.5mg/L2,4-D，0.1～0.3mg/L活性炭；IAA浓度为0.2mg/L，2,4-D浓度为0.3mg/L，活性炭浓度为0.2mg/L时，生根率最高，生根时间最短，生根数量最多，为生根培养基最适合的培养基组分组成条件；IAA，2,4-D和活性炭三种组分共同作用，保证了本发明生根培养过程的进行。

本发明中，培养基成分解释：

CPPU：所述CPPU为氯吡苯脲，作为植物生长调节剂可促进植物细胞分裂和增大。

TDZ：所述TDZ是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等，可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，可用作植物组织培养。

2,4-D：为2,4-二氯苯氧乙酸)，是一种生长素类似物。

IAA：所述IAA为吲哚乙酸，是一种植物生长激素，能够调节植物的生长，不仅能促进生长，而且具有抑制生长和器官建成的作用。在细胞水平上，可刺激形成层细胞分裂、刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长、促进木质部、韧皮部细胞分化、促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成，因此可用作植物组织培养。

NN69基本培养基为：Nitsch&Nitsch(1969)培养基。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种阳光狭冠冬青组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述进行消毒灭菌处理具体包括：75％酒精处理10s，无菌水清洗1～3次，再用10％次氯酸钠溶液处理8～12min，无菌水清洗4～5次，晾干。

3.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述初代培养基包括：NN69基本培养基，补充1.0mg/LCPPU，0.01mg/LTDZ。

4.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述增殖培养基包括：NN69基本培养基，补充1.0mg/LCPPU，0.01mg/LTDZ，0.1mg/L2，4-D。

5.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基包括：1/2NN69基本培养基，补充0.2mg/LIAA，0.3mg/L2,4-D，0.2mg/L活性炭。

6.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述初代培养基还包括：30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述增殖培养基还包括：25～30g/L蔗糖，6.5g/L琼脂；所述生根培养基还包括：20g/L蔗糖，6.5g/L琼脂。

7.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述初代培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基pH值为5.8～6.2。

8.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述初代培养过程、增殖培养过程和生根培养过程培养条件为：培养温度为23～27℃，光照强度为2400～2600Lx，光照时间为14h/d。

9.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述组织培养方法还包括：炼苗移栽过程，所述炼苗移栽过程包括：将所述生根苗经闭瓶炼苗，开瓶炼苗后移至荫棚的苗床中培养；所述苗床的基质包括：泥炭和珍珠岩；所述泥炭和所述珍珠岩体积比为1:1。

10.根据权利要求9所述的组织培养方法，其特征在于，所述炼苗移栽过程具体包括：将所述生根苗置于玻璃温室中闭瓶炼苗4～7天，玻璃温室中闭瓶炼苗条件为温度30℃以下，遮阴度70％；玻璃温室中开瓶炼苗培养2～4天，开瓶炼苗条件为温度25～28℃；开瓶炼苗后移至拱棚穴盘内，搭建拱棚培养10～20天，拱棚中培养温度25～28℃，湿度95％；后移至荫棚的苗床中培养。