CN106538388B - 一种组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法 - Google Patents

一种组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法，通过在组织培养条件下，添加不同浓度的聚乙二醇(PEG8000)至培养基中，模拟干旱环境，胁迫处理30天后根据旱害指数鉴定猕猴桃资源的耐旱性，涉及果树抗性资源的筛选和评价，主要步骤包括：猕猴桃资源的组织培养；组培苗的继代培养；组培苗的PEG模拟干旱处理；旱害指数的统计分析；耐旱性的鉴定。该方法简单易操作，因选用的材料为生长一致的组培苗，能够保证鉴定结果的准确性和可靠性，快速筛选耐旱猕猴桃种质资源，也可为其他果树资源的抗性鉴定提供借鉴。

Description

一种组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法
技术领域
本发明涉及农业技术领域中的果树种质资源的鉴定方法，特别提供了一种在组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法。
背景技术
我国是猕猴桃的原产地，也是世界猕猴桃资源的分布中心。猕猴桃是野生果树人工驯化栽培最成功的四大果树之一，富含维生素C和叶酸，风味独特，备受人们喜爱。我国的猕猴桃栽培面积和产量都居世界前列，但果实综合品质、单位产量和价格与新西兰、智利、意大利等发达国家相比，差距明显，原因之一是我国缺乏适应性强、高抗性的猕猴桃专用砧木。栽培过程中大多从美味猕猴桃(Actinidiadeliciosa)的不同株系或实生苗中选择砧木，由于砧木根系生长不完全一致、输导组织结构的差异及实生苗性状的分离和变异等因素，导致嫁接品种的果实综合品质(如果形均一性、单果重、口感等)参差不齐，价格偏低，缺乏市场竞争力，在国际竞争中处于劣势，价格偏低。
嫁接是果树栽培的主要繁殖方式，砧木对于嫁接品种至关重要，选择抗性强的砧木不但可以增强对逆境(如干旱、高温、涝渍等)的适应能力，还可以促进接穗的健康生长，并提高果实的综合品质，提升市场竞争力。因此，培育抗性强、适应性广的高效砧木对于我国猕猴桃的抗性育种及产业发展都具有重要意义。
猕猴桃属于肉质根系，大多分布在地下40厘米左右的深度，对干旱胁迫非常敏感。干旱胁迫不但会导致猕猴桃叶片萎蔫、脱落、茎杆干枯，严重时生长受抑制，甚至整株干枯。抗性资源的鉴定首先要明确抗性鉴定标准。20世纪90年代新西兰培育出了优良的猕猴桃砧木“凯迈”，也是世界上第一个登记注册的猕猴桃砧木品种，湖南省农科院园艺研究所于2000年引入并进行观察评比，发现“凯迈”比普通砧木具有更强的抗旱性。然而，我国目前在猕猴桃耐旱方面的研究较少，也没有制定统一的耐旱资源鉴定标准。因此，为了筛选耐旱猕猴桃资源，必须建立一套行之有效的资源鉴定方法，并以此为基础加快培育耐旱专用砧木，促进我国猕猴桃的抗性育种及产业发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法。
本发明提供了一种耐旱猕猴桃资源的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：
1)猕猴桃资源的组织培养；
2)组培苗的继代培养；和
3)组培苗的模拟干旱处理
在培养基中添加不同浓度的聚乙二醇(优选为PEG8000)制得PEG模拟干旱培养基，并将步骤2)获得猕猴桃组培苗，接入所述PEG模拟干旱培养基中，培养观察。
优选地，所述方法还包括步骤：
4)旱害指数的统计分析；和
5)耐旱性鉴定。
优选地，所述步骤3)中组培苗的模拟干旱处理方法为：
(1)PEG模拟干旱培养基的配制
配制1/2MS-PEG培养基，所述1/2MS-PEG培养基中大量元素、微量元素、有机质和铁盐都减半，加入30g/L的蔗糖，不加激素和琼脂，分别加入质量分数为0、10％、20％、30％和40％的PEG8000，配制出含有不同浓度PEG8000的1/2MS-PEG培养基；
配制固体增殖培养基，将液体1/2MS-PEG培养基加入到冷却后的固体增殖培养基中(优选地体积比为1:1，更优选地各为30mL)，平衡24-72h后，将固体增殖培养基表面的液体培养基倒掉，得到0、5％、10％、15％和20％的PEG模拟干旱培养基；
2)挑选具有3～4片小叶、高度约1.5～2cm的生长一致的各猕猴桃组培苗，接入不同浓度的PEG模拟干旱培养基中，进行组培苗的模拟干旱处理。
优选地，所述固体增殖培养基为MS培养基+1.0mg/L ZT(玉米素)，琼脂6-10g/L，pH5.8；或MS培养基+1.0mg/L ZT+0.5mg/L GA3(赤霉素)，琼脂6-10g/L，pH5.8。
优选地，所述步骤1)中猕猴桃资源的组织培养方法为：
挑选前一年休眠的猕猴桃枝条，根据芽点分布情况，切成约40cm长度，保证每个枝条切段上带有2～3个芽点，浸泡在水中，加入0.5％(v/v)的吐温-20，用毛刷将表面灰尘洗去，并用蒸馏水清洗3-5遍，放于大玻璃烧杯中，保持1/3水深；
芽点处长出新芽后，将新芽和茎段切下(长度约2～3cm)，浸泡在75％(v/v)酒精中30s，之后用25％(体积分数)市售消毒剂(5％(w/v)次氯酸钠)清洗消毒20min，无菌水冲洗5遍，并用灭菌的刀片将切口处切掉约2～3mm，将带芽茎段放于出芽培养基：MS+0.5mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)+1.0mg/L IBA(吲哚乙酸)，调整培养基pH值5.8；培养条件为：24±2℃，相对湿度40％，14小时光照，8小时黑暗。
优选地，所述步骤2)中，组培苗的继代培养方法为：
在出芽培养基中培养约3～4周后，茎段上新生出的腋芽长至2厘米时，切下腋芽转入增殖培养基：MS+1.0mg/L ZT(玉米素)(pH5.8)或MS+1.0mg/L ZT+0.5mg/L GA3(赤霉素)(pH5.8)，实现组培苗的增殖，大约1个月后将新长出的嫩芽转入新的增殖培养基中实现组培苗的继代培养，大约每隔1个月更换一次增殖培养基。
优选地，所述步骤3)中组培苗的聚乙二醇(PEG)模拟干旱处理方法为：
(1)PEG模拟干旱培养基的配制
先配制1/2MS-PEG培养基(大量元素、微量元素、有机质和铁盐都减半，加入30g/L的蔗糖，不加激素和琼脂)，分别加入质量分数为0、10％、20％、30％和40％的PEG8000；
再配制增殖培养基，两种培养基高温高压灭菌，之后用灭菌的量筒将液体1/2MS-PEG培养基加入到冷却后的固体增殖培养基中(一般二者各30mL)，平衡48h后，在超净台上将固体增殖培养基表面的液体培养基倒掉，得到0、5％、10％、15％和20％的PEG模拟干旱培养基；
2)挑选具有3～4片小叶、高度约1.5～2cm的生长一致的各猕猴桃组培苗，接入不同浓度的PEG干旱模拟培养基中，每个处理每份资源接苗10瓶，每瓶3颗，共计30颗小苗。
优选地，所述步骤4)中旱害指数的统计分析方法为：
干旱胁迫30天后，根据每个PEG浓度下组培苗所表现出来的受害症状进行统计分析，
旱害指数(DDI)的分级标准如下：
Ⅰ叶片和植株均生长正常，无旱害症状；
Ⅱ叶片有轻度发黄或发褐，主要表现在叶缘或叶尖部位；
Ⅲ叶片有干枯症状，叶片数量明显减少，植株矮化，生长受到抑制；
Ⅳ叶片或茎段干枯，伴有叶片脱落，植株矮化，几乎不生长。
依据下列公式计算各猕猴桃资源的旱害指数：DDI＝∑(x×n)/(4N)×100
x--各级旱害级数值
n--不同浓度下各旱害级株数的总和
N--调查的总植株数。
优选地，所述步骤5)中耐旱性鉴定的依据为DDI值：DDI值越大，表明旱害越严重，越不耐旱；值越小，表明旱害越轻，越耐旱；旱害指数25≤DDI＜45为耐旱资源；45≤DDI＜65为中度耐旱资源；65≤DDI＜85为旱敏感资源；85≤DDI≤100为旱极敏感资源。
附图说明
图1是旱害指数分级标准的示例图片。
具体实施方式
本发明针对果树抗性资源鉴定的技术难点，提供一种在组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法，本发明操作简便，节省时间和空间，鉴定结果可靠，利用本发明可以快速筛选和鉴定耐旱资源，为培育耐旱猕猴桃专用砧木提供抗性材料。所述耐旱性鉴定方法包括如下步骤：
1)猕猴桃资源的组织培养；
2)组培苗的继代培养；
3)组培苗的聚乙二醇(PEG8000)模拟干旱处理；
4)旱害指数(Drought Damage Index，DDI)的统计分析；
5)耐旱性鉴定。
优选地，步骤1)中猕猴桃资源的组织培养方法为：挑选前一年休眠的猕猴桃枝条，剪取适当长度带回组培准备室，根据芽点分布情况，切成约40cm长度，保证每个枝条切段上带有2～3个芽点，浸泡在水中，加入0.5％的吐温-20，用毛刷将表面灰尘洗去(注意不要伤及芽点)，并用蒸馏水清洗3-5遍，放于大玻璃烧杯中，保持1/3水深。待约6～8周后，芽点处会有新芽长出，将新芽和茎段切下(长度约2～3cm)，浸泡在75％酒精中30s，之后用25％(体积分数)市售消毒剂(5％次氯酸钠)清洗消毒20min，无菌水冲洗5遍，并用灭菌的刀片将切口处切掉约2～3mm，将带芽茎段放于出芽培养基：MS+0.5mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)+1.0mg/LIBA(吲哚乙酸)，调整培养基pH值5.8。培养条件为：24±2℃，相对湿度40％，14小时光照，8小时黑暗。
优选地，步骤2)中，猕猴桃组培苗的继代培养方法为：在出芽培养基中培养3～4周后，茎段上新生出的腋芽长至2厘米时，切下转入增殖培养基：MS+1.0mg/LZT(玉米素)(pH5.8)或MS+1.0mg/L ZT+0.5mg/L GA3(赤霉素)(pH5.8)，实现组培苗的增殖，大约1个月后将新长出的嫩芽转入新的增殖培养基中实现组培苗的继代培养，大约每隔1个月更换一次增殖培养基。
优选地，步骤3)中组培苗的聚乙二醇(PEG)模拟干旱处理方法为：
(1)PEG模拟干旱培养基的配制，先配制1/2MS-PEG培养基(大量元素、微量元素、有机质和铁盐都减半，加入30g/L的蔗糖，不加激素和琼脂)，分别加入质量分数为0、10％、20％、30％和40％的PEG8000；再配制增殖培养基(根据不同的猕猴桃资源加入相应的植物激素)，两种培养基高温高压灭菌，之后用灭菌的量筒将液体1/2MS-PEG培养基加入到冷却后的固体增殖培养基中(一般二者各30mL)，平衡48h后，在超净台上将固体增殖培养基表面的液体培养基倒掉，得到0、5％、10％、15％和20％的PEG模拟干旱培养基；
(2)挑选具有3～4片小叶、高度约1.5～2cm的生长基本一致的各猕猴桃组培苗，接入不同浓度的PEG干旱模拟培养基中，每个处理每份资源接苗10瓶，每瓶3颗，共计30颗小苗。评价一份猕猴桃资源的耐旱性至少需要150颗组培小苗。
优选地，步骤4)中旱害指数(Drought Damage Index，DDI)的统计分析方法为：干旱胁迫30天后，根据组培苗所表现出的受害症状进行统计分析，旱害指数(DDI)的分级标准如下：
Ⅰ叶片和植株均生长正常，无旱害症状；
Ⅱ叶片有轻度发黄或发褐，主要表现在叶缘或叶尖部位；
Ⅲ叶片有干枯症状，叶片数量明显减少，植株矮化，生长受到抑制；
Ⅳ叶片或茎段干枯，伴有叶片脱落，植株矮化，几乎不生长。
依据下列公式计算各猕猴桃资源的旱害指数：DDI＝∑(x×n)/(4N)×100
x--各级旱害级数值
n--不同浓度下各旱害级株数的总和
N--调查的总植株数
优选地，步骤5)中耐旱性鉴定依据为DDI值：值越大，表明旱害越严重，越不耐旱；值越小，表明旱害越轻，越耐旱。旱害指数25≤DDI＜45为耐旱资源；45≤DDI＜65为中度耐旱资源；65≤DDI＜85为旱敏感资源；85≤DDI≤100为旱极敏感资源。
本发明的主要优点在于鉴定耐旱猕猴桃资源时所用的材料为组培苗，可以保证鉴定材料生长的一致性，并制定了相应的旱害指数分级标准。猕猴桃是多年生雌雄异株、异花授粉果树，雌株授粉不均匀会导致种子质量的差异，实生后代又会出现性状的分离，枝条会因树龄及位置(近轴端或远轴端)的不同而出现生长情况的差异，因此，如果直接使用枝条或实生后代进行抗性鉴定，会导致鉴定结果的不稳定。组织培养不但可以保持猕猴桃资源的稳定性和一致性，还可以保持其优异性状。因此在组织培养条件下进行猕猴桃资源耐旱性鉴定，可以保证材料的均一性，结合不同浓度PEG8000进行模拟干旱处理，在处理30天后采集数据，并根据旱害指数对各资源的耐旱性进行评价，确保鉴定结果的稳定和可靠。
实施例1
本实施例以采集的两份野生猕猴桃资源ZM-1和ZM-2为例，
一种组织培养条件下耐旱猕猴桃资源的鉴定方法，所述耐旱性鉴定方法包括如下步骤：
1)ZM-1和ZM-2的组织培养；
2)组培苗的继代培养；
3)组培苗的聚乙二醇(PEG8000)模拟干旱处理；
4)旱害指数(Drought Damage Index，DDI)的统计分析；
5)耐旱性鉴定。
步骤1)中猕猴桃资源的组织培养方法为：挑选前一年休眠的两种猕猴桃枝条，剪取适当长度带回组培准备室，根据芽点分布情况，切成约40cm长度，保证每个枝条切段上带有2个芽点，浸泡在水中，加入0.5％的吐温-20，用毛刷将表面灰尘洗去(注意不要伤及芽点)，并用蒸馏水清洗3-5遍，放于大玻璃烧杯中，保持1/3水深。待约6～8周后，芽点处会有新芽长出，将新芽和茎段切下(长度约2～3cm)，浸泡在75％酒精中30s，之后用25％(体积分数)市售消毒剂(5％次氯酸钠)清洗消毒20min，无菌水冲洗5遍，并用灭菌的刀片将切口处切掉约2～3mm，将带芽茎段放于出芽培养基：MS+0.5mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)+1.0mg/LIBA(吲哚乙酸)，调整培养基pH值5.8。培养条件为：24±2℃，相对湿度40％，14小时光照，8小时黑暗；
MS培养基的配方如下：(mg/L)
大量元素：
微量元素：
铁盐：
FeSO4·7H2O 27.8
Na2-EDTA·2H2O 37.3
有机成分：
步骤2)中两种猕猴桃组培苗的继代培养方法为：大约在出芽培养基中培养3～4周后，茎段上新生出的腋芽长至2厘米时，切下转入增殖培养基，ZM-1的增殖培养基为：MS+1.0mg/L ZT(玉米素)(pH5.8)，ZM-2的增值培养基为：MS+1.0mg/LZT+0.5mg/L GA3(赤霉素)(pH5.8)。大约1个月后将新长出的嫩芽转入新的增殖培养基中实现组培苗的继代培养，大约每隔1个月更换一次增殖培养基；
步骤3)中组培苗的聚乙二醇(PEG)模拟干旱处理方法为：
(1)PEG模拟干旱培养基的配制，先配制1/2MS-PEG培养基(大量元素、微量元素、有机质和铁盐都减半，加入30g/L的蔗糖，不加激素和琼脂)，分别加入质量分数为0、10％、20％、30％和40％的PEG8000；再配制增殖培养基，两种培养基高温高压灭菌，之后用灭菌的量筒将液体1/2MS-PEG培养基加入到冷却后的固体增殖培养基中(一般二者各30mL)，平衡48h后，在超净台上将固体增殖培养基表面的液体培养基倒掉，得到0、5％、10％、15％和20％的PEG模拟干旱培养基；
(2)挑选具有3～4片小叶、高度约1.5～2cm的两种生长基本一致的组培苗，接入不同浓度的PEG干旱模拟培养基中，每个处理每份资源接苗10瓶，每瓶3颗，每个处理接苗30棵，5个处理一共接苗150棵。
步骤4)中旱害指数(Drought Damage Index，DDI)的统计分析方法为：干旱胁迫30天后，根据每个PEG浓度下组培苗所表现出来的受害症状进行统计分析，
旱害指数(DDI)的分级标准如下：
Ⅰ叶片和植株均生长正常，无旱害症状；
Ⅱ叶片有轻度发黄或发褐，主要表现在叶缘或叶尖部位；
Ⅲ叶片有干枯症状，叶片数量明显减少，植株矮化，生长受到抑制；
Ⅳ叶片或茎段干枯，伴有叶片脱落，植株矮化，几乎不生长。
依据下列公式计算各猕猴桃资源的旱害指数：DDI＝∑(x×n)/(4N)×100
x--各级旱害级数值
n--不同浓度下各旱害级株数的总和
N--调查的总植株数
步骤5)中耐旱性鉴定依据为DDI值：值越大，表明旱害越严重，越不耐旱；值越小，表明旱害越轻，越耐旱。旱害指数25≤DDI＜45为耐旱资源；45≤DDI＜65为中度耐旱资源；65≤DDI＜85为旱敏感资源；85≤DDI≤100为旱极敏感资源。
根据旱害指数对ZM-1和ZM-2进行抗性鉴定，ZM-1每级的株数分别为51、57、21、21，旱害指数为52.00；ZM-2分别为89、41、12、8，旱害指数为39.83；因此ZM-1为中度耐旱资源，ZM-2为耐旱资源。

Claims (4)

1.一种耐旱猕猴桃资源的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)猕猴桃资源的组织培养；
2)组培苗的继代培养；和
3)组培苗的模拟干旱处理；
在培养基中添加不同浓度的聚乙二醇制得PEG模拟干旱培养基，并将步骤2)获得猕猴桃组培苗，接入所述PEG模拟干旱培养基中，培养观察；
所述步骤3)中组培苗的模拟干旱处理方法为：
(1)PEG模拟干旱培养基的配制
配制1/2MS-PEG培养基，所述1/2MS-PEG培养基中大量元素、微量元素、有机质和铁盐都减半，加入30g/L的蔗糖，不加激素和琼脂，分别加入质量分数为0、10％、20％、30％和40％的PEG8000，配制出含有不同浓度PEG8000的1/2MS-PEG培养基；
配制固体增殖培养基，将液体1/2MS-PEG培养基加入到冷却后的固体增殖培养基中，液体1/2MS-PEG培养基和固体增殖培养基体积比为1:1，平衡24-72h后，将固体增殖培养基表面的液体培养基倒掉，得到0、5％、10％、15％和20％的PEG模拟干旱培养基；所述固体增殖培养基为MS培养基+1.0mg/L ZT，琼脂6-10g/L，pH5.8；或MS培养基+1.0mg/L ZT+0.5mg/LGA3，琼脂6-10g/L，pH5.8；
(2)挑选具有3～4片小叶、高度1.5～2cm的生长一致的各猕猴桃组培苗，接入不同浓度的PEG模拟干旱培养基中，进行组培苗的模拟干旱处理；每个处理每份资源接苗10瓶，每瓶3颗，共计30颗小苗；
4)旱害指数的统计分析；和
5)耐旱性鉴定；
所述步骤4)中旱害指数的统计分析方法为：
干旱胁迫30天后，根据每个PEG浓度下组培苗所表现出来的受害症状进行统计分析，旱害指数的分级标准如下：
Ⅰ叶片和植株均生长正常，无旱害症状；
Ⅱ叶片有轻度发黄或发褐，主要表现在叶缘或叶尖部位；
Ⅲ叶片有干枯症状，叶片数量明显减少，植株矮化，生长受到抑制；
Ⅳ叶片或茎段干枯，伴有叶片脱落，植株矮化，几乎不生长；
依据下列公式计算各猕猴桃资源的旱害指数：DDI＝∑(x×n)/(4N)×100
x--各级旱害级数值
n--不同浓度下各旱害级株数的总和
N--调查的总植株数。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤1)中猕猴桃资源的组织培养方法为：
挑选前一年休眠的猕猴桃枝条，根据芽点分布情况，切成40cm长度，保证每个枝条切段上带有2～3个芽点，浸泡在水中，加入0.5％的吐温-20，用毛刷将表面灰尘洗去，并用蒸馏水清洗3-5遍，放于大玻璃烧杯中，保持1/3水深；
芽点处长出新芽后，将新芽和茎段切下，浸泡在75％酒精中30s，之后用体积分数为25％市售消毒剂清洗消毒20min，无菌水冲洗5遍，并用灭菌的刀片将切口处切掉2～3mm，将带芽茎段放于出芽培养基：MS+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA，调整培养基pH值5.8；培养条件为：24±2℃，相对湿度40％，14小时光照，8小时黑暗。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤2)中，组培苗的继代培养方法为：
在出芽培养基中培养3～4周后，茎段上新生出的腋芽长至2厘米时，切下腋芽转入增殖培养基：MS培养基+1.0mg/L ZT，pH5.8；或MS培养基+1.0mg/L ZT+0.5mg/L GA3，pH5.8；进行组培苗的增殖，长出新的嫩芽后转入新的增殖培养基中实现组培苗的继代培养，每隔1个月更换一次增殖培养基。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤5)中耐旱性鉴定的依据为DDI值：DDI值越大，表明旱害越严重，越不耐旱；值越小，表明旱害越轻，越耐旱；旱害指数25≤DDI＜45为耐旱资源；45≤DDI＜65为中度耐旱资源；65≤DDI＜85为旱敏感资源；85≤DDI≤100为旱极敏感资源。
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