CN107549014A

CN107549014A - 一种红华猕猴桃组培种苗的繁育方法

Info

Publication number: CN107549014A
Application number: CN201710889310.7A
Authority: CN
Inventors: 黄登艳; 陈泽雄; 李洪海; 刘然
Original assignee: Chongqing Tianpei Agricultural Technology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Yuang Chuang Chuang Chuang Agricultural Development Co., Ltd.
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2018-01-09

Abstract

本发明公开了一种红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，包括以下步骤：以当年抽出的茎节作为外植体，将外植体消毒后，接种于诱导培养基上进行腋芽诱导培养，获得腋芽；将所得初代腋芽切割成单芽后，转接至继代培养基中进行继代培养，获得继代丛生芽；待所得继代丛生芽生长至1.5～2cm高时，将丛生芽切割成单芽后，转接至生根培养基中进行生根培养，获得试管苗；将所得试管苗移栽入体积比为1:9的珍珠岩‑泥炭土混合基质中培养，即获得红华猕猴桃组培种苗。该方法具有腋芽诱导率高，不定芽增殖系数高，生根率高，试管苗移栽成活率高，芽苗生长健壮、叶形叶色正常、皮下生根、新叶萌发快等优点，能够满足红华猕猴桃大面积规模化栽培的需要。

Description

一种红华猕猴桃组培种苗的繁育方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体地说，涉及一种红华猕猴桃组培种苗的繁育方法。

背景技术

猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)，也称狐狸桃、藤梨、羊桃、木子、毛木果、奇异果、麻藤果等，果形一般为椭圆状，外观呈绿褐色，表皮覆盖浓密绒毛，不可食用，其内是呈亮绿色的果肉和一排黑色的种子。因猕猴喜食，故名猕猴桃；亦有说法是因为果皮覆毛，貌似猕猴而得名，是一种品质鲜嫩，营养丰富，风味鲜美的水果。猕猴桃除含有猕猴桃碱、蛋白水解酶、单宁果胶和糖类等有机物，以及钙、钾、硒、锌、锗等微量元素和人体所需17种氨基酸外，还含有丰富的维生素C、葡萄酸、果糖、柠檬酸、苹果酸、脂肪。

“红华”是用中华猕猴桃变种红肉猕猴桃为母本、美味猕猴桃为父本杂交育成的红肉猕猴桃新品种。2004年10月通过四川省农作物品种审定委员会种审定(审定号:川审果树2004003)，并正式命名“红华”2005年4月获得农业部植物新品种保护办公室保护。果子平均97克，最大137克，长椭圆型，果顶平坦，果皮褐色，光滑，有短绒毛，果脐平坦，外表美观。种子外侧呈放射状鲜红色，红色部分不低于横切面的40％。果肉黄色，可溶性固形物18.9％，总糖11.94％，总酸1.35％，常温下后熟期20天左右，在1℃条件下可冷藏4个月左右。

植株生长健壮，夏季无卷叶焦枯现象，到10月仍然枝繁叶茂。果子较大，不空心，吃起来口感好，果蒂无木质伸入果肉。生长旺，长势强，叶片大而浓绿，夏季不焦枯，因此抗风，抗旱，抗涝，抗病力都强。丰产性也好，嫁接苗定植后第三年结果，第五年进入盛果期。667平方米(1亩)产量1500～2000公斤。

植物组织培养(plant tissue culture)是在植物生理学的基础上发展起来的一门非常重要的生物技术学科，其理论基础是植物细胞全能性(totipotency)及植物生长调节剂(plant growth regulator)应用。至上世纪初，德国著名植物学家Haberlandt首次提出植物细胞具有全能性假说，并进行离体细胞培养试验以来。White、Muir等利用组织培养技术在不同植物上获得了成功，如番茄，万寿菊等。经过科学家、学者不断探索与研究，植物组织培养技术及配套方法日臻成熟，形成了一整套高技术水平体系，为植物组织培养科学发展及应用奠定了基础，已被运用于各学科领域。

国内外大多数栽培猕猴桃品种都通过扦插，嫁接、压条等方法育苗。然而传统繁育方法周期较长、种质退化严重、溃疡病严重等已成为猕猴桃产业的限制因素。尽管近年来，国内外利用组织培养技术在猕猴桃的离体再生获得了不少成绩，但至今未见关于红华猕猴桃组织培养的研究报道。本发明人在前期工作中发现，在猕猴桃组织培养过程中主要存在以下几个问题：(1)增值系数低；(2)腋芽诱导率低等不能实现红华猕猴桃产业化生产。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种红华猕猴桃组培种苗的繁育方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，包括以下步骤：

1)外植体腋芽诱导：以当年抽出的茎节作为外植体，将外植体消毒后，接种于诱导培养基上进行腋芽诱导培养，获得腋芽；

2)增殖培养：将步骤1)所得初代腋芽切割成茎段后，转接至继代培养基中进行继代培养，获得继代苗；

3)生根：待步骤2)所得继代苗生长至3cm左右时，将继代苗顶芽切成1.5-2cm高的单芽，转接至生根培养基中进行生根培养，获得无菌苗；

4)试管苗移栽：将步骤3)所得无菌苗移栽到体积比为1:9的珍珠岩-泥炭土混合基质中培养，即获得红华猕猴桃组培种苗。

进一步地，步骤1)中的诱导培养基是以改良MS培养基为基本培养基，并添加6-苄氨基嘌呤1mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.6～5.8，其中，改良MS培养基是在MS培养基基础上硝酸铵减半，增加磷酸二氢钠170mg/L。

进一步地，步骤2)中的继代培养基是以改良MS培养基为基本培养基，并添加6-BA0.5mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.6～5.8，其中，改良MS培养基是在MS培养基基础上硝酸铵减半，增加磷酸二氢钠170mg/L。

进一步地，步骤3)中的生根培养基是以1/2改良MS培养基为基本培养基，并添加吲哚丁酸(IBA)0.7mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖20g/L，调节pH至5.6～5.8。

进一步地，步骤3)中的切割方式采用茎段增殖法，所述茎段增殖法是指每次继代都将芽苗切割成带一个顶芽或腋芽的小段。

进一步地，步骤1)所述腋芽诱导培养和步骤3)所述生根培养的条件为：每天在温度为25±1℃、光照强度为2000～3000lx的条件下光照培养10～12小时。

进一步地，步骤2)所述增殖培养的条件为：每天在温度为25±1℃、光照强度为2000～3000lx的条件下光照培养10～12小时，昼夜温差控制在8～12℃。

进一步地，步骤4)所述培养的条件为：每天在基质湿度为75％～85％、光照强度为1500～3000lx的条件下光照10～12小时，每10天施用1次氮质量百分含量为15％、磷和钾质量百分含量各为5％的氮磷钾三元复混肥。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明具有腋芽诱导率高，不定芽增殖系数高，芽苗生长健壮、叶形叶色正常、皮下生根、新叶萌发快等优点，能够满足红华猕猴桃大面积规模化栽培的需要。

2)GA₃可以有效改善继代苗的质量，不但增殖率大大提高了，叶片大小，叶色及整个继代苗质量都可以达到种苗质量要求。

3)暗培养时间为14天获得的继代苗平均株高高达35.57cm，平均茎粗为2.97mm，增殖率高达3.44，并且继代苗长势旺盛、叶色嫩绿、苗壮、分枝较多、叶片较大，是产业化理想的水平状态。

4)本发明采用茎段增殖法，其增殖率可达到3.51，保证了增殖系数的同时也为切割生根苗打下了良好的基础；而不定芽增殖法增殖率只有1.83，并且叶片大，影响切割速度。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明GA₃对红华猕猴桃继代苗生长的影响；其中，a为处理A中继代培养配方处理后的红华猕猴桃继代苗，b为处理B中继代培养配方处理后的红华猕猴桃继代苗，c为处理C中继代培养配方处理后的红华猕猴桃继代苗；

图2是本发明暗培养时间对红华猕猴桃组培继代苗生长的影响，其中，A-F分别代表暗培养时间为0d、7d、14d、21d、28d、35d的红华猕猴桃组培继代苗生长情况；

图3是本发明不同切割工艺对红华猕猴桃继代苗生长的影响，其中，A为不定芽增殖法得到的团块，B为茎段增殖法得到的小段；

图4是本发明繁育方法获得的红华猕猴桃苗，其中，A为本发明繁育方法获得的红华猕猴桃试管苗，B为本发明繁育方法获得的产业化红华猕猴桃。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明公开了一种红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，包括以下步骤：

1)外植体腋芽诱导：以当年抽出的茎节作为外植体，将外植体消毒后，接种于诱导培养基上进行腋芽诱导培养，获得腋芽；所述诱导培养基是以改良MS培养基为基本培养基，并添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.6～5.8，其中，改良MS培养基是在MS培养基基础上硝酸铵减半，增加磷酸二氢钠170mg/L；

2)增殖培养：将步骤1)所得初代腋芽切割成单芽后，转接至继代培养基中进行继代培养，获得继代丛生芽；所述继代培养基是以改良MS为基本培养基，并添加6-BA 0.5mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L、蔗糖30g/L和GA₃0-1.0ml/L，调节pH至5.6～5.8，其中，改良MS培养基是在MS培养基基础上硝酸铵减半，增加磷酸二氢钠170mg/L；

3)生根：待步骤2)所得继代苗生长至3cm左右高时，将继代苗切割成单芽后，转接至生根培养基中进行生根培养，获得试管苗；所述生根培养基是以1/2改良MS培养基为基本培养基，并添加吲哚丁酸(IBA)0.7mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖20g/L，调节pH至5.6～5.8；

4)试管苗移栽：将步骤3)所得试管苗移栽入体积比为1:9的珍珠岩-泥炭土混合基质中培养，即获得红华猕猴桃组培种苗。

进一步，步骤1)所述腋芽诱导培养、步骤2)所述增殖培养和步骤3)所述生根培养的条件为：每天在温度为25±1℃、光照强度为2000～3000lx的条件下光照培养10～12小时；步骤2)所述增殖培养的条件为：每天在温度为25±1℃、光照强度为2000～3000lx的条件下光照培养10～12小时，昼夜温差控制在8～12℃；步骤4)所述培养的条件为：每天在基质湿度为75％～85％、光照强度为1500～3000lx的条件下光照10～12小时，每10天施用1次氮质量百分含量为15％、磷和钾质量百分含量各为5％的氮磷钾三元复混肥。

1、GA₃对红华猕猴桃继代苗生长的影响

红华猕猴桃在处理A中继代培养配方的继代培养后，生长情况不理想，主要表现为增殖率低、叶片大且浓绿、植株矮小等(见图1)。基于此，添加不同浓度GA₃调整现状，设计优化培养基见表1。

从表1可以看出，处理B在原有配方中添加0.5ml/L的GA₃，可以有效改善继代苗的质量，不但增殖率大大提高了，叶片大小，叶色及整个继代苗质量都可以达到种苗质量要求(见图2)。但是GA₃的用量一定不能超过1.0cm/L，处理C中可以看出，高浓度的GA₃会影响红华猕猴桃继代苗的质量，出现顶芽坏死的现象(见图3)。其中，处理A中继代培养配方：改良MS为基本培养基，并添加6-BA0.5mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L、蔗糖30g/L，调节pH至5.6～5.8，其中，改良MS培养基是在MS培养基基础上硝酸铵减半，增加磷酸二氢钠170mg/L；

处理B：改良MS为基本培养基，并添加6-BA 0.5mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L、蔗糖30g/L和GA₃ 0.5ml/L，调节pH至5.6～5.8，其中，改良MS培养基是在MS培养基基础上硝酸铵减半，增加磷酸二氢钠170mg/L；

处理C：改良MS为基本培养基，并添加6-BA 0.5mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L、蔗糖30g/L和GA₃ 1ml/L，调节pH至5.6～5.8，其中，改良MS培养基是在MS培养基基础上硝酸铵减半，增加磷酸二氢钠170mg/L；

表1GA₃对红华猕猴桃继代苗生长的影响

2、暗培养时间对红华猕猴桃组培继代苗生长的影响

传统的组织培养继代苗培养方式都是在不同光照条件下进行培养，但是红华猕猴桃在继代培养过程中发现，继代苗切割后常规光照培养多代后茎节抽不高，增殖系数和生根苗质量都达不到产业化的要求。通过切割后调整暗培养和光培养的时间可以达到产业化理想的水平。

表2可以看出，C处理获得的继代苗平均株高高达35.57cm，平均茎粗为2.97mm，增殖率高达3.44，并且继代苗长势旺盛、叶色嫩绿、苗壮、分枝较多、叶片较大(见图2A-F)，是产业化理想的水平状态。

表2暗培养时间对红华猕猴桃组培继代苗生长的影响

3、切割工艺对红华猕猴桃继代苗生长的影响

切割工艺是组织培养中十分重要的环节，切割工艺的好坏直接决定着种苗的生长和增殖，甚至影响生根率。

红华猕猴桃一般采用不定芽增殖法，但是经过多次试验和生产现状可以得出此增殖方法不太适合红华猕猴桃，因为其增值率低，继代苗质量达不到质量标准，切割速度提不高等。在现有的基础上我们同时使用不定芽增殖方法和茎段增殖方法。不定芽增殖方法即每次继代时都将每个不定芽单独分割成独立的团块(见图3A)，茎段增殖法即每次继代都将芽苗切割成带一个顶芽或腋芽的小段(见图3B)。从表3实验结果可以看出，茎段增殖法增殖率可达到3.51，保证了增殖系数的同时也为切割生根苗打下了良好的基础。而不定芽增殖法增殖率只有1.83，并且叶片大，影响切割速度。

表3不同切割工艺对红华猕猴桃继代苗生长的影响

通过对红华猕猴桃继代培养基中GA₃浓度，暗培养时间及切割工艺进行调整后，为获得红华猕猴桃产业化提供了坚实的基础(见图4A-4B)。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)增殖培养：将步骤1)所得初代腋芽切割成单芽后，转接至继代培养基中进行继代培养，获得继代丛生芽；

3)生根：待步骤2)所得继代丛生芽生长至1.5～2cm高时，将丛生芽切割成单芽后，转接至生根培养基中进行生根培养，获得无菌苗；

2.根据权利要求1所述的红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，其特征在于，所述步骤1)中的诱导培养基是以改良MS培养基为基本培养基，并添加6-苄氨基嘌呤1mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.6～5.8，其中，改良MS培养基是在MS培养基基础上硝酸铵减半，增加磷酸二氢钠170mg/L。

3.根据权利要求1所述的红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，其特征在于，所述步骤2)中的继代培养基是以改良MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 0.5mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.6～5.8，其中，改良MS培养基是在MS培养基基础上硝酸铵减半，增加磷酸二氢钠170mg/L。

4.根据权利要求1所述的红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，其特征在于，所述步骤3)中的生根培养基是以1/2改良MS培养基为基本培养基，并添加吲哚丁酸(IBA)0.7mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖20g/L，调节pH至5.6～5.8。

5.根据权利要求1所述的红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，其特征在于，所述步骤3)中的切割方式采用茎段增殖法，所述茎段增殖法是指每次继代都将芽苗切割成带一个顶芽或腋芽的小段。

6.根据权利要求1所述的红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，其特征在于，所述步骤1)所述腋芽诱导培养和步骤3)所述生根培养的条件为：每天在温度为25±1℃、光照强度为2000～3000lx的条件下光照培养10～12小时。

7.根据权利要求1所述的红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，其特征在于，所述步骤2)所述增殖培养的条件为：每天在温度为25±1℃、光照强度为2000～3000lx的条件下光照培养10～12小时，昼夜温差控制在8～12℃。

8.根据权利要求1所述的红华猕猴桃组培种苗的繁育方法，其特征在于，所述步骤4)所述培养的条件为：每天在基质湿度为75％～85％、光照强度为1500～3000lx的条件下光照10～12小时，每10天施用1次氮质量百分含量为15％、磷和钾质量百分含量各为5％的氮磷钾三元复混肥。