CN111887153B - 一种燕子花根段诱导愈伤组织的方法 - Google Patents

一种燕子花根段诱导愈伤组织的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种燕子花根段诱导愈伤组织的方法。具体步骤是：(1)外植体的获取；(2)愈伤组织的诱导；(3)愈伤组织的增殖。通过本发明提供的方法，获得的根段诱导愈伤组织的最佳培养基配方是MS+0.5mg/L6‑BA+0.5mg/L2,4‑D+0.4mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，诱导率可达73.33％，获得愈伤增殖率达73.33％的最佳培养基配方是MS+0.5mg/L6‑BA+0.5mg/L2,4‑D+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，该方法为燕子花愈伤诱导及增殖的有效途径，有利于后续再分化形成不定芽，进一步培养成完整植株，为燕子花种苗的快速大量繁殖奠定了坚实基础。

Description

一种燕子花根段诱导愈伤组织的方法
技术领域
本发明涉及草本植物组织培养技术领域，具体涉及到一种燕子花根段诱导愈伤组织的 方法。
背景技术
燕子花(Iris laevigata)是鸢尾科(Iris)鸢尾属的多年生草本花卉，又称光叶鸢尾。 产自东三省及云南，生于沼泽地、河岸边的水湿地以及海拔1890-3200米的云南高山湿地。根 状茎粗壮，棕褐色。须根黄白色，有皱缩的横纹。叶灰绿色，剑形或宽条形，苞片膜质披针 形，内包2-4朵大花，蓝紫色，花期5-6月；蒴果椭圆状柱形有6条纵肋，种子扁平状半圆形， 褐色有光泽，果期7-8月。因其极高的观赏价值及抗寒能力，在园林应用上潜力巨大，同时也 可用作插花材料进行室内小环境家居装饰。但燕子花目前在我国尚未得到大量开发应用，一 方面，其种子繁殖结实率低且繁殖周期过长，分株繁殖繁殖系数不高；另一方面，其野生环 境不断遭到破坏，野生种质资源生长空间越来越少，因此快速扩繁技术的研究迫在眉睫。
组织培养是在人工配制的培养基上，于无菌状态下培养植物器官、组织、细胞、原生 质体等材料的方法，因可高效繁殖植株并且可以改进植株质量，而被广为使用。目前有关燕 子花愈伤组织诱导及大量繁殖等方面的研究十分欠缺，我们在实验选材、实验条件设置、培 养基配制方法等方面进行探索，最终首次获得了一种诱导率高达73.33％的燕子花根段诱导愈 伤组织的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有燕子花愈伤组织诱导鲜见报道这一问题，首次提供一种燕子 花根段诱导愈伤组织的方法。该方法大量获得的颜色鲜黄，状态良好的愈伤组织，有利于后 续再分化形成不定芽，进一步培养成完整植株，从而实现燕子花快速繁殖，有助于实验的高 效开展。
本发明提供一种燕子花根段诱导愈伤组织的方法，其技术方案如下：
(1)外植体的获取：在无菌条件下，选择生长健壮的组培苗，冲洗干净，将叶片修剪至2-3cm，切去根部后接种到培养基中培养生根。生根30d，选择生出发达根系的幼苗，将相对较粗的不定根切成2cm左右的根段，作为诱导愈伤的外植体；
(2)愈伤组织的诱导：在无菌条件下，将切成的2cm左右的根段放入培养基 MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+0.4mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉中。培养45d，在 根段上的切口处长出了黄色的愈伤组织；
(3)愈伤组织的增殖：在无菌条件下，将黄色愈伤组织切下，放入培养基 MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉中。培养45d，原 有愈伤组织膨大，呈黄色干燥颗粒状；
上述所有培养基的pH值均在灭菌前调节至弱酸性(5.8-6.0)，培养室的培养温度为25 ±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/(m2·s)；
进一步地，步骤(1)中所述冲洗是指用无菌水将组培苗根部残余的原有培养基冲洗 干净；
进一步地，步骤(1)中所述切取长度为2cm左右的根段是指将相对较粗的不定根切成2cm左右的根段，同时切去根段上较细的不定根以制造伤口，接入培养基中诱导愈伤组织；
进一步地，步骤(2)中所述长出了黄色的愈伤组织是指在根段上的切口处长出了颜 色鲜黄，状态良好的愈伤组织；
进一步地，步骤(1)、(2)、(3)中所述在无菌条件下是指在超净工作台上，用经高温高压灭菌后的手术刀和镊子，完成外植体与愈伤组织的切取和移动过程。
本发明采用组织培养技术，在愈伤组织诱导过程中产生的有益效果为：操作简便，获 得的愈伤组织诱导率和增值率均可达73.33％，为实现燕子花种苗的快速大量繁殖首次提供了 一种根段诱导愈伤组织的方法。
附图说明
附图1是燕子花根段诱导出愈伤组织的状况图；
附图2是燕子花根段诱导出愈伤组织的细节图；
附图3是燕子花愈伤组织增殖前的培养状况图；
附图4是燕子花愈伤组织增殖后的培养状况图。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图来进一步详细完整地阐述本发明，而非限制本发明。
本实施例提供的一种燕子花根段诱导愈伤组织的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的获取：在超净工作台上，选择生长健壮的组培苗，用无菌水将根部残余的培养基冲洗干净，将叶片修剪至2-3cm，切去根部后接种到培养基中培养生根。培养30d， 在超净工作台内选择生出发达根系的幼苗，用经高温高压灭菌后的手术刀和镊子，在灭菌后 的滤纸片上将相对较粗的不定根切成2cm左右的根段，同时切去根段上较细的不定根以制造 伤口，这样的根段作为诱导愈伤的外植体；
(2)愈伤组织的诱导：将步骤(1)中切取的2cm左右的根段用镊子放入诱导培养基MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+0.4mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉中。灭菌前调节培 养基的pH值为5.8-6.0，接种数量为10个/皿，培养室的培养温度为25±1℃，光照时间为 14h/d，光照强度为25μmol/(m2·s)。培养45d，最终选取获得颜色鲜黄，状态良好的愈伤组 织，其诱导率达73.33％。
(3)愈伤组织的增殖：在超净工作台上，用经高温高压灭菌后的手术刀和镊子，将步骤(2)中在根段上的切口处长出的黄色愈伤组织切下，用镊子放入增殖培养基 MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2，4-D+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉中。灭菌前调节培 养基的pH值为5.8-6.0，接种数量为10块/皿，培养室的培养温度为25±1℃，光照时间为 14h/d，光照强度为25μmol/(m2·s)，培养45d，原有愈伤组织膨大，呈黄色干燥颗粒状。
步骤(2)中愈伤诱导率和步骤(3)中愈伤增殖率均采用SPSS22.0软件进行显著性分 析，详细计算方法为：
愈伤诱导率＝(诱导形成愈伤的外植体个数/接种外植体个数)×100％
愈伤增殖率＝(增殖的愈伤总个数/接种的愈伤总个数)×100％
进行根段诱导愈伤组织培养基配方选择试验
本发明在基础培养基(MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉)中加入不同浓度的激素(6-BA、NAA和2，4-D)，灭菌前调节pH至5.8-6.0。每个处理接种10个根段，将其放入不 同配方的培养基中，与培养基充分接触，每组试验重复3次，培养45d。进行数据统计，具体 见表1。
表1不同激素组合对愈伤诱导影响的比较试验
处理 6-BA(mg/L) 2，4-D(mg/L) NAA(mg/L) 愈伤诱导率(％) 生长状况
1 0 0.5 0.4 0.00±0.00d 未诱导出愈伤
2 0.5 0.5 0.4 73.33±9.89a 黄色，较小
3 2.0 0.5 0.4 66.67±12.29a 黄色，较小
4 3.0 0.5 0.4 25.00±11.47bcd 黄色，较小
5 0.5 0 0.4 6.67±4.22cd 黄色，较小
6 0.5 1.0 0.4 36.67±9.55b 黄色，较小
7 0.5 2.0 0.4 20.00±7.30bcd 黄色，较小
8 0.5 0.5 0 3.33±3.33d 黄色，较小
9 0.5 0.5 1.0 30.00±8.56bc 黄色，较小
10 0.5 0.5 2.0 13.33±6.67bcd 黄色，较小
注：表中数据为平均值±SE。同列相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字 母表示差异显著(P＜0.05)。
对表1数据进行分析可知，当两种激素浓度不变时，愈伤诱导率随第三种激素浓度的 升高呈先上升后下降的趋势；不添加2，4-D或NAA时，诱导率都极低，不添加6-BA时， 诱导率为0；因此认为，6-BA对根段诱导愈伤影响最大，2，4-D和NAA对根段诱导愈伤稍 有影响。结果显示，培养基MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2，4-D+0.4mg/LNAA+30g/L蔗糖 +7g/L琼脂粉能够诱导根段长出愈伤，且诱导率可达73.33％，为本试验中最佳根段诱导愈伤 组织的培养基配方。
进行愈伤组织增殖培养基配方选择试验
本发明在基础培养基(MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉)中加入不同浓度的激素(6-BA、NAA和2，4-D)，灭菌前调节pH至5.8-6.0。每个处理接种10块愈伤，将其放入不 同配方的培养基中，与培养基充分接触，每组试验重复3次，培养45d。进行数据统计，具体 见表2。
表2不同激素组合对愈伤增殖影响的比较试验
处理 6-BA(mg/L) 2，4-D(mg/L) NAA(mg/L) 愈伤增殖率(％) 内生菌污染率(％) 生长状况
1 0.5 0.5 0.2 73.33±2.11a 33.33±14.53a 黄色，干燥，颗粒状
2 0.5 0.5 0.4 61.67±1.67b 26.67±3.33a 黄色，干燥，颗粒状
3 0.5 0.5 0.6 28.33±3.07de 28.33±4.77a 黄色，干燥，颗粒状
4 1.0 1.0 0.4 21.67±1.67e 26.67±4.22a 黄色，干燥，颗粒状
5 2.0 0.5 0.4 38.33±3.07cd 28.33±3.07a 有绿色的点，呈分化趋势
6 1.5 0.5 0.4 46.67±6.67c 31.67±4.77a 黄色，干燥，颗粒状
注：表中数据为平均值±SE。同列相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字 母表示差异显著(P＜0.05)。
如表2所示，各处理都对愈伤增殖有效果，浓度较低时效果更好，且污染率差异不显 著；处理1最为明显，愈伤增殖率为73.33％，愈伤状况为黄色干燥颗粒状。综上认为，内生 菌污染率不会因为激素水平的改变而产生显著变化，低浓度的激素组合对愈伤增殖作用更明 显，培养基MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2，4-D+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，为 本试验中愈伤增殖最佳培养基配方。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可利用上述阐述 的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案 所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种燕子花根段诱导愈伤组织的方法，其特征在于：
(1)外植体的获取：在无菌条件下，选择生长健壮的组培苗，冲洗干净，将叶片修剪至2-3cm，切去根部后接种到培养基中培养生根；生根30d，将相对较粗的不定根切成2cm的根段，作为诱导愈伤的外植体；
(2)愈伤组织的诱导：在无菌条件下，将被切成2cm的根段放入培养基MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L 2,4-D+0.4mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉中；培养45d，在根段上的切口处长出了黄色的愈伤组织，愈伤诱导率为73.33％；
(3)愈伤组织的增殖：在无菌条件下，将黄色愈伤组织切下，放入培养基MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L 2,4-D+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉中；培养45d，原有愈伤组织膨大，呈黄色干燥颗粒状，愈伤增殖率达73.33％；
上述所有培养基的pH值均在灭菌前调节至弱酸性5.8-6.0，培养室的培养温度为25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/(m2·s)。
2.根据权利要求1所述的燕子花根段诱导愈伤组织的方法，其特征在于步骤(1)中所述冲洗干净是指用无菌水将组培苗根部残余的原有培养基冲洗干净。
3.根据权利要求1所述的燕子花根段诱导愈伤组织的方法，其特征在于步骤(1)中所述切取长度为2cm的根段是指选择相对较粗的不定根切成2cm的根段，同时切去根段上较细的不定根以制造伤口，接入培养基中诱导愈伤组织。
4.根据权利要求1所述的燕子花根段诱导愈伤组织的方法，步骤(2)中所述长出了黄色的愈伤组织是指在根段上的切口处长出了颜色鲜黄，状态良好的愈伤组织。
5.根据权利要求1所述的燕子花根段诱导愈伤组织的方法，其特征在于步骤(1)、(2)、(3)中所述在无菌条件下是指在超净工作台上，用经高温高压灭菌后的手术刀和镊子，完成外植体与愈伤组织的切取和移动过程。
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