CN101785429B

CN101785429B - 一种提高红掌愈伤组织快速分化成芽的方法

Info

Publication number: CN101785429B
Application number: CN2009101885285A
Authority: CN
Inventors: 陈春满; 张善信; 蔡新娇
Original assignee: DONGGUAN CITY INST OF BIOTECHNOLOGY
Current assignee: DONGGUAN CITY INST OF BIOTECHNOLOGY
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2029-12-01
Also published as: CN101785429A

Abstract

一种提高红掌愈伤组织快速分化成芽的方法，涉及红掌组培苗培育方法。包括如下步骤：A、选用目前较难诱导出愈伤组织或其愈伤组织较难分化成不定芽的红掌品种作为作种的红掌品种；B、在制种前一周停浇水、肥、药，保持叶面干净；C、选择刚展开而未转色的叶片作为外植体材料；D、愈伤组织的诱导；E.不定芽的分化。本发明通过在红掌愈伤诱导和芽分化的不同关键阶段运用不同的培养基配方和不同切割工艺，从而达到快速诱导和分化成芽的目的，该发明的运用有效地建立了难以开发的红掌品种的无性系，利于红掌不同品种试管苗工厂化生产的开展。

Description

一种提高红掌愈伤组织快速分化成芽的方法

技术领域

本发明涉及红掌组培苗培育方法，尤其指一种提高红掌愈伤组织快速分化成芽的方法。

技术背景

红掌(Anthurium andraeanum)属天南星科花烛属，别名安组花、花烛，为多年生附生常绿草本植物。其花叶姿态优美、典雅，花色鲜红，花期长，观赏性强，观赏价值高，是近年来国内外最为流行的名贵花卉之一。红掌既可做切花栽培又可作盆花观赏而倍受人们欢迎。在全球热带花卉贸易中红掌的销量仅次于兰花，名列第二。一直以来国内红掌种苗多依赖进口。随着红掌生产的发展及市场的迫切需要，国内从事红掌组织培养生产的厂家越来越多。但在红掌组织培养中却存在瓶颈现象，目前在红掌组培快繁中，由于茎尖作为外植体材料来源少、易产生细菌污染等现象，不利于大规模的工厂化生产需要，而叶片作为外植体材料来源丰富，表面消毒容易，更适合大规模的工厂化生产需要。其原理是通过叶片诱导脱分化产生愈伤组织，愈伤组织经过再分化产生不定芽而形成再生植株。但是叶片作为外植体材料诱导愈伤组织而产生不定芽的途径，在生产实际中存在着一些技术难题，一是不同品种诱导愈伤组织的难易程度不同，某些品种的叶片较易诱导愈伤组织，而某些品种很难诱导出愈伤组织，如深色水晶花烛(A.andraeanum‘Clavinervium’)、观叶花烛(A.andraeanum‘Jungle King’)、绿翡翠(A.andraeanum‘Casparo’)等品种；二是诱导形成愈伤组织后，愈伤组织较难再分化形成不定芽，如热情(A.andraeanum‘Tropical’)、塔妮斯(A.andraeanum′Tenessee′)、孖宝(A.andraeanum′ZiBao′)等品种；三是由叶片诱导产生不定芽的途径，小苗变异现象较多。由于这些问题的存在，极大地制约了红掌组培苗工厂化生产的进程。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的上述不足，提供一种提高红掌愈伤组织快速分化成芽的方法，其能促使较难诱导出愈伤组织或其愈伤组织较难分化成不定芽的红掌品种容易诱导出愈伤组织，且其愈伤组织快速分化形成不定芽，同时，能减少小苗变异率。

为此，本发明的技术方案包括如下步骤：

A、选用目前较难诱导出愈伤组织或其愈伤组织较难分化成不定芽的红掌品种作为作种的红掌品种，包括：深色水晶花烛(A.andraeanum‘Clavinervium’)、观叶花烛(A.andraeanum‘Jungle King’)、通红火鹤(Anthurium scherzerianum)、大哥大(A.andraeanum‘Dakota’)、热情(A.andraeanum‘Tropical’)、塔妮斯(A.andraeanum‘Tenessee’)、橙恋(A.andraeanum‘Feroza’)、孖宝(A.andraeanum‘ZiBao’)、绿翡翠(A.andraeanum‘Casparo’)、粉佳人(A.andraeanum‘Texana’)、格莱佛火鹤(A.andraeanum‘Graffity’)；

B、对所述作种的红掌品种在制种前一周停浇水、肥、药，保持叶面干净；

C、选择刚展开而未转色的叶片作为外植体材料；

D、愈伤组织的诱导：

(1)采回的所述叶片，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花蘸按重量计的0.5％的洗衣粉水轻擦上下表面，再在自来水下冲洗5～10分钟。在洁净工作台上，将所述叶片切割成2cm×2cm大小的小块叶片，并放入0.10％升汞溶液中进行浸泡消毒8～10分钟，并不断摇动。然后将所述小块叶片取出，在无菌水中漂洗4～5次，每次5～6分钟。后浸入无菌水中备用；

(2)将消毒好的所述小块叶片切除边缘受升汞毒害的部分，并将所述小块叶片切割成1cm×1cm大小的叶片切块，转入诱导愈伤形成的培养基中，叶面朝上平放在培养基上。每瓶3～5片。诱导愈伤培养基为：1/3MS+2，4-D 0.5～1.0mg·L^-1+6-BA1.0～2.0mg·L^-1+白糖3％+琼脂粉0.6％，pH 5.8～6.0。所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；2，4-D即2，4-氯苯氧乙酸；6-BA即6-苄氨基嘌呤；

(3)培养条件：黑暗，温度24～26℃，培养时间30～60天；

E.不定芽的分化：

(1)当作为外植体的所述叶片切块的边缘产生1mm大小的黄色颗粒状愈伤组织块时，立刻将带有所述愈伤组织块的所述叶片切块转入一级分化培养基中，一级分化培养基为1/2MS+6-BA 0.2～0.5mg·L^-1+KT 0.3～0.5mg·L^-1。培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为24～26℃。培养周期40～50天。1/2MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(2)当所述叶片切块上的所述愈伤组织块转绿并增大到3～4mm的颗粒时，将所述愈伤组织块切下，转入二级分化培养基中，二级分化培养基为1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+KT1.0mg·L^-1，培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为24～26℃。培养周期40～50天。1/2MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(3)当所述愈伤组织块在二级分化培养基上培养40～50天时，部分颗粒状的愈伤组织顶端开始有不定芽产生。不同品种产生不定丛芽的速度有所不同。将已经产生不定芽的团块切下，接种到芽增殖培养基中，增殖培养基为1/2MS+6-BA 0～0.8mg·L^-1+KT 0～0.8mg·L^-1。每30～40天继代培养一次。未产生不定芽的愈伤团块则继续在二级分化培养基中进行培养。1/2MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(4)根据增殖培养基中不定芽的所述团块(丛芽团块)的生长情况，对所述增殖培养基进行适当的调整。如增殖率很高，增殖系数超过3.0，并且植株较细小时，说明繁殖速度过快，易于产生变异或不利于小芽的生长，这时可将6-BA浓度降低为0.2mg·L^-1以下及KT的浓度降为0.2mg·L^-1以下，或加活性炭1g·L^-1，将培养体内累积的激素吸附掉，以利于不定芽的生长；当不定芽增殖速度减慢而达不到所需的增殖速度时，适当提高激素比例，如将6-BA浓度提高为0.5mg·L^-1以上及KT的浓度提高为0.5mg·L^-1以上。如此反复，可获得较理想的不定芽增殖效果。当不定芽增殖数量达到一定规模时，根据生产的需要，即可进行生根培养，从而获得完整的再生植株。

本发明的有益效果是：

在叶片愈伤诱导的最初阶段利用较高的2，4-D浓度刺激愈伤组织的形成，而在愈伤组织诱导形成后，即当愈伤颗粒只有1mm的大小时快速去除2，4-D，其目的是使材料尽快脱离含有高浓度生长素2，4-D的培养基，以减少只产生愈伤组织不产生不定芽的现象。因为2，4-D能强烈地刺激细胞脱分化形成愈伤组织，并使愈伤组织呈现快速增殖状态，但其后续的作用影响较大，快速增殖的愈伤组织易于产生变异，且不利于不定芽的产生。由于红掌对激素比较敏感，高浓度激素刺激有明显的累积效应，快速转入只含有少量的细胞分裂素(KT和6-BA)的一级分化培养基中，愈伤组织细胞快速增殖状态有所减慢，利于下一步的不定芽诱导和分化。

在二级分级培养基中提高了6-BA和KT的浓度，此步骤的目的是利用较高浓度的细胞分裂素刺激已经转绿的愈伤组织尽快分化出不定芽。当不定芽形成后，又要尽快降低激素的用量，以防止激素的累积效应而不利于小芽的后期分化和健壮生长。

本发明通过在红掌愈伤诱导和芽分化的不同关键阶段运用不同的培养基配方和不同切割工艺，从而达到快速诱导和分化成芽的目的，该发明的运用有效地建立了难以开发的红掌品种的无性系，利于红掌不同品种试管苗工厂化生产的开展。

具体实施方式

下面，介绍本发明的具体实施方式。

实施例一

C、选择刚展开而未转色的叶片作为外植体材料；

D、愈伤组织的诱导：

(2)将消毒好的所述小块叶片切除边缘受升汞毒害的部分，并将所述小块叶片切割成1cm×1cm大小的叶片切块，转入诱导愈伤形成的培养基中，叶面朝上平放在培养基上。每瓶3～5片。诱导愈伤培养基为：1/3MS+2，4-D 0.5mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1+白糖3％+琼脂粉0.6％，pH 5.8～6.0。所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；6-BA即6-苄氨基嘌呤；

(3)培养条件：黑暗，温度24℃～26℃，培养时间30～60天；

E.不定芽的分化：

(1)当作为外植体的所述叶片切块的边缘产生1mm大小的黄色颗粒状愈伤组织块时，立刻将带有所述愈伤组织块的所述叶片切块转入一级分化培养基中，一级分化培养基为1/2MS+6-BA 0.2mg·L^-1+KT 0.3mg·L^-1。培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为24℃～26℃，培养周期40～50天。1/2MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(2)当所述叶片切块上的所述愈伤组织块转绿并增大到3～4mm的颗粒时，将所述愈伤组织块切下，转入二级分化培养基中，二级分化培养基为1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+KT1.0mg·L^-1，培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为24℃。培养周期40～50天。1/2MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(3)当所述愈伤组织块在二级分化培养基上培养40～50天时，部分颗粒状的愈伤组织顶端开始有不定芽产生。不同品种产生不定丛芽的速度有所不同。将已经产生不定芽的团块切下，接种到芽增殖培养基中，增殖培养基为1/2MS+6-BA 0～0.8mg·L^-1+KT 0～0.8mg·L^-1。每30～40天继代培养一次。未产生不定芽的愈伤团块则继续在二级分化培养基中进行培养。所述1/2MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(4)根据增殖培养基中不定芽的所述团块(丛芽团块)的生长情况，对所述增殖培养基进行适当的调整。如增殖率很高，增殖系数超过3.0，并且植株较细小时，说明繁殖速度过快，易于产生变异或不利于小芽的生长，这时可将6-BA浓度降低为0.2mg·L^-1以下及KT的浓度降为0.2mg·L^-1以下，当不定芽增殖速度减慢而达不到所需的增殖速度时，将6-BA浓度提高为0.5mg·L^-1以上及KT的浓度提高为0.5mg·L^-1以上。如此反复，可获得较理想的不定芽增殖效果。当不定芽增殖数量达到一定规模时，根据生产的需要，即可进行生根培养，从而获得完整的再生植株。

实施例二

C、选择刚展开而未转色的叶片作为外植体材料；

D、愈伤组织的诱导：

(2)将消毒好的所述小块叶片切除边缘受升汞毒害的部分，并将所述小块叶片切割成1cm×1cm大小的叶片切块，转入诱导愈伤形成的培养基中，叶面朝上平放在培养基上。每瓶3～5片。诱导愈伤培养基为：1/3MS+2，4-D 0.8mg·L^-1+6-BA1.5mg·L^-1+白糖3％+琼脂粉0.6％，pH 5.8～6.0。所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；6-BA即6-苄氨基嘌呤；

(3)培养条件：黑暗，温度24～26℃，培养时间30～60天；

E.不定芽的分化：

(1)当作为外植体的所述叶片切块的边缘产生1mm大小的黄色颗粒状愈伤组织块时，立刻将带有所述愈伤组织块的所述叶片切块转入一级分化培养基中，一级分化培养基为1/2MS+6-BA 0.3mg·L^-1+KT 0.5mg·L^-1。培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为24～26℃，培养周期40～50天。1/2MS即NH₄NO3、KNO3、MgSO4.7H2O、KH2PO4用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(2)当所述叶片切块上的所述愈伤组织块转绿并增大到3~4mm的颗粒时，将所述愈伤组织块切下，转入二级分化培养基中，二级分化培养基为1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+KT1.0mg·L^-1，培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为25℃。培养周期40～50天。1/2MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(3)当所述愈伤组织块在二级分化培养基上培养40～50天时，部分颗粒状的愈伤组织顶端开始有不定芽产生。不同品种产生不定丛芽的速度有所不同。将已经产生不定芽的团块切下，接种到芽增殖培养基中，增殖培养基为1/2MS+6-BA 0～0.8mg·L^-1+KT 0～0.8 mg·L^-1。每30～40天继代培养一次。未产生不定芽的愈伤团块则继续在二级分化培养基中进行培养。所述1/2MS即NH4NO3、KNO3、MgSO4.7H2O、KH2PO4用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(4)根据增殖培养基中不定芽的所述团块(丛芽团块)的生长情况，对所述增殖培养基进行适当的调整。如增殖率很高，增殖系数超过3.0，并且植株较细小时，说明繁殖速度过快，易于产生变异或不利于小芽的生长，这时可将6-BA浓度降低为0.2mg·L^-1以下及KT的浓度降为0.2mg·L^-1以下，以利于不定芽的生长；当不定芽增殖速度减慢而达不到所需的增殖速度时，适当提高激素比例，如将6-BA浓度提高为0.5mg·L^-1以上及KT的浓度提高为0.5mg·L^-1以上。如此反复，可获得较理想的不定芽增殖效果。当不定芽增殖数量达到一定规模时，根据生产的需要，即可进行生根培养，从而获得完整的再生植株。

实施例三

C、选择刚展开而未转色的叶片作为外植体材料；

D、愈伤组织的诱导：

(2)将消毒好的所述小块叶片切除边缘受升汞毒害的部分，并将所述小块叶片切割成1cm×1cm大小的叶片切块，转入诱导愈伤形成的培养基中，叶面朝上平放在培养基上。每瓶3～5片。诱导愈伤培养基为：1/3MS+2，4-D 1.0mg·L^-1+6-BA2.0mg·L^-1+白糖3％+琼脂粉0.6％，pH 5.8～6.0。所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；6-BA即6-苄氨基嘌呤；

(3)培养条件：黑暗，温度24～26℃，培养时间30～60天；

E.不定芽的分化：

(1)当作为外植体的所述叶片切块的边缘产生1mm大小的黄色颗粒状愈伤组织块时，立刻将带有所述愈伤组织块的所述叶片切块转入一级分化培养基中，一级分化培养基为1/2MS+6-BA 0.5mg·L^-1+KT 0.5mg·L^-1。培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为24～26℃，培养周期40～50天。1/2MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(2)当所述叶片切块上的所述愈伤组织块转绿并增大到3～4mm的颗粒时，将所述愈伤组织块切下，转入二级分化培养基中，二级分化培养基为1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+KT 1.0mg·L^-1，培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为26℃，培养周期40～50天。1/2MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(4)根据增殖培养基中不定芽的所述团块(丛芽团块)的生长情况，对所述增殖培养基进行适当的调整。如增殖率很高，增殖系数超过3.0，并且植株较细小时，说明繁殖速度过快，易于产生变异或不利于小芽的生长，这时可将6-BA浓度降低为0.2mg·L^-1以下及KT的浓度降为0.2mg·L^-1以下，当不定芽增殖速度减慢而达不到所需的增殖速度时，适当提高激素比例，如将6-BA浓度提高为0.5以上mg·L^-1及KT的浓度提高为0.5以上mg·L^-1。如此反复，可获得较理想的不定芽增殖效果。当不定芽增殖数量达到一定规模时，根据生产的需要，即可进行生根培养，从而获得完整的再生植株。

实施例四

C、选择刚展开而未转色的叶片作为外植体材料；

D、愈伤组织的诱导：

(2)将消毒好的所述小块叶片切除边缘受升汞毒害的部分，并将所述小块叶片切割成1cm×1cm大小的叶片切块，转入诱导愈伤形成的培养基中，叶面朝上平放在培养基上。每瓶3～5片。诱导愈伤培养基为：1/3MS+2，4-D 1.0mg·L^-1+6-BA1.5mg·L^-1+白糖3％+琼脂粉0.6％，pH 5.8～6.0。所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；6-BA即6-苄氨基嘌呤；

(3)培养条件：黑暗，温度26℃，培养时间30～60天；

E.不定芽的分化：

(2)当所述叶片切块上的所述愈伤组织块转绿并增大到3～4mm的颗粒时，将所述愈伤组织块切下，转入二级分化培养基中，二级分化培养基为1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+KT1.0mg·L^-1，培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为24～26℃，培养周期40～50天。1/2MS即NH₄NO₃、KNO3、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(4)根据增殖培养基中不定芽的所述团块(丛芽团块)的生长情况，对所述增殖培养基进行适当的调整。如增殖率很高，增殖系数超过3.0，并且植株较细小时，说明繁殖速度过快，易于产生变异或不利于小芽的生长，这时可将所有的激素去掉，加活性炭1g·L^-1，当不定芽增殖速度减慢而达不到所需的增殖速度时，适当提高激素比例，如将6-BA浓度提高为0.5以上mg·L^-1及KT的浓度提高为0.5以上mg·L^-1。如此反复，可获得较理想的不定芽增殖效果。当不定芽增殖数量达到一定规模时，根据生产的需要，即可进行生根培养，从而获得完整的再生植株。

Claims

1.一种提高红掌愈伤组织快速分化成芽的方法，其特征在于包括如下步骤：

A、选用目前较难诱导出愈伤组织或其愈伤组织较难分化成不定芽的红掌品种作为作种的红掌品种，包括：深色水晶花烛A.andraeanum‘Clavinervium’、观叶花烛A.andraeanum‘Jungle King’、通红火鹤Anthurium scherzerianum、大哥大A.andraeanum‘Dakota’、热情A.andraeanum‘Tropical’、塔妮斯A.andraeanum‘Tenessee’、橙恋A.andraeanum‘Feroza’、孖宝A.andraeanum‘ZiBao’、绿翡翠A.andraeanum‘Casparo’、粉佳人A.andraeanum‘Texana’、格莱佛火鹤A.andraeanum‘Graffity’；

C、选择刚展开而未转色的叶片作为外植体材料；

D、愈伤组织的诱导：

(1)采回的所述叶片，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花蘸按重量计的0.5％的洗衣粉水轻擦上下表面，再在自来水下冲洗干净5～10分钟；在洁净工作台上，将所述叶片切割成2cm×2cm大小的小块叶片，并放入0.10％升汞溶液中进行浸泡消毒8～10分钟，并不断摇动；然后将所述小块叶片取出，在无菌水中漂洗4～5次，每次5～6分钟；后浸入无菌水中备用；

(2)将消毒好的所述小块叶片切除边缘受升汞毒害的部分，并将所述小块叶片切割成1cm×1cm大小的叶片切块，转入诱导愈伤形成的培养基中，叶面朝上平放在培养基上；每瓶3～5片；诱导愈伤培养基为：1/3MS+2，4-D 0.5～1.0mg·L^-1+6-BA1.0～2.0mg·L^-1+白糖3％+琼脂粉0.6％，pH 5.8～6.0；所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；6-BA即6-苄氨基嘌呤；

(3)培养条件：黑暗，温度24～26℃，培养时间30～60天；

E.不定芽的分化：

(1)当作为外植体的所述叶片切块的边缘产生1mm大小的黄色颗粒状愈伤组织块时，立刻将带有所述愈伤组织块的所述叶片切块转入一级分化培养基中，一级分化培养基为1/2MS+6-BA0.2～0.5mg·L^-1+KT 0.3～0.5mg·L^-1；培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为24～26℃；培养周期40～50天；1/2MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(2)当所述叶片切块上的所述愈伤组织块转绿并增大到3～4mm的颗粒时，将所述愈伤组织块切下，转入二级分化培养基中，二级分化培养基为1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+KT1.0mg·L^-1，培养条件为：光照强度12.5～19μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，温度为24～26℃；培养周期40～50天；1/2MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(3)当所述愈伤组织块在二级分化培养基上培养40～50天时，部分颗粒状的愈伤组织顶端开始有不定芽产生；将已经产生不定芽的团块切下，接种到芽增殖培养基中，增殖培养基为1/2MS+6-BA 0～0.8mg·L^-1+KT 0～0.8mg·L^-1；每30～40天继代培养一次；未产生不定芽的愈伤团块则继续在二级分化培养基中进行培养；1/2MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/2，其它元素的用量不变；6-BA即6-苄氨基嘌呤；KT即6-糠氨基嘌呤；

(4)根据增殖培养基中不定芽的所述团块的生长情况，对所述增殖培养基进行适当的调整；增殖系数超过3.0，并且植株较细小时，说明繁殖速度过快，易于产生变异或不利于小芽的生长，这时将6-BA浓度降低为0.2mg·L^-1以下及KT的浓度降为0.2mg·L^-1以下，或将所有的激素去掉，加活性炭1g·L^-1”；

当不定芽增殖速度减慢而达不到所需的增殖速度，将6-BA浓度提高为0.5mg·L^-1以上及KT的浓度提高为0.5mg·L^-1以上；如此反复，可获得较理想的不定芽增殖效果。