CN101940163B

CN101940163B - 地涌金莲植株的组培快繁方法

Info

Publication number: CN101940163B
Application number: CN2010105052165A
Authority: CN
Inventors: 刘秀贤; 李正红; 马宏; 万友名
Original assignee: Research Institute of Resource Insects of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Resource Insects of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2010-10-13
Filing date: 2010-10-13
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-10-13
Also published as: CN101940163A

Abstract

本发明提供一种地涌金莲植株的组培快繁方法，它以即将开放的花序为外植体，接入诱导培养基中诱导培养愈伤组织，之后接种于不定芽分化培养基中培养分化出芽，将分化芽切成带适量基盘组织的单芽，接种于增殖培养基中培养得丛生芽，将丛生芽分切成单株，接种于生根培养基中，培养成生根苗，经炼苗得移栽苗。不仅取材容易、方便，而且外植体数量众多，一个花序可取数百个外植体，同时被苞片紧紧包裹的花序不带病菌，因为病菌很难浸入到其中，因此清洗、消毒灭菌非常方便，经特配的诱导培养基、不定芽分化培养基、增殖培养基、生根培养基的依次培养，即获得健康移栽苗，移栽后成活率高达90％以上，完全能够满足市场对地涌金莲的需求量。

Description

地涌金莲植株的组培快繁方法

技术领域

本发明涉及一种植物的组培快繁方法，尤其是地涌金莲植株的组培快繁方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

地涌金莲(Musella lasiocarpa)又名地金莲、地涌莲、地母金莲，是芭蕉科(Musaceae)地涌金莲属具根状茎的多年生大型丛生草本植物，为中国特有单属种，主要分布于云南中部和西部海拔1500～2500米的山间坡地，四川省临近云南的部分地区也有少量分布。其花形奇特，花色鲜艳，观赏期长达200多天，是极富观赏价值和地方特色的珍稀花卉；同时还具有药用、食用、饲料、纺织和水土保持等多方面的作用。现有的地涌金莲组织培养方法，均以吸芽为外植体，并经过诱导不定芽的分化、增殖和生根培养等步骤。这种方法存在的不足是：由于地涌金莲植株上的吸芽数量较为有限，一般每株地涌金莲只萌生3～6株吸芽，且通常情况下吸芽基部都深埋于土中，不仅取材困难，而且常会因携带大量病菌，而难于清洗灭菌，甚至无法进行组织培养，从而难于获得无菌材料，极大影响了地涌金莲植株的产量，难于满足市场对地涌金莲植株的需求量，阻碍了这一观赏价值高、发展潜力大、应用广泛的地涌金莲的推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种取材容易，数量多，带菌少，繁殖系数高，容易获得无菌材料的地涌金莲植株的组培快繁方法。

本发明通过以下技术方案实现：一种地涌金莲植株的组培快繁方法，其特征在于经过下列步骤：

A、将消毒灭菌的外植体接入下列愈伤组织诱导培养基中：

改良MS

6-BA 1.0～6.0 mg/L

NAA 1.0～6.0 mg/L

蔗糖 20～40 g/L

于20～30℃黑暗条件下，培养诱导愈伤组织30～50天，诱导出愈伤组织；

B、将A步骤诱导出的愈伤组织接种于下列不定芽分化培养基中：

改良MS

6-BA 0.0～3.0 mg/L

NAA 0.0～0.04 mg/L

蔗糖 20～40 g/L

在温度为20～30℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为30～50μmol/m²·s的条件下，进行不定芽分化培养30～40天，得分化芽；未分化的愈伤组织再转入新的与上述不定芽分化培养基相同的培养基中转培养；

C、将B步骤的分化芽切成带适量基盘组织的单芽，接种于下列增殖培养基中：

改良MS

6-BA 1.0～5.0 mg/L

NAA 0.1～0.5 mg/L

蔗糖 20～40 g/L

在温度为20～30℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为30～50μmol/m²·s的条件下，增殖培养20～40天，再转入新的与上述增殖培养基相同的培养基中，按相同培养条件转培养一次，得丛生芽；

D、将C步骤增殖培养的丛生芽分切成单株，接种于下列生根培养基中：

1/4改良MS

IBA 0.2～1.0 mg/L

蔗糖 10～30 g/L

在温度为20～30℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为30～50μmo/m²·s的条件下培养15～25天，得生根苗；

E、将D步骤的生根苗移至湿度为70～85％的炼苗棚中，揭盖炼苗3～5天，取出生根苗，洗去根部培养基，移栽到消毒营养袋中，于湿度为70～85％的条件下培养1周后，得移栽苗。

所述A步骤的消毒灭菌的外植体是：将田间即将开放的花序切下，剥去外层苞片，先用质量浓度为0.2～2％的次氯酸钠溶液浸泡5～15分钟，无菌水冲洗3～5次，再用质量浓度为0.1～1％的升汞溶液浸泡5～20分钟，无菌水冲洗4～8次，无菌滤纸吸干表面水分，即得消毒灭菌的外植体。

所述B步骤的不定芽分化培养的转接为每30～40天转接一次，分化率均不低于10％。

所述E步骤的消毒营养袋，是指经800～1000倍甲基托布津消毒的营养袋。

本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：本发明以即将开放的被苞片紧紧包裹的地涌金莲花序作为外植体，不仅取材容易、方便，而且外植体数量众多，一个花序可取数百个外植体，同时被苞片紧紧包裹的花序不带病菌，因为病菌很难浸入到其中，因此清洗、消毒灭菌非常方便，经特配的诱导培养基、不定芽分化培养基、增殖培养基、生根培养基的依次培养，即获得健康移栽苗，移栽后成活率高达90％以上，完全能够满足市场对地涌金莲的需求量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

A、愈伤组织诱导：取田间即将开放的地涌金莲花序，剥去外层苞片，在超净工作台上先用质量浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗3次，再用质量浓度为0.1％的升汞溶液浸泡20分钟，无菌水冲洗4次，用无菌滤纸吸干表面水分后，接入愈伤组织诱导培养基中：改良MS，1.0mg·L^-16-BA，6.0mg·L^-1NAA，20.0g·L^-1蔗糖，25℃暗培养30天，诱导出愈伤组织，愈伤组织诱导率为64.0％；

B、愈伤组织不定芽分化：将A步骤诱导出的愈伤组织接种于愈伤组织不定芽分化培养基中：改良MS，30.0g·L^-1蔗糖，在培养温度为25℃，光照时间为12h·d^-1，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1的条件下，培养30天，转接到新的本步骤所述愈伤组织不定芽分化培养基中，在相同条件下培养，使愈伤组织不定芽分化出芽，分化率为10％；未分化的愈伤组织继续转接，每次分化率均不低于10％；

C、增殖培养：将B步骤愈伤组织分化出的芽，切割成带适量基盘组织的单芽，接种于增殖培养基中：改良MS，1.0mg·L^-16-BA，0.1mg·L^-1NAA，20.0g·L^-1蔗糖，在培养温度为25℃，光照时间为12h·d^-1，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1的条件下，培养30天；再转接至新的本步骤所述增殖培养基中，按相同条件培养一次，得丛生芽，增殖率为4.5％；

D、生根培养：将C步骤增殖培养的丛生芽分切成单株，接种于生根培养基中：1/4改良MS，0.2mg·L^-1IBA，10.0g·L^-1蔗糖，在培养温度为25℃，光照时间为12h·d^-1，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1的条件下进行生根培养，15天生根率达100％，平均生根4.1条，根长3.1cm；

E、组培苗移栽：将D步骤的生根组培苗移至湿度为70％的炼苗棚揭盖炼苗3天，取出生根幼苗，洗去根部培养基，移栽到经1000倍甲基托布津消毒的营养袋中，于湿度为70％的条件下培养，1周后逐步降低湿度，得移栽苗，成活率达90％。

实施例2

A、愈伤组织诱导：取田间刚要开放的地涌金莲花序，剥去外层苞片，在超净工作台上先用0.2％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，无菌水冲洗5次，再用1％升汞溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面水分，接入愈伤组织诱导培养基中：改良MS，2.0mg·L^-16-B A，3.0mg·L^-1NAA，30.0g·L^-1蔗糖，在20℃暗培养50天，诱导出愈伤组织，愈伤组织诱导为76.0％；

B、愈伤组织不定芽分化：将A步骤诱导出的愈伤组织接种于愈伤组织不定芽分化培养基中：改良MS，2.0mg·L^-16-BA，0.02mg·L^-1NAA，20.0g·L^-1蔗糖，在培养温度为20℃，光照时间为8h·d^-1，光强度为30μmol·m^-2·s^-1的条件下，培养40天，再转接到新的本步骤所述愈伤组织分化培养基中，培养40天，如此转接培养两次，愈伤组织不定芽分化出芽，分化率为18.3％，未分化的愈伤组织继续转接，每次分化率均不低于18％；

C、增殖培养：将B步骤愈伤组织分化出的芽，切割成带适量基盘组织的单芽，接种于增殖培养基中：改良MS，3.0mg·L^-16-BA，0.3mg·L^-1NAA，30.0g·L^-1蔗糖，在培养温度为20℃，光照时间为8h·d^-1，光强度为30μmol·m^-2·s^-1的条件下，培养20天，再转接到新的本步骤所述增殖培养基中，按相同条件培养一次，增殖率为4.8；

D、生根培养：将C步骤增殖培养的丛生芽分切成单株，接种于生根培养基中：1/4改良MS，0.5mg·L^-1IBA，20.0g·L^-1蔗糖，在培养温度为20℃，光照时间为8h·d^-1，光强度为30μmol·m^-2·s^-1的条件下进行生根培养，25天生根率达100％，平均生根4.6条，根长3.4cm；

E、组培苗移栽：将D步骤的生根组培苗移至相对湿度80％的炼苗棚揭盖炼苗4d，取出生根幼苗，洗去根部培养基，移栽到经800倍甲基托布津消毒的营养袋中，于湿度为80％的条件培养，1周后逐步降低湿度，得移栽苗，成活率达91％。

实施例3

A、愈伤组织诱导：取田间刚要开放的地涌金莲花序，剥去外层苞片，在超净工作台上先用1％次氯酸钠溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗4次，再用0.5％升汞溶液浸泡15分钟，无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干表面水分，接入愈伤组织诱导培养基中：改良MS，6.0mg·L^-16-BA，1.0mg·L^-1NAA，40.0g·L^-1蔗糖，30℃暗培养40天，诱导出愈伤组织，愈伤组织诱导为30.0％。

B、愈伤组织不定芽分化：将上述诱导出的愈伤组织接种于愈伤组织不定芽分化培养基中：改良MS，3.0mg·L^-16-BA，0.04mg·L^-1NAA，40.0g·L^-1蔗糖，在培养温度为30℃，光照时间为10h·d^-1，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1的条件下，培养35天，再转接至新的本步骤所述愈伤组织分化培养基中，培养35天，如此转接培养两次，愈伤组织不定芽分化出芽，分化率为13.2％，未分化的愈伤组织继续转接，每次分化率均不低于13％；

C、增殖培养：将愈伤组织分化出的芽，切割成带适量基盘组织的单芽，接种于增殖培养基中：改良MS，5.0mg·L^-16-BA，0.5mg·L^-1NAA，40.0g·L^-1蔗糖，在培养温度为30℃，光照时间为10h·d^-1，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1的条件下培养40天，再转接到新的本步骤所述增殖培养基中，按相同条件培养一次，增殖率为4.8；

D、生根培养：将增殖培养的丛生芽分切成单株，接种于生根培养基中：1/4改良MS，1.0mg·L^-1IBA，30.0g·L^-1蔗糖，在培养温度为30℃，光照时间为10h·d^-1，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1的条件下进行生根培养，20天生根率达100％，平均生根4.4条，根长3.4cm；

E、组培苗移栽：将生根组培苗移至相对湿度85％的炼苗棚揭盖炼苗5天，取出生根幼苗，洗去根部培养基，移栽到经900倍甲基托布津消毒的营养袋中，于湿度为85％的条件培养，1周后逐步降低湿度，得移栽苗，成活率达95.2％。

Claims

1.一种地涌金莲植株的组培快繁方法，其特征在于经过下列步骤：

A、将消毒灭菌的外植体接入下列愈伤组织诱导培养基中：

改良MS

6-BA 1.0～6.0 mg/L

NAA 1.0～6.0 mg/L

蔗糖 20～40 g/L

于20～30℃黑暗条件下，培养诱导愈伤组织30～50天，诱导出愈伤组织，其中，所述的消毒灭菌的外植体是：将田间即将开放的花序切下，剥去外层苞片，先用质量浓度为0.2～2％的次氯酸钠溶液浸泡5～15分钟，无菌水冲洗3～5次，再用质量浓度为0.1～1％的升汞溶液浸泡5～20分钟，无菌水冲洗4～8次，无菌滤纸吸干表面水分，即得消毒灭菌的外植体；

改良MS

6-BA 0.0～3.0 mg/L

NAA 0.0～0.04 mg/L

蔗糖 20～40 g/L

改良MS

6-BA 1.0～5.0 mg/L

NAA 0.1～0.5 mg/L

蔗糖 20～40 g/L

1/4改良MS

IBA 0.2～1.0 mg/L

蔗糖 10～30 g/L

2.根据权利要求1所述的地涌金莲植株的组培快繁方法，其特征在于所述B步骤的不定芽分化培养的转接为每30～40天转接一次，分化率均不低于10％。

3.根据权利要求1所述的地涌金莲植株的组培快繁方法，其特征在于所述E步骤的消毒营养袋，是指经800～1000倍甲基托布津消毒的营养袋。