CN1362993A - pyrF基因及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及pyrF基因及其用途,其可作为在栓菌属、革盖菌属或多孔菌属真菌中生产蛋白质的表达系统的选择标记基因。pyrF基因的特征在于其包含DNA序列SEQ ID NO:1的位置1133直至并包含位置1877,或包含DNA序列SEQ ID NO:2的位置1直至并包含位置684,或包含一DNA序列,该序列与DNA序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的所述区域的序列同源性超过60%。

Description

pyrF基因及其用途
本发明与一pyrF基因及其用作表达系统选择标记基因于栓菌属(Trametes)、革盖菌属(Coriolus)或多孔菌属(Polyporus)真菌内制造蛋白质有关。
用以制造蛋白质的各种原核生物型及真核生物型表达系统业经公开。德国专利申请案DE-A-19814853中曾详细述及有关此方面的既有技术。DE-A-19814853本身曾揭示一种转化栓菌属及多孔菌属丝状真菌的方法，利用该方法总是可大幅提高所表达蛋白质的制造速率。该专利申请案曾揭示若干表达载体，该等表达载体包括：于担子菌纲的丝状真菌内实施表达作用的遗传调节元件。担子菌纲的丝状真菌实施转化作用时，该等遗传调节元件容许依据营养缺陷型基因缺陷的互补作用以选择阳性转化体(株)。
DE-A-19814853中所揭示的基因缺陷与pyrG基因有关。该基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶。DE-A-19814853亦曾揭示若干附有pyrG基因内缺陷的菌株，该等菌株仅在有尿苷存在的情况下可在基本培养基上生长(尿苷营养缺陷型)。在该等菌株利用包括一完整pyrG基因的脱氧核糖核酸(DNA)载体实施转化作用之后，无需尿苷，该等尿苷缺陷营养型的菌株再度在基本培养基上生长(尿苷原养型)。
藉用基因毒性物质5-氟乳清酸(FOA)的处理，以最新技术将尿苷—营养缺陷型菌株分离出来(伯克等人，酶学方法(1987)154，第164至175页)。以5-氟乳清酸处理而产生的尿苷—营养缺陷型菌株，在pyrG基因内或在pyrF基因内有一基因缺陷。该pyrF基因亦称尿嘧啶5(ura5)基因。该基因编码乳清酸磷酸核糖基转移酶。
若担子菌纲的完整pyrF基因可作为有效转化作用的选择标记基因，pyrF基因内具有缺陷的尿苷—营养缺陷型担子菌纲菌株亦将成为转化作用的宝贵菌株，以制造蛋白质。但目前曾述及的pyrF基因仅是用于子囊菌纲的真菌者，例如：Podospora anserina(基因53(1987)，201至209页)，乳克鲁维氏酵母(kluyveromyces lactis)(未公开，该DNA序列是以提取号码klj001358.gb_pl寄存在“基因库”资料库内)或Yarrowia lipolytica(桑其斯等人，酵母11(1995)，425至433页)。另一方面，担子菌纲(例如：栓菌属、革盖菌属或多孔菌属)丝状真菌的pyrF基因则未经公开。
本发明的一个目的是提供担子菌纲丝状真菌的pyrF基因。该等基因适用作尿苷—营养缺陷的菌株转化作用的选择标记基因。
本发明涉及编码具有乳清酸磷酸核糖基转移酶酶活性(pyrF活性)的蛋白质的DNA序列，该序列包括染色体DNA序列的SEQ IDNO：1自位置1133直至并包含位置1877，或包括cDNA序列SEQ IDNO：2自位置1直至并包含位置684，或包括一DNA序列，该DNA序列与DNA序列SEQ ID NO：1或DNA序列SEQ ID NO：2具有超过60％的序列同源性。
一适合的DNA序列与该DNA序列SEQ ID NO：2具有超过70％的序列同源性。
在一特别适合的实施方案中，本发明包括一DNA序列，该DNA序列与该DNA序列SEQ ID NO：2具有超过80％的序列同源性。
上述本发明内的所有同源性数值与电脑程序“威斯康辛套装9.1版，遗传学电脑组(GCG)，参迪逊，威斯康辛”所得的结果有关。同源性是利用次程序“blast”及预定值(命中频率10.0)藉搜索资料库而测定。随后利用次程序“gap”对相似性最高的序列加以检验以求得同源性。其中是利用预定参数“缺口产生罚分50”及“缺口延伸罚分3”以比较DNA序列。并利用预定参数“缺口加权8”及长度加权2”以比较氨基酸序列。
本发明DNA序列SEQ ID NO：1自位置1133直至并包含位置1225及自位置1287直至并包含位置1877，及自该DNA序列衍生的cDNA序列SEQ ID NO：2自位置1直至并包含位置684编码具有pyrF活性的蛋白质。
所以本发明亦涉及一具有pyrF活性的蛋白质，该蛋白质包括氨基酸序列SEQ ID NO：3或包括一氨基酸序列，该氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：3的序列同源性超过60％。
优选的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：3的序列同源性超过70％。
本发明内特别适合的氨基酸序列是与氨基酸序列SEQ ID NO3具有超过80％序列同源性。
DNA序列SEQ ID NO：1自位置1226直至并包含位置1226是一插入序列，该插入序列未经转译成氨基酸序列。
DNA序列SEQ ID NO：1自位置1至位置1132代表变色栓菌(Trametes versicolor)pyrF基因转录作用启动子区的DNA序列。该启动子序列可由转录作用的任何其他启动子序列替代。
举例言之，本发明的DNA序列可从担子菌菌株变色栓菌TV-1(以编码DSM11523寄存于德意志微生物保藏中心，D-38124不伦瑞克)克隆而制得。为达成此目的，藉习知方法建立一变色栓菌TV-1基因文库。该文库可以是一cDNA或一基因组基因文库。
本发明的DNA序列是利用含有pyrF特定DNA序列的DNA探针自基因文库分离出来。举例言之，利用变色栓菌TV-1基因组DNA的DNA引物，藉聚合酶链反应可制得该等DNA探针。
所用引物是长度最好为23至26碱基对的简并DNA片段，该等DNA片段的序列是经与习知pyrF基因序列比较而建立者。适作引物的DNA片段最好是由所建DNA片段的寡核苷酸合成制得。举例言之，本发明的pyrF基因可依照实施例1至3内所述分离出来。
举例言之，经如此分离出来的pyrF基因，藉精于此项技术人员习知的技术，(例如：定点诱变)，于序列内任何预期的位置，可加以修饰。所以本发明亦包括一DNA序列，该DNA序列可编码一具有pyrF活性的蛋白质，该蛋白质所包括的DNA序列与DNA序列SEQID NO：2自位置1直至并包含位置684的序列同源性超过60％，但以超过70％较佳，尤以超过80％更佳。
为表达本发明的DNA，将其以习知的方式克隆于一表达载体内，该含有pyrF基因的表达载体导入一微生物内且在该微生物内加以表达。
所以本发明亦与一表达载体有关，该表达载体包括本发明pyrF基因。
本发明的表达载体特别适于表达基因，该等基因编码栓菌属、革盖菌属及多孔菌属宿主微生物内的蛋白质。为达成本发明的目的，编码蛋白质的基因亦意谓自蛋白质结构基因衍生的cDNA。该等蛋白质可能是宿主微生物的异种蛋白质或宿主微生物的同种蛋白质。
因此本发明的表达载体最好亦包括至少一种编码待表达蛋白质的基因。
本发明的表达载体最好包括至少一种基因，该基因编码一水解酶(例如：选自由纤维素酶、半纤维素酶及脂肪酶所组成的组或选自由氧化还原酶，如：木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维二糖—醌氧化还原酶或纤维二糖氧化酶所组成的组)。
本发明的表达载体最好包括一种漆酶的基因。
本发明的表达载体可以是一DNA结构，该DNA结构是整合在宿主微生物的基因组内并连同后者加以复制。另一变通方式是，该表达载体可以是一自主复制DNA结构(该结构未经整合在宿主基因组内)，例如：一质粒、一人造染色体或一相当的染色体外遗传元件。
本发明的表达载体应最好亦包括下列遗传元件：
在宿主微生物内介导蛋白质编码基因表达的启动子。该启动子应最好是一强启动子，由此可确保高度表达效率。该启动子优选与待表达基因的5’端功能相连。该启动子可源自待表达的基因，或者可用外来基因的启动子。
适当及优选的启动子是选自在担子菌纲丝状真菌内具有活性的启动子组，例如：来自变色栓菌的GAPDH启动子、来自变色栓菌或Polyporus pinsitus的漆酶基因的启动子、来自毛革盖菌用于鸟氨酸转氨甲酰酶基因或GAPDH基因的启动子或来自双孢蘑菇的GAPDH启动子。
来自变色栓菌的GAPDH启动子最适合。该启动子曾于德国专利申请案DE-A-19814853的实施例5及DE-A-19814853的SEQ IDNO：3，碱基1-1542中揭示出来。
该表达载体应该亦最好包括：宿主微生物终止转录的适当信号及在真核生物内聚腺苷酸化作用所需的另外信号，该等信号与待表达基因的3’端功能相连。举例言之，该等用以终止转录作用及聚腺苷酸化作用的信号如SEQ ID NO：1，碱基对1878-3448所示。
所用转录终止子可以是待表达的蛋白质编码基因的终止子或外来基因的终止子。所用者最好是来自漆酶基因的转录终止子。
蛋白质表达的实施可在细胞内，或在有可发挥分泌功能的信号序列存在的情况下，亦可在细胞外。
若经表达的蛋白质需要自细胞中分泌出来，本发明的表达载体最好包括一个可在蛋白质编码基因5’上游发挥功能的信号序列。功能上与蛋白质编码基因5’端相连的所谓分泌载体亦可存在于本发明的表达载体内。
该分泌载体可以是分泌蛋白质所需的基因或分泌蛋白质所需的基因的片段。该分泌载体可能在功能上与待分泌蛋白质适当地相连，从而自分泌载体及待分泌蛋白质产生一融合蛋白。在另一实施方案中，分泌载体与待分泌蛋白质的连接是经适当设计，从而分泌载体可自待分泌蛋白质分开。举例言之，藉将蛋白质裂解酶所需的识别序列插入分泌载体与待分泌蛋白质间的连接位点内，即可达到此目的。可提及的此类实例是所谓KEX2蛋白酶的赖氨酸—精氨酸识别序列，分泌载体的实例是来自黑曲霉的葡糖淀粉酶(康特勒拉斯等人，生物技术(1991)9，378-381，布鲁奎孙等人，生物技术学报(1993)31，135-145)。
除于表达中及表达基因的分泌作用中，在蛋白质编码基因3’端作为转录终止子之外相关的DNA序列，同样地可出现在本发明的DNA载体内。其一个实例是由来自粗糙链孢霉的漆酶基因提供，该基因的3’端含有13个氨基酸的序列，在蛋白质分泌过程中该等氨基酸消失(被删除)且不再存在于成熟蛋白质内(杰尔曼等人，生物化学学报(1988)263，885-896)。
本发明的表达载体是以既有技术习知的方法制备。其各种可能性将于下列诸实施例中加以说明。精于此项技术者可将其中所述的方法应用于任何其他预期的载体、抗性基因、调节元件及结构基因。
本发明更与包括本发明表达载体的微生物有关。
适于表达本发明表达载体的微生物是来自担子菌纲丝状真菌的菌株。
来自栓菌属、革盖菌属及多孔菌属的菌株最适当。
来自栓菌属、革盖菌属及多孔菌属的菌株是最适合的宿主微生物。
变色栓菌的宿主微生物最适合。
该宿主微生物最好是藉代谢作用中具有一基因缺陷(营养缺陷)而加以清楚地识别，基于此主要代谢物尿苷不再能合成，不添加此代谢物该宿主微生物在基本培养基上不再能生长。
本发明的表达载体容许：在转化选自栓菌属、革盖菌属及多孔菌属的真菌时，基于宿主微生物内营养缺陷型基因缺陷的互补作用，选择阳性转化株。
本发明的表达载体适于制造真菌型菌株，该等菌株可有效地表达及分泌蛋白质。
所以本发明亦涉及产生真菌菌株的方法，该等菌株可有效地表达及分泌蛋白质。
此方法包括：利用选自栓菌属、革盖菌属及多孔菌属的尿苷—营养缺陷型真菌(其在pyrF基因内具有基因缺陷)作为宿主菌株，在该方法中，利用习知的加工步骤，藉一表达载体(该载体具有一互补宿主菌株内营养缺陷型基因缺陷的基因)，于一转化混合物内转化作为宿主菌株的具有营养缺陷型基因缺陷的真菌，经以表达载体转化的克隆是藉选择营养缺陷型基因缺陷的互补作用自转化混合物中选得，此处互补宿主菌株内营养缺陷型基因缺陷的基因的表达是藉一在该宿主菌株内具有活性的基因调节元件加以控制。
用以实施基因表达作用的适合宿主是一来自栓菌属、革盖菌属或多孔菌属的单核生物型担子菌。
特别适合基因表达的宿主是pyrF基因内具有缺失且是尿苷营养缺陷的变色栓菌。
本发明亦涉及：①一表达系统，该表达系统包括一宿主菌株，该宿主菌株是选自在代谢作用中具有一基因缺陷的栓菌属、革盖菌属及多孔菌属，基于该代谢作用缺陷，生长所必需的代谢物尿苷不再能合成，不添加该代谢物，该宿主菌株不再能在基本培养基上生长，②一表达载体，该表达载体包括一选择标记基因，该选择标记基因互补该宿主菌株的营养缺陷型基因缺陷，其中该宿主菌株在pyrF基因内有一缺失作为代谢作用的基因缺陷，且选择标记基因是pyrF基因。
该pyrF基因最好是衍生自蘑菇属、革盖菌属、多孔菌属、灰侧耳菌属(Pleurotus)、Phanerochaete、裂褶菌属(Schizophyllum)或栓菌属之一种真菌。
特别适当作为本发明表达系统选择标记基因者是来自担子菌纲变色栓菌丝状真菌的乳清酸磷酸核糖基转移酶基因(pyrF基因)。
本发明的表达载体特别适于表达pyrF基因。
来自担子菌纲变色栓菌的pyrF基因的表达最好是由来自变色栓菌的启动子及(合适时)终止子加以调节。
本发明的表达系统最好适于表达一基因，该基因编码—水解酶编码，举例言之，该水解酶是选自一个由蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶及脂肪酶所组成的组或选自一个由木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维素二糖—醌氧化还原酶或纤维素二糖氧化酶等氧化还原酶所组成的组。
特别适当及适合的是表达漆酶基因。
实施宿主菌株转化作用是采用对应于既有技术的方法。该等方法包含：藉CaCl2/PEG法的原生质体转化作用，藉电穿孔法的转化作用或藉含DNA微弹丸轰击的biolistic转化作用。该等方法在标准教科书中均曾述及。
举例言之，待转化的基因是以习知的方式克隆在本发明的表达载体中并藉上述方法导入选自栓菌属、革盖菌属及多孔菌属的丝状真菌内。
待转化的基因亦可克隆在无选择标记基因的表达载体中且与在宿主菌株内互补该营养缺陷型基因缺陷的载体一起应用以产生转化株(共转化)。
转化作用所用的菌株是一选自栓菌属、革盖菌属及多孔菌属的尿苷—营养缺陷型丝状真菌。来自担子菌纲的相关菌株可以是一单核型菌株或一双核型菌株。在一适合实施方案中，pyrF基因内具有一缺失的菌株系一尿苷营养缺陷型菌株。
来自变色栓菌的单核型尿苷营养缺陷型pyrF缺陷的菌株特别适合于转化作用。
举例言之，以载体DNA转化之后，藉将原生质体置于一培养基上可实施阳性转化株的选择，为原生质体的渗透安定，该培养基内添加以山梨糖醇、甘露糖醇、焦糖且该培养基容许带有互补性pyrF基因的转化株的选择。
在本发明的一个适合实施方案中，变色栓菌的丝状真菌是以变色栓菌的漆酶基因在一同源系统内加以转化。如此可增加该漆酶的表达率，而在0.1克漆酶/升培养物培养基(既有技术可达成者)的发酵作用中大幅改进生产率。
为达成此目的，最好使用漆酶基因固有的启动子或变色栓菌强表达基因的启动子。最好使用漆酶基因I及III的启动子(其分离方法及用途曾于DE-A-19814853中述及)。另一强表达基因的启动子是由变色栓菌甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶的GAPDH启动子代表。
适合使用的选择培养基是仅变色栓菌转化株可在其上面生长者，该等转化株是用pyrF基因所需的功能性表达过的选择标记基因转化者。最适合者是实施例6所述及的基本培养基，在该基本培养基上，若无尿苷存在，变色栓菌的pyrF-营养缺陷型菌株不再能生长或仅在添加尿苷之后再能生长。
本发明表达载体的成功使用(包括将pyrF基因作为选择系统)有赖该选择标记基因在栓菌属转化株内的有效表达。有效表达需要适当表达信号。
来自担子菌属的表达信号在变色栓菌内产生的功能表达远较来自子囊菌纲的表达信号惊奇地有效。因此，本发明DNA载体内的pyrF选择标记基因以在来自担子菌纲的基因调节元件控制之下为佳，尤以在来自栓菌属、革盖菌属及多孔菌属者控制之下更佳。
该pyrF基因最好是在其上游5’启动子区及其下游3’终止子区的控制下。SEQ ID NO：1内曾述及一DNA片段，在该片段内，来自变色栓菌的pyrF基因是在来自变色栓菌的表达信号控制之下。
pyrF基因亦可在来自担子菌的异于pyrF基因者的表达信号控制之下。符合此功能的表达信号包含：来自担子菌纲丝状真菌的GAPDH启动子，例如：毛革盖菌、Phanerochaete chrysosporium、双孢蘑菇或变色栓菌、来自毛革盖菌的鸟氨酸氨甲酰转移酶启动子、来自变色栓菌漆酶I或漆酶III的启动子及来自双孢蘑菇的GAPDH终止子或来自变色栓菌漆酶I或漆酶III的终止子。
特别适合的载体是其中来自栓菌属的pyrF基因是在来自栓菌属GAPDH基因的表达信号控制之下。在实施例4内述及该载体。
特别适合的载体是其中来自栓菌属的pyrF基因是在来自栓菌属pyrF基因的表达信号控制之下。在实施例3内述及该载体。
pyrF基因可以是任何编码具有乳清酸磷酸核糖基转移酶酶活性的蛋白质的基因。
pyrF基因最好是衍生自来自担子菌纲的丝状真菌，例如：双孢蘑菇，Phanerochaete chrysosporium，毛革盖菌，Polyporus pinsitus菌，群交裂褶菌(Schizophyllum commune)或变色栓菌。
来自变色栓菌的pyrF基因特别优选。
本发明亦与一种制造蛋白质的方法有关，该方法包括利用本发明的表达系统(其中包括一以习知方式编码蛋白质的基因)以制造蛋白质，或包括以习知的方式培养一真菌菌株。该菌株包括一编码蛋白质的基因且是藉本发明的方法制得。
原则上该等方法均是经公开者，例如：艾格特等人，应用环境微生物学(1996)62，1151-1158，马丁奈兹等人，应用微生物生物技术(1994)41，500-504，或WO 93/08272。
下列诸实施例将对本发明作进一步说明。除另有表示外，该等实施例内用以处理DNA或RNS(例如：用限制核酸内切酶、DNA聚合酶、逆转录酶等的处理)的标准方法，及细菌转化、Southern和Northern分析、DNA测列，放射标记、筛选及聚合酶链反应等标准方法，是依照制造商所建议者实施，若无制造商的说明资料，则依照标准教科书内习知既有技术实施。实施例1
pyrF特异性DNA探针的分离
用以分离pyrF基因的DNA探针是用简并引物由变色栓菌基因组DNA的聚合酶链反应扩增而产生者。该等简并引物是基于与习知pyrF基因序列的比较而构建。乳清酸磷酸核糖基转移酶的基因(称作pyrF基因，或依照另一命名系统，称作ura5基因)是于下列基因数据库内寻得：a)swissprot，b)sptrembl，c)pir，d)embl，e)genbank，f)em_tags，g)gb_tagsEMBL。下述微生物的ura5，或pyrF基因选择用于序列比较：Yarrowia lipolytica，啤酒糖酵母、大肠杆菌、Rhizomucor circinelloides，Colletotrichum graminicola，Trichodermareesei及Sordaria macrospora，该等pyrF基因的氨基酸序列也加以比较。藉序列的比较可鉴定出在所有pyrF蛋白质内完全保守的长度为6至9个氨基酸的三个肽。为产生简并引物，将简并密码子纳入考量，该等肽中的两个经逆转译成DNA。该等引物具有下列序列(缩写I是指碱基次黄苷)：引物A：5′-TTYGGICCIGCITAYAARGGIATHCC-3′SEQ ID NO：4引物B：5′-TTICCICCYTCICCRTGRTCYTT-3′SEQ ID NO：5
聚合酶链反应(PCR)扩增是依照制造商所述的既有技术(聚合酶链反应试剂盒，奇亚根公司，希尔顿)实施：50微升PCR反应物中含有100纳克染色体变色栓菌DNA(依照实施例2所述分离出来)，制造商提供的缓冲液及1.25酶单位Taq聚合酶，1.25毫摩尔MgCl2，0.2毫摩尔四种dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)中的每一种及各100pmol引物A及B。预期PCR产物特定扩增所需的其他条件是：在94℃下温度下4分钟，继之10个循环的在94℃温度下1分钟，在45℃温度1分钟及在65℃温度下1分钟，及30个循环的在94℃温度下1分钟，在50℃温度下1分钟及在72℃温度下1分钟。所得PCR产物约为140碱基对。藉琼脂糖凝胶电泳将该PCR产物加以纯化，克隆进pCR-Script载体(克隆试剂盒，来自斯特拉塔根公司出品，海德堡)并转化大肠杆菌。质粒自转化大肠杆菌培养物中分离出来。自5’及3’端的DNA序列分析确认：克隆的DNA片段是一pyrF基因的片段。
为制备DNA探针以筛选pyrF基因，藉用Not I及Eco RI的处理将pyrF特定PCR片段切割，藉琼脂电泳加以分离并利用勃朗斯威格市阿美沙姆公司出品的非放射性“基因影像”侦检试剂盒加以标记。
实施例2
自变色栓菌制备染色体基因文库
所使用者是变色栓菌TV-1菌株(以编号DSM 11523寄存于德意志微生物保藏中心，D-38124不伦瑞克)。来自变色栓菌的菌丝体首先于麦芽—琼脂平板(3％麦芽汁，0.3％来自大豆粉的肽胨，1.5％琼脂，pH5.0)上，在28℃温度下，历时7天而制得。将麦芽—琼脂平板切割成3片并用以于500毫升圆锥烧瓶内接种100毫升无菌麦芽汁培养基(3％麦芽汁，0.3％来自大豆粉的肽胨，pH5.0)。在温度28℃及每分钟100转的振动情况下将该培养物加以保温，历时7天。经由陶瓷漏斗，利用一吸滤器将如此制得的菌丝体悬浮液加以过滤，并以0.9％盐水加以清洗。在有液氮存在的情况下，用一皿及研杵将1克的菌丝体研磨成细粉。将该粉末置入一消毒样品管内并立即与5毫升萃取液(0.1M Tris-HCl，pH8.0，0.1M 乙二胺四乙酸，0.25M NaCl，0.6毫克/毫升蛋白酶K)及0.5毫升的10％浓度(重量/体积)月桂酰基肌氨酸钠溶液混合。在50℃温度下保温至少2小时之后，将该混合物与0.85毫升的5M NaCl及0.7毫升的在0.7M NaCl中10％浓度(重量/体积)溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)溶液加以混合并在65℃温度下保温30分钟。添加7毫升氯仿/异戊醇混合物(24∶1)之后，将该混合物加以振动，藉离心作用将两相分开，移除水相部分，添加0.6份体积比的异丙醇，染色体DNA沉淀下来。随后于一层析柱(Qiagen Genomic Tip)上实施沉淀DNA的进一步纯化。如此可自16克菌丝体分离出0.5毫克染色体DNA。
为制备染色体基因文库，用Sau 3A将90微克来自变色栓菌TV-1的染色体DNA部分酶解并藉琼脂糖凝胶电泳作用将其加以分级分离。依照5至20kb及大于20kb的尺寸范围将该染色体DNA片段加以分离，并且将其克隆在先前曾经用Bam HI切割过的λ噬菌体(斯特拉塔根公司出品的“λZap表达”克隆系统)。自5至20kb DNA部分制得4×104个噬菌体/微克载体DNA，自大于20kb DNA部分制得5×104个噬菌体/微克载体DNA。藉感染大肠杆菌菌株XL-1 BlueMRF’将该等噬菌体加以扩增。
实施例3
pyrF基因的分离
所用的染色体基因文库是来自实施例2所述的变色栓菌TV-1。基因组pyrF基因的筛选依照既有技术实施。在第一轮筛选中，大肠杆菌XL-1 Blue MRF’在10个平皿上培养，随后每个平皿用染色体基因文库的50,000个噬菌体(5至20kb部分，请参阅实施例2)加以感染。在37℃温度下保温过夜之后，将新形成的噬菌体转移至尼龙滤膜(斯特拉塔根公司出品)内。随后依照制造商的的建议用非放射标记的pyrF特异性探针(请参阅实施例1)与该等滤膜杂交。杂交作用的温度为60℃。藉重复筛选方法，将阳性克隆检出并加以纯化。于三轮分离作用之后，在筛选过程中将强烈杂交的噬菌体克隆分离出来并依照厂商指导(斯特拉塔根公司)藉“体内切割”将其再克隆进pBX CMV载体(斯特拉塔根公司)。经以限制核酸内切酶水解及PCR所作克隆分析显示：所有克隆均包含pyrF基因。于分析三种克隆的序列后，约3.4kb的序列信息自最长的pyrF克隆中发现。该pyrF克隆称作pyrF61(SEQ ID NO：1)。该pyrF61克隆含有pyrF结构基因的序列信息(编码区，SEQ ID NO：1，碱基对1133至1286)。编码序列还含有一内含子(SEQ ID NO：1，bp1226-1286)，其未翻译成氨基酸序列。对应的pyrF cDNA基因于SEQ ID NO：2指示出来。无内含子序列的存在于pyrF61克隆内的pyrF结构基因编码具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蛋白质。
再者，pyrF61克隆亦含有在ATG超始密码子5’上游区(启动子区，SEQ ID NO：1，碱基对1至1132)的序列信息及在终止密码子3’下游区(终止子区，SEQ ID NO：1，碱基对1878至3448)的序列信息。这些是变色栓菌的新基因调节元件，该等基因调节元件可用以制备用于表达来自担子菌纲的丝状真菌的基因的表达载体。
实施例4
变色栓菌GAPDH启动子与变色栓菌pyrF基因的功能连接
A：将pyrF基因克隆进pBluescript载体
为进一步加工，将来自pyrF61的pyrF基因再克隆进pBluescript载体。为达成此目的，自实施例3制得的pyrF61克隆将pyrF基因分离出来成为1.6kb Sac I-Spe I片段并将其亚克隆进已用SacI和SpeI切割的pBluescript载体。由此形成的4.6kb质粒称作pPyrF1。
B：将一接头掺入pPyrF1以达成pyrF基因的ATG转译起始密码子与GAPDH启动子的功能连接
用SacI切割pPyrF1载体，藉琼脂糖凝胶电泳作用将4.6kb大小的线性化载体分离出来并藉碱性磷酸酶的处理加以去磷酸化。将如此制得的载体与接头寡核苷酸PyF-1(SEQ ID NO：6)及PyF-2(SEQ ID NO：7)连接起来。PyF-1及PyF-2所具有的序列如下：
寡核苷酸PyF-1：
5’-CTAGACATGTCGCTCGAAAAATACCAGACAGAGCT-3’SEQ ID NO：6
寡核苷酸PyF-2：
5’-CTGTCTGGTATTTTTCGAGCGACATGTCTAGAGCT-3’SEQ ID NO：7
限制核酸内切酶的裂解位点可用以对来自变色栓菌的GAPDH启动子的功能连接，其在PyF-1及PyF-2内加以下划线指出。
Sac I切割pPyrF1与接头寡核苷酸PyF-1及PyF-2的连接混合物转化大肠杆菌Top 10F’细胞。阳性克隆含有一经新引入的BspLU11I的裂解位点(除pPyrF1内先前已存在的两个之外)。掺入接头(利用该接头于pyrF基因的起始ATG密码子处引入一BspLU11 I裂解位点)的正确方向藉DNA序列分析加以测定。如此制得的载体(约4.5kb大小)称作pPyrF2。
C：将变色栓菌GAPDH启动子掺入pUC19载体
德国专利申请案DE-A-19814853中曾述及变色栓菌GAPDH基因启动子的DNA序列，SEQ ID NO：3，碱基对1至1542。约1kb大小的GAPDH基因启动子片段作为Sph I片段分离出来，并克隆进-pUC19载体。经以限制核酸内切酶Eco RI(存在于pUC19的聚接头内)及BspLU11 I(存在于GAPDH启动子片段内)实施双重水解作用的分析后，继以选择克隆，其中BspLU11 I裂解位点紧邻Eco RI裂解位点。如此制得的3.7kb大小载体称作pTVgap(图1)。
可能干扰随后的载体构建的唯一BspLU11 I裂解位点预先自用以产生pTVgap的pUC19载体中缺失，这是通过用BspLU11 I切割pUC19载体及用Klenow DNA聚合酶处理如此线性化的载体而进行。BspLU11 I水解之后的pUC19载体的末端被补平。随后的连接及转化大肠杆菌Top 10F’产生含有一无BsplLU11 I裂解位点的修饰pUC19载体。D：GAPDH启动子与pyrF基因的功能连接
载体pTVgap用BspLU11 I及Eco RI切割，由其形成的3.7kb大小载体片段经琼脂糖凝胶电泳加以分离并以碱性磷酶的处理加以去磷酸化。
pyrF基因是自pPyrF2载体分离出的1.6kb大小的BspLU11 I-EcoRI片段。为达成此目的，pPyrF2首先用BspLU11 I加以部分切割，用琼脂糖凝胶电泳加以分离4.6kb大小的线性化载体片段。之后经分离的4.6kb片段用EcoRI加以切割。如此得以制得预期1.6kb的pyrF基因片段，该pyrF基因片段用琼脂糖凝胶电泳作用加以分离。
将来自pTVgap的3.7kb大小的BspLU11 I-Eco RI片段及来自pPyrF2的1.6kb大小的BspLU11 I-Eco RI片段加以连接，及用连接混合物转化E.Coli Top 10F’细胞。其中pyrF基因经由BspLU11 I裂解位点与GAPDH启动子加以功能性连接的克隆藉限制分析加以鉴定。GAPDH启动子与pyrF基因起始ATG密码子的正确连接藉DNA测序加以确认。正确克隆的大小为5.3kb且称作pPyrFgap(图2)。
实施例5
栓菌属原生质体的产生及真菌菌落的再生
双核菌株变色栓菌TV-1，变色栓菌380770(可自美国典型培养物保藏中心获得，拉克维尔，马里兰州，20852)及单核菌株变色栓菌F2 100(以编号DSM 11972寄存于德意志微生物保藏中心，D-38124不伦瑞克)用以制备原生质体。首先在麦芽—琼脂平板(3％麦芽汁、0.3％来自大豆粉的肽胨、1.5％琼脂，pH5.0)上、在28℃温度下培养7天而制得自变色栓菌的菌丝体。将麦芽—琼脂平板切割成3片并用以接种于500毫升圆锥烧瓶内的100毫升无菌麦芽汁培养基(3％麦芽汁、0.3％来自大豆粉的肽胨、pH5.0)或在162cm2细胞培养物瓶内的125毫升无菌培养基。在28℃及不振动的情况下保温7天直至培养物液体中长出一层密实的菌丝体。将培养物液体倒出并添加新培养基(对100毫升培养物内的菌丝体添加30毫升)。用Ultra Turrax(每分钟9500转，4分钟)将该菌丝体加以均质并在温度28℃及每分钟100转的振动情况下继续保温18小时。
在每分钟1500转(2000xg)的情况下利用离心作用将如此制得的菌丝体悬浮液加以收获，历时5分钟。藉将其悬浮在0.1M MgSO4、0.6M蒸糖、0.1M磷酸盐、pH5.8(OMT培养基)将如此制得的菌丝体清洗三次并随后施以离心作用。将分离出来的菌丝体加以称量并在4℃温度下储存直至用裂解酶加以处理。
原生质体是依照下列方法制造：于一无菌圆锥烧杯内，将取自圆锥烧瓶的菌丝体悬浮在15毫升、新制及无菌过滤的裂解酶混合物Novozym234(3毫克/毫升，Novo Nordisk公司巴格期维尔德，丹麦)在OMT培养基中的溶液中。于低速(每分钟80转)下在振动保温器(Infors公司出品)上，在30℃温度下，将重悬于酶溶液内的菌丝体保温1至3小时。在保温过程中，在显微镜下观察到原生质体的形成。1小时之后，正常情况下看到自由移动的原生质体。在显微镜下，藉目视测定原生质体形成作用的终点。经由玻璃过滤器内的玻璃绒，藉过滤作用将该等原生质体自其余菌丝体分开。用冰冷OMT培养基将玻璃绒谨慎地清洗。于一无菌样品管内(每分钟2000转：2500xg，4℃，10分钟)对悬浮液施以离心作用将原生质体分离出来。该等细胞的进一步加工是在4℃温度下实施。在OMT培养基内，藉悬浮作用将该等原生质体沉淀加以清洗，并藉离心作用将之再度分离出来。必要时，清洗步骤重复实施。原生质体的浓度是于一计数室内、在显微镜下测得。该原生质体悬浮液是依照原生质体再生或转化作用的需要调整为1×108原生质体/毫升的浓度。
为进行再生实验，由原生质体悬浮液制得一系列的稀释液，并在琼脂平板(该等平板含有1.5％麦芽汁、0.1％胰蛋白酶解酪蛋白胨，2％葡萄糖，1.5％琼脂及(为渗透稳定)0.4M甘露糖醇)铺板。以此方式，活细胞比例得以测定，所得原生质体再生为菌丝生长的可能性得以测试。以同样方法，渗透作用稳定的细胞(例如：菌丝体片段)的比例是在无渗透稳定剂(无甘露糖醇)的情况下在平板上测定。将在28℃下保温7天后制得的菌落加以计数。来自许多原生质体制品的活细胞的比例约为0.5％。该等结果显示：供作转化作用的活原生质体及可再生原生质体可自变色栓菌制得。
实施例6
变色栓菌尿苷—营养缺陷型突变体的分离
具有嘧啶代谢作用基因缺陷的变色栓菌尿苷—营养缺陷型突变体(pyr突变体)是依照柏克等人，酶学方法(1987)154，164至175页所述的方法分离出来。所用选择剂为基因毒性物质5-氟乳清酸(FOA)。藉紫外线处理以实施变色栓菌原生质体的诱变。
A：紫外线诱变
诱变作用所用者是实施例5所述的单核菌株变色栓菌F2 100。该菌株的原生质体依照实施例5所述制得。
诱变作用所用的紫外线光源是BioRad UV Linker(Biorad公司出品，慕尼黑，功率5.8瓦/cm2，距紫外线光源16cm)。诱变作用所用原生质体数为8×109。将变色栓菌原生质体置入一平皿内并以紫外光照射不同长度的时间。由此显示：在所述情况下，照射60秒钟者最适于营养缺陷型突变体的随后选择。
B：尿苷—营养缺陷型突变体的选择：
尿苷—营养缺陷型突变体所使用者是下列基本培养基(MM)：
葡萄糖       20克/升
琼脂         15克/升磷酸二氢钾    1克/升
硫酸镁             0.5克/升
磷酸氢二钠         0.1克/升
腺嘌呤             27.5毫克/升
DL-苯丙氨酸        0.15克/升
L-天冬酸胺         2.5克/升
硫胺素             0.48毫克/升
氯化钙             10毫克/升
硫酸铁             10毫克/升
硫酸铜             2毫克/升
硫酸锌             1毫克/升
硫酸锰             1毫克/升
pH5.0，以硫酸调整。
为达成原生质体的渗透稳定作用，该基本培养基(MM)补充以0.6M的蔗糖(MMS)。对液体培养物，MM的制备不用琼脂。
初始时，将MMS补充以不同浓度的FOA及10mM的尿苷以在用于不同栓菌属菌株的选择培养基上鉴定宿主特性。由此显示：具有1.5毫克/毫升FOA及10mM尿苷的MMS(选择性MMS)可完全抑制所研究栓菌属菌株的生长。
用紫外线诱变的原生质体(如A节中所述)接种含有选择性MMS的平板并在28℃温度下保温21天。与未诱变的原生质体相反，观察到35个菌落的生长。为详细鉴定尿苷—营养缺陷型表型，将该等潜在pyr缺陷的突变体置于MM平板上，含有10mM尿苷的MM平板上及选择性MM平板上，并将其生长与F2100初始菌株比较。其中，所选35个栓菌属突变体菌落中的13个明确地显示pyr缺陷表型。藉助于表1将野生型菌株和3个突变体加以说明。
表1变色栓菌突变体在不同基本培养基(MM)上的生长菌株         MM    MM+10mM 尿苷    MM+10mM 尿苷+
                               1.5mg/ml FOAF2 100        +        +                  -F2 100C2-1    -        +                  +F2 100C2-8    -        +                  +F2 100C4-13   -        +                  +
C：pyrE突变体的鉴定
用5’-氟乳清酸的诱变作用可导致预期pyrF基因(乳清酸磷酸核糖基转移酶)的突变体或pyrG基因(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)的突变体。pyrG突变体与pyrF突变体的区分是利用来自变色栓菌的pyrF基因所行的转化作用，其分离于实施例3述及(质粒pyrF61)。与此并行的是，尿苷—营养缺陷型变色栓菌菌株亦用质粒pPyrFgap(其制备方法请参阅实施例4)转化。变色栓菌的转化于实施例7述及。
用质粒pyrF61及pPyrFgap转化之后，由13个分离出来的pyr缺陷突变体中的6个可观察到在基本培养基上的菌落。此乃表示该等6个突变体在pyrF基因中有缺陷。3个菌株F2 100C2-1，F2 100C2-8及F2 100 C4-13可以最高几率重复转化且供随后研究之用。质粒pyrF61与pPyrFgap就转化率作比较则无重大差异。所以该pyrF启动子可用以分离转化株。
实施例2所述及的pyrF基因是变色栓菌转化的新选择标记基因。变色栓菌菌株F2 100C2-1，F2 100C2-8及F2 100C4-13是目前描述的首批pyrF缺陷变色栓菌菌株。该等pyrF缺陷菌株可用作变色栓菌转化的宿主生物而且是担子菌纲丝状真菌内蛋白质表达及蛋白质分泌的新的及重要的宿主生物。菌株F2 100C2-1的作此用途在下列实施例中有所说明。
实施例7
用变色栓菌pyrF基因转化pyrF缺陷变色栓菌
A：转化株的分离
变色栓菌F2 100C2-1的原生质体是藉实施例5所述的方法制得。在此情况下，营养缺陷型菌株所用的培养物培养基补充以10mM的尿昔。实施转化是用载体pyrF61(实施例3述及)或pPyrFgap(实施例4述及)。
依照实施例5所述，自变色栓菌F2 100C2-1制得原生质体并将其以最终浓度108/毫升悬浮于。于一容积12毫升的保温容器内，将该等原生质体的0.1毫升等份与10微克相关质粒的DNA加以混合并在冰上保温30分钟。之后，徐徐添加1.25毫升PEG 4000并重复地与该转化混合物混合。在室温下继续保温20分钟之后，将实施例5述及的OMT培养基加入该等反应容器内，混合后，并以2000xg在4℃温度下施以离心作用，历时10分钟。将沉淀加以再悬浮并在渗透稳定的无尿苷的MMS平板(实施例6述及)上铺板。在28℃温度下将该等平板保温14天并检查该等菌落的生长情形。在不同实验中所达成的转化率为0.5至3转化株/微克质粒DNA。
B：转化株的纯化
所得转化株的菌丝体在新鲜MM平板上铺板而加以选择及纯化。在此情况上，该接种物施加在平板中央，形成斑点。在28℃温度下保温约7天之后，可观察到径向菌丝体生长。重复这一纯化程序，将该菌丝体当作来自第一个纯化平板边缘的接种物。之后用来自第二个纯化平板的接种物将基本培养基平板再度加以接种并在28℃温度下保温直到该等平板表面均有菌丝体生长。
C：转化株的分析
藉Southern印迹分析研究变色栓菌转化株中质粒pyrF61的整合。藉在液体培养物内产生各种转化株及作为对照的pyrF缺陷菌株F2100C2-1的菌丝体(请参阅实施例2，麦芽汁培养基，对于F2 100C2-1添加10mM尿苷)。依照实施例2所述自分离的菌丝体将染色体DNA分离出来。
用Nco I消化来自所研究的转化株及来自未经转化的尿苷—营养缺陷型F2 100C2-1初始菌株的染色体DNA各3微克，及100ng质粒pyrF61，之后藉琼脂糖凝胶电泳法加以分离并吸印在尼龙滤膜(奇亚根公司)上。所用的DNA探针是如实施例1所述非放射标记的NcoI-切割的质粒pyrF61。用此DNA探针可以自各个质粒侦检到pyrF基因及载体部分。
非放射标记DNA探针与吸印在尼龙滤膜上的DNA实施杂交的温度为60℃，或者符合专家文献所述Southern印迹条件。Southern印迹分析采用放射自显影术。除其他片段外，可能侦检出衍生自pyrF61的pBK CMV部分且长度分别为0.7kb及1.9kb的两种Nco I片段。该两种片段仅在转化株内检测得到但在尿苷—营养缺陷型菌株F2 100C2-1内则未检测到。该结果确认：在尿苷—营养缺陷栓菌属菌株F2 100C2-1实施转化作用时，质粒pyrF61业经整合入基因组内并导致选择标记基因pyrF的生产性表达，藉此，该菌株的营养缺陷得以互补。实施例8
利用pyrF基因产生过量生产漆酶的变色栓菌菌株
A：变色栓菌的转化
用实施例5所述方法产生变色栓菌的原生质体。转化作用中所用者是实施例3所述的载体pyrF61及漆酶表达载体pLac3gap。该两种载体用于共转化作用实验中，在该等共转化作用实验内选择标记基因及待表达基因存在于不同的质粒上。pLac3gap的制备曾在DE-A-19814853，实施例6揭示。在pLac3gap中，来自变色栓菌的漆酶III基因是与来自变色栓菌GAPDH启动子相连。
pyrF缺陷菌株变色栓菌F2 100C2-1是如实施例7所述制得并将其悬浮成终浓度为108/毫升。于一容积12毫升的保温容器内将0.1毫升原生质体等份与pLac3gap及pyrF61的各10微克DNA相混合并在冰上保温30分钟。之后，徐徐加入1.25毫升PEG 4000溶液并重复地混合该转化混合物。在室温下继续保温20分钟之后，将实施例5所述及的OMT培养基加入反应容器内，在2000xg及4℃温度下加以混合及施以离心作用，历时10分钟。将沉淀再悬浮并在无尿苷、渗透稳定的基本培养基上铺板(实施例6所述)。在28℃温度下将该等平板保温14天并检查菌落的生长。在不同实验内均达成0.5至3转化株/微克选择标记质粒pyrF61 DNA的转化率。
于不含尿苷的MM选择培养基的新鲜平板上铺板，依照实施例7所述将所得转化株选出并纯化两次。之后，用来自第二个纯化平板的接种物将选择平板重新加以接种，于该等平板表面上均有丝菌体生长之后，于摇瓶培养物内检查漆酶生产情形。
B：摇瓶内培养
为在一摇瓶内实施培养，自一表面均有菌丝体生长的平板切割出一2cm2的菌丝体并在无菌情况下将其压碎用以接种，于一250毫升圆锥瓶内的50毫升的麦芽汁培养基(请参阅实施例1)。在28℃及以每分钟120转的振动情况下将该预培养物保温6天。于第六天，用一Ultra Turrax在每分钟9500转的情况下将该预培养物均质，历时30秒，并用于接种1升圆锥烧瓶内的250毫升主培养物培养基(其组成请参阅实施例6的基本培养基)。之后，在28℃及每分钟120转的振动情况下将该主培养物再度加以培养。自实施培养工作第二天开始，每天量测漆酶的产生。漆酶活性是藉分光光度法利用底物ABTS[2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]在波长420nm处测得。ABTS在波长420nm的消光系数ε420：3.6×104[1×mol-1×cm-1]。其中，漆酶活性1个单位对应于：在温度37℃及pH4.5的情况下，转换1微摩尔ABTS/分钟。起始主培养物10至14天之后，摇瓶培养物内漆酶的产量达到最高。表2所示是各转化株与未经转化的起始菌株变色栓菌F2 100的比较。至于未经转化的菌株F2100，在用文献(亚华等人，应用及环境微生物学(1996)62，第834页至841页)中所述诱导物2，5-二甲代苯胺诱导之后，另外将漆酶产量加以测定。由表2明显所示，与未转化的起始菌株相较，菌株F2 100最佳转化株的摇瓶漆酶产量增加14倍(未经诱导)及6倍(经由诱导)。表2变色栓菌菌株                   最大漆酶产量(单位/毫升)F2 100                            4.60F2 100/二甲代苯胺*               11.20TVL3F-4                           15.20TVL3F-7                           42.50TVL3F-9                           17.60TVL3F-14                          51.50TVL3F-21                          33.90TVL3F-29                          64.80TVL3F-35                          35.10TVL3F-38                          13.80TVL3F-51                          56.70
*起始主培养物3天之后，藉添加2，5-二甲代苯胺(最终浓度1.5mM)实施诱导。
                      序列表<110>电化学工业有限公司(国际)<120>pyrF基因及其用途<130>Co9904<140><141><160>7<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>3448<212>DNA<213>Trametes versicolor<220><221>基因<222>(1133)..(1877)<220><221>启动子<222>(1)..(1132)<220><221>3′UTR<222>(1878)..(3448)<220><221>内含子<222>(1226)..(1286)<400> 1gatctcgagt aggatggaga acggtataac gatgccagag atgataggtg tccagcggta 60gttgggaacg aggctgtcta ggtcggcgtt cttgtcgtcg gtcggccaga ggtacgattt 120gaggcgagag tatagagata tccctaggag tgtgacgtca tcggacgagt taccctccgc 180ggtatgttgt gtactgtcca ccttctccgg gtcagacggg tgtgatgtac tgcgtccggg 240ttggagcgtc aggaaaagcg cagacaggct gaagagtccc attccgccgc agaaggtgtg 300cgagggggaa agtgccagtg tagcagtgag gcgtgcctac gatatgagac ggacatggtc 360agtatctatg cccggtcaag gtcgccgcac agacctcact gtaacctcat ggcaatgtcg 420cggatgcaca aagcaggtag agatgttcaa atggggcacg gagcgggtcg tccggagcgc 480tctccctcgg ctctttgcaa ggcagctggc ggatgtttgg tcagttgagg tactgcatcc 540cttgcaatag cgaaaacagc tcaccagacg tgagtatatg ctgtatacgg gagaaggaag 600cggaacaccg tgagtggaag agatgaagtg gttatgaata catcccggtg gaggttgagt 660ctaacagcgt cggatctcgc tgcgttccgg agcagaggcc cggtacgagc gccggtgtct 720gctcgtgttc cggcacgccg tatgctcgta aatcaccttt agaaaacttg aataagtgag 780agaagatacg aaacgtcagt ctgcacctat ggagatatgt aaaaatcgca aaaacatagc 840gttgacgcta taaaaaagaa aaggacaaaa tgaccaccgc aggggtcgaa cctgcaatct 900cctgatccct aggtttgaag gttcatcacc tcaattcgta gtcagacgcg atgccatttc 960gccaggcggc cgttagaaac gaaactacta cgtttaaacc cgggtataac acagcctagt 1020attccgtgcg ggccgcgccg ccgataagct tgttttcgtg aactgtcttc cccctcctgc 1080atctcgattc tcgacctcca tcgccgcgac gatcccttcc ttcccactca ccatgtcgct 1140cgaaaaatac cagacagagc tcatcgagca cggcatgacc gccggtgcgc tcaagttcgg 1200gaccttcacc ctcaaatcag gccggtccgt cccctcccta ggctgcgcgc cgctctcccc 1260gtgaacgctc cctcaccccg cgcaggacct cgccctactt cttcaacgcc ggcctgctcg 1320cgtccgggcc cgtgctcgac acgctgtgct ccgcgtacgc cgcgacgatc gcgcgcgcgc 1380tcaaggcgtc gcccgggctg cccgcgttcg acgtgctctt cgggcccgcg tacaagggca 1440tcccgttcgc ggcggggacc gcgctgctgc tgcaccgcga ccacggcatc accgtcgggt 1500tcgcgtacga ccgcaaggag gcgaaggatc atggggaggg cgggatactt gtgggcgcgc 1560cggtgagggg caagcgcgtg ctggtgctgg acgacgtcgc gacggcgggc acggcgatcc 1620gccaggcgat tgagactgtg acgaaggagg ggggcgaggt cgttggcgcg gtgttgatgc 1680tcgatcggca ggaggtgggc aaggagggga agagcacgct tgcggaggtg gaggcgctgt 1740tgggcgggaa gggacgtgtg ccgacgatcc tgaggatgaa ggacctcatg aagtggttgc 1800aggagcacgg ccggacggag gagcttgcga agatgcaaga gtactgggag cagtacggcg 1860cgaaggaaag cgaatgagaa gacacgaagg cagttgtgta ctaggtgagt aacaccacgc 1920tacatcgatc catccactaa acccatgcag atgaagaccc actgtacaat ttctcggtac 1980ctgtcacgtt gaacgcaaag agccgaagat gtgagagtac acatgccatt catcccgata 2040tatagcacaa gaacatgtag taatagaacc tgcagaaaca caaagcatga tcagcaagac 2100tccatgggca ctgagttatg atgaactaac cgctatcacc aaaaacaccg ctcttattcg 2160cccaaccgac gacccgaacc ccagttatat cctcccacac cgctcgcagc agcagcagca 2220gcagcctgct ccctgaccct ccgtgggggc acaacatgca cgcccccacc gacattcgca 2280acgcccccga ccccacccgt cgcgccccca ctagcagact ccccgaacca cccgcgcagc 2340cacgccggcg ccgtacctgc agccctgagc gagccggtgt caaagacagt ccaccaccag 2400aggtggccga cgacagcccc agagatgctg atggcagcgg cgccggggcc gcccatgagg 2460aggtccatgc cgacgagcat gtagggaagg tagatgacgg ggaaggtgat gagcccgaag 2520aaggatgtct gggacccagg tggggcgagc cgggaggaga cgtaggtgag cgcgaggagg 2580agcgcgcggg tgtgcacaaa ggtgccgagg ggaatgttga ggccctggtg tgaggcgggt 2640tagcgcaaag gtcagaggcg ggatgatact attggacgta cgaggatagc aagtcctgcg 2700agcgagagct gccatgcgta gtctgaagag cggcggggga agtgtgtctc ttctagctca 2760ttggaatttc gactagtttc aagtgtacgg tcctcagtat catcatgtat tgcaacagtg 2820tcatacgcac tagagcatcg caaggtcgaa gatgaagttg atccccgagc ctataaagac 2880aaggtcagca ccgacatggc atgtagtcag acaagattga gtacgcactt cccaagaaga 2940agctcgtaaa cactctccag atctacatta agacgtgagt atcgcatacc ttctcagtgc 3000ctgacttatc tttcatccaa ctacagagac agaaacccac ctcaaacttc tgcgtaacga 3060actccttcac aaagacgacc ttgtatattg gcaagatttg caggagcact ggcaaggtga 3120cggcgagaga ggaggcgcat agaaaccgag tgactggagg gattttgcga atctcatcca 3180tgaaagacat cttgaggaga ctggaggtga gtagagcgat agaagtacag caggcagagc 3240agagacgacg gcagaatgtg gggaagaaca agcaggagga ggagtagagt gattttgaag 3300taatgaaaag tggcgcaacc taatgcaaag tgtatgaggg acatccgtgg acataaagta 3360ttccgcacct cgggcaagac attcaatctc agtaatgcac ttcactttcg gagttcaact 3420tcaaactcga ctttgaaact tgagatcc                                    3448<210>2<211>684<212>DNA<213>Trametes versicolor<220><221>CDS<222>(1)..(684)<400>2atg tcg ctc gaa aaa tac cag aca gag ctc atc gag cac ggc atg acc 48Met Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Thr Glu Leu Ile Glu His Gly Met Thr1            5              10                15gcc ggt gcg ctc aag ttc ggg acc ttc acc ctc aaa tca ggc cgg acc 96Ala Gly Ala Leu Lys Phe Gly Thr Phe Thr Leu Lys Ser Gly Arg Thr
       20               25               30tcg ccc tac ttc ttc aac gcc ggc ctg ctc gcg tcc ggg ccc gtg ctc 144Ser Pro Tyr Phe Phe Asn Ala Gly Leu Leu Ala Ser Gly Pro Val Leu
    35               40              45gac acg ctg tgc tcc gcg tac gcc gcg acg atc gcg cgc gcg ctc aag 192Asp Thr Leu Cys Ser Ala Tyr Ala Ala Thr Ile Ala Arg Ala Leu Lys
50               55              60gcg tcg ccc ggg ctg ccc gcg ttc gac gtg ctc ttc ggg ccc gcg tac 240Ala Ser Pro Gly Leu Pro Ala Phe Asp Val Leu Phe Gly Pro Ala Tyr65               70               75              80aag ggc atc ccg ttc gcg gcg ggg acc gcg ctg ctg ctg cac cgc gac 288Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu His Arg Asp
          85               90               95cac ggc atc acc gtc ggg ttc gcg tac gac cgc aag gag gcg aag gat 336His Gly Ile Thr Val Gly Phe Ala Tyr Asp Arg Lys Glu Ala Lys Asp
      100             105               110cat ggg gag ggc ggg ata ctt gtg ggc gcg ccg gtg agg ggc aag cgc 384His Gly Glu Gly Gly Ile Leu Val Gly Ala Pro Val Arg Gly Lys Arg
  115               120              125gtg ctg gtg ctg gac gac gtc gcg acg gcg ggc acg gcg atc cgc cag 432Val Leu Val Leu Asp Asp Val Ala Thr Ala Gly Thr Ala Ile Arg Gln130               135              140gcg att gag act gtg acg aag gag ggg ggc gag gtc gtt ggc gcg gtg 480Ala Ile Glu Thr Val Thr Lys Glu Gly Gly Glu Val Val Gly Ala Val145              150                  155          160ttg atg ctc gat cgg cag gag gtg ggc aag gag ggg aag agc acg ctt 528Leu Met Leu Asp Arg Gln Glu Val Gly Lys Glu Gly Lys Ser Thr Leu
         165               170              175gcg gag gtg gag gcg ctg ttg ggc ggg aag gga cgt gtg ccg acg atc 576Ala Glu Val Glu Ala Leu Leu Gly Gly Lys Gly Arg Val Pro Thr Ile
      180              185               190ctg agg atg aag gac ctc atg aag tgg ttg cag gag cac ggc cgg acg 624Leu Arg Met Lys Asp Leu Met Lys Trp Leu Gln Glu His Gly Arg Thr
  195               200              205gag gag ctt gcg aag atg caa gag tac tgg gag cag tac ggc gcg aag 672Glu Glu Leu Ala Lys Met Gln Glu Tyr Trp Glu Gln Tyr Gly Ala Lys210               215              220gaa agc gaa tga                                                 684Glu Ser Glu225<210>3<211>227<212>pRT<213>Trametes versicolor<400>3Met Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Thr Glu Leu Ile Glu His Gly Met Thr1             5               10               15Ala Gly Ala Leu Lys Phe Gly Thr Phe Thr Leu Lys Ser Gly Arg Thr
       20               25               30Ser Pro Tyr Phe Phe Asn Ala Gly Leu Leu Ala Ser Gly Pro Val Leu
   35                40              45Asp Thr Leu Cys Ser Ala Tyr Ala Ala Thr Ile Ala Arg Ala Leu Lys
50               55               60Ala Ser Pro Gly Leu Pro Ala Phe Asp Val Leu Phe Gly Pro Ala Tyr65              70               75                80Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu His Arg Asp
          85              90                95His Gly Ile Thr Val Gly Phe Ala Tyr Asp Arg Lys Glu Ala Lys Asp
      100             105               110His Gly Glu Gly Gly Ile Leu Val Gly Ala Pro Val Arg Gly Lys Arg
  115               120              125Val Leu Val Leu Asp Asp Val Ala Thr Ala Gly Thr Ala Ile Arg Gln130               135              140Ala Ile Glu Thr Val Thr Lys Glu Gly Gly Glu Val Val Gly Ala Val145             150               155              160Leu Met Leu Asp Arg Gln Glu Val Gly Lys Glu Gly Lys Ser Thr Leu
         165              170              175Ala Glu Val Glu Ala Leu Leu Gly Gly Lys Gly Arg Val Pro Thr Ile
      180              185              190Leu Arg Met Lys Asp Leu Met Lys Trp Leu Gln Glu His Gly Arg Thr
  195               200              205Glu Glu Leu Ala Lys Met Gln Glu Tyr Trp Glu Gln Tyr Gly Ala Lys210               215             220Glu Ser Glu225<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物A<220><221>引物结合<222>(1)..(26)<220><221>引物结合<222>(1)..(26)<223>n＝i<400>4ttyggnccng cntayaargg nathcc                               26<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物B<220><221>引物结合<222>互补((1)..(23))<220><221>引物结合<222>互补((1)..(23))<223>n＝i<400>5ttnccnccyt cnccrtgrtc ytt                                  23<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PyF-1<220><221>misc特征<222>(1)..(35)<400>6ctagacatgt cgctcgaaaa ataccagaca gagct                     35<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：pyF-2<220><221>misc_特征<222>互补t((1)..(35))<400>7ctgtctggta tttttcgagc gacatgtcta gagct                     35
         国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
                          国际表格
                          存活证明
                        根据细则10.2签发
致：电化学工业有限公司(国际)
    I.保藏人     II.微生物的鉴定特征
名称：电化学工业有限公司(国际)地址：德国慕尼黑.     国际保藏机构给出的保藏号：DSM 11972保藏日或转存日1：1998年1月28日
    III.存活证明
    上述II的微生物的存活性于1998年1月28日被测试2。在该日，所述微生物[x]3存活[]3不再存活
    IV.进行存活性测试的条件4
    V.国际保藏机构
    名称：德意志微生物保藏中心    授权官员地址：Mascheroder Weg 1bD-38124 Braunschweig日期：1998年2月2日
1指出原始保藏日，或者当进行新的保藏或转存时，指出最近相关日期(新保藏日或转存日)。
2当涉及细则10.2(a)(ii)和(iii)时，指最近的存活性测试。
3用X号标记
4如果需要或测试结果为负时填充
表格DSMZ-BP/9(一页)0196
            国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
                               国际表格
                        原始保藏物受理通知书
                           根据细则7.1签发
致：电化学工业有限公司(国际)
    I.微生物的鉴定特征
    由保藏人提供的名称：F2 100     国际保藏机构给出的保藏号：DSM 11972
    II.科学描述和/或建议的分类命名
    上述微生物附有：[]科学描述[x]建议的分类命名(当适用时以X标记)
    III.受理及接受
    上述微生物已于1998年1月28日(原始保藏日)1由本国际保藏机构收到。
    IV.请求转存的受理
    上述微生物于＿年＿月＿日由本国际保藏机构受理，并且将原始保藏物转存为根据布达佩斯条约的保藏的请求于＿年＿月＿日受理。
    V.国际保藏机构
    名称：德意志微生物保藏中心    授权官员地址：Mascheroder Weg 1bD-38124 Braunschweig日期：1998年2月2日
1当细则6.4(d)适用时，该日为获得国际保藏机构资格的日期。
表格DSMZ-BP/4(一页)0196
         国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
                            国际表格
                      原始保藏物受理通知书
                         根据细则7.1签发
致：电化学工业有限公司(国际)
    I.微生物的鉴定特征
    由保藏人提供的名称：TV-1     国际保藏机构给出的保藏号：DSM 11523
    II.科学描述和/或建议的分类命名
    上述微生物附有：[]科学描述[x]建议的分类命名(当适用时以X标记)
    III.受理及接受
    上述微生物已于1997年4月25日(原始保藏日)1由本国际保藏机构收到。
    IV.请求转存的受理
    上述微生物于＿年＿月＿日由本国际保藏机构受理，并且将原始保藏物转存为根据布达佩斯条约的保藏的请求于＿年＿月＿日受理。
    V.国际保藏机构
    名称：德意志微生物保藏中心    授权官员地址：Mascheroder Weg 1bD-38124 Braunschweig日期：1997年4月29日
1当细则6.4(d)适用时，该日为获得国际保藏机构资格的日期。
表格DSMZ-BP/4(一页)0196
          国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
                            国际表格
                            存活证明
                         根据细则10.2签发
致：电化学工业有限公司(国际)
    I.保藏人     II.微生物的鉴定特征
名称：电化学工业有限公司(国际)地址：德国慕尼黑.     国际保藏机构给出的保藏号：DSM 11523保藏日或转存日1：1997年4月25日
    III.存活证明
    上述II的微生物的存活性于1997年4月25日被测试2。在该日，所述微生物[x]3存活[]3不再存活
    IV.进行存活性测试的条件4
    V.国际保藏机构
    名称：德意志微生物保藏中心    授权官员地址：Mascheroder Weg 1bD-38124 Braunschweig日期：1997年4月29日
1指出原始保藏日，或者当进行新的保藏或转存时，指出最近相关日期(新保藏日或转存日)。
2当涉及细则10.2(a)(ii)和(iii)时，指最近的存活性测试。
3用X号标记
4如果需要或测试结果为负时填充表格DSMZ-BP/9(一页)0196

Claims (7)

1、一种编码具有乳清酸磷酸核糖基转移酶酶活性(pyrF活性)的蛋白质的DNA序列，其特征为包括DNA序列SEQ ID NO：1自位置1133直至并包含位置1877，或
包括DNA序列SEQ ID NO.：2自位置1直至并包含位置684，或
包括一DNA序列，该序列与DNA序列SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的所述区域的序列同源性超过60％。
2、一种具有pyrF活性的蛋白质，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：3或与氨基酸序列SEQ ID NO：3的序列同源性超过60％的氨基酸序列。
3、一表达载体，其包括如权利要求1的DNA序列。
4、一微生物，其包括如权利要求3的表达载体。
5、一种产生能有效表达及分泌蛋白质的真菌菌株的方法，在该方法中，利用选自栓菌属、革盖菌属及多孔菌属的在pyrF基因内具有基因缺陷的尿苷—营养缺陷型真菌作为宿主菌株，在该方法中，利用习知的加工步骤，藉一具有互补宿主菌株内营养缺陷型基因缺陷的基因的表达载体，于一转化混合物内转化作为宿主菌株的具有营养缺陷型基因缺陷的真菌，用表达载体转化的克隆是藉选择营养缺陷型基因缺陷的互补作用自转化混合物中选得，此处互补宿主菌株内营养缺陷型基因缺陷的基因的表达是藉一在该宿主菌株内具有活性的基因调节元件加以控制。
6、一种表达系统，其包括一宿主菌株，该宿主菌株选自具有代谢作用基因缺陷的栓菌属、革盖菌属及多孔菌属，依据该代谢作用缺陷，生长所必需的代谢物尿苷即不再合成，不添加该代谢物，该宿主菌株即不再在基本培养基上生长；及一表达载体，该表达载体包括一可互补宿主营养缺陷型基因缺陷的选择标记基因，其中该宿主菌株的pyrF基因内具有一缺陷作为代谢作用基因缺换，且该选择标记基因是来自担子菌纲真菌的pyrF基因。
7、一种生产蛋白质的方法，其包括采用如权利要求6所述的表达系统，该系统包括一基因，该基因依照蛋白质生产习知的方式编码蛋白；或者所述方法包括培养如权利要求4所述的微生物，该微生物中包括一编码蛋白质的基因，或培养由权利要求5所述的方法制备的真菌菌株，该菌株包括依照习知方式编码蛋白质的基因，及自该培养物制得蛋白质。
CN00810699A 1999-07-22 2000-06-29 pyrF基因及其用途 Pending CN1362993A (zh)

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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7514253B2 (en) * 2003-05-16 2009-04-07 Glycofi, Inc. URA5 gene and methods for stable genetic integration in yeast
JP2006067890A (ja) * 2004-09-01 2006-03-16 Shigeji Ikeda 核酸抽出方法および核酸抽出キット
BRPI1009574A2 (pt) * 2009-03-10 2015-08-18 Athena Biotechnologies Inc Método para reduzir a produção de co2 em um processo de fermentação para produzir um álcool, e, microorganismo modificado.
US9404101B2 (en) * 2011-08-24 2016-08-02 Novozymes, Inc. Methods for obtaining positive transformants of a filamentous fungal host cell
JP6398115B2 (ja) * 2014-01-22 2018-10-03 本田技研工業株式会社 糖化酵素の生産方法、及び草木類バイオマスの糖化処理方法
JP6398116B2 (ja) * 2014-01-22 2018-10-03 本田技研工業株式会社 糖化酵素の生産方法、及び草木類バイオマスの糖化処理方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4134716C1 (zh) 1991-10-21 1993-04-15 Hans-Peter Dr. 5132 Uebach-Palenberg De Call
DE69331121T2 (de) * 1992-03-09 2002-07-11 Oji Paper Co., Ltd. Ornithin-Carbamoyl-Transferase Gen und seine Verwendung als Gen-Marker in einem Expression-System für die Herstellung von Proteinen bei Basidiomyceten
DE19724039A1 (de) * 1997-06-06 1998-12-10 Consortium Elektrochem Ind DNS-Sequenzen, Expression dieser DNS-Sequenzen, durch die DNS-Sequenzen kodierte thermophile Laccasen sowie deren Verwendung
DE19814853A1 (de) 1998-04-02 1999-10-21 Consortium Elektrochem Ind Expressionssystem zur Produktion von Proteinen

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