CN107904263A - 一种提高产氢菌氢产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术应用领域，具体的说是一种提高产氢菌氢产量的方法。将产氢菌株接种至含2.5‑20mmol/L的铁氧化物的培养基中，通过暗发酵培养，即可实现产氢菌株的大量产氢。本发明水铁矿和磁铁矿的添加促进了产氢梭菌C.pasteurianum的生长，进而加速了该菌底物转化效率，并提高了代谢产物氢气、乙酸和丁酸的产量。该发明方法，极大提高了产氢梭菌氢产量，为实现微生物暗发酵产氢大规模生产提供了理论支持。

Description

一种提高产氢菌氢产量的方法
技术领域
本发明属于微生物技术应用领域，具体的说是一种提高产氢菌氢产量的方法。
背景技术
微生物暗发酵产氢是一种具有应用潜力的生物制氢方式，然而，速率慢和产量低仍是制约该制氢方式大规模生产应用的主要原因，因此，寻找新的高底物转化率的产氢菌株和寻求提高产氢菌株高效产氢的方法是目前微生物暗发酵产氢领域亟待解决的问题。
氢气是一种高燃烧热(122kJ/g)的清洁能源，然而，目前工业制氢的主要方式还是通过天然气、丙烷或者石油的高温重整，该种方式不仅高耗能且存在污染。相比传统的通过化石燃料高温重整制氢这种方式，生物制氢是一种新型的制氢方式，因其具有低能耗且环保等优势，受到广泛关注与研究。生物制氢的主体主要是微生物，包括光合制氢微生物和暗发酵制氢微生物，相比光合微生物制氢，暗发酵微生物制氢不需要提供光源，节省了生产空间，降低了产氢成本。目前已发现的具有暗发酵产氢能力的微生物主要包括：梭菌属Clostridium、肠杆菌属Enterobacter和芽孢杆菌属Bacillus等，其中梭菌属Clostridium因其底物广泛，产氢量高且易于培养等优势，是目前研究者关注的焦点。
梭菌属Clostridium可将己糖(葡萄糖和果糖等)暗发酵转化为代谢产物，氢气、二氧化碳、乙酸和丁酸等。根据代谢底物中有机酸乙酸和丁酸相对含量的高低，可将产氢梭菌分为乙酸型产氢梭菌和丁酸型产氢梭菌，其相对应的代谢方程式如公式(1)和公式(2)：
C6H12O6+2H2O→2C2H4O2+2CO2+4H2 (1)公式
C6H12O6→C4H8O2+2CO2+2H2 (2)公式
C.pasteurianum是Winogradsky在1895年分离得到的一株固氮菌(Winogradsky,S.(1895).Recherches sur l’assimilation de l’azote libre de l’atmosphere parles microbes.Arch Sci Biol 3,297–352.)，后续研究发现其同时具有发酵产氢能力，在以葡萄糖为底物，37℃，暗培养条件下，可以产生代谢底物氢气、二氧化碳、乙酸和丁酸，且相比丁酸的含量乙酸为主要的有机酸产物，因此，C.pasteurianum为乙酸型发酵产氢梭菌。
但是，如何提高乙酸型发酵产氢梭菌(C.pasteurianum)氢气产量现阶段并未有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高产氢菌氢产量的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种提高产氢菌氢产量的方法，将产氢菌株接种至含2.5-20mmol/L的铁氧化物的培养基中，通过暗发酵培养，即可实现产氢菌株的大量产氢。
进一步的说,将5％(v/v)C.pasteurianum菌接种至含2.5-20mmol/L的铁氧化物的培养基中，通过暗发酵培养，即可实现产氢菌株的大量产氢及提高培养基中底物葡萄糖的转化率；其中，TPG培养基主要成分为：胰蛋白胨：0.5g/L，蛋白胨：0.5g/L，NaCl：5g/L，葡萄糖：10g/L，KH2PO4：0.544g/L，K2HPO4：2.10g/L，微量矿物盐(参见表1)：10mL/L，维他命溶液(参见表2)：10mL/L。
所述铁氧化物分别为纳米水铁矿和磁铁矿。所述磁铁矿浓度为2.5-10mmol/L，水铁矿浓度为5.0-20mmol/L。
所述暗发酵条件为37℃，黑暗，静置培养。
通过向暗发酵产氢微生物C.pasteurianum培养基中添加适量浓度磁铁矿和水铁矿的方法，显著提高了C.pasteurianum的氢产量，最大氢产量提高了75.2％。有效促进暗发酵产氢梭菌C.pasteurianum氢产量的磁铁矿和水铁矿浓度范围，为2.5-40mmol/L。磁铁矿和水铁矿的添加不仅促进了氢气产量的提高，同时，代谢产物乙酸和丁酸的含量也显著增加，最大增量约提高了159.0％和118.2％。磁铁矿和水铁矿的添加在促进代谢产物氢气、乙酸和丁酸生成的同时加速了代谢底物葡萄糖的转化率，葡萄糖的转化率提高了50％。通过对C.pasteurianum生物量的检测发现，C.pasteurianum的生物量在添加磁铁矿和水铁矿后相比未添加铁氧化物的对照组显著提高。
本发明所具有的优点：
本发明通过对C.pasteurianum培养基的修饰，在不降低产氢量的情况下，降低了培养基的成本，且通过添加适量浓度磁铁矿和水铁矿，显著促进了C.pasteurianum对代谢底物葡萄糖的转化率，同时增加了代谢产物氢气、乙酸和丁酸的产量。
本发明方法最大氢产量提高了75.2％。通过高效液相色谱对其代谢底物葡萄糖与其他代谢产物乙酸和丁酸的进一步的检测发现，水铁矿和磁铁矿的添加提高了葡萄糖的转化率50％，并促进了乙酸和丁酸的积累，分别提高了159.0％和118.2％。生物量检测结果显示，铁氧化物的添加显著提高了C.pasteurianum的生物量。综上所述，水铁矿和磁铁矿的添加促进了产氢梭菌C.pasteurianum的生长，进而加速了该菌底物转化效率，并提高了代谢产物氢气、乙酸和丁酸的产量。该发明方法，极大提高了产氢梭菌氢产量，为实现微生物暗发酵产氢大规模生产提供了理论支持。
附图说明
图1为本发明实施例提供的磁铁矿和水铁矿的添加对暗发酵产氢梭菌C.pasteurianum产氢量的影响图；其中，添加两种不同类型铁氧化物的实验组，相比未添加铁氧化物的对照组，氢气产量显著提高。
图2为本发明实施例提供的磁铁矿和水铁矿的添加对暗发酵产氢梭菌C.pasteurianum底物葡萄糖转化的影响图；其中，两种不同类型铁氧化物的添加均显著促进了底物葡萄糖的代谢速率，加快了葡萄的转化。
图3为本发明实施例提供的磁铁矿和水铁矿的添加对暗发酵产氢梭菌C.pasteurianum代谢产物乙酸的影响图；其中，两种不同类型铁氧化物的添加均显著促进了代谢底物乙酸的积累。
图4为本发明实施例提供的磁铁矿和水铁矿的添加对暗发酵产氢梭菌C.pasteurianum代谢产物丁酸的影响图；其中，两种不同类型铁氧化物的添加显均著促进了代谢底物丁酸的积累。
图5为本发明实施例提供的磁铁矿和水铁矿的添加对暗发酵产氢梭菌C.pasteurianum生物量的影响图；其中，两种不同类型铁氧化物的添加均显著促进了C.pasteurianum生物量的合成。
具体实施方式
通过附图说明和具体实施例对本发明的内容作进一步详细说明。
本发明通过添加铁氧化物，纳米水铁矿和磁铁矿，产氢梭菌Clostridiumpasteurianum的产氢量明显提高，且相比未添加铁氧化物的对照组，最大氢产量提高了75.2％。通过高效液相色谱对其代谢底物葡萄糖与其他代谢产物乙酸和丁酸的进一步的检测发现，水铁矿和磁铁矿的添加提高了葡萄糖的转化率50％，并促进了乙酸和丁酸的积累，分别提高了159.0％和118.2％。生物量检测结果显示，相比未添加铁氧化物的对照组，铁氧化物的添加显著提高了C.pasteurianum的生物量。综上所述，水铁矿和磁铁矿的添加促进了产氢梭菌C.pasteurianum的生长，进而加速了该菌底物转化效率，并提高了代谢产物氢气、乙酸和丁酸的产量。该发明方法，极大提高了产氢梭菌氢产量，为实现微生物暗发酵产氢大规模生产提供了理论支持。
实施例1
1)菌株获得与培养：
C.pasteurianum(巴斯德梭菌)购自美国组织培养库(ATCC)，保藏号为：7041。培养条件，培养基成分：胰蛋白胨：0.5g/L，蛋白胨：0.5g/L，NaCl：5g/L，KH2PO4：0.544g/L，K2HPO4：2.10g/L，微量矿物盐：10mL/L(详见表1)，维他命溶液：10mL/L(详见表2)。PH＝7.0，37℃，黑暗培养。
表1
表2
维他命组分(100×) mg/L
Biotin 2
folic acid 2
pyridoxine HCl 10
thiamine HCl 5
riboflavin 5
nicotinic acid 5
calcium D-(+)-pantothenate 5
cyanocobalamine 0.1
p-aminobenzoic acid 5
thioctic acid 5
2)磁铁矿和水铁矿实验室合成：
参照Young等的方法合成磁铁矿：将0.85mL 12.1mol/L的HCl添加到除氧的去离子水中；称取5.2g FeCl3和2.0g FeCl2依次溶于配好的HCl溶液中；然后逐滴加入到250mL1.5mol/L的NaOH溶液中，边加边充分搅拌；在产生的黑色沉淀物附近添加一块磁铁将沉淀物吸附与溶液分开，将上清倒掉；加入除氧去离子水清洗后4000r/min离心去上清，重复3次；加入500mL 0.01mol/L HCl溶液中和纳米颗粒上的阴离子；4000r/min离心去上清，加入除氧去离子水将阳离子纳米颗粒悬浮，最终形成明显的阳离子胶体。
参照Lovley实验室方法合成水铁矿：称取162.2g FeCl3·6H2O溶于400mL去离子水，加转子搅拌至溶解；用10mol/L的NaOH调节pH至7.0；将溶液分装至250mL的离心瓶中；离心洗涤，用低速离心机3500r/min离心10min，弃上清，用去离子水将沉淀重新悬浮，再离心10min，重复此操作进行清洗，直至离心后上清液变黄色；此清洗次数约为4-5次；洗至上清液变黄后，弃掉上清，收集无定形铁，加入400mL去离子水溶解后得到浓度约为1mol/L的无定形铁；置于黑暗条件下保存，测定浓度后使用。
3)将TPG培养基分配在体积为25mL西林瓶中，每瓶10mL，氮吹除氧，用橡胶塞铝盖密封，高压蒸汽灭菌。将不同浓度的磁铁矿和水铁矿添加到培养基中，接种5％(v/v)C.pasteurianum，37℃，黑暗培养。
培养过程，定时连续(每10h一次，共5次)取气体样品(0.2mL)和液体样品(0.1mL)。
气相色谱检测气体样品(氢气)：用气相色谱进样针取0.2mL血清瓶顶部气体进行气相色谱(安捷伦7820)检测。检测条件：检测器TCD，温度250℃；进样口温度80℃；柱箱温度80℃；载气，氮气；流速，10mL/min。液相色谱检测液体样品(葡萄糖、乙酸和丁酸)：取0.1mL菌悬液于0.9mL去离子水中稀释10倍，0.22μm滤膜过滤，液相色谱(安捷伦1260)检测。检测条件：色谱柱，HPLC-Hi-Plex H，300×7.7mm，柱温60℃；检测器，示差检测器(RID)，温度55℃；流动相为5mmol/L硫酸，流速为0.6mL/min。
氢气检测结果显示(参见图1)，不同浓度水铁矿和磁铁矿的添加相比未添加矿物的对照组，氢气产量显著提高，且最大氢气提高量为75.2％(10mM/L水铁矿)。
代谢底物葡萄糖检测结果显示(参见图2)，不同浓度水铁矿和磁铁矿的添加显著促进了葡萄糖的转化率，且最大转化效率提高了约50％(20mM/L水铁矿)
代谢产物乙酸和丁酸的检测结果显示(参见图3,4)，通过添加不同浓度水铁矿和磁铁矿，培养基中代谢产物乙酸和丁酸的累积量明显增多，且最大累积量分别提高了159.0％和118.2％(10mM/L水铁矿)。
取样结束后(50h)，用BCA试剂盒参照操作说明检测C.pasteurianum生物量，检测结果显示(参见图5)，添加水铁矿和磁铁矿的实验组相比未添加铁氧化物的对照组，其生物量显著提高，且磁铁矿相比水铁矿更能加速C.pasteurianum生物量的积累。

Claims (5)

1.一种提高产氢菌氢产量的方法，其特征在于：将产氢菌株接种至含2.5-20mmol/L的铁氧化物的培养基中，通过暗发酵培养，即可实现产氢菌株的大量产氢。
2.按权利要求1所述的提高产氢菌氢产量的方法，其特征在于：将5％(v/v)C.pasteurianum菌接种至含2.5-20mmol/L的铁氧化物的培养基中，通过暗发酵培养，即可实现产氢菌株的大量产氢及提高培养基中底物葡萄糖的转化率；其中，TPG培养基主要成分为：胰蛋白胨：0.5g/L，蛋白胨：0.5g/L，NaCl：5g/L，葡萄糖：10g/L，KH2PO4：0.544g/L，K2HPO4：2.10g/L，微量矿物盐：10mL/L，维他命溶液：10mL/L。
3.按权利要求1或2所述的提高产氢菌氢产量的方法，其特征在于：所述铁氧化物分别为纳米水铁矿和磁铁矿。
4.按权利要求3所述的提高产氢菌氢产量的方法，其特征在于：所述磁铁矿浓度为2.5-10mmol/L，水铁矿浓度为5.0-20mmol/L。
5.按权利要求1-4任意一项所述提高产氢菌氢产量的方法，其特征在于：所述暗发酵条件为37℃，黑暗，静置培养。
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