CN115605580A

CN115605580A - 在多种植物中诱导抗性的枯草芽孢杆菌jck-1398菌株、利用其的用于防治松材线虫病的组合物及防治方法

Info

Publication number: CN115605580A
Application number: CN202080096321.XA
Authority: CN
Inventors: 金镇铁; 朴涯兰; 全熙元; 成旼贞; 郑世仁; 徐荣秀; 金男圭; 金俊宪; 李尚炫
Original assignee: National College Of Forestry; University Industry Cooperation Foundation of Pusan National University; Industry Foundation of Chonnam National University
Current assignee: JAN153 Biotechnology Co.,Ltd.; National College Of Forestry
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2023-01-13
Also published as: JP2023513563A; EP4105317A4; JP7425884B2; EP4105317A1; MX2022009902A; KR102237327B9; US20230087802A1; WO2021162226A1; KR102237327B1

Abstract

本发明涉及对松树及多种植物具有诱导抗性活性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK‑1398菌株(保藏编号KCTC 14084BP)、包含该菌株作为有效成分的杀虫剂或抗菌剂组合物、用于防治植物病或害虫的组合物及利用其的防治方法，通过实验确认，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK‑1398菌株通过在宿主中诱导抗性来对引起多种植物病的害虫、线虫及病菌具有防治活性。因此，本发明的枯草芽孢杆菌JCK‑1398菌株可有效用于防治相关植物病，并且可通过叶面喷施对大范围区域进行喷施，因此有望以低成本防止松材线虫病的扩散。

Description

在多种植物中诱导抗性的枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株、利用其的用于防治松材线虫病的组合物及防治方法

【技术领域】

本发明是在韩国林务厅的支持下通过课题号FE0702-2016-02完成的，该课题的研究管理专门机构为韩国国立森林科学院，研究项目名称为“服务研究项目”，研究课题名称为“利用诱导抗性的环境友好型松材线虫病防治剂的开发与鉴定”，由韩国全南大学产学合作财团主办，研究时间为2019年04月19日～2019年11月29日。

本专利申请要求于2020年2月12日提交韩国专利厅的韩国授权专利第10-2020-0017232号的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

本发明涉及在松树及多种植物中诱导抗性的枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株、利用其的用于防治植物病的组合物及防治方法。

【背景技术】

松材线虫(Bursaphe lenchus xylophilus)引起的松材线虫病对全球松树引发严重的灾害，近年来，随着气候变化引起的森林生态系统环境变化，呈现复杂状态并迅速扩散。

已知松材线虫病的主要原因是松材线虫，其作为通过寄主、病原体、媒介虫及环境因素之间的复杂的相互作用枯死松树的难以防治的森林病害虫，一旦被感染，就无法治疗，几乎所有松树都会枯死。

为了防治这种松材线虫病而提出了多种方法，而通过树干注入的防治方法几乎是作为预防方法的唯一方法。但是，在树干注入的情况下，目前广泛使用的阿维菌素(abamectin)及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin benzoate)药效持续时间短，仅为两年，注入时期也有限，并且日本的绿色卫士因价格昂贵而在广泛应用中受限。

并且，在树干注入的情况下，不仅存在药剂价格问题，还存在难以预防大范围地区的问题，在高山地带的松树林的情况下，难以接近，因此该方法不能成为有效的方法。而且，黑田(Kuroda)及剱持(Kenmochi)(2016年，松树病大会(Pine Wilt Disease Conference)-国际林业研究组织联盟(IUFRO))警告过，为了防治松材线虫病而反复树干注入杀线虫剂反而是杀死未感染松树的原因。

因此，迫切需要开发一种可以通过土壤浇灌或叶面喷施等来有效防治大范围区域的环保药剂。

【发明内容】

【技术问题】

本发明人试图开发一种在松树及多种植物中诱导抗性的微生物制剂。结果，发现本发明的新型枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株对包括引起松材线虫病的线虫在内的多种植物病原体具有防治效果，并且这种效果由菌株的抗性诱导活性引起，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供激活植物对病害虫的诱导抗性(inducedresistance)的保藏编号为KCTC 14084BP的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株。

本发明的再一目的在于，提供杀虫剂或抗菌剂组合物，其包含选自由枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩物、上述培养物的干燥物、上述菌株的培养上清液及它们的组合组成的组中的一种以上作为有效成分。

本发明的另一目的在于，提供用于防治植物病或害虫的组合物，其包含选自由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩物、上述培养物的干燥物、上述菌株的培养上清液及它们的组合组成的组中的一种以上作为有效成分。

本发明的又一目的在于，提供植物病或害虫的防治方法，其利用选自由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩物、上述培养物的干燥物、上述菌株的培养上清液及它们的组合组成的组中的一种以上。

【解决问题的手段】

本发明人试图开发一种在松树及多种植物中诱导抗性的微生物制剂。结果，发现本发明的新型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株对包括松材线虫在内的引起多种植物病的线虫及病菌具有诱导抗性活性。

本发明涉及杀虫剂或抗菌剂组合物以及用于防治植物病或害虫的组合物，这些包含激活植物对病害虫的诱导抗性(induced resistance)的保藏编号为KCTC 14084BP的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株、上述菌株的培养物等作为有效成分。

以下，将更详细地说明本发明。

本发明的一方面涉及保藏编号为KCTC 14084BP的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JCK-1398菌株。

上述菌株的特征在于，包含SEQ ID NO：33的gyrA碱基序列。

上述SEQ ID NO：33的碱基序列与作为试验菌株的CP021892具有99％的同源性，并且识别出两个菌株之间具有1％的差异，因此被证明为新型菌株。

通过在GenBank数据库和NCBI数据库中的Blast搜索确认了上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株的gyrA(旋转酶A亚单位基因(Gyrase Asubunit))碱基序列。

将上述得到的新型菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株，于2019年12月19日保藏在韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for TypeCultures)，被赋予保藏编号KCTC 14084BP。

上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株可以从番茄植物体分离及鉴定得到，上述菌株的菌体性状如下：

作为一种棒状圆柱形杆菌，带有鞭毛，活动活跃，在菌体的中心形成圆形或椭圆形孢子(spore)。在普通培养箱中发育良好，形成大的灰白色菌落，其周围呈放射状。由于具有孢子，因此对干燥或高温具有极强的抵抗力，菌体作为含有糖原的革兰氏阳性菌，能分解许多碳水化合物而产生酸。将D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、蔗糖等碳源用作能源。

根据本发明的一实施例，上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株的诱导抗性活性通过利用松树及多种植物体的实验得到确认(图3至图9)。

上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株通过诱导抗性(inducedresistance)活性具有病害虫防治活性。

上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株具有由植物病原性线虫、害虫或植物病原性细菌及真菌(霉菌)引发的植物病或害虫防治活性。

上述线虫可以是松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)，但不限于此。

上述害虫可以是番茄刺皮瘿螨(Aculops lycopersici)，但不限于此。

上述细菌及真菌可以是辣椒疮痂病菌(Xanthomonas euvesicatoria)和/或币斑病菌(Sclerotinia homoeocarpa)，但不限于此。

上述植物病可以是松材线虫病、辣椒细菌性斑点病和/或草坪币斑病，但不限于此。

因此，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株在宿主中诱导抗性，从而通过抑制植物病原性线虫、细菌、真菌、害虫生长的活性而具有植物病防治活性。

并且，若将上述枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株与现有诱导抗性物质制成合剂，则引发协同效应，因而可用于植物病的环保防治。

与上述枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株组合使用的诱导抗性物质可以是酸苯甲酸-S-甲基(Acibenzolar-S-methyl，ASM)和/或水杨酸甲酯(Methylsalicylate，MeSA)，但不限于此。

并且，上述枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株与现有合成杀菌剂(合成农药)制成合剂时会引发协同效应，因此即使使用常用浓度以下的合成农药，植物病防治效果也与使用常用浓度时相似或更高。因此，其可以减少合成杀菌剂的常用浓度使用量，并且可用于植物病的环保防治。

与上述枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株组合使用的合成农药可以是戊唑醇(tebuconazole)、异菌灵(iprodione)、氟虫腈(fludioxonil)、苯菌灵(benomyl)和/或苯醚甲环唑(difenoconazole)，但不限于此。

本发明的再一方面涉及杀虫剂或抗菌剂组合物，其包含选自由保藏编号为KCTC14084BP的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩物、上述培养物的干燥物、上述菌株的培养上清液及它们的组合组成的组中的一种以上。

因此，本发明可以提供包含选自由枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩物、上述培养物的干燥物、上述菌株的培养上清液及它们的组合组成的组中的一种以上的杀虫剂或抗菌剂微生物制剂，并且可以提供用上述微生物制剂处理的杀虫或抗菌方法。

上述微生物制剂可以按常规方法配制，可以制成干粉形式或液体肥料形式。具体地，本发明的微生物制剂可以制成液体形式，也可以添加增量剂而制成粉末形式来使用，也可以进行配制、造粒。但是并不特别限于剂型。

在本发明中，上述微生物制剂可以通过向菌株或其培养物中添加添加剂、增量剂、营养剂等附加剂来制备。在此情况下，作为添加剂，可以使用选自由聚羧酸盐、木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、二烷基磺基琥珀酸钠、烷基芳基磺酸钠、聚氧乙烯烷基苯基醚、三聚磷酸钠、聚氧乙烯烷基芳基磷酸酯、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯烷基芳基聚合物、聚氧烷基酮烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、磺化甲醛萘基钠、曲拉通100及吐温80组成的组中的一种以上，作为增量剂及营养剂，可以使用选自由脱脂乳(skim milk)(培养基)、豆粉、米、小麦、黄土、硅藻土、鹏润土(bentonite)、糊精、葡萄糖及淀粉组成的组中的一种或两种以上，作为崩解剂，可以使用鹏润土(bentonite)、滑石(talc)、硅藻土(dialite)、高岭土(kaolin)及碳酸钙(calcium carbonate)组成的组中的一种以上。

并且，本发明提供一种通过用上述微生物制剂处理土壤或植物来在植物体中诱导抗性的方法。在此情况下，作为处理方法，可通过通常进行的方法，即喷施(例如，喷雾、雾化、喷洒、粉末喷施、颗粒喷施、睡施、常规施用等)、土壤施用(例如，混入、浇灌等)、表面使用(例如，涂敷、涂抹法、包覆等)、浸渍、中毒、烟熏施用等进行。使用量可根据剂型、受损情况、使用方法、使用场所等适当确定。

在本发明中，根据上述方法处理的制剂中所含微生物的有效量可以是每耕地面积(m²)包含1至1×10¹⁰⁰个微生物。并且，通过上述方法中的喷施处理的制剂中所含微生物的有效量能够以1至1×10¹⁰⁰/ml的微生物浓度包含在内，通过浸渍处理的组合物中所含微生物的有效量能够以1×10¹⁰⁰/ml的微生物浓度包含在内。

本发明的另一方面涉及用于防治植物病或害虫的组合物，其包含选自由保藏编号为KCTC 14084BP的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩物、上述培养物的干燥物、上述菌株的培养上清液及它们的组合组成的组中的一种以上。

本发明的上述每种组合物除了作为有效成分的上述菌株、其培养物、培养物的浓缩物、培养物的干燥物和/或上述菌株的培养上清液之外，还可以包含含有菌体的培养物、菌体的提取物、它们的浓缩液、浓缩物、干燥物，并且，可根据需要包含稀释液、稀释物等，可以包含通过用培养液、培养物处理来获得的所有状态的物质。

上述菌株的培养法、提取法、分离法、浓缩法、干燥法、稀释法等没有特别限制。

用于培养上述菌株的培养基通常包含脱脂乳、乳清、酪蛋白等乳蛋白、糖类、酵母提取物等，作为培养方法，可以适当使用各种普通的好氧或厌氧方法。

在培养上述菌株之后，还可根据需要对培养物或其上清液进行浓缩、干燥、稀释。

并且，还可以使用离心分离法或膜分离法分离培养物的上清液和菌体来以浓缩状态回收菌体。此外，可以对菌体进行超声波处理或酶处理等来提取菌体中的成分，培养物或其上清液，或者可以将菌体或其提取物等干燥。可将它们可以用作本发明的上述组合物的有效成分。

考虑到本说明书的复杂性，省略了上述菌株及包含其的每种组合物的重复内容。

【发明的效果】

本发明涉及在松树及多种植物中具有诱导抗性活性的枯草芽孢杆菌(Bacil lussubtilis)JCK-1398菌株(保藏编号KCTC 14084BP)、包含该菌株作为有效成分的杀虫剂或抗菌剂组合物、用于防治植物病或害虫的组合物及利用其的防治方法，通过实验确认，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株通过在宿主中诱导抗性而对引起多种植物病的害虫、线虫及病菌具有防治活性。因此，本发明的枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株可有效用于防治相关植物病，并且可通过叶面喷施对大范围区域进行喷施，因此有望以低成本防止松材线虫病的扩散。

【附图说明】

图1为确认到由本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-1398菌株引起的诱导抗性相关基因的表达的图。

图2为示出本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株的gyrA碱基序列的系统图分析结果的图。

图3a为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株的松材线虫病防治效果的图，其中通过病进展曲线示出JCK-1398菌株培养液对红松幼苗的幼苗鉴定结果。

图3b为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株的松材线虫病防治效果的图，其中示出用JCK-1398菌株培养液(a)、未处理区(b)及未接种组(c)处理的红松幼苗。

图4a为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株的松材线虫病防治效果的图，其中示出JCK-1398菌株在O.D₆₀₀＝0.8时的培养液、培养滤液及细胞级分的松材线虫病防治效果。

图4b为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株的松材线虫病防治效果的图，其中示出用JCK-1398菌株培养液(a)、JCK-1398菌株培养滤液(b)、JCK-1398菌株细胞级分(c)、未处理区(d)及未接种组(e)处理的红松幼苗。

图5a为根据本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株培养液的处理时间确认松材线虫病防治效果的图，其中通过病进展曲线示出JCK-1398菌株培养液对红松幼苗的幼苗鉴定结果。

图5b为根据本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株培养液的处理时间确认松材线虫病防治效果的图，其中示出接种松材线虫60天后JCK-1398菌株培养液防治效果。

图5c为根据本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株培养液的处理时间确认松材线虫病防治效果的图，其中示出接种松材线虫2周前-1周前(a)、3周前-1周前处理(b)、4周前-1周前处理(c)、用未处理区(d)及未接种组(e)处理的红松幼苗。

图6为根据本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株培养液的处理浓度确认松材线虫病防治效果的图。

图7a为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株的松材线虫病防治效果的图，其中通过病进展曲线示出JCK-1398菌株培养液对成熟红松的幼苗鉴定结果。

图7b为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株的松材线虫病防治效果的图，其中通过第一次和第二次现场试验示出枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株的防治效果。

图7c为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株的松材线虫病防治效果的图，其中示出用JCK-1398菌株喷雾干燥粉末50倍稀释液(a)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(b)及未接种组(c)处理的成熟红松。

图8为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-139820％SC(悬浮剂)制剂和作为诱导抗性物质的ASM(苯丙噻重氮)及MeSA(外源水杨酸甲酯)合剂的松材线虫病防治效果的图。

图9为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-139820％SC制剂和JCK-1398 10％SC制剂在多种浓度下的松材线虫病防治效果的图。

图10a为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-139810％SC制剂对30年树龄松树的松材线虫病防治效果的图，其中通过病进展曲线示出利用无人直升机的实用化评价结果。

图10b为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JCK-139810％SC制剂对30年树龄松树的松材线虫病防治效果的图，其中示出接种材线虫6个月后的发病率。

图11为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株培养液的辣椒细菌性斑点病防治效果的图。

图12为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株培养液的草坪币斑病防治效果的图。

图13为确认到本发明一实施例的枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株20％SC制剂的番茄刺皮瘿螨防治效果的图。

【具体实施方式】

本发明涉及枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)JCK-1398菌株，其保藏编号为KCTC 14084BP，激活植物对病害虫的诱导抗性(induced resistance)。

【本发明的实施方式】

以下，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围不应被解释为受这些实施例的限制，这对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。

【实施例1.诱导诱导抗性的菌株的筛选】

为了找到诱导对松材线虫病的诱导抗性的菌株，从多种植物中分离出500多株植物来源的微生物菌株。从利用PR-1promoter(启动子)上用GUS(β-葡萄糖苷酶)标记的vector(载体)转化的拟南芥分离的500多株植物来源的微生物菌株中筛选出诱导诱导抗性的菌株(25个菌株)，结果如下表1所示。

【表1】

菌株

活性

菌株

活性

菌株

活性

菌株

活性

JCK-757

*

JCK-1180

*

JCK-1266

*

JCK-1320

*

JCK-758-1

*

JCK-1182

*

JCK-1287

*

JCK-1328

*

JCK-758-2

*

JCK-1187

*

JCK-1288

*

JCK-1333

*

JCK-761

*

JCK-1217

*

JCK-1307

*

JCK-1398

*

JCK-767

*

JCK-1222

*

JCK-1308

*

JCK-947

*

JCK-1229

*

JCK-1309

*

JCK-1005

*

JCK-1233

*

JCK-1318

*

【实施例2.利用松树愈伤组织(callus)的体外(in vitro)诱导抗性鉴定】

对于通过上述实施例1筛选的25个菌株，确认了红松松树愈伤组织的诱导抗性相关基因的表达。

具体地，在12-孔微孔板中，用500μl的LM培养基在600nm的吸光度(OD 600)下培养松树诱导抗性菌株至达到0.8，然后用500μl培养液处理100mg的红松愈伤组织表面，并在25℃黑暗条件、50rpm的振荡培养箱中使愈伤组织表面和松树诱导抗性菌株培养液充分反应24小时。然后，利用离心分离机以600×g离心分离5分钟至10分钟，分离完成反应的愈伤组织。从分离的愈伤组织中提取RNA(核糖核酸)后合成cDNA(互补脱氧核糖核酸)，通过RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)或qRT-PCR(荧光定量PCR)确认特异性增加的诱导抗性基因的表达，结果如图1及表2所示。qRT-PCR中使用的诱导抗性相关基因如下表3所示。

【表2】

顺序	命名	表达量
			1	PR-1b家族	1.35
2	PR-2家族	1.02
			3	PR-3家族第1类	0.70
4	PR-3家族第4类	2.84
			5	PR-4家族	10.20
6	PR-5家族	2.21
			7	PR-9家族	1.49
8	PR-10家族	1.56
			9	抗微生物肽	11.91
10	细胞色素P450	1.06
			11	伸长素	0.84
12	富含羟脯氨酸的糖蛋白前体	0.50
			13	金属硫蛋白样蛋白	1.59
14	木葡聚糖内转糖基酶	0.72

【表3】

可从图1及表2确认，确认到在筛选的25个菌株中，本发明的枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株特异性增加生成蛋白质的基因如PR-1b家族(PR-1b家族)、PR-3家族第4类(PR-3家族4类)、PR-4家族(PR-4家族)、PR-5家族(PR-5家族)、PR-9家族(PR-9家族)、PR-10家族(PR-10家族)、抗微生物肽(抗菌肽)及金属硫蛋白样蛋白(金属硫蛋白)等。

【实施例3.分子生物学鉴定及系统分类】

将枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株在TSA(胰酶大豆琼脂(Tryptic soy agar)，培养基(Difco))固体培养基上划线后，在30℃下静置培养1天。利用无菌环将获得的单菌落接种在TSB(胰蛋白大豆肉汤(Tryptic soy broth)，Difco)液体培养基中，然后在30℃下以150rpm振荡培养1天。然后，利用ELPIS-Biotech的DOKDO-prep细菌基因组DNA纯化试剂盒，根据方案提取菌株的gDNA(基因组DNA(genomic DNA))。将提取的gDNA与iNtRON Biotechnology的能够扩增PCR-预混料(聚合酶链式反应-预混料(Polymerase chain reaction-premix))及gyrA(Gyrase A subunit)基因的引物组混合后，通过PCR扩增上述JCK-1398菌株的gyrA基因。用于PCR的引物组如表4所示。

【表4】

序列号	命名	序列表(5'→3')
			31	gyrA For	CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT
32	gyrA Rev	CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT

PCR重复30次，从95℃下进行5分钟开始，在95℃下进行30秒，在55℃下进行30秒，在72℃下进行30秒，然后在72℃下进行7分钟后在12℃下完成扩增。委托Genotech(Daejeon，Korea)对扩增的PCR产物进行碱基序列分析，获得JCK-1398菌株的gyrA(SEQ IDNO：33)基因的碱基序列。利用NCBI的nBlast搜索将获得的gyrA基因的碱基序列与GenBank数据库的碱基序列进行比较。并且，从GenBank数据库中获取具有高度相似的gyrA基因碱基序列，利用BioEdit Sequence Alignment Editor(生物编辑序列校准编辑器)对JCK-1398菌株的gyrA基因碱基序列与所有碱基序列进行校准，使用mega程序版本6.0，在boot-strap试验设置(trials set)1000条件下，基于NJ(近邻相接(neighbour-joining))算法进行系统分析，结果如图2所示。

【表5】

可从图2确认，JCK-1398菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacil lus subtilis)菌株。

【实施例4.松材线虫病防治效果的确认】

为了确认枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株培养液对松材线虫病的防治效果，利用红松(Pinus densiflora)3年生至4年生幼苗(直径约5.5mm，离土壤高度约35cm至45cm)进行了幼苗鉴定。

【4-1.JCK-1398菌株培养液的制备】

将悬浮在20％甘油溶液中并储存在-80℃深冰箱(deep freezer)中的JCK-1398菌株在TSA中在30℃下静置培养约24小时。然后，将TSB放入试管中，用面罩堵住入口并灭菌后，用铂齿刮取培养的JCK-1398菌株的一个菌落并将其接种到TSB中，然后在30℃、150rpm、好氧条件下进一步振荡培养约24小时。将JCK-1398菌株培养液放入含有50ml灭菌TSB的250ml三角烧瓶中制备悬浮液，使得在UV分光光度计中在600nm处的光密度(opticaldensity)值为1.0。然后，在30℃、150rpm、好氧条件下振荡培养约24小时。

【4-2.JCK-1398菌株培养液的喷施】

首先，为了使JCK-1398菌株培养液能够很好地吸附到叶子上，每颗松树用5ml的250μg/ml Tween20充分预处理后干燥2小时。然后，将上述实验例4-1中培养的JCK-1398菌株培养液溶解在含有250μg/ml Tween20的水溶液中，使得光密度值达到约0.8，然后放入微型喷射器中，每颗松树以5ml的量进行叶面喷施。

【4-3.松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的培养】

在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar)，培养基(Difco))培养基中接种作为松材线虫食物的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)并在25℃培养箱中静置培养7天。在培养的灰葡萄孢菌上接种松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus，韩国国立森林科学院)后在25℃培养箱中静置培养7天。利用贝尔曼漏斗法(Baermann funnel method)收获培养的松材线虫后，在光学显微镜下照射数量并将其调整为约20000只/ml。

【4-4.松材线虫病防治效果的确认】

将用实验例4-2的JCK-1398菌株培养液通过叶面喷施预处理的松树的木质部用灭菌刀切入内皮深层部位约1cm，然后制作0.5cm宽、1cm长的脱脂棉，将其插入切口部位，将分离出的松材线虫接种2000只每只100μl(用JCK-1398菌株培养液等药剂处理1周后接种)，接种部位用封口膜密封以防止干燥(树皮剥皮接种法)。接种松材线虫45天后观察干燥程度，结果如图3a至图3b及表6所示。

【表6】

可从图3a至3b及表6确认，JCK-1398菌株培养液在红松幼苗中对松材线虫病表现出24％的低发病率，与未处理区相比，表现出71.4％的防治值。

【实施例5.体外(in vitro)杀线虫活性评价】

【5-1.确保JCK-1398菌株培养滤液及待防治线虫】

以与实施例4-1相同的方法培养JCK-1398菌株后，利用离心分离机在13000rpm条件下离心分离30分钟来收获培养滤液，并利用灭菌的0.2μm微注射器过滤器对培养滤液进行除菌。

作为甘薯根结线虫(Meloidogyne incognita)，在韩国光州广域市全南大学绿色农业中心温室中，从人工感染甘薯根结线虫的番茄根中获取卵，并利用贝尔曼漏斗法分离从卵孵化的幼虫(2龄幼虫)用于实验。以与实施例4-3相同的方法收获松材线虫。

【5-2.确保JCK-1398菌株培养滤液及线虫】

将实施例5-1中确保的各线虫的悬浮液分别放入96-孔微孔板的各孔中，然后用JCK-1398菌株培养滤液处理至浓度达到0.625至20％，使孔的最终体积为100μl。试样处理后，将96-孔板搅拌30秒，放入相对湿度100％的塑料桶中室温保存。试样处理72小时后，在光学倒置显微镜下利用以下计算式确认杀线虫率。所有实验重复3次，结果如下表7所示。

[计算式]

杀线虫率(％)＝[(处理区的致死率-对照组的致死率)/(100-对照组的致死率)]×100

【表7】

可从上表7确认，在甘薯根结线虫的情况下，20％培养滤液处理区表现出97.45％的杀线虫活性，10％培养滤液处理区表现出13.15％的杀线虫活性，可知5％以下浓度下不会出现杀线虫活性。

另一方面，在松材线虫的情况下，在任何处理区中均未出现杀线虫活性，这表明枯草芽孢杆菌JCK-1398对松材线虫病的防治效果是由于诱导抗性引起的效果，而不是由于直接杀线虫活性引起。

【实施例6.表现出松材线虫病防治效果的诱导抗性物质的确认】

基于实施例5的结果，确认到枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株具有表现出松材线虫病防治效果的诱导抗性物质(培养液，培养滤液及细胞级分)。JCK-1398菌株的培养通过与实施例4-1相同的方法将光密度值调整为0.8来进行。

将JCK-1398菌株的培养液离心分离(1300rpm、15分钟)来分成培养滤液和细胞级分。通过加入离心分离前使用的相同体积的磷酸盐缓冲盐水(phosphate-bufferedsaline)来悬浮沉淀的细胞级分。为了使每个试样(培养液、培养滤液及细胞级分)很好地吸附到叶子上，每颗松树用5ml的250μg/ml Tween20充分预处理后干燥2小时。然后，将培养液、培养滤液及细胞级分溶解在含有250μg/ml Tween20的水溶液中，使光密度值为约0.8，然后放入微型喷射器中，每颗松树以5ml的量进行叶面喷施。在此情况下，作为对照组，将作为杀线虫物质的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin benzoate)按约20mg/ml溶解在含有10％甲醇的水溶液中，然后进行树干注入。结果如图4a至图4b及表8所示。

【表8】

处理区	培养液	培养滤液	细胞级分	EB
					防治值(％)	61.7	64.2	42.0	97.0

可从图4a至图4b及表8确认，JCK-1398菌株培养液及培养滤液分别表现出61.7％及64.2％的防治效果，但细胞级分表现出42％的略低防治效果。

这种结果表明，本发明的JCK-1398菌株的松材线虫病防治效果是由分泌到细胞外的分泌物引起的效果。

【实施例7.表现出松材线虫病防治效果的最佳处理时间的确认】

基于实施例6的结果，通过枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株培养液的松材线虫病体内(in vivo)鉴定确认了最佳处理时间。利用红松3年生至4年生幼苗(直径约5.5mm，离土壤高度约35cm至45cm)进行了体内鉴定。

以与实施例4-1相同的方法培养JCK-1398菌株并将光密度值调整为约0.8，然后将培养液以每颗松树5ml的量进行叶面喷施。在此情况下，培养液处理在不同时间进行2次，分别在接种松材线虫2周前和1周前、4周前和1周前及4周前和1周前，在第二次培养液处理7天后，以与上述实施例4-4相同的方法接种松材线虫。最后，接种松材线虫60天后观察干燥程度，结果如图5a至5c及表9至表10所示。

【表9】

【表10】

处理区	2周前-1周前	3周前-1周前	4周前-1周前
				防治值(％)	59.2	20.4	38.8

可从图5a至5c及表9至表10确认，直到接种第49天，无论处理时间如何，松材线虫病的发病率都保持在相似的水平，但可知此后根据处理时间显著变化(图5a)。结果，当在接种2周前-1周前(59.2％)处理时，与在4周前-1周前(20.4％)及4周前-1周前(38.8％)处理时相比表现出优异的防治效果。

【实施例8.表现出松材线虫病防治效果的最佳处理浓度的确认】

基于实施例7的结果，通过枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株喷雾干燥粉末的松材线虫病体内(in vivo)鉴定确认了最佳处理浓度。同样，利用红松3年生至4年生幼苗进行了体内鉴定。

具体地，将通过下表11的方法制备的JCK-1398菌株的喷雾干燥粉末用无菌水制备成50倍、500倍及5000倍稀释液后，以与上述实施例4-2相同的方法，在松树上以7天的间隔进行2次叶面喷施。最后，在以与上述实施例4-4相同的方法第二次处理上述稀释液7天后接种松树材线虫，接种松材线虫55天后观察干燥程度，结果如图6及表12所示。

【表11】

喷雾干燥工艺过程	JCK-1398
		入口及出口温度	190～198℃/90～98℃
喷雾率	10000rpm
		载体	培养液70L
喷雾干燥粉末	11kg
		QC	2.4×10<sup>9</sup>cfu/g
CFU(×50)	4.8×10<sup>7</sup>cfu/g

【表12】

处理区	50倍稀释液	500倍稀释液	5000倍稀释液
				防治值(％)	85.5	60.5	69.8

可从图6及表12确认，当用JCK-1398菌株喷雾干燥粉末的50倍稀释液(85.5％)处理时，与500倍(60.47％)及5000倍(69.77％)稀释液相比，表现出优异的防治效果。

【实施例9.松材线虫病防治效果的确认】

基于上述结果，为确认枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株对成熟树的松材线虫病防治效果，还利用15年生红松(根径8cm至11cm，高度6m至8m)进行了现场试验。现场试验在2018年(第一次现场试验)及2019年(第二次现场试验)进行了2次。第一次现场试验试验了JCK-1398菌株培养液的喷雾干燥粉末(以与实施例8相同的方法制备)，第二次现场试验将JCK-1398菌株培养液的喷雾干燥粉末配制成JCK-139820％SC(乳剂)来使用。JCK-1398 20％SC制剂以JCK-1398喷雾干燥粉末20.0％、CR-NF 135B 4.5％、黄原胶0.03％、消泡剂0.1％、水75.37％的组成配制。

将JCK-1398菌株培养液的喷雾干燥粉末及JCK-1398 20％SC制剂分别在含有250μg/ml Tween 20的水溶液中稀释50倍及2000倍后，放入喷雾器中并以每颗松树约1L的量进行叶面喷施。叶面喷施进行2次，间隔1个月。上述2次处理一周后，采用树干注入方法，第一次现场试验中每颗松树接种20000只松材线虫，第二次现场试验中每颗松树接种10000只松材线虫。在此情况下，作为对照组，以每胸高直径1ml树干注入阴离子型聚丙烯酰胺(甲氨基阿维菌素苯甲酸盐2.15％、乳剂、先正达(Syngenta))，阴离子型聚丙烯酰胺在接种松材线虫1周前处理。作为未处理区，仅用250μg/ml Tween20在没有药剂的情况下进行相同处理。结果如图7a至7c及表13至表14所示。

【表13】

【表14】

可从图7a至7c及表13至表14确认，与未处理区相比，JCK-1398菌株培养液喷雾干燥粉末50倍稀释液(JCK-1398)及JCK-1398 20％SC制剂(20％SC制剂)分别表现出65.5％及68.8％的防治效果。通过2次现场试验，确认到JCK-1398菌株对松材线虫病的防治效果的重现性。

【实施例10.合剂的松材线虫病防治协同效应的确认】

基于实施例的结果，为了确认作为枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株的诱导抗性物质的酸苯甲酸-S-甲基(Acibenzolar-S-methyl，ASM)与水杨酸甲酯(Methyl salicylate，MeSA)的合剂对成熟树中的松材线虫病防治效果，还利用15年生红松(根径8～11cm、高度6～8m)进行了现场试验。

将JCK-1398 20％SC制剂、ASM 5％SC制剂、MeSA 20％EC-LV制剂分别以2000倍稀释并制备成0.1mm、0.5mm。将JCK-1398 20％SC+ASM 5％SC合剂和JCK-139820％SC+MeSA20％EC-LV合剂制备成最终浓度包含每个单剂处理区浓度的一半。将各试样放入喷雾器并以每颗松树约1L的量处理2次，间隔一个月。上述2次处理一周后，采用树干注入方法，每颗松树接种10000只松材线虫。在此情况下，作为对照组，以每胸高直径1ml树干注入阴离子型聚丙烯酰胺(甲氨基阿维菌素苯甲酸盐2.15％、乳剂、先正达(Syngenta))，阴离子型聚丙烯酰胺在接种松材线虫1周前处理。作为未处理区，仅用250μg/ml Tween20在没有药剂的情况下进行相同处理。结果如图8及表15所示。

【表15】

可从图8及表15确认，与未处理区相比，JCK-1398 20％SC制剂、ASM 5％SC制剂、MeSA 20％EC-LV制剂分别表现出23.1％、27.3％及33.9％的防治效果。但是与未处理区相比，JCK-1398 20％SC+ASM 5％SC合剂和JCK-1398 20％SC+MeSA 20％EC-LV组合分别表现出46.2％和53.8％的提高的防治效果。

因此，确认到枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株在于作为诱导抗性物质的ASM及MeSA一同处理时，可通过协同效果更有效地防治松材线虫病。

【实施例11.空中喷施用制剂的制备及对松材线虫病防治效果的确认】

为了确认空中喷施枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株对成熟树的松材线虫病防治效果，制备了新型制剂。JCK-1398 10％SC制剂以JCK-1398喷雾干燥粉末10.0％、CR-NF 135B3.0％、黄原胶0.01％、消泡剂0.1％，丙二醇5.0％、苯甲酸钠0.2％、水81.69％的组成配制。

在分别制备JCK-1398 10％SC制剂和JCK-1398 20％SC制剂(现有制剂，实施例9)的10倍、100倍及500倍稀释液后，在3年生松树接种2周前和1周前，在每颗松树以100μl的量(现有处理量的50/1)进行叶面喷施2次，间隔7天。最后，以与上述实施例4-4相同的方法在用上述稀释液第二次处理7天后接种松树材线虫，接种松材线虫40天后观察干燥程度，结果如图9及表16所示。

【表16】

可从图9及表16确认，与JCK-1398 20％SC制剂相比，JCK-1398 10％SC在10倍稀释液(87.9％)、100倍稀释液(79.3％)及500倍稀释液(86.2％)的所有浓度下均表现出稳定的防治效果。因此筛选出JCK-1398 10％SC作为最终制剂以用于随后的空中喷施。

【实施例12.空中喷施用JCK-1398 10％SC制剂的松材线虫防治实用化评价】

基于上述结果，为了确认空中喷施用JCK-1398 10％SC制剂对成熟树的松材线虫病防治效果，利用30年生红松进行了现场试验。

在制备JCK-1398 10％SC制剂的50倍稀释液后，利用无人直升机在韩国晋州试验林的450M²中空中喷施3.6L(80L/1ha水平)。在接种松材线虫2个月前、1个月前及1个月后通过空中喷施处理3次。上述第二次处理1个月后，以与实施例9相同的方法在每颗松树接种20000只松材线虫。结果如图10a、10b及表17所示。

【表17】

可从图10a、10b及表17确认，接种材线虫6个月后，与未处理区(73.3％)相比，JCK-1398 10％SC制剂(20.0％)表现出非常低的发病率。即，表现出72.7％的防治效果，因而确认到JCK-1398 10％SC制剂即使在现场也可以与幼苗鉴定中一样非常有效地防治松材线虫病。

【实施例13.多种植物病防治效果的确认】

基于枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株的诱导抗性效果，为了进行应用扩大实验，利用JCK-1398菌株培养液的喷雾干燥粉末确认对多种植物病的防治效果。

【13-1.辣椒细菌性斑点病(病原菌：Xanthomonas euvesicatoria(黄单胞菌))防治效果的确认】

在以与实施例8相同的方法将JCK-1398菌株的喷雾干燥粉末分别稀释500倍及5000倍的溶液中，加入表面活性剂250μg/ml Tween20后，在8-9叶辣椒(Heungnong种子，Bultap辣椒)中通过土壤浇灌及叶面喷施方法以每盆20ml的量进行处理。所有试样均在辣椒细菌性斑点病菌株接种源接种4天前进行处理。在此情况下，作为对照组，用作为合成农药杀菌剂的城宝环素可湿性粉剂(土霉素(oxytetracydine)，韩国城宝化学株式会社)及一品可湿性粉剂(恶喹酸(奥索利酸)20％WP，Dongbang Agro Co.，Ltd.)以定量(1000倍稀释液)处理，作为未处理区，仅用250μg/ml Tween20在没有药剂的情况下进行相同处理。

然后，将辣椒细菌性斑点病菌株(Xanthomonas euvesicatoria)在TSA中在30℃下静置培养约48小时，然后使用2ml无菌水收获细胞。使用UV分光光度计将收获的辣椒细菌性斑点病原菌稀释至600nm处的光密度值为0.1，从而制备了接种源。接种源以每个幼苗5ml的量进行叶面喷施。将接种的幼苗在25±2℃的生长室中保持95％的湿度3天。然后在恒定灌水和在叶面浇水的情况下观察发病率，结果如图11及表18所示。

所有处理重复3次，所有实验重复2次。根据Abbasi(阿巴西)，发病程度以0-6的指数进行测量，从而确认辣椒叶上形成的辣椒细菌性斑点病的发病率。发病程度的指数标准如下：

0＝没有发病，

1＝1～2片叶子上出现1～2个小斑点，

2＝多片叶子上出现多个斑点，

3＝许多斑点聚集并出现在叶子上，

4＝许多斑点聚集并出现在许多叶子上，

5＝发病严重的同时出现落叶，

6＝植物体死亡。

【表18】

可从图11及表18确认，当用枯草芽孢杆菌JCK-1398的喷雾干燥粉末5000倍稀释溶液进行土壤浇灌处理时，表现出52.1％的防治效果，当进行叶面喷施时，表现出31.3％的防治效果。并且，当用500倍稀释溶液进行土壤浇灌处理时，表现出37.5％的防治效果，当机芯叶面喷施时，表现出20.8％的防治效果。因此，当用JCK-1398菌株培养液处理辣椒时，有望可通过有效诱导抗性来有利于防治辣椒细菌性斑点病。

【13-2.草坪币斑病(病原菌：Sclerotinia homoeocarpa)防治效果的确认】

作为JCK-1398培养液的稀释液，将以与实施例4-1相同的方法培养JCK-1398菌株后使用UV分光光度计稀释至600nm处的光密度值为0.08的稀释溶液用作100倍稀释溶液，将稀释至0.008的稀释溶液用作1000倍稀释溶液。使用用无菌水稀释100倍及1000倍的JCK-1398培养液稀释液制备了JCK-1398 20％SC。作为未处理区，使用其中以250μg/ml水平添加Tween-20的溶液，作为对照组，使用Tebuconazole(戊唑醇)25％EC(Horikuo乳剂)定量(2000倍稀释液)及半量(4000倍稀释液)。

所有试样均在草坪币斑病菌株接种源接种4天前进行土壤浇灌处理，JCK-1398培养液分别以100倍及1000倍稀释液单剂处理或分别与Tebuconazole 25％EC 4000倍稀释液组合处理，JCK-1398 20％SC以100倍及1000倍稀释液单剂处理或分别与Tebuconazole25％EC 4000倍稀释液组合处理。

然后，用宽度×长度为2×2mm的agar plug(琼脂塞)除去草坪币斑病菌株(Sclerotinia homoeocarpa)的菌落并接种在PDA培养基后，在25℃恒温器中培养5天。将在2次灭菌的麸皮-稻壳培养基(麸皮9g，稻壳1.5g，蒸馏水10ml)中培养的菌株的菌落切成宽度×长度为1×1cm的大小，各移植5个后，仅用生物硅橡胶封闭入口，并在25℃恒温器中培养7天。然后，将培养的细菌与培养基一起放入研磨机中，加入110ml蒸馏水及1.1ml的硫酸链霉素(streptomycin sulfate)200μg/ml后磨碎。

最后，在播种后生长约一个月的匍匐剪股颖(creeping bentgrass)盆中心钻1cm左右的孔，每盆接种3.3ml的接种源。在95％湿度和25℃温度下观察接种的草，直到观察到未处理区与处理区之间的差异。通过调查发病面积相对于盆总面积来计算发病率(diseaseseverity)，对每个处理区的3个盆进行2次重复实验，结果如图12及表19所示。

【表19】

可从图12及表19确认，在将JCK-1398培养液(100倍稀释液及1000倍稀释液)及JCK-1398 20％SC(100倍稀释液)以单剂处理的情况下，均表现出与未处理区相似的发病率。相反，在将JCK-1398培养液(100倍稀释液)与Tebuconazole 25％EC 4000倍稀释液组合处理的情况下，表现出97.26％的高防治效果，在将JCK-139820％SC(100倍稀释液及1000倍稀释液)与Tebuconazole 25％EC 4000倍稀释液组合处理的情况下，也分别表现出84.93％及73.97％的防治效果，可知防治效果以浓度依赖性方式出现。因此，当使用本发明的JCK-1398菌株培养液时，有望能够显著减少草坪币斑病防治时使用的化学农药处理量。

【13-3.番茄刺皮瘿螨(害虫：Aculops lycopersici)防治效果的确认】

使用用无菌水稀释250倍、500倍及1000倍的JCK-1398培养液稀释液制备JCK-139820％SC。作为未处理区，使用其中以250μg/ml水平添加Tween-20的溶液，作为对照组，定量(4000倍稀释液)使用线虫液剂(Fosthiazate(噻唑磷)30％SL，Farm HannongCo.，Ltd.)。

将每个试样在4-5叶Seogwang番茄(Lycopersicon esculentum Mill)中以每颗20ml的量进行土壤浇灌处理。在此情况下，JCK-1398 20％SC处理2次，间隔3天，线虫液剂处理一次。然后，通过保持发生刺皮瘿螨的适当温度及湿度(25-28℃30％)来使刺皮瘿螨自然发病。用药剂第二次处理2周后出现刺皮瘿螨，刺皮瘿螨发病2周后测量地上部分的长度，调查对刺皮瘿螨的防治效果，结果如图13及表20所示。

【表20】

可从图13及表20确认，JCK-1398 20％SC 250倍、500倍及1000倍稀释液处理区的地上部分的长度分别为26.13cm、21.75cm、15.88cm，可知随着浓度的增加，地上部分的长度增加。另一方面，用作对照组的Fosthiazate 30％SL 4000倍稀释液的地上部分的长度为32cm，其最长，未处理区为16.83cm，其最短。因此，当用JCK-1398菌株培养液处理番茄时，有望可通过有效诱导抗性来有利于防治番茄刺皮瘿螨。

【产业上的可利用性】

涉及在松树及多种植物中诱导抗性的枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株、利用其的用于防治植物病的组合物及防治方法。

【国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约】

国际表格

在原始保藏情况下的收条

细则第7.1款发给

至：全南大学校产学协力团

全南大学校产学协力团

韩国，光州，北区，龙凤路，77号

BP/4表格(KCTC表格17)(单页)。

序列表

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY

National Institute of Forest Science

Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation

<120> 在多种植物中诱导抗性的枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株、利用其的用于防治松材线虫病的组合物及防治方法

<130> PP200080

<150> KR 10-2020-0017232

<151> 2020-02-12

<160> 33

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-1b家族For

<400> 1

tgccccttca ggtaaatcgt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-1b家族Rev

<400> 2

gcgggtcgta gttgcagata a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-2家族For

<400> 3

cgacaacatt cgccccttct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-2家族Rev

<400> 4

ctgcagcgcg gtttgaatat 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-3家族第1类For

<400> 5

acctacagcg cttcattgc 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-3家族第1类Rev

<400> 6

tgtggtttca tgcgacgttt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-3家族第4类For

<400> 7

ccatcgaagc ccaggtaatt t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-3家族第4类Rev

<400> 8

agccgggaag caatattatg gt 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-4家族For

<400> 9

ccccgttact gtcaattgca t 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-4家族Rev

<400> 10

aaagcgtgac ggtgcgtatt 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-5家族For

<400> 11

gaaccagtgc ccatacacag tct 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-5家族Rev

<400> 12

cctgcggcaa cgttaaaagt c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-9家族For

<400> 13

acaccaccgt gctggacatt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-9家族Rev

<400> 14

gtgcgggagt cggtgtagag 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-10家族For

<400> 15

tgtctcaagt ggaggcaagg a 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PR-10家族Rev

<400> 16

aagcgacaat ttcaggcaaa ac 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗微生物肽For

<400> 17

gcgttgctca tacccgtttt 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗微生物肽Rev

<400> 18

gcagcactta gcactggatg aa 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞色素P450 For

<400> 19

aacatgtcct gcagcacgaa 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞色素P450 Rev

<400> 20

gtgcaccgca agtaaaccaa 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 伸长素For

<400> 21

cgaatgtaat tccgaagttg ca 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 伸长素Rev

<400> 22

ccatcccaaa ccaccagtct 20

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 富含羟脯氨酸的糖蛋白前体For

<400> 23

gagaaactgg caccgtctta gga 23

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 富含羟脯氨酸的糖蛋白前体Rev

<400> 24

acctccccct ccatctcaca 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 金属硫蛋白样蛋白For

<400> 25

tcaggctgct gcgttatttg 20

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 金属硫蛋白样蛋白Rev

<400> 26

tgtcagcgca gtcacaattt g 21

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 木葡聚糖内转糖基酶For

<400> 27

tctgcgcccc tacttttcc 19

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 木葡聚糖内转糖基酶Rev

<400> 28

agctgggcga ttgatcatgt 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 伸长因子-1α For

<400> 29

gggaagccac ccaaagtttt 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 伸长因子-1α Rev

<400> 30

tacatgggaa gacgccgaat 20

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gyrA For

<400> 31

cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gyrA Rev

<400> 32

caaggtaatg ctccaggcat tgct 24

<210> 33

<211> 856

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JCK-1398株gyrA序列

<400> 33

gatgtttgta gagcagtttg tttgtacaga ttgtttaaga tgacattcgc attggcatcg 60

cgtctgattt caatgacaat tctcatacct gtacgatctg actcatcacg cagatctgtg 120

ataccctcta tctttttgtc ccttacgaga tcagcaattt tctcaattaa tttcgcctta 180

tttacttggt aaggtaactc tgtaacgata attctttctt tacccgaaga tgtttgttcg 240

atctcagctt ttgcccggat cgtgatagag cctcggcctg attcgtatgc tttccggata 300

ccgctgcggc ccaagatttg acccgcagtc gggaaatcag gtcctggaat gacttccata 360

agctctggaa tggtaatgtc cggattctca ctgacagcaa gtactccgtc aatgatttct 420

cccagctggt gcggaggaat gtttgttgcc atacctaccg caatgccggc agcaccgttc 480

acgagcagat tcgggaacct tgaaggcata acgacaggtt ctctttctga cccgtcatag 540

ttatcctggt aatcgattgt gtcttttgtg atgtcacgaa gaatctccat tgagatttta 600

gacattcttg cttctgtata acgcatggcc gccgctgagt ctccgtcaac agaaccgaag 660

tttccgtgac cgtcaacgag catataacgg tagttgaaat cctgagccat tctgaccatg 720

gattcatata ccgctgaatc accgtgcggg tggtatttcc cgataacttc tccaacgata 780

cgcgcggatt ttttataagg cttgtcactt gtcatgccta aatcattcat tgcatacaaa 840

atccgtctat gaactg 856

PCT/RO/134表

Claims

1.激活植物对病害虫的诱导抗性的保藏编号为KCTC 14084BP的枯草芽孢杆菌JCK-1398菌株。

2.根据权利要求1所述的菌株，其中所述菌株包含SEQ ID NO：33的gyrA碱基序列。

3.根据权利要求1所述的菌株，其中所述菌株对松材线虫病、辣椒细菌性斑点病、草坪币斑病及番茄刺皮瘿螨组成的组中的一种以上植物病或害虫表现出防治效果。

4.杀虫剂或抗菌剂组合物，其包含选自由权利要求1至3中任一项所述的菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、所述培养物的干燥物及所述菌株的培养上清液组成的组中的一种以上。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物对选自由松材线虫及番茄刺皮瘿螨组成的组中的一种以上表现出杀虫活性。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物对选自由辣椒疮痂病菌及币斑病菌组成的组中的一种以上表现出抗菌活性。

7.用于防治植物病或害虫的组合物，其包含选自由权利要求1至3中任一项所述的菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、所述培养物的干燥物及所述菌株的培养上清液组成的组中的一种以上。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述植物病或害虫选自由松材线虫病、辣椒细菌性斑点病、草坪币斑病及番茄刺皮瘿螨组成的组中。

9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物用于与合成农药制成合剂。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述合成农药为戊唑醇。