CN109913385B - 用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及制备方法和应用，该光合细菌菌株为光合细菌Rhodomicrobium vannielii B‑30。(1)本发明的光合细菌生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到猕猴桃炭疽病防控的生防菌剂及生防发酵液；(2)本发明的光合细菌制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性；(3)本发明的光合细菌制得的生防菌剂及生防发酵液既可以防治猕猴桃炭疽病害又能促进猕猴桃生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体是用于猕猴桃炭疽病的防治的光合细菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及制备方法和应用。
背景技术
猕猴桃炭疽病是危害猕猴桃生产的主要病害之一，该病主要危害猕猴桃叶片和果实，也感染枝条。猕猴桃整个生育期都能发生炭疽病，以结果初期至落叶期受害较严重。病原菌为半知菌刺盘孢菌 Colletotrichum sp.。主要为害茎、叶及果实，影响植株生长发育及果实品质。在猕猴桃产区个别果园发病率达到95％以上，少数果园植株感病率80％以上，叶片感病率15％～85％。果园发病中心植株叶片发病率95％，果实发病率30％～80％。
长期以来，针对炭疽病这种严重危害猕猴桃的真菌性病害，许多研究已提出多种不同的防治对策，并获得一定效果。但目前所采用的各种防治措施只能在一定程度上控制病害的扩展和蔓延，尚不能根治。由于化学防治效果有限且可能发生安全或环境隐患，在使用范围和时期方面受到的控制越来越严格。生物防治将是今后病害防治的一个重要发展向。生物防治是利用有益生物或其他生物来消灭或抑制有害生物，受到广泛采用和具有良好生态效益、环境效益与社会效益的一种病虫害防治方法，因其具有对环境、生态和人类健康安全的优点，符合农业的可持续发展，是当前和未来植物病害防治的发展趋势。
科研工作者在生物防治猕猴桃炭疽病上做了较为广泛的研究。用于炭疽病生物防治的拮抗微生物主要有真菌、细菌、粘菌、海洋微生物，其中生防细菌包括芽孢杆菌、假单孢菌、海洋细菌等。它们对炭疽病菌产生抑制作用的机理主要是通过竞争性生长繁殖而占居生存空间的方式来阻止植物病原真菌的生长与增殖，能在植物表面迅速形成一层高密保护膜，使炭疽病菌得不到生存空间，保护了植物免受病原菌为害；或分泌如细菌素类、蛋白类、脂肽类、多肽类、酚类等抑菌物质来抑制菌丝生长和病菌孢子发芽，从而达预防植物病害的发生；另外通过生防菌诱发植物自身的抗病潜能从而增强植物的抗病性。近年来，国内外学者在光合细菌的基础性研究、应用研究方面也取得很大的进展。诸多研究结果证明，光合细菌菌体富含多种生理活性物质及促生长因子，甚至菌体分泌的胞外组份对固氮根瘤细菌也有刺激作用，能显著提高其固氮活性；且因其含有脯氨酸、尿嘧啶、胞嘧啶等物质，能增加多种经济作物的产量等。而且光合细菌的一些活性物质能钝化病原体的致病力、促进放线菌等有益微生物增殖，以及抑制病原体的生长，从而有效地抑制某些植物病害的发生与蔓延。因而，利用光合细菌防治猕猴桃炭疽病具有丰富的生防资源和广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及制备方法和应用，以解决猕猴桃炭疽病防治的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌菌株，光合细菌菌株为光合细菌万尼氏红微菌B-30，保藏编号CCTCC NO:M2018210，于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心。
一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防菌剂，光合细菌生防菌剂由上述的光合细菌菌株经活化、培养制备得到。
一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
活化：将光合细菌菌株万尼氏红微菌B-30的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；
种子培养：将红色单菌落接入至光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；
生产培养：菌液按光合细菌菌株总体积5%的接种量接种至光合细菌生产培养基，进行生产培养至对数生长期即制得光合细菌生防菌剂。
进一步地，步骤种子培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
进一步地，生产培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
进一步地，光合细菌液体培养基配方和光合细菌生产培养基均为：(NH4)2SO40.5g/L、CH2COONa 0.5g/L、YE 1.5g/L、K2HPO4 为1g/L、FeSO4 0.05g/L、H3BO4 0.05g/L。
一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防发酵液，光合细菌生防发酵液为上述的光合细菌生防菌剂分离的上清液或上述制备方法的制得的光合细菌生防菌剂分离的上清液。
进一步地，分离方法为离心，离心的转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min。
一种上述光合细菌生防菌剂或上述制备方法制得的光合细菌生防菌剂的应用，光合细菌生防菌剂应用于猕猴桃促生。
一种上述光合细菌生防菌剂或上述制备方法制得的光合细菌生防菌剂的应用，光合细菌生防菌剂应用于拮抗猕猴桃炭疽菌或防控猕猴桃炭疽病。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明的光合细菌万尼氏红微菌B-30的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到猕猴桃炭疽病防控的生防菌剂及生防发酵液；
（2）本发明的光合细菌万尼氏红微菌B-30制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性；
（3）本发明的光合细菌万尼氏红微菌B-30制得的生防菌剂及生防发酵液既可以防治猕猴桃炭疽病害又能促进猕猴桃生长。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明：
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为光合细菌菌株万尼氏红微菌B-30的双层平板菌落图；
图2为光合细菌菌株万尼氏红微菌B-30的血清瓶培养图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌菌株，光合细菌菌株为光合细菌万尼氏红微菌B-30，保藏编号CCTCC NO:M2018210，保藏单位地址：中国 武汉 武汉大学，于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心。
参照图1，光合细菌万尼氏红微菌B-30为革兰氏阴性菌，其拉丁文名称为Rhodomicrobium vannielii B-30。经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为光合细菌。主要生物学特征有：双层固体平板培养基上培养4d～6d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm～0.60mm；液体培养基中培养5d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30℃～35℃，pH=7。
一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防菌剂，光合细菌生防菌剂由光合细菌菌株经活化、培养制备得到。其中培养可分为种子培养和生产培养两个阶段。
一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
活化：将光合细菌菌株万尼氏红微菌B-30的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；
种子培养：将红色单菌落接入至光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；参照图2.
生产培养：菌液按光合细菌菌株总体积5%的接种量接种至光合细菌生产培养基，进行生产培养至对数生长期即制得光合细菌生防菌剂。
种子培养阶段，红色单菌落可接入至血清瓶中，以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液。
生产培养阶段，可将种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株总体积5%的接种量接种到生产瓶中，以光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得光合细菌生防菌剂。
进一步地，种子步骤培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
进一步地，生产培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
种子培养步骤和生产培养阶段中的pH值可加入0.01M摩尔浓度的磷酸缓冲液进行调节和保持。
进一步地，光合细菌液体培养基配方和光合细菌生产培养基均为：(NH4)2SO40.5g/L、CH2COONa 0.5g/L、YE 1.5g/L、K2HPO4 为1g/L、FeSO4 0.05g/L、H3BO4 0.05g/L。由于培养过程中要加入磷酸缓冲液，因此，培养基最终的K2HPO4浓度会有所变化，以根据实际情况将PH值调到7时的用量为准。
一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防发酵液，光合细菌生防发酵液为上述的光合细菌生防菌剂分离的上清液或上述制备方法的制得的光合细菌生防菌剂分离的上清液。
进一步地，分离方法为离心，离心的转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min。
一种上述光合细菌生防菌剂或上述制备方法制得的光合细菌生防菌剂的应用，光合细菌生防菌剂应用于猕猴桃促生。
一种上述光合细菌生防菌剂或上述制备方法制得的光合细菌生防菌剂的应用，光合细菌生防菌剂应用于拮抗猕猴桃炭疽菌或防控猕猴桃炭疽病。
（1）本发明的光合细菌万尼氏红微菌B-30的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到猕猴桃炭疽病防控的生防菌剂及生防发酵液；
（2）本发明的光合细菌万尼氏红微菌B-30制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性；
（3）本发明的光合细菌万尼氏红微菌B-30制得的生防菌剂及生防发酵液既可以防治猕猴桃炭疽病害又能促进猕猴桃生长。
实施例1：
一株光合细菌菌株，其名称为光合细菌万尼氏红微菌B-30。
光合细菌菌株万尼氏红微菌B-30为革兰氏阴性菌，经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为光合细菌。主要生物学特征有：双层固体平板培养基上培养4d～6d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm～0.60mm；液体培养基中培养5d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30℃～35℃，pH=7。
实施例2：
一种光合细菌生防菌剂，采用实施例1的光合细菌菌株万尼氏红微菌B-30为原料，通过经活化、种子培养、生产培养制备得到，其具体制备方法包括以下步骤：
(1)活化：将光合细菌万尼氏红微菌B-30菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：(NH4)2SO40.5g/L、CH2COONa 0.5g/L、YE 1.5g/L、K2HPO4 约1g/L（根据实际情况将PH值调到7时的用量为准）、FeSO4 0.05g/L、H3BO4 0.05g/L，pH=7.0。
（2）种子培养：将步骤（1）培养出的红色单菌落接入至120mL血清瓶中，在温度为30℃～35℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH=7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液。光合细菌液体培养基的配方为：(NH4)2SO4 0.5g/L、CH2COONa 0.5g/L、YE1.5g/L、K2HPO4 约1g/L（根据实际情况将PH值调到7时的用量为准）、FeSO4 0.05g/L、H3BO40.05g/L，pH=7.0。
（3）生产培养：将步骤（2）种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基（培养基成分与上述光合细菌液体培养基一致）进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5%，在温度为30℃～35℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH=7.0条件下，培养至对数生长期即制得生防菌剂。
实施例3：
一种光合细菌生防发酵液，采用实施例1的光合细菌菌株万尼氏红微菌B-30为原料，通过经活化、种子培养、生产培养、离心制备得到，其具体制备方法包括以下步骤：
取实施例1中获得的生防菌剂，经发酵培养6d，发酵培养在温度为30-35℃、光照条件为3000Lx-4000Lx条件下进行，发酵培养基成分与上述的光合细菌液体培养基成分相同，然后在6000rpm条件下离心5min-8min，离心收集上清液，将上清液用细菌过滤器过滤，得到无光合细菌菌体的上清液即为生防发酵液，4℃保存备用。
实施例4：光合细菌万尼氏红微菌B-30生防菌抑制猕猴桃炭疽病菌丝的作用。
一种实施例2的生防菌在猕猴桃炭疽病病防治中的应用，具体的应用方法为：
将光合细菌万尼氏红微菌B-30菌株采用双层平板法进行培养：下层为实施例2中的光合细菌固体培养基，上层为10mLPDA组成双层平板，在温度为30℃～35℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH=7.0条件下培养，待光合细菌万尼氏红微菌B-30菌株布满平板后，在平板中央接种预先培养5d的直径为6mm的猕猴桃炭疽病菌菌饼，每平板接种一片，每处理重复3次，倒置于28 ℃恒温箱中进行暗培养，逐日观察菌丝的生长情况并于5d记录菌饼直径大小，按照下列公式计算抑菌率：抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%（单位：cm）。
光合细菌万尼氏红微菌B-30对猕猴桃炭疽病菌的抑菌率为65.57%。空白对照是下层为10mL光合细菌固体培养基和上层为10mLPDA的空白双层平板。
实施例5：光合细菌万尼氏红微菌B-30生防菌猕猴桃炭疽病离体果实生测试验。
一种实施例3的生防发酵液在猕猴桃炭疽病病防治中的应用，具体的应用方法为：
采集成熟果，经表面消毒后，用HAMILTON微量注射器的针头在果面上刺2个接种点，将生防发酵液：孢子=1：1：1比例配制的孢子悬浮液(浓度为1×106个/mL)，每点注入2μL于果肉中，28℃、12h光照/d、RH≥95 %的条件下培养，第7 d调查发病情况。病斑直径≥4 mm的视为发病，统计发病率，即病斑数占总接种点的百分率。设4次重复，每重复至少5个果。
对照处理的猕猴桃炭疽病菌发病率为96%，而发酵液处理后猕猴桃炭疽病发病率为30%。液体的光合培养基为空白对照。
实施例6：光合细菌万尼氏红微菌B-30生防菌剂在猕猴桃促生中的应用。
一种实施例2的生防菌在猕猴桃促生中的应用，具体的应用方法为：
在温室中，将分别将5×106cfu/mL生防菌剂、光合细菌培养基和清水处理喷施于移栽生长一致的5-6片真叶的猕猴桃扦插苗，每处理10株共喷100mL至叶面滴水，重复3次。鉴定期间幼苗保持在26～28℃、10 h光照/d条件下的温室中培养，50d后调查。每个处理选取 3 株代表性植株分别测定株高和第 7片叶(自下而上)的长宽。
CK为清水对照，编号1、编号2分别为5×106 cfu/mL生防菌和光合细菌培养基。从下表中可以知道施用生防菌剂处理后的猕猴桃株高相对于清水对照平均增加31.02%、猕猴桃叶片长度平均增加了57.58%，叶片宽度平均增加了46.33%。
| 处理 | 平均株高（cm） | 增高率（%） | 平均叶片长度（mm） | 叶长增加率（%） | 平均叶片宽度（mm） | 叶宽增加率（%） |
| 1 | 80.94 | 33.34 | 90.51 | 59.60 | 60.11 | 49.68 |
| 2 | 78.12 | 28.70 | 88.22 | 55.56 | 57.42 | 42.98 |
| CK | 60.70 | - | 56.71 | - | 40.16 | - |
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防菌剂，其特征在于，所述光合细菌生防菌剂由光合细菌菌株经活化、培养制备得到；
所述光合细菌菌株为万尼氏红微菌B-30，拉丁文名称为Rhodomicrobium vannieliiB-30，保藏编号CCTCC NO:M2018210，于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心；
万尼氏红微菌B-30主要生物学特征有：双层固体平板培养基上培养4d～6d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm～0.60mm；液体培养基中培养5d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30℃～35℃，pH=7。
2.一种如权利要求1所述的用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；
活化：将光合细菌菌株万尼氏红微菌B-30的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；
种子培养：将所述红色单菌落接入至光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；
生产培养：所述菌液按光合细菌菌株总体积5%的接种量接种至光合细菌生产培养基，进行生产培养至对数生长期即制得光合细菌生防菌剂。
3.根据权利要求2所述的用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤种子培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
4.根据权利要求2所述的用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述生产培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
5.根据权利要求2~4中任一项所述的用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述光合细菌液体培养基配方和所述光合细菌生产培养基均为：(NH4)2SO4 0.5g/L、CH2COONa 0.5g/L、YE 1.5g/L、K2HPO4 为1g/L、FeSO4 0.05g/L、H3BO40.05g/L。
6.一种用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防发酵液，其特征在于，所述光合细菌生防发酵液为权利要求1所述的光合细菌生防菌剂分离的上清液或权利要求2~5中任一项制备方法的制得的光合细菌生防菌剂分离的上清液。
7.根据权利要求6所述的用于猕猴桃炭疽病防治的光合细菌生防发酵液，其特征在于，所述分离方法为离心，所述离心的转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min。
8.一种权利要求1所述的光合细菌生防菌剂或权利要求2-5中任一所述制备方法制得的光合细菌生防菌剂的应用，其特征在于，所述光合细菌生防菌剂应用于猕猴桃促生。
9.一种权利要求1所述的光合细菌生防菌剂或权利要求2-5中任一所述制备方法制得的光合细菌生防菌剂的应用，其特征在于，所述光合细菌生防菌剂应用于拮抗猕猴桃炭疽菌或防控猕猴桃炭疽病。
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