KR101001928B1 - 방사선 조사에 의하여 항산화능, 티로시나제 저해능및/또는 암세포 독성이 증가된 고분자량의 피브로인, 그의제조방법 및 그의 사용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 방사선 조사에 의하여 분자구조가 변형되어 분자량이 증가되고, 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포독성이 증가된 피브로인 (fibroin), 그의 제조방법 및 상기 방사선 조사된 피브로인을 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포독성 향상용 식품, 화장품 또는 의약품 소재로 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 고분자량의 피브로인은 항산화 활성, 미백 효과 및/또는 암세포에 대한 세포독성이 우수하기 때문에, 기능성 식품, 화장품, 의약품 등의 원료로 유용하게 사용될 수 있다.

방사선 조사, 피브로인(fibroin), 분자구조 변형(structural modification), 분자량, 미백 효과, 항산화, 암세포 독성

Description

방사선 조사에 의하여 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포 독성이 증가된 고분자량의 피브로인, 그의 제조방법 및 그의 사용방법 {High molecular weight fibroin having improved antioxidant, tyrosinase inhibitory ability and/or cytotoxicity in cancer cell by irradiation, method for producing the same and method for using the same}

본 발명은 방사선 조사에 의하여 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포독성이 증가된 피브로인, 그의 제조방법, 그의 사용방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 방사선 조사에 의하여 분자구조가 변형되어 분자량이 증가되고, 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포독성이 증가된 피브로인, 그의 제조방법 및 상기 방사선 조사된 피브로인을 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포독성 향상용 식품, 화장품 또는 의약품 소재로 사용하는 방법 및 상기 피브린을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

오래전부터 실크 단백질은 오직 의류용 실크(clothing silk)로만 사용되어져 왔으나, 최근 생화학 및 의학적 용도로의 응용이 활발히 연구되고 있어 새로운 생 체재료(biomaterial)로 주목을 받고 있으며 실크 피브로인의 여러 가지 생리활성이 보고되어 왔다.

실크 피브로인을 급여한 쥐에서 혈중 콜레스테롤치와 혈당치가 낮아지고 알코올 흡수가 저해되는 효과가 밝혀졌으며 (Luo, J., K. Chen, Q. Xu, and K. Hirabayashi. 1993. Study on foodization of fibroin and its functionality, pp. 73-87. In The collection of papers for the second international silk conference, China), sulfate기로 반응시킨 피브로인의 경우에는 anti-HIV 활성을 나타내기도 하였다(Gotoh, K., H. Izumi, T. Kanamoto, Y. Tamada, and H. Nakashima. 2000. Sulfated fibroin, a novel sulfated peptide derived from silk, inhibits human immunodeficiency virus replication in vitroo. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64: 1664-1670).

그러나, 이러한 많은 연구와 환경친화적인 실크 단백질임에도 불구하고 아직까지 피브로인의 기능성 식품, 화장품 소재, 및 의약품 소재로의 활용을 위한 기능성의 개선과 같은 연구는 전무한 상태였다.

따라서, 실크 산업으로부터 피브로인의 실용적인 사용과 식품에 적용을 위해 상기한 바와 같은 피브로인의 기능성 증진 기술이 절실하게 대두되어 왔다.

이에 본 발명자들은 생리적 활성이 증가된 피브로인에 대해 연구하던 중, 피 브로인 용액에 방사선을 조사하면 분자구조가 변형이 되고, 라디칼 소거능, 티로시나제 저해효과 및/또는 암세포에 대한 세포독성이 증가된 고분자량의 피브로인을 얻을 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 방사선 조사를 통하여 분자구조가 변환되어 생리적 활성이 증가된 피브로인을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 분자구조가 변환되어 생리적 활성이 증가된 피브로인의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분자구조가 변환되어 생리적 활성이 증가된 피브로인의 사용방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분자구조가 변환되어 생리적 활성이 증가된 피브로인을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 방사선 조사에 의하여 분자구조가 변형되어 분자량이 증가되고, 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포독성이 증가된 피브로인을 제공한다.

본 발명은 또한 피브로인에 흡수선량이 1 내지 1,000 kGy이 되도록 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자구조가 변형되어 분자량이 증가되고, 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포독성이 증가된 피브로인의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 상기의 분자구조가 변형된 피브로인을 항산화능, 티로시나제 저해 능 및/또는 암세포에 대한 세포독성 향상용 식품 소재, 화장품 소재 및 의약품 소재로 사용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 분자구조가 변형된 피브로인을 유효성분으로 함유하는 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포독성 향상용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 감마선 조사에 의해 분자구조가 변형된 고분자량의 피브로인은 비조사구에 비하여 라디칼 소거능의 증가, 티로시나제 억제효과 및/또는 암세포에 대한 세포독성의 증가 등과 같은 우수한 생리학적 특성과 미백효과 등을 지니고 있기 때문에, 식품, 화장품 및 의약품 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은, 방사선 조사에 의하여 분자구조가 변형되어 분자량이 증가되고, 항산화능, 티로시나제 저해능, 및/또는 암세포에 대한 세포독성이 증가된 피브로인에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 피브로인은 누에 고치로부터 얻을 수 있는데, 누에 고치에 탄산나트륨 수용액 등을 처리하여 세리신을 제거하고 여과하여 얻은 피브로인 용액을 투석 등을 행하여 불순물을 제거하여 사용할 수 있는데, 상기 불순물이 제거된 피브로인 용액을 동결건조하여 분말형태의 피브로인을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 상기 방사선은 감마선, 전자선 및 X-선으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있으나, 방사선 조사 후에 얻어진 피브로인의 분자량의 증가 효과에서 감마선 또는 전자선을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 방사선의 흡수선량은 1 내지 1,000 kGy, 바람직하게는 5 내지 500 kGy, 보다 바람직하게는 5 내지 200 kGy로 조사하는데, 상기 흡수선량이 1 kGy 미만인 경우에는 방사선을 조사하는 소기의 목적을 달성할 수 없고, 반면에 1,000 kGy를 초과하는 경우에는 고 선량의 방사선 조사에 의한 물질분해 등의 문제가 발생할 수 있다.

본 발명에 따른 방사선 조사에 의하여 분자구조가 변형된 피브로인의 UV 흡수 스펙트럼에서 280nm와 300nm에서 비조사구에 비하여 각각 105% 및 500% 이상 증가함을 확인할 수 있었다.

본 발명에 의한 피브로인의 분자구조의 변형은 알파-헬릭스(a-helix) 이차구조의 감소이거나, 베타-시트(b-sheet), 베타-턴(b-turn), 및 랜덤 코일(random coil)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 이차구조의 증가일 수 있다.

또한, 상기 피브로인의 분자구조의 변형이 알파-헬릭스 이차구조의 감소 및 베타-시트, 베타-턴과 랜덤 코일로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 이차구조의 증가일 수 있으나, 바람직하게는 항산화능과 티로시나제 저해능, 암세포에 대한 세포독성 등의 증가 효과를 극대화시킬 수 있다는 점에서, 알파-헬릭스 이차구조의 감소 및 베타-시트, 베타-턴과 랜덤 코일의 이차구조의 증가인 것이 바람직하다.

Lee 등(Lee, S., Lee, S., & Song, KB. (2003). Effect of gamma-irradiation on the physicochemical properties of porcine and bovine blood plasma proteins. Food Chem 82;521-6)은 용액상에 있는 단백질을 조사시키면 발생된 산소 라디칼에 의해 단백질의 공유결합이 쉽게 깨져 정렬된 구조가 무너지기 때문에, 2차와 3차 구조가 변형될 수 있다고 보고하였다.

베타-턴(b-turn) 구조는 단백질의 i번째 카보닐기와 i+3 번째 아민기 사이에 수소결합을 이룬 4개의 잔기로 구성되어 있는데, 상기 베타-턴은 구상단백질을 이루는 일반적인 요소로써 구상단백질 표면에서 흔히 볼 수 있으며, 이들은 폴리펩티드 사슬의 방향을 반전시킴으로써 구조 접힘을 촉진시킨다. 따라서 베타-턴은 천연 단백질의 구조 접힘에 있어 중요한 요소로써 작용한다.

본 발명에 따른 방사선 조사에 의하여 분자구조가 변형된 피브로인의 분자량 은 5 kDa 내지 2,000 kDa, 바람직하게는 5 kDa 내지 1,000 kDa, 보다 바람직하게는 10 kDa 내지 1,000 kDa인 것을 특징으로 한다. 상기한 바와 같이, 방사선을 조사하지 않은 피브로인의 분자량이 5 kDa 이하인 것을 고려하면, 본 발명에 의한 피브로인은 방사선을 조사함으로써 그 분자량이 상당히 증가함을 알 수 있다.

본 발명에 따른 방사선 조사에 의하여 분자구조가 변형된 피브로인의 라디칼 소거능은 비조사구에 비하여 최대 10배 이상으로 증가함으로써, 항산화능과 같은 생리활성을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방사선 조사에 의하여 분자구조가 변형된 피브로인의 티로시나제 저해효과는 비조사구에 비하여 최대 7배 이상으로 증가함으로써, 미백효과를 향상시킬 수 있다.

사람 피부에 있는 멜라닌 색소는 UV에 의한 손상을 보호해주는 주요한 메커니즘이지만, 기미(melasma), 주근깨(freckles), 광선각화증(senile lentigines) 그리고 과도한 색소 같은 비정상 색소형성은 바람직하지 않은 문제점들을 야기시킨다. 티로시나제는 사람의 피부에 멜라닌 생합성을 초래하며, 티로시나제 억제제 들은 미백효과를 위한 화장품에 사용되는 중요한 소재로 알려져 있다.

또한, 본 발명에 따른 방사선 조사에 의하여 분자구조가 변형된 피브로인의 암세포에 대한 세포독성은 비조사구에 비하여 최대 40배 이상으로 증가함으로써, 암세포의 성장억제 효과를 향상시킬 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 피브로인에 흡수선량이 1 내지 1,000 kGy이 되도록 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자구조가 변형되어 분자 량이 증가되고, 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포독성이 증가된 피브로인의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 피브로인의 제조방법에 사용되는 상기 방사선 조사되는 피브로인은 누에고치로부터 분리한 피브로인이거나 또는 합성된 피브로인인 것을 특징으로 하는데, 상기 누에고치 분리한 피브로인은 누에 고치에 탄산나트륨 수용액 등을 처리하여 세리신을 제거하고 가열하고 CaCl₂-H₂0-Ethanol 3성분 용액을 사용하여 용해시킨 후, 여과하여 얻은 피브로인 용액을 투석 등을 행하여 불순물을 제거하여 사용할 수 있는데, 상기 불순물이 제거된 피브로인 용액을 동결건조하여 분말형태의 피브로인을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 합성된 피브로인은 미생물을 이용한 생합성 방법으로 합성하거나 상용되고 있는 폴리펩타이드 합성법에 의해 얻어진 피브로인을 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 피브로인의 제조방법은 상기 단계에서 얻은 피브로인을 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 상기 동결건조는 통상의 방법에 의해 수행할 수 있다.

본 발명에 의한 피브로인의 제조방법에 사용되는 상기 방사선은 감마선, 전자선 및 X-선으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있으나, 방사선 조사 후에 얻어진 피브로인의 분자량의 증가 효과 면에서 감마선 또는 전자선을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 피브로인의 분자구조의 변형은 알파-헬릭스(a-helix) 이차구 조의 감소이거나, 베타-시트(b-sheet), 베타-턴(b-turn), 및 랜덤 코일(random coil)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 이차구조의 증가일 수 있다.

또한, 상기 피브로인의 분자구조의 변형이 알파-헬릭스 이차구조의 감소 및 베타-시트, 베타-턴과 랜덤 코일로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 이차구조의 증가일 수 있으나, 바람직하게는 항산화능과 티로시나제 저해능 증가효과 및/또는 암세포에 대한 세포독성을 극대화시킬 수 있다는 점에서, 알파-헬릭스 이차구조의 감소 및 베타-시트, 베타-턴과 랜덤 코일의 이차구조의 증가인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방사선 조사에 의하여 분자구조가 변형된 피브로인의 분자량은 5 kDa 내지 2,000 kDa, 바람직하게는 5 kDa 내지 1,000 kDa, 보다 바람직하게는 10 kDa 내지 1,000 kDa인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기의 분자구조가 변형된 피브로인을 항산화능과 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포독성 향상용 식품 소재, 화장품 소재 및 의약품 소재로 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기의 분자구조가 변형된 피브로인을 유효성분으로 함유하는 항산화능, 티로시나제 저해능 및/또는 암세포에 대한 세포 독성 향상용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 의한 상기 식품 소재, 화장품 소재 또는 의약품 소재로 사용하는 방법은 식품공전, 식품첨가물공전, 화장품 원료지정과 기준 및 시험방법 등에 관한 규정 등에서 허용되는 범위 내에서 필요에 따라 다양하게 변형하여 사용될 수 있 다.

본 발명에 의한 상기 분자구조가 변형된 피브로인을 식품 소재로 사용하는 예로서는 음료류, 면류, 냉동식품, 유가공 제품, 육가공 제품, 조미식품, 생식류 등과 같은 식품 조성물을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의한 상기 분자구조가 변형된 피브로인을 화장품 소재로 사용하는 예로서는 로션, 크림, 젤 등의 제형인 화장품 조성물이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 의한 상기 분자구조가 변형된 피브로인을 의약품 소재로 사용하는 예로서는 정제, 과랍제, 환제, 액제, 주사제, 크림제, 연고제 등의 제형인 의약품 조성물이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 식품 조성물, 화장품 조성물 또는 의약품 조성물의 제조방법은 특별한 제한없이, 통상의 방법으로 제조할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 (감마선 조사에 분자구조가 변형된 피브로인의 제조(1))

본 발명에서 사용된 피브로인은 누에고치로부터 분리한 천연 피브로인을 사용하였다.

누에고치 10g에 5%(w/v)농도의 탄산나트륨 수용액 500ml을 처리하여 1시간 동안 가열하고 여과지로 여과하여 용해된 세리신을 제거하였다. 열수를 이용하여 잔사를 수 차례 세척함으로써 잔여 세리신과 탄산나트륨을 제거하였다. 이로써 세리신이 제거되어 피브로인만 남아있는 피브로인 견사를 얻었다. 이 피브로인 견사는 CaCl₂-H₂0-에탄올3성분 용액을 사용하여 용해시켰다. 용해된 피브로인 용액은 투석막에 넣어 증류수에 3일간 투석한 후 동결건조하여 분말상태의 피브로인을 얻어 실험에 사용하였다.

상기에서 얻은 피브로인 시료는 한국원자력연구원 정읍방사선과학연구소의 코발트-60 조사기(cobalt-60 irradiator)에서 조사되었다. 이때 선원의 크기는 약 300 kCi이었으며, 선량율은 시간당 10 kGy이었다.

흡수선량 확인은 5 mm 다이어미터 알라닌 도시미터(diameter alanine dosimeters ; Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)로 하였으며, 도시메트리 시스템(dosimetry system)은 국제원자력기구 (IAEA)의 규격에 준하여 표준화한 후에 사용하였다.

실크 피브로인을 증류수에 1mg/ml의 농도가 되도록 녹인 후, Co-60 감마선 조사 시설(IR-79, Nordion International Ltd., Ontario, Canada)을 이용하여 시간당 10 kGy의 선량률로 5 kGy의 총 흡수선량을 얻도록 조사하여 분자구조가 변형된 피브로인 용액을 제조하였다.

실시예 2 (감마선 조사에 분자구조가 변형된 피브로인의 제조(2))

감마선의 총 흡수선량이 10 kGy가 되도록 조사한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 분자구조가 변형된 피브로인 용액을 제조하였다.

실시예 3 (감마선 조사에 분자구조가 변형된 피브로인의 제조(3))

감마선의 총 흡수선량이 50 kGy가 되도록 조사한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 분자구조가 변형된 피브로인 용액을 제조하였다.

실시예 4 (감마선 조사에 분자구조가 변형된 피브로인의 제조(4))

감마선의 총 흡수선량이 100 kGy가 되도록 조사한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 분자구조가 변형된 피브로인 용액을 제조하였다.

실시예 5 (감마선 조사에 분자구조가 변형된 피브로인의 제조(5))

감마선의 총 흡수선량이 150 kGy가 되도록 조사한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 분자구조가 변형된 피브로인 용액을 제조하였다.

실시예 6 (감마선 조사에 분자구조가 변형된 피브로인의 제조(6))

감마선의 총 흡수선량이 200 kGy가 되도록 조사한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 분자구조가 변형된 피브로인 용액을 제조하였다.

실험예 1 (UV 스펙트럼 분석)

상기 실시예 1 내지 실시예 6에서 제조한 감마선 조사된 실크 피브로인 용액은 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

감마선 조사에 의한 실크 피브로인의 구조변형을 알아보기 위하여 상기 실크 피브로인 용액을 2 mg/ml의 농도로 용해시킨 후, 감사선 조사하여 자외선 스펙트로포토미터(UV spectrophotometer ; UV-1601PC, Shimadzu C., Tokyo, Japan)을 이용하여 180~500 nm의 범위에서 UV-VIS 스펙트럼으로 분석한 결과를 도 1에 나타내었다. 이때 대조군으로는 감마선 비조사구를 사용하였다.

UV 흡수 스펙트럼(UV absorption spectra)은 단백질 표면의 방향족 아미노산의 곁사슬의 흡광도에 의해 구조적인 변형을 보여준다. 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine) 그리고 트립토판(tryptophan)과 같은 상기 3가지 아미노산들은 방향족 곁사슬을 가지는데, 결합고리를 가지는 대부분의 화합물과 같은 방향족 아미노산은 스펙트럼(spectrum)의 자외선 영역에서 빛을 흡수한다.

티로신과 트립토판은 대부분의 UV 흡광도가 280nm 영역에서 밝혀지는데, 트립토판은 페닐알라닌보다 100배 가량 흡수율이 강하며, 페닐알라닌은 대부분 260nm에서 측정되어 진다.

도 1을 참조하면, 감마선 조사된 실크 피브로인의 흡광도는 선량이 증가할수록 260nm와 280nm에서 증가되는데, 상기 UV 흡광도의 변형은 방사선에 의해 구조적인 변형이 있음을 보여준다. 이러한 구조적인 변형은 단백질 구조의 분열에 의해 트립토판과 티로신과 같은 내부의 아미노산들이 밖으로 드러났기 때문으로서, 방사 선량이 증가할수록 혼탁도 또한 330nm에서 증가되었음을 알 수 있다.

보고된 연구에 따르면, 최대한의 흡수파장 영역은 214nm이었는데, 이러한 결과는 펩타이드 결합들이 UV 영역에서 피브로인이 주로 흡수되는 그룹이라는 것을 나타내며, 본 실험예 1은 이러한 결과들을 뒷받침해 준다고 할 수 있다.

실험예 2 (원편광 이색성 스펙트럼 분석)

원편광 이색성 스펙트럼(circular dichroism spectra ; 이하 CD spectra라 한다)은 150-W 제논 램프(xenon lamp)가 장착된 Jasco J-715 스펙트로폴라리미터(spectropolarimeter ; Japan Spectroscopic)를 이용하여 측정하였다.

원자외선 스펙트럼(far-UV spectra)은 190-250nm 의 영역에서 측정하였고, 시료(0.2 mg/ml)는 pH7.2의 PBS 용액상태에서 분석하였는데, 상기 시료는 질소가스로 세척하였으며, 1 mm의 커비트(cuvette)을 사용하였다.

3 반복으로 해당 영역을 분석하여 평균을 구했으며, PBS에 대해 측정된 값을 차감하여 계산하였는데, 이때 CD spectra의 단위는 잔여타원률 (residue ellipticity) (degree cm²/dmol)로 표시하였다.

CD 스펙트로스코피(CD spectroscopy)를 이용하여 구조 불균형으로 인해 발생하는 좌회전 편광(left-handed polarized light)과 우회전 편광(right-handed polarized light)의 흡수차이를 측정할 수 있는데, 상기 CD 스펙트로스코피는 원자외선 스팩트럼far-UV spectral 영역 (190-250 nm)에서 이차 단백구조를 측정할 수 있다.　 이 파장에서 발색단은 단백질 결합이고, 이 결합이 정상 접힘 상태(regular, folded environment), 알파-헬릭스(alpha-helix), 베타-시트(beta-sheet) 또는 랜덤 코일 구조(random coil structures)에 위치할 때 각각 독특한 모양과 크기의 CD 스펙트럼을 나타낸다.

208, 220 nm에서 나타나는 각각 두개의 네거티브 피크(negative peaks)는 알파-헬릭스 이차구조(a-Helix secondary structure) 형태의 단백질이고, 214 nm에서 나타나는 피크는 베타-시트 이차구조(b-sheet secondary structure)형태의 단백질로 알려져 있다.

피브로인은 방사선 조사에 의해 이차구조가 변형되는데, 도 2에서 보는 바와 같이, 방사선 조사량이 증가할수록 알파-헬릭스(a-helix) 이차구조는 감소되고, 반면에 베타-시트(b-sheet), 베타-턴(b-turn), 랜덤 코일(random coil)은 알파-헬릭스 이차구조의 감소에 따라 상대적으로 증가함을 알 수 있다.

실험예 3 (겔침투 크로마토그래피(GPC)를 이용한 분자량 분석)

감마선을 조사한 피브로인의 분자량을 겔침투 크로마토그래피-고압액체 크로마토그래피(gel permeation chromatography(GPC)-high performance liquid chromatography(HPLC))를 이용하여 측정하였다.

HPLC 시스템은 Waters Agilent HPLC system (Mo. 2690, MA, USA)에 PL 아쿠아겔-OH 컬럼(PL aquagel-OH column (300 × 7.5 mm, 8 ㎛) ; Polymer Laboratories, Ltd, UK)을 사용하였다.

0.1 M 소디움 나이트레이트(sodium nitrate)를 이동상으로 하여 1 mL/min의 유속으로 하여 40분간 이동시켰다. GPC용 표준물질(Pullulan standard)은 Showa Denko사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.

도 3은 서로 다른 조사선량 하에, 조사 효과의 표현으로서 실크 피브로인의 분자량 변형을 나타낸 것이다. 도 3을 참조하면, 조사되지 않은 실크 피브로인의 분자량은 5 kDa 이하에서 나타났으며, 5 kGy와 10 kGy에서 조사된 실크 피브로인의 분자량이 각각 320, 5765 kDa으로 나타났는데, 이러한 결과들은 선량이 증가할수록 구조적 변형에 의해 분자간의 재결합이 증가 되었음을 알 수 있다.

실험예 4 (감마선 조사된 분자구조가 변형된 피브로인의 라디칼 소거능 측정)

상기 실시예 1 내지 실시예 6에서 제조한 피브로인 시료의 전자공여능 측정은 Blois의 방법에 준하여 실크 피브로인의 DPPH (2.2-diphenyl-1-picryl-hydrazil)에 대한 수소공여 효과로 측정하였다.

일정 농도의 각 시료 2ml에 99% 에탄올에 용해시킨 2*10⁴M DPPH 용액을 1ml 가하고, 보텍스 믹싱하여(vortex mixing) 37℃에서 30분간 반응시켰다. 상기 반응액을 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 전자공여 효과는 시료첨가 전, 후의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다.

517nm 에서 흡수되는 특징을 가진 안정된 유리기인 DPPH는 실크 피브로인의 라디칼 소거능력의 연구를 위해 사용되었는데, 방사선 조사된 실크 피브로인의 항산화 효과를 도 4에 나타내었다. 도 4를 참조하면, 방사선 조사된 실크 피브로인의 DPPH 라디칼 소거능력은 같은 농도에서 0 kGy의 것 보다 더 높았고, 선량이 증가할수록 항산화 능력이 증가했음을 알 수 있다.

실험예 5 (감마선 조사된 분자구조가 변형된 피브로인의 티로시나제 저해 효과 측정)

감마선 조사에 의한 실크 피브로인의 미백활성 능력을 확인하기 위해 상기 실시예 1 내지 실시예 6에 의해 제조된 피브로인의 티로시나제 저해효과를 측정하였다.

0.175 M 소디움 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer) (pH6.8) 0.5 ml에 10 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine ; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA)를 용해시킨 기질액 0.2 ml와 시료용액 0.1 ml를 혼합한 용액에 버섯 티로시나제(mushroom tyrosinase ; 100 U/ml, sigma USA) 0.2 ml을 첨가하여 25℃에서 15분간 반응시킨 후, 생성된 DOPA 크롬(chrome)을 흡광도 475 nm에서 측정하였다. 티로사나제 저해 활성은 시료용액 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 백분율(%)로 나타내었다.

도 5는 본 발명에 의한 피브로인의 티로시나제 저해효과를 보여 주는 것으로, 도 5를 참조하면, 감마선 조사된 실크 피브로인은 모두가 비조사된 것보다 티로시나제 저해효과가 더 높았으며, 조사선량이 증가할수록 티로시나제 저해효과 또 한 증가함을 알 수 있다.

실험예 6 (감마선 조사된 분자구조가 변형된 피브로인의 암세포에 대한 세포독성 효과 측정)

감마선 조사에 의한 실크 피브로인의 미백활성 능력을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1 내지 실시예 6에 의해 제조된 피브로인의 암세포에 대한 세포독성 효과를 측정하였다.

본 실험에 사용된 세포들은 B16BL6(피부암), AGS(위암), HT-29(결장암 ; colon cancer) 그리고 RAW264.7(마크로파지 세포)이며, 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다.

상기 B16BL6와 RAW264.7 세포주는 100 U/ml 페니실린과 100 U/ml 스트렙토마이신 및 10% 소혈청(fetal bovine serum)이 함유된 EMEM 및 DMEM 배지를 사용하였고,　 AGS와 HT-29는 100 U/ml 페니실린과 100 U/ml 스트렙토마이신 및 10% 소혈청이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

실크 피브로인에 의한 암세포와 정상세포의 세포독성 평가는 MTT[3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, sigma] assay에 의해서 실험하였다.

각각의 암세포와 정상세포는 96 웰플레이트(well plate)에 웰당 3* 10⁴cells/well의 농도로 분주하였다. 각각의 실크 피브로인 시료는 농도 5 mg/ml로 96 웰플레이트에 가하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 24시간 배양한 후, 5 mg/ml의 농도의 MTT 시약을 각각의 웰에 30 ul씩 가하였고, 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음, 2000 rpm에서 3분간 원심분리 하고, 상등액을 제거한 후, 100ul의 DMSO (dimehylsulfoxide)를 첨가하고, 37℃에서 5분간 반응 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

방사선 조사된 실크 피브로인의 암세포 성장억제 효과는 도 6a 내지 도 6c와 같다. 본 실험에서 사용한 암세포는 HT-29 (결장암), B16BL6 (피부암) 및 AGS (위암)이다.

상기 암세포에 대한 항암효과를 측정하기 위하여, MTT 환원 검정법(MTT reduction assay)을 이용하여 방사선 조사하지 않은 대조구와 비교하여 암세포 성장억제 효과를 확인하였다.

방사선 조사 선량이 증가할수록, HT-29의 세포독성은 39 %까지 증가하였으며, B16BL6의 세포독성은 48% 까지 증가하였다. 마지막으로 AGS의 세포독성은 87 %까지 증가하였다.

방사선 조사된 실크 피브로인과 비 조사된 실크 피브로인의 세포독성을 비교해 볼 때, 모든 선량에서 비 조사된 실크 피브로인 보다 세포독성이 증가되었음을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 방사선 조사가 암세포에 대한 저항성을 증가시켜준다는 것을 확인할 수 있었다.

앞선 실험의 암세포에 대한 세포독성이 방사선 조사선량이 증가함에 따라 증가함을 보였으며, 이러한 관점에서 정상세포에 대한 세포독성을 확인해 볼 필요가 있어, 상기 RAW264.7 세포주를 이용하여 정상세포 독성실험을 실시하였다.

Anna Chiarini 등은 실크 피브로인이 인간세포(human cells)의 성장을 도와 준다고 보고하였는데Anna Chiarini, Paola Petrini, Sabrina Bozzini, Ilaria Dal Pra and Ubaldo Armato (2003) Silk fibroin/poly(carbonate)-urethane as a substrate for cell growth: in vitro interactions with human cells Biomaterials,　Volume 24,　Pages 789-799), 상기의 선행연구에 기초하여 방사선 조사된 실크 피브로인의 정상세포에 대한 효과를 실험한 결과를 도 7에 나타내었다.

방사선 조사에 의한 실크 피브로인의 정상세포에 대한 세포독성 효과의 감소를 확인한 결과인 도 7를 참조하면, 조사선량이 증가함에 따라 5 kGy에서는 세포독성이 29%까지 감소하였고, 10 kGy에서는 세포독성이 22 %까지 감소했으며, 50 kGy에서의 세포독성은 7 %까지 감소하였다. 그러나, 100 kGy 조사선량부터는 유의적으로 증가나 감소의 차이가 없었음을 알 수 있었다.

본 실험을 통해 방사선 조사에 의한 실크 피브로인은 비조사구에 대조해 볼 때, 정상세포에 대한 독성이 매우 적음을 알 수 있으며, 또한 도 6의 실험결과와 비교해 볼 때, 방사선 조사된 실크 단백질의 암세포의 독성은 증가하지만, 정상세포에 대한 독성은 감소함을 알 수 있었다.

상기의 결과로부터 방사선 조사된 실크 피브로인은 비조사구와 비교했을 때 보다 높은 항산화 효과, 미백 효과, 그리고 암세포에 대한 세포독성을 가지고 있음을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해 당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 감마선 조사에 의해 분자구조가 변형된 고분자량의 피브로인은, 비조사구에 비하여 라디칼 소거능의 증가, 티로시나제 억제효과 및/또는 암세포에 대한 세포독성의 증가 등과 같은 우수한 생물학적 특성과 미백효과 등을 지니고 있기 때문에, 식품, 화장품 및 의약품 산업분야에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 감마선 조사에 의한 피브로인 단백질의 자외선 흡수 스펙트럼(UV absorption spectrum)을 확인한 결과,

도 2는 감마선 조사에 의한 피브로인 단백질의 원자외선 CD 스펙트럼(far-UV CD spectrum)으로부터 이차 구조를 확인한 결과,

도 3은 감마선 조사에 의한 피브로인 단백질의 분자량을 GPC를 이용하여 측정한 결과,

도 4는 감마선 조사에 따른 피브로인의 베타글루칸의 라디칼 소거능 증가를 확인한 결과,

도 5는 감마선 조사에 의한 피브로인 단백질의 티로시나제 저해 효과의 증가를 확인한 결과,

도 6a 내지 도 6c는 감마선 조사에 의한 피브로인 단백질의 암세포에 대한 세포독성 효과의 증가를 확인한 결과로서, 도 6a는 결장암 세포인 HT- 29 세포주, 도 6b는 흑색종(melanoma) 세포인 B16BL6 세포주, 도 6c는 위암 세포인 AGS 세포주에 대한 세포독성 효과의 증가를 확인한 결과,

도 7은 감마선 조사에 의한 피브로인 단백질의 정상 세포에 대한 세포독성 효과의 감소를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

Claims (20)

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8. 피브로인에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 분자구조가 변형되어 감마선을 조사하지 않은 분자량 5 kDa 이하의 피브로인에 비하여 분자량이 증가되고, 항산화능, 티로시나제 저해능 및 암세포에 대한 세포 독성으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 증가된 피브로인의 제조방법에 있어서,

   상기 방사선이 5 내지 200 kGy 흡수선량의 감마선이고,

   상기 분자구조의 변형이 알파-헬릭스(α-helix) 이차구조의 감소, 또는 베타-시트(β-sheet), 베타-턴(β-turn), 및 랜덤 코일(random coil)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 이차구조의 증가인 것을 특징으로 하는 피브로인의 제조방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 방사선 조사되는 피브로인은 누에고치로부터 분리하거나 합성된 것임을 특징으로 하는 피브로인의 제조방법.
10. 제 8항에 있어서, 상기 단계에서 얻은 피브로인을 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피브로인의 제조방법.
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15. 제 8항에 있어서, 상기 방사선 조사된 피브로인의 분자량이 10 kDa 내지 1000 kDa인 것을 특징으로 하는 피브로인의 제조방법.
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