CN109517034A - 活性肽、重组载体、重组细胞、药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

活性肽、重组载体、重组细胞、药物组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种活性肽、重组载体、重组细胞、药物组合物及其制备方法和应用。该活性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。该活性肽能够抑制小细胞肺癌细胞增殖且安全性较高。

Description

活性肽、重组载体、重组细胞、药物组合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种活性肽、重组载体、重组细胞、药物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
正常生命过程中生物体会不断地产生自由基，适量的自由基可维持生物体的正常生理代谢，但是过量的自由基会导致细胞组织受到肿瘤胁迫，肿瘤系统和抗肿瘤系统失衡，从而导致机体组织细胞中蛋白和核酸等生物大分子发生损伤，进而引发癌症的产生，对人体健康造成极大损害。因此，有效的抗肿瘤物质进行抗肿瘤对于维护机体健康具有极其重要的作用。
近几年来，肿瘤化疗取得了相当的进步，肿瘤患者生存时间明显延长，特别是对白血病、恶性淋巴瘤等的治疗有了突破，但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90％以上的实体瘤的治疗未能达到满意的效果。其中，小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)约占肺癌的20％，恶性程度高，倍增时间短，转移早而广泛，是癌症患者死亡的主要原因。目前，研究出的新一代的化疗药物对SCLC转移性患者的疗效有所提高，中位生存期为7个～8个月，1年生存率为45％。但是，这些药物大多具有不同程度的副作用，不宜长期服用。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够抑制小细胞肺癌细胞增殖且安全性较高的活性肽。
此外，还提供一种重组载体、重组细胞、药物组合物及其制备方法和应用。
一种活性肽，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述活性肽的氨基酸序列为His-Lys-Phe-Trp，使得该活性肽能够有效地抑制小细胞肺癌细胞增殖，且该活性肽无毒副作用，安全性较高。经试验验证，上述活性肽能够促进SCLC细胞内的ROS(活性氧簇，reactive oxygen species)的大量分泌，以对SCLC细胞产生氧化性损伤，降低SCLC细胞的细胞膜电位并将SCLC细胞阻滞于S期，以抑制SCLC细胞的增殖，影响与细胞凋亡相关蛋白的表达，促进SCLC细胞凋亡，从而达到抗SCLC的效果。
一种重组载体，所述重组载体含有所述活性肽的编码序列。
在其中一个实施例中，所述编码序列为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
所述编码序列为与SEQ ID No.2所示核苷酸序列具有90％同源性的核苷酸序列；或
所述编码序列为由SEQ ID No.2所示核苷酸序列中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
一种重组载体，所述重组载体含有编码上述所述活性肽的核苷酸。
一种重组细胞，所述重组细胞含有编码权上述所述活性肽的核苷酸；或者，
所述重组细胞含有上述所述重组载体。
一种药物组合物，所述药物组合物中的活性组分包括上述所述活性肽。
一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中的活性组分包括上述所述活性肽。
上述所述的活性肽、上述所述的重组载体、上述所述的重组细胞或上述所述的药物组合物在制备抑制小细胞肺癌细胞增殖的药物中的应用。
上述所述的活性肽、上述所述的重组载体、上述所述的重组细胞或上述所述的药物组合物在制备预防或治疗小细胞肺癌的药物中的应用。
上述所述的活性肽在制备食品或保健品中的应用。
上述所述的活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：从石金钱龟中分离得到所述活性肽；或
通过化学合成方法合成所述活性肽。
在其中一个实施例中，所述从石金钱龟中分离得到所述活性肽包括如下步骤：
将石金钱龟肉酶解，得到酶解物；及
采用有机溶剂对所述酶解物进行萃取，得到所述活性肽。
附图说明
图1为实施例1的活性肽的质谱图；
图2为实施例1的活性肽的高效液相色谱图；
图3为I～IV组的细胞凋亡的FACS分析的散点图；
图4为I～IV组的细胞凋亡的柱状统计图；
图5为I～IV组的细胞周期影响的FACS分析对比图；
图6为I～IV组的细胞周期影响的柱状统计图；
图7为I～IV组的细胞内ROS的相对含量的对比图；
图8为IV组的细胞内ROS的相对含量随培养时间的变化曲线图；
图9为I～IV组的线粒体膜电位下降的细胞比例的对比图；
图10为IV组的线粒体膜电位下降的细胞比例随培养时间的变化曲线图；
图11为I～IV组的细胞中Bcl-xL、Bcl-2、cyt c、Bax、Bak蛋白相对表达量的电泳对比图；
图12为I～IV组的细胞中Bcl-xL、Bcl-2、cyt c、Bax、Bak蛋白相对表达量的柱状对比图；
图13为I～IV组的细胞中Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Caspase-9、Caspase-3、p53、MDM2蛋白相对表达量的电泳对比图；
图14为I～IV组的细胞中Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Caspase-9、Caspase-3、p53、MDM2蛋白相对表达量的柱状对比图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本研究一实施方式提供了一种活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
具体地，SEQ ID No.1所示的氨基酸序列为His-Lys-Phe-Trp。其中，His表示组氨酸，缩写为H。Lys表示赖氨酸，缩写为K。Phe表示苯丙氨酸，缩写为F。Trp表示色氨酸，缩写为W。
由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。
功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的短肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。
一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性。因此，由上述氨基酸序列组成的短肽，如果其构成的活性肽没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。
在其中一个具体示例中，活性肽具有如下结构式：
上述活性肽的氨基酸序列为His-Lys-Phe-Trp，使得该活性肽能够有效地抑制小细胞肺癌细胞增殖，且该活性肽无毒副作用，安全性较高。经试验验证，上述活性肽能够促进SCLC细胞内的ROS的大量分泌，以对SCLC细胞产生氧化性损伤，降低SCLC细胞的细胞膜电位并将SCLC细胞阻滞于S期，以抑制SCLC细胞的增殖，影响与细胞凋亡相关蛋白的表达，促进SCLC细胞凋亡，从而达到抗SCLC的效果。上述活性肽具有优异的抗SCLC作用，肽链较短，易于吸收，能够直接用于合成蛋白，安全性较高，能够用于制备抑制小细胞肺癌细胞增殖的药物中，也能够用于制备预防和治疗小细胞肺癌的药物，还能够应用于食品或保健品中。其中，ROS(reactive oxygen species，活性氧)。ROS是生物有氧代谢过程中的一种副产品，包括氧离子、过氧化物和含氧自由基等。细胞中存在过多的ROS能够导致细胞快速凋亡。
本研究还提供了一种食品，其包括上述活性肽。上述活性肽作为食用添加剂，以使食品具有一定的抑制小细胞肺癌细胞增殖的功效，以具有一定的保健功能，同时，上述活性肽能够给机体补充所需的蛋白和氨基酸。
在其中一个实施例中，食品为片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂。
在其中一个实施例中，食品中活性肽的质量百分含量为5％～10％。
进一步地，本研究还提供一种保健品，其包括上述活性肽。上述活性肽作为活性成分，以使保健品具有较优异的抑制小细胞肺癌增殖的功效，同时，上述活性肽能够给机体补充所需的蛋白和氨基酸。
在其中一个实施例中，保健品为片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂。
在其中一个实施例中，保健品中活性肽的质量百分含量为3％～5％。
在其中一个实施例中，保健品还包括保健品学上可接受的辅料基质。保健品学上可接受的辅料基质选自单糖、寡糖、多糖、氨基酸、防腐剂、pH调节剂和抗SCLC助剂中的至少一种。进一步地，活性肽与保健品学上可接受的辅料基质的质量比为3:97～5:95。
更进一步地，本研究还提供一种重组载体，其含有上述活性肽的编码序列。
在其中一个实施例中，编码序列为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。具体地，SEQID No.2所示的核苷酸序列为5’-CAUAAGUUCUUG-3’。
在其中一个实施例中，编码序列为与SEQ ID No.2所示核苷酸序列具有90％同源性的核苷酸序列。
在其中一个实施例中，编码序列为由SEQ ID No.2所示核苷酸序列中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
进一步地，编码序列为由SEQ ID No.2所示核苷酸序列中一个或多个碱基被其兼并碱基替代得到的核苷酸序列。
需要说明的是，由核苷酸序列编码的短肽，如果其构成的活性肽没有明显的功能差异，也包括在本研究的范围内。
在其中一个实施例中，重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
在其中一个实施例中，重组载体含有纯化标签。通过设置纯化标签，有利于活性肽的分离纯化。进一步地，纯化标签为His标签、GST标签或SUMO标签。需要说明的是，纯化标签不限于上述指出纯化标签，其他常见的纯化标签也可以作用重组载体的纯化标签。
在其中一个实施例中，重组载体包括基因工程载体。编码上述活性肽的核苷酸插入基因工程载体中。进一步地，基因工程载体为pET-32a载体、pGEX-6P-1载体、pPIC-9K载体或pPIC-Zα载体。需要说明的是，基因工程载体不限于上述指出基因工程载体，其他常见的基因工程载体也可以作用重组载体的基因工程载体。
上述重组载体能够较好地保存编码上述活性肽的核苷酸，有利于活性肽的表达，能够应用于制备能够用于制备抑制小细胞肺癌细胞增殖的药物，也能够用于制备预防和治疗小细胞肺癌的药物。
再者，本研究还提供一种重组细胞，其含有编码上述活性肽的核苷酸或上述重组载体。
在其中一个实施例中，编码上述活性肽的核苷酸为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
在其中一个实施例中，编码上述活性肽的核苷酸为与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有90％同源性的核苷酸序列。
在其中一个实施例中，编码上述活性肽的核苷酸为由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
进一步地，编码上述活性肽的核苷酸为由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中一个或多个碱基被其兼并碱基替代得到的核苷酸序列。
需要说明的是，由上述核苷酸序列编码的活性肽，如果其构成的活性肽没有明显的功能差异，也包括在本研究的范围内。
在其中一个实施例中，重组细胞为克隆编码上述活性肽的核苷酸的细胞。
在其中一个实施例中，重组细胞为表达编码上述活性肽的核苷酸的细胞。
在其中一个实施例中，重组细胞包括受体细胞。编码上述活性肽的核苷酸或上述重组载体位于受体细胞内。
在其中一个实施例中，受体细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动物细胞或植物细胞。进一步地，受体细胞为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌Orgami(DE3)、毕赤酵母GS115或毕赤酵母SMD1168。
需要说明的是，受体细胞不限于上述指出受体细胞，其他常见的受体细胞也可以作用重组细胞的受体细胞。
上述重组细胞能够克隆或表达上述活性肽，使得能够大规模的制备该活性肽，并且通过重组细胞定向表达该活性肽，以能够获得纯度较高的活性肽，进而有利于活性肽的应用，因此，上述重组细胞能够用于制备抑制小细胞肺癌细胞增殖的药物中，也能够用于制备预防和治疗小细胞肺癌的药物。
此外，本研究还提供一种药物组合物，药物组合物中的活性组分包括上述活性肽。需要说明的是，活性组分不限于包括活性肽，活性组分还可以包括其他活性成分，例如可以是中药提取物。可以通过添加某种功效的中药提取物以使药物组合物具有相应的功效。
在其中一个实施例中，药物组合物还包括辅助载体。辅助载体用于负载活性组分。
在其中一个实施例中，辅助载体包括溶剂、聚合物及脂质体中的至少一种。
溶剂用于溶解或悬浮活性组分。溶剂包括无菌水、生理盐水及常用非水性溶剂中的一种。其中，常用非水性溶剂例如可以是乙醇。
聚合物用于增强活性短肽的水溶性及稳定性。聚合物包括聚赖氨酸、聚赖氨酸改性物、聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺改性物、壳聚糖、聚乳酸及明胶中的至少一种。其中，聚赖氨酸的改性物例如可以是聚赖氨酸的水溶性改性物。聚乙烯亚胺的改性物例如可以是聚乙烯亚胺的水溶性改性物。
脂质体用于包裹活性短肽，增强其稳定性。脂质体包括胆固醇及卵磷脂中的至少一种。其中，卵磷脂选自豆卵磷脂及蛋黄卵磷脂中的至少一种。具体地，豆卵磷脂例如可以为大豆卵磷脂。
在其中一个实施例中，辅助载体还包括稀释剂及赋形剂中的至少一种。
稀释剂用于稀释活性组分。稀释剂包括淀粉、糖、纤维素及无机盐中的至少一种。具体地，淀粉例如可以为支链淀粉。糖例如可以为麒麟菜多糖。纤维素例如可以为甘蔗纤维素。无机盐例如可以为氯化钠。
赋形剂用于使药物组合物呈现特定的形态。具体地，赋形剂使药物组合物呈片剂、半固体制剂、液体制剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、混悬剂或气雾剂等形态。需要说明的是，药物组合物不限于为上述指出形态，还可以为其他形态，例如可以是膏剂。
在其中一个实施例中，赋形剂包括黏合剂、填充剂及润滑剂中的至少一种。通过添加该赋形剂，以使药物组合物呈片剂。
在其中一个实施例中，赋形剂包括软膏剂的基质部分或霜剂的基质部分。通过添加该赋形剂，以使药物组合物呈半固体制剂。
在其中一个实施例中，赋形剂包括防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂及着色剂中的至少一种。通过添加该赋形剂，以使药物组合物呈液体制剂。
在其中一个实施例中，药物组合物中，活性组分与辅助载体的质量比为5：10～95：5。可选地，药物组合物中，活性组分与辅助载体的质量比为10：90～90：10。进一步地，药物组合物中，活性组分与辅助载体的质量比为15：85～85：15。更进一步地，药物组合物中，活性组分与辅助载体的质量比为30：70～80：20。
在其中一个实施例中，药物组合物还包括辅助组分。辅助组分包括维生素C、维生素E、辅酶Q、谷胱甘肽、胡萝卜素及甜菜碱中的至少一种。通过添加辅助组分，以增强药物组合物的抗SCLC作用。需要说明的是，辅助组分不限于上述指出的组分，还可以包括具有其他辅助功效的物质，例如可以是具有抗氧化活性的物质。具体地，具有抗氧化活性的物质例如可以是虾青素或番茄红素等。
在其中一个实施方式中，辅助组分与活性组分的质量比为5:1～95:70。
上述药物组合物含有活性肽，能够用于制备抑制小细胞肺癌细胞增殖的药物中，也能够用于制备预防和治疗小细胞肺癌的药物。
另外，本研究的活性肽可以从石金钱龟中分离得到，也可以通过化学合成方法合成。
在其中一个实施方式中，从石金钱龟中分离得到活性肽包括如下操作S110～S120：
S110、将石金钱龟肉酶解，得到酶解物。
具体地，S110包括如下操作S111～S112：
S111、向石金钱龟肉糜加入水混合，得到肉糜水。
在其中一个实施例中，石金钱龟肉糜为石金钱龟肉粉碎后得到。
在其中一个实施例中，水为去离子水或超纯水。
在其中一个实施例中，石金钱龟肉糜的质量与水的体积之比为1:1.5～1:2.5。
S112、向肉糜水中加入酶进行酶解，得到酶解物。
在其中一个实施例中，酶为碱性蛋白酶。进一步地，酶为郑州市伟丰生物科技有限公司的2017-JD-0812的碱性蛋白酶。更进一步地，酶的终浓度为5U/mL～100U/mL。肉糜水与酶的混合物的pH为7.5～9.5。酶解温度为30℃～50℃。酶解时间为4h～7h。可选地，酶的终浓度为7U/mL～8U/mL。
在其中一个实施例中，在向肉糜水中加入酶进行酶解之后，还包括如下操作：对酶解后的肉糜水进行灭酶处理；灭酶结束后，离心收集上清；将上清进行干燥，得到酶解物。
具体地，对酶解后的肉糜水进行灭酶处理的操作具体为：将酶解后的肉糜水放入85℃～95℃下灭酶10min～30min。
离心收集上清的操作中，离心转速为8000r/min～10000r/min。离心时间为10min～20min。
将上清进行干燥的方式为冷冻干燥。将酶解物干燥至含水量为0.1％～0.6％。其中，含水量即为酶解物中水的质量百分含量。需要说明的是，干燥的方式不限于冷冻干燥，还可以为其他干燥方式，例如风干。
S120、采用有机溶剂对酶解物进行萃取，得到活性肽。
具体地，将酶解物与有机溶剂混合，萃取，得到水相层；将水相层进行纯化，得到活性肽。其中，水相层即为含有活性肽的溶液。需要说明的是，若水相层中活性肽的纯度能够满足实际需求的话，对水相层进行纯化的操作可以省略。
在其中一个实施例中，酶解物与有机溶剂的体积比为1：2～1：10。
在其中一个实施例中，有机溶剂选自乙酸乙酯及丙酮中的至少一种。
在其中一个实施例中，萃取的时间为20min～50min。
在其中一个实施例中，将酶解物与有机溶剂混合，萃取，得到水相层的操作具体为：将酶解物、有机溶剂与水混合，萃取，得到水相层。通过将酶解物、有机溶剂与水混合，更有利于萃取的进行。其中，水为去离子水或超纯水。
更具体地，将450g～550g的酶解物、3150mL～3850mL的乙酸乙酯与900mL～1100mL的水混合，萃取，得到水相层。进一步地，重复萃取至少三次；将每次萃取得到的水相层合并，以进行纯化。可选地，将500g的酶解物、3500mL的乙酸乙酯和1000mL的水混合，萃取，重复三次，得到水相层。
在其中一个实施例中，将水相层进行纯化的操作具体为：将水相层进行干燥；将干燥后的水相层进行色谱法分离，得到活性肽。
具体地，将水相层进行干燥的操作中，干燥的方式为真空低温冷冻干燥。需要说明的是，干燥的方式不限于冷冻干燥，还可以为其他干燥方式，例如风干。
将干燥后的水相层进行色谱法分离的方法为HPLC，即高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography)。具体地，HPLC的条件为：色谱柱为Cosmosil 5C18，流动相为体积百分含量为25％的乙腈的水溶液，流速为0.5mL/min～1.5mL/min，检测波长为220nm，进样量为100μL。需要说明的是，若水相层的浓度能够满足色谱法分离的需要时，对水相层进行干燥的操作可以省略。
通过上述活性肽的制备方法可以得到天然的活性肽，且活性肽的纯度较高。
在其中一个实施例中，活性肽的制备方法，包括如下步骤：通过化学合成方法合成活性肽。
在其中一个实施例中，化学合成方法为多肽固相合成法。进一步地，化学合成方法为Boc固相合成法或Fmoc固相合成法。其中，Boc为叔丁氧羰基。Boc固相合成法中以易酸解的Boc基团作为N-α-保护基团。Fmoc为9-芴甲氧羰基。Fmoc固相合成法中以易酸解的Fmoc基团作为N-α-保护基团。
上述活性肽的制备方法，工艺简单、操作方便，且能够制备纯度较高的活性肽。
以下为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
如未特别说明，以下实施例中，Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH均购于阿拉丁试剂有限公司公司。NCI-H446型SCLC肿瘤细胞购于中国科学院上海细胞库公司。DMEM培养基购于碧云天生物科技有限公司。
实施例1
本实施例的活性肽的制备过程如下：
(1)向1250g的石金钱龟肉糜加入2580mL的超纯水混合，得到肉糜水。向肉糜水中加入5U/mL的碱性蛋白酶于40℃、pH为8下酶解3h，将酶解后的肉糜水放入85℃下灭酶10min，灭酶结束后，9500r/min离心20min收集上清；将上清进行干燥至含水量为0.5％，得到酶解物。
(2)将500g的酶解物、3500mL的乙酸乙酯和1000mL的超纯水混匀，静置萃取35min，收集水相层，重复萃取三次，将三次萃取收集的水相层混合进行真空低温冻干，得到干燥后的水相层。
(3)将干燥后的水相层进行色谱法分离，得到活性肽。将干燥后的水相层进行色谱法分离的条件为：色谱柱为Cosmosil 5C18，流动相为体积百分含量为25％的乙腈的水溶液，流速为1mL/min，检测波长为220nm，进样量为100μL。
实施例2
本实施例的活性肽的制备过程如下：
(1)取100mg的Fmoc-His Wang Resin(组氨酸预装树脂，购于阿拉丁公司且货号为ALD2018-12-55)置于固相合成管中，加入25mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)后静置使预装树脂充分溶胀，滤去溶剂，再加入5mL的含有质量百分含量为20％的哌啶的DMF溶液，振荡后滤出溶剂，得到处理后的树脂。
(2)将8mg的Fmoc-Lys-OH(购于阿拉丁公司且货号为ALD-2118-45-52)、5mg的1-羟基苯并三唑、3mg的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯溶于20mL的DMF中，在加入30mg的N,N-二异丙基乙胺混匀后避光，得到活化的Fmoc-Lys-OH。将活化后的Fmoc-Lys-OH加入步骤(1)得到的处理后的树脂中，常温下氮气吹动搅拌20min，过滤，采用DMF和二氯甲烷依次洗涤沉淀，去除溶剂，得到第一反应物。
(3)按照步骤(2)的操作活化Fmoc-Phe-OH，得到活化的Fmoc-Phe-OH；按照步骤(2)的操作，将活化后的Fmoc-Phe-OH加入第一反应物中，得到第二反应物。按照步骤(2)的操作活化Fmoc-Trp-OH，得到活化的Fmoc-Trp-OH；按照步骤(2)的操作，将活化后的Fmoc-Trp-OH加入第二反应物中，得到第三反应物。
(4)用无水乙醇洗涤第三反应物，固液分离，将上清液依次进行旋转蒸发浓缩、冷冻干燥，得到活性肽。
测试：
1、采用高效液相色谱对实施例1～2的活性肽的纯度进行测定，并采用质谱对实施例1的活性肽进行鉴定。
其中，高效液相色谱测定条件为：Boston Green ODS-AQ色谱柱(250mm*4.6mm)；以体积百分含量为0.1％的三氟乙酸的水溶液为流动相A，以体积百分含量为0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B，流动相A与流动相B的体积比为70:30；流速为1mL/min；检测波长为330nm；进样量10μL；标准品为苯丙氨酸；
质谱测定条件：ESI正离子模式，毛细管电压为3kV，锥孔电压为50V，萃取电压为5V，脱溶剂温度为350℃，雾化气流为350L/h。
测定结果详见表1和图1～2。表1表示的是实施例1～2的活性肽的纯度。图1为实施例1的活性肽的质谱图。图2为实施例1的活性肽的高效液相色谱图，箭头(2-1)即为活性肽的吸收峰。
表1实施例1～2的活性肽的纯度
实施例1 实施例2
纯度(％) 99.5 95.6
从图1～2可以看出，实施例1的活性肽的氨基酸序列为His-Lys-Phe-Trp，其结构式如下：
从表1可以看出，实施例1～2得到的活性肽的纯度均在95％以上，说明上述实施方式的活性肽的制备方法能够获得具有较高纯度的活性肽。
2、活性肽对NCI-H446型SCLC肿瘤细胞(以下简称SCLC细胞)的影响
(1)实验共分为四组，分别为对照组(即I组)、实验组1(即II组)、实验组2(即III组)及实验组3(即IV组)，每组三个平行实验。
(2)将SCLC细胞接种于DMEM培养基中于37℃进行培养。其中，在实验组1的培养基中加入3.84μg/mL的实施例1的活性肽培养48h；在实验组2的培养基中加入19.2μg/mL的实施例1的活性肽培养48h，然后在实验组3的培养基中加入96μg/mL的实施例1的活性肽培养48h；对照组的培养基不额外添加任何物质，培养48h。培养完全结束后，得到四组培养后的SCLC细胞。
(3)采用流式细胞仪(即FACS)对步骤(2)中四组培养后的SCLC细胞进行检测，测定结果详见图3～6。
其中，图3为I～IV组的细胞凋亡的FACS分析的散点图。图4为I～IV组的细胞凋亡的柱状统计图，图4中I组与III组的连线和*表示III组与I组的P<0.05，I组与IV组的连线和**表示IV组与I组的P<0.01。图5为I～IV组的细胞周期影响的FACS分析对比图。图6为I～IV组的细胞周期影响的柱状统计图，图6中I组与IV组的连线和*表示IV组与I组的P<0.05。
凋亡和坏死的总和(Total Apoptosis&necrosis)是指凋亡早期(EarlyApoptosis)、晚期凋亡和坏死(Late Apoptosis&necrosis)之和。细胞比例指已经处于相应状态下的细胞占总细胞的比例，例如：凋亡早期情况下的细胞比例为10％表示已处于进入凋亡早期的细胞占总细胞10％；G2/M情况下的细胞的比例为10％表示处于G2/M期的细胞占总细胞的10％。
从图3～4可以看出，II～IV组的凋亡和坏死的总和的细胞比例分别与I组提高3.13％、7.89％、20.0％，说明活性肽的加入能够促进SCLC细胞凋亡或坏死；同时，随着活性肽的浓度的增加，SCLC细胞的凋亡比例逐渐增加。
从图5～6可以看出，II～IV组的S期的细胞比例分别与I组的提高4.80％、7.01％、20.1％，说明活性肽的加入可以较明显地将SCLC细胞阻滞于细胞周期的S期，同时，随着活性肽的浓度的增加，对SCLC细胞的阻滞能力越强。
(4)测定活性肽对SCLC细胞内ROS含量的影响。具体地，采用ROS活性氧检测试剂盒(购于碧云天生物科技有限公司)测定步骤(2)中四组培养后的SCLC细胞内ROS的相对含量，并测定IV组的SCLC细胞内ROS的相对含量随着培养时间的变化。其中，ROS活性氧检测试剂盒即为DCFH-DA法；由于DCFH-DA(即2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)能够经细胞内酯酶水解而穿过细胞膜产生DCFH，ROS能够氧化DCFH而转化为具有荧光的DCF，因此，检测DCF的荧光能够反应ROS的水平。测定结果详见图7～8。
其中，图7为I～IV组的细胞内ROS的相对含量的对比图。图7中的ROS相对含量是指将I组测得的ROS含量计为1，其他组的ROS相对含量即为各组与I组的ROS含量的比值。图8为IV组的细胞内ROS的相对含量随培养时间的变化曲线图。图8中的ROS相对含量是指将0h测得的ROS含量计为1，其他时间的ROS相对含量即为各组与0h的ROS含量的比值。
从图7可以看出，II～IV组的ROS相对含量均高于I组，说明活性肽的加入能够促进SCLC细胞内的ROS的大量分泌，以对SCLC细胞产生氧化性损伤，进而抑制SCLC细胞的增殖，甚至使SCLC细胞凋亡。
从图8可以看出，在0～24h内，随着培养时间的延长，IV组的ROS相对含量逐渐增加，在24h～48h内，随着培养时间的延长，IV组的ROS相对含量略有下降。其中，19.2μg/mL的活性肽加入的最佳作用时间为24h。
(5)测定活性肽对SCLC细胞的细胞膜电位的影响。具体地，采用流式细胞仪测定步骤(2)中四组培养后的SCLC细胞内线粒体膜电位，并测定IV组的SCLC细胞内ROS的相对含量随着培养时间的变化，并计算线粒体膜电位下降的细胞比例。测定结果详见图9～10。图9为I～IV组的线粒体膜电位下降的细胞比例的对比图。图10为IV组的线粒体膜电位下降的细胞比例随培养时间的变化曲线图。
从图9可以看出，II～IV组的线粒体膜电位下降的细胞比例均高于I组，说明活性肽的加入能够引起SCLC细胞内的线粒体膜电位下降，以抑制小细胞肺癌细胞的增殖。
从图10可以看出，在0～24h内，随着培养时间的延长，IV组的线粒体膜电位下降的细胞比例逐渐增加。在24h～48h内，随着培养时间的延长，IV组的线粒体膜电位下降的细胞比例略有下降。其中，19.2μg/mL的活性肽加入的最佳作用时间为24h。
(6)活性肽对SCLC细胞内与细胞凋亡通路相关的蛋白表达的影响。
具体地，采用Western Blot测定四组培养后的SCLC细胞中与细胞凋亡相关的蛋白表达，其中，以β-actin蛋白作为对照。测定结果详见图11～14。
其中，图11为I～IV组的细胞中Bcl-xL、Bcl-2、cyt c、Bax、Bak蛋白相对表达量的电泳对比图。图12为I～IV组的细胞中Bcl-xL、Bcl-2、cyt c、Bax、Bak蛋白相对表达量的柱状对比图；图12中的蛋白相对表达量是指将I组的各蛋白的表达量计为1，其他组的相应蛋白的表达量与I组的对应蛋白的表达量之比即为该组对应蛋白的相对表达量。图13为I～IV组的细胞中Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Caspase-9、Caspase-3、p53、MDM2蛋白相对表达量的电泳对比图。图14为I～IV组的细胞中Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Caspase-9、Caspase-3、p53、MDM2蛋白相对表达量的柱状对比图；图14中蛋白相对表达量是指将I组的各蛋白的表达量计为1，其他组的相应蛋白的表达量与I组的对应蛋白的表达量之比即为该组对应蛋白的相对表达量。
从图11～14可以看出，II～IV组的细胞中Bcl-xL、Bcl-2、cyt c、Caspase-9、Caspase-3、MDM2、蛋白相对表达量均低于I组对应蛋白的相对表达量，说明活性肽的加入能够抑制上述六种蛋白的表达。II～IV组的细胞中Bax、Bak、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、p53蛋白相对表达量均高于I组对应蛋白的相对表达量，说明活性肽的加入能够使上述六种蛋白过表达。综上，说明活性肽的加入能够影响SCLC细胞内中与细胞凋亡相关的蛋白表达，促进SCLC细胞的凋亡。
综上，上述活性肽能够促进SCLC细胞内的ROS的大量分泌，以对SCLC细胞产生氧化性损伤，降低SCLC细胞的细胞膜电位并将SCLC细胞阻滞于S期，以抑制SCLC细胞的增殖，影响与细胞凋亡相关蛋白的表达，促进SCLC细胞凋亡，从而达到抗SCLC的效果。上述活性肽具有优异的抗SCLC作用，肽链较短，易于吸收，能够直接用于合成蛋白，安全性较高，能够用于制备抑制小细胞肺癌细胞增殖的药物中，也能够用于制备预防和治疗小细胞肺癌的药物。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳凯联健康生物科技有限公司
<120> 活性肽、重组载体、重组细胞、药物组合物及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His Lys Phe Trp
1
<210> 3
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cauaaguucu ug 12

Claims (10)

1.一种活性肽，其特征在于，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有所述活性肽的编码序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述编码序列为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
所述编码序列为与SEQ ID No.2所示核苷酸序列具有90％同源性的核苷酸序列；或
所述编码序列为由SEQ ID No.2所示核苷酸序列中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有编码权利要求1所述活性肽的核苷酸；或，
所述重组细胞含有权利要求2～3任一项所述重组载体。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中的活性组分包括权利要求1所述活性肽。
6.权利要求1所述的活性肽、权利要求2～3任一项所述的重组载体、权利要求4所述的重组细胞或权利要求5所述的药物组合物在制备抑制小细胞肺癌细胞增殖的药物中的应用。
7.权利要求1所述的活性肽、权利要求2～3任一项所述的重组载体、权利要求4所述的重组细胞或权利要求5所述的药物组合物在制备预防或治疗小细胞肺癌的药物中的应用。
8.权利要求1所述的活性肽在制备食品或保健品中的应用。
9.权利要求1所述的活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：从石金钱龟中分离得到所述活性肽；或
通过化学合成方法合成所述活性肽。
10.根据权利要求9所述的活性肽的制备方法，其特征在于，所述从石金钱龟中分离得到所述活性肽包括如下步骤：
将石金钱龟肉酶解，得到酶解物；及
采用有机溶剂对所述酶解物进行萃取，得到所述活性肽。
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