KR100286388B1 - 효소분해에 의한 실크분말 펩타이드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실크피브로인을 단백질 분해효소로 분해한 펩타이드의 제조에 관한 것이다. 실크(견사)를 효소분해하여 견단백질인 피브로인을 얻고 이를 염화칼슘과 에탄올에 반응시켜 투석하여 얻은 용액에 단백질 분해효소인 플라보자임(flavourzyme) 및 액티나제(actinase)로 분해하여 동결건조한 후 분말상의 피브로인 펩타이드를 제조하였다. 이들 펩타이드는 분자량이 12,000 - 13,000이고 중합도가 163으로서 pH 1-13에서 70% 용해도를 나타내고 있으므로 체내 흡수율이 높아 항산화작용과 알콜대사분해능력이 탁월하여 기능성 식품 또는 의약품으로 사용과 각 성분에 대한 순수 활성물질의 개발에 기여할 수 있다.

Description

효소분해에 의한 실크분말 펩타이드의 제조방법

본 발명은 실크 피브로인을 단백질 분해효소로 분해한 펩타이드의 제조에 관한 것이다. 보다 상세하게는 실크(견사)를 효소분해하여 염화칼슘과 에탄올 용액에 반응시켜 아스퍼질루스 오리자에(Aspergilus oryzaze) 및 바실러스변종(Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus Rokko)으로부터 생산되는 효소 플라보자임(flavourzyme, Nova Nordisk, Denmark) 또는 프로틴(Protin, Nova Nordisk, Denmark)으로 분해하여 동결건조시켜 분말상태의 피브로인 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

실크는 섬유이외 분야의 기초소재로써 이용되고 있는데 견 피브로인과 세리신 단백질을 이용한 소재개발이 주가되고 있다. 이것은 이들 단백질을 기능성 식품 혹은 각종 첨가물의 이용에 관한 것이 많으며, 대부분이 강산 혹은 중성염을 사용한 제조방법이다. 예를들어 일본국 특허공개 소58-38449의 미분말상 견피브로인의 제조법, 소59-31520의 견피브로인 펩타이드수용액의 제조 및 특허공개, 평1-256352에서는 견단백질을 이용한 숙취방지용 식품 핌 그 제조방법 그리고 대한민국 특허 공고 94-2871의 견단백질을 이용한 식품 및 그 식품소재의 제조방법 등 다수의 특허가 국내·외에서 소개되고 있다. 그러나, 이들 종래기술은 강산 혹은 중성염 만을 사용한 분말로서 불규칙한 분자량의 분포로인하여 기능성의 극대화는 기대할 수 없다. 또한 산 혹은 염을 사용함으로써 분자량의 조절이 매우 어려울 뿐아니라 중화를 하고난 뒤에도 고 분자량 혹은 가혹한 조건을 사용함으로써 특정 수소이온 농도에서의 단백질 분자들 사이의 인력 및 반발로 인한 겔화, 침전물 그리고 저분자화로 인한 필요성분의 급속한 유출등이 생기는 등 제품 공정상의 제한성을 불러일으키고 있다. 때문에 보다 단순화할 수 있고, 보다 적절한 분자량의 조절을 가능케하는 기능성 바이오 실크분말 펩타이드의 제조방법이 요구되고 있을 뿐아니라 그 기능성이 기존의 방법으로 조제된 분말과는 어떻게 다른가의 문제도 대두될 것이다. 이러한 기능성가 관련한 펩타이드의 크기는 영양학적으로도 중요한 문제로 나타날 수도있는데, 펩타이드가 인체내에서 어느정도 소화 흡수의 특성을 나타내는지의 보고(식품 과학과 산업,30권 1호 page 26, 1997)를 고려할 때에도 단백질을 섭취할 경우 그것의 소화흡수의 정도는 유리아미노산보다는 Oligopeptide정도의 흡수 효율이 훨씬 효과적이라는 연구보고되어 있듯이 효소에 의한 실크분말의 펩타이드화는 중요한 소재가 되고 있다.

본 발명에서는 효소를 사용한 바이오 실크펩타이드의 제조분말이 기존의 산가수분해법 혹은 산처리후 분쇄분말법으로 제조한 분말과 분자량의 크기, 유효아미노산 함량의 차이, 용해도의 차이 및 그 기능성에 있어서 어떻게 다른지를 비교하였다. 기능성의 검증은 항산화 작용, 알콜대사분해 작용으로 하였으며, 이것의 결과로부터 어느정도 크기의 분자량이 어떠한 기능성에 사용될 수 있는지에 대한 구체적인 증거를 제시하였다. 이하, 본 발명에 대한 그 구체적인 기술내용을 상세히 설명하기로 한다. 아울러 본 발명의 재료는 실크의 제사 및 제직과정에서 나오는 섬유화할 수 없는 부잠사, 절간격 및 파사의 협잡물을 제거한 실크를 대상으로 하였으므로 이것들로 인한 환경오염을 줄일 수 있고, 원료가 산업폐기물이어서 원료 공급의 측면에서 볼 때에도 고부가가치의 경제성이 충분히 있다고 생각되어진다. 또한 분자량이 조절된 특정 기능성 식품보조제, 첨가제 및 의약품으로 개발이 기대되어 진다.

제1도는 산 가수분해하여 얻어진 평균분자량(MW) 2,500내외의 실크분말 전자현미경 사진이다.

제2도는 본 발명의 효소처리한 평균분자량(MW) 13,000내외의 바이오실크분말 전자 현미경 사진이다.

제1공정 (세리신 제거공정)전 처리과정으로서 액비 1:30에서 식용 단백질 분해효소인 아스퍼질루스 오리자에(Aspergilus oryzaze) 및 바실러스변종(bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus Rokko)으로부터 생산되는 효소 플라보자임(flavourzyme, Nova Nordisk, Denmark) 또는 프로틴(Protin, Nova Nordisk, Denmark)을 0.5~1 %(w/v) 첨가하여 55℃의 조건에서 정련을 실시하여 일반적으로 쓰이는 비누 및 염을 쓰지 않고 고효율 견 단백질의 피브로인(fibroin)을 얻는다.

제2공정 (피브로인 용해공정)

상기1공정을 거친 각각의 순수 피브로인 견단백질에 대하여 2N 염산을 110℃에 2시간 용해한 후 가성소오다로 중화시킨것을 탈염기를 사용하여 분자량을 조절한 샘플(샘플 1), 또 대조 샘플로서 정련한 견사를 5% 염산에서 1시간 습열처리한 후 건조분쇄한 샘플(샘플 2) 및 50%의 CaCl2, H2O 및 에탄올 함량비가 1:8:2 M%가 되도록 조절 후 90℃에서 3-5시간 반응시킨 후 투석하여 얻어진 용액에 단백질 분해효소인 아스퍼질루스 오리자에 및 바실러스변종으로부터 생산되는 효소 플라보자임 또는 프로틴을 처리하여 동결건조 한 샘플(샘플3) 등 기존의 샘플제조와 제조방법이 다른 피브로인을 얻는다.

제3공정 (피브로인 용액을 동결건조 공정)

제 2 공정에서 얻어진 각각의 제조방법이 다른 피브로인 용액을 동결건조시켜 피브로인분말을 얻는다.

이상과 같은 서로다른 제조공정을 통하여 본 발명에서 목적하는 효소를 사용한 바이오 실크펩타이드 제조분말을 얻을 수 있다. 이하 실시 예를 통해 상세히 설명하기로 한다.

실시 예1) 효소를 사용한 실크펩타이드 분말의 제조법 및 특성

섬유화할 수 없는 부잠사, 절각견 및 파사로부터 협잡물을 완전히 제거한 견사 100g을 준비하였다.

제 1공정 : 준비된 견사에 대하여 액비 1:30으로 조정한 후 0.5~1%(w/v)에 단백질 분해효소인 아스퍼질루스 오리자에 및 바실러스변종으로부터 생산되는 효소 플라보자임 또는 프로틴을 55℃의 조건 하에 10분간 질소가스를 투입하여 효소의 산화를 방지한 후, 6시간 정련을 실시하여 고효율의 견 단백질 피브로인(fibroin)을 얻었다. 이때의 연감율은 평균 23%가 얻어졌다.

제2공정 : 세리신이 제거된 견사 35g에 대하여 CaCl2 266.4g, H2O 346g, Ethanol 280㎖를 2구형 둥근 플라스크에 넣어, 90℃에서 가열(Boiling)을 하면서 5시간 견피브로인을 용해시켰다.

제3공정 : 용해된 피브로인-CaCl₂수용액에 대하여 투석을 4일 실시하여 염을 완전히 제거 시켰다.

제4공정 : 제 3공정에서 얻어진 용액을 사용하여 단백질분해효소인 플라보자임 및 프로틴 1-5%(견사무게 기준)를 첨가하여 55℃에서 3 시간 처리하였다.

제 5공정 : 제1공정에서 얻어진 견사50g에 대하여 2N HCl 1.8ℓ를 넣어서 110℃에서 2시간 산 가수분해시킨 후 액을 여과하여 4 N NaOH액으로 중화 시켰다.

제6공정 : 제5공정에서 얻어진 액을 분자량(MW)이 1000-3000정도의 분자량을 얻을수 있는 탈염기를 사용하여 분자량 1000-3000정도의 피브로인 액을 얻었다.

제7공정 : 5% HCl수용액 1ℓ에 견사 50g을 넣어서 80℃에서 1시간 습열 처리한 후 동량의 NaOH용액으로 중화시켰다. 그 후 105℃에서 3시간 완전히 건조시킨 후 60Mesh의 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다.

제8 공정 : 얻어진 수용액 상태 혹은 제6공정에서 얻어진 분말을 물에 녹인 후 그액들을 0.8㎛의 막을 사용하여 고형물 및 기포를 제거하였다. 또한 GPC에 lnjection하기 전의 농도를 Moisture Analyzer를 사용하여 정확히 측정한 후, 절대 분자량을 확인하였다.

또한 용해도의 측정은 pH가 다른 수용액 10㎖에 각 샘플을 1g넣은 후, 2시간 처리 후 얻어진 수용액 상태의 카르복실기에 의한 말단기의 양으로 평균 중합도를 계산하였다. 아울러 각 샘플의 전 아미노산 함량은 6N 염산으로 가수분해 하였고, 자동아미노산 분석기로 분석하였다.

이상의 제조공정에서 얻어진 수용액 상태를 농축, 동결건조하여 분말 상의 피브로인을 얻었다. 이러한 서로 다른 분자량으로 제조된 피브로인 분말의 미세구조를 100-150배, 2000배 배율의 사진으로 첨부된 도면에서와 같이 각각의 특색있는 모습으로 관찰 되었다. 또한 평균분자량 및 중합도가 표1)과 같이 분석되었으며, 말단기 분석에 의한 중합도가 분자량의 크기와 거의 일치하는 결과를 얻어, 본 특허에서 얻은 분자량의 신뢰도가 타당함을 알았다. 그리고 위에서 언급한 3가지 샘플에 대한 가수분해 된 저분자 상태의 피브로인에 대한 유용한 각종 아미노산 함량의 결과를 표2)에 나타내었다.

상기 표 2)에서 가수분해가 된 저분자량으로 존재하는 전 아미노산의 함량이 각각의 샘플에 있어서 그 조성이 다르게 존재하고 있음릉 나타내고 있다. 또한 단백질 분해효소인 플라보자임, 프로틴에 의한 아미노산 함량의 차이는 거의 같게 나타났다. 특히 여기서 주목해야 할 아미노산의 조성은, 각 샘플에 있어서 Serine 및 Tyrosine의 조성이다. 대조구라고 할 수 있는 샘플 2의 아미노산 조성과 비교하였을 때, 완전 산 가수분해 한 샘플(샘플 1)의 경우와 효소분해 분말(샘플 3)의 경우 모두 견 피브로인의 기본구조인 β-sheet내의 수소결합을 지탱하는 Glycine 및 Alanine의 함량은 거의 유효 근사치 내에 있음을 알 수 있다. 그러나, 효소를 사용한 샘플3의 경우는 온화한 조건 때문인지 β-sheet구조의 기본골격은 유지하지만, 대조인 샘플 2에 비하여 Serine의 함량은 1.5배이상, Tyrosine의 함량은 2배정도 함량의 차이를 나타내었는데, 이것은 식용 단백질 분해효소에 의하여 특정아미노산, 즉 수산기(-OH)를 함유하는 Serine 및 Tyrosine의 -OH부분이 영향을 받았음을 확실히 알 수 있고, 상대적으로 많이 존재하는 아미노산 등의 활성기가 유효한 기능성의 역할을 하였을 것이다. 이러한 기본 아미노산 조성의 차이가 어떠한 기능성에 효과가 있는지, 또는 각기 다른 소소이온 영역에 있어서의 용해도 차이 실시 예를 설명한다.

표 3)은 효소를 사용한 바이오실크 분말 및 다른 조건으로 조제한 각 샘플의 경우, 다른 수소이온영역에 있어서 겔화의 진전 혹은 침전물이 어느정도 발생하는지를 알아보기 위함이다. 위의 표 3)에서와 같이 본 발명의 분자량이 조절된 피브로인의 경우, 대조구라 할 수 있는 샘플2의 경우는 거의 전 pH영역에서 용해되지 않고있음을 나타내고, 샘플3의 경우는 약70%정도 고른 용해가 일어났음을 암시한다. 이러한 용해도의 차이는 인체에 섭식 하였을 경우, 인체 효소에 의한 분해를 생각한다면 어느정도의 분자량이 있어야 함은 물론, 서로 다른 기능성의 차이를 기대할 수 있을것이다. 상기 실시 1)에서 제조한 각 샘플의 기능성 실험의 실시예를 소개한다.

실시예 2) 기능성 시험

① 항산화 작용 : 최근 천연물은 항산화제, 항암제등을 함유하는, 생물학적으로는 활성이 있는 자원이 주목을 받고 있으며, 특히 항산화작용은 세포막에서의 다가 불포화지방산을 공격하여 지질과산화를 일으키는 인자등과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 결국, 지질과산화로 인한 노화 및 발암의 원인과 매우 밀접한 관계가 있으므로 대단히 중요한 작용인데, 항산화작용의 실험은, 시료를 수용액상태로 준비하여 유발마우스의 조직을 마쇄한 후, 시료를 10㎍/㎖씩 테스트 튜브에 첨가하여, 대표적인 지질과산화물의 측정에 많이 쓰이는 Thio Barbitric Acid (TBA법) 및 Phenol성 화합물의 산화정도를 나타내는 1,1-Diphenyl-2-Hydrazyl (DPPH법)을 채택하여 각 시료에 의한 항산화 작용의 효과로 판단하였다.

표 4)에서와 같이 샘플1의 산가수분해하여 분자량(MW)을 2500내외로 조절한 분말의 경우, TBA법의 49.5%±1.8% (대조구의 91% 수준)로서, 산으로 가수분해한 분말 30.3%±3.2%에 비하여 우수하였다. 또한 중성염용해후 단백질 분해효소처리(0.1-1% 플라보자임 및 프로틴)하여 용해수준의 분자량으로 조절한 샘플의 항산화 작용이 47.5±0.9%로서 대조구의 88%수준을 나타내어서 우수한 효과를 나타내었다. 또한 분자량이 아주 큰 샘플 2의 경우는 낮은 항산화작용의 정도를 나타내어서 분자량 및 특정 아미노산의 차이에 의한 항산화작용에 효과가 있음을 나타내고 있다.

②Alcohol대사 분해 활성 평가

현재 개발되어 있는 합성의약품에 의한 알콜대사의 효과는 몇몇 보고가 되어어있으나, 합성의약품 자체가 독성 또는 부작용을 나타냄으로써 부작용이 적은 천연물로 부터 유효성분을 얻고자하는 추세에 있다.

실험전 마우스를 24시간 절식시키고 물만 공급하였다. 본 실험전에 Urethane 500mg/kg식 복강경 내에 투여하여 마취시킨 후 0.5g/ℓ의 arabia gum에 현탁시켜서 경구투여 하였다. 알콜분해 활성의 평가는 알콜을 분해하는 효소인 Alcoholdehydrogenase를 모니터화 하는방법 및 혈중의 알콜양을 측정하는 방법이 있는데, 본 특허의 알콜분해효소에 대한 활성의 평가는 후자의 법으로 하였다. in Vitro의 경우는 550㎍/mg, in Vivo의 경우는 50㎍/kg을 각각 처리하여 어느정도의 알콜분해 능력이 있는지를 확인하였다. 확인된 결과를 표 5)에 나타내었다.

표 5)에서와 같이 실크분말의 알콜분해효소에 대한 활성을 보면 In Vitro시험에서는 산가수분해 분말(샘플 1)과 효소용해 분말(샘플 3) 간에 유의차이가 없었으나 In Vivo 시험에서는 상대적으로 분자량이 큰 효소 용해 분말이 58.40±0.2의 활성치로, 나타내어 분자량이 작은 산가수분해 분말의 활성치인 22.61±0.21에 비하여 2.5배이상 높은 분해능력을 발휘하였다. 이러한 사실은, 본 발명에서 규명하고자 하는 분자량 및 특정아미노산의 차이에서오는 기능성에 효과가 있음을 알 수 있다. 표 2)의 아미노산 조성에서도 알 수 있듯이 Tyrosine 및 Serine의 함량에 의한, 특히 이러한 활성기를 가진 펩타이드 수준의 절단된 유효부분이 작용했음을 짐작할 수 있다. 이러한 사실은 영양학적인 측면에서 Oligopeptide레벨의 경우에 소화흡수에 유리하다고 하는 사실과 일치하는 결과를 보여주고 있다.

이상에서 살펴본 기능성의 결과와 같이 제조방법에 따라 분자량이 다른 실크분말의 기능성 검정 결과에 있어 분자량과 기능성이 상당한 차이가 있음을 알 수 있었다. 또한 본 발명에서 제시하고자 하는 식용효소에 의한 분자량의 조절이라는 톡창적인 사실은 실크분말의 유용 성분이 소화·흡수의 측면에서 효능이 있음을 입증하였고, 각 성분에 의한 천연 순수 활성물질로 개발될 수 있음을 기대할 수 있게되었다.

본 발명에 의해 얻어진 실크 피브로인 분말펩타이드는 단백질분해 효소분해로 인하여 분자량이 3,000-13,000이고 중합도가 39~195로서 pH 1-13에서 70% 용해도를 나타내고 있듯이 적정분자량으로 인하여 체내흡수율이 높고 항산화작용과 알콜 대사분해능력이 탁월하여 기능성식품 또는 의약품 및 순수활성물질의 개발에 기여할 수 있다.

Claims (4)

1. 실크 피브로인을 분해하여 분말상태의 펩타이드를 제조함에 있어서, 실크 피브로인에 아스퍼질루스 오리자에(Aspergilus oryzaze) 및 바실러스변종(Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus Rokko)으로부터 생산되는 효소 플라보자임(flavourzyme) 또는 프로틴(Protin)을 첨가하여 정제하는 단계와 정제된 실크 피브로인에 염화칼슘과 에탄올을 첨가하여 반응 및 용해시켜 투석하여 염을 제거하는 단계와 그 용액에 아스퍼질루스 오리자에 및 바실러스변종으로부터 생산되는 효소 플라보자임 또는 프로틴을 첨가하여 반응시켜 동결건조하여 분말상의 펩타이드를 얻는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 효소분해에 의한 실크 분말 펩타이드의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 아스퍼질루스 오리자에 및 바실러스변종으로부터 생산되는 효소 플라보자임 또는 프로틴 0.1-1.0%(w/v)를 55℃에서 3시간 처리함을 특징으로 하는 효소분해에 의한 실크 분말 펩타이드의 제조 방법.
3. 정제된 실크 피브로인에 염화칼슘과 물에 에탄올 (1:8:2)의 M%비로 첨가하여 90℃에서 3-5시간 반응시켜 용해한 후 3-4일간 투석하여 염을 제거하는 것을 특징으로 하는 효소분해에 의한 실크 분말 펩타이드의 제조 방법.
4. 제1항에 있어서, 분말상의 펩타이드는 분자량이 10,000-15,000이고, 중합도가 39~195이며 pH 1-13에서 70% 용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 효소분해에 의한 실크 분말 펩타이드의 제조 방법.