PT86358B

PT86358B - Processo para a preparacao de um produto de hidrolise enzimatica de proteinas rico em di- e tri-peptidos utilizavel principalmente na nutricao artificial e em dietetica

Info

Publication number: PT86358B
Application number: PT86358A
Authority: PT
Original assignee: Bellon Labor Sa Roger
Priority date: 1986-12-15
Filing date: 1987-12-14
Publication date: 1990-11-07
Also published as: ATE74494T1; JPS63258599A; DE3778141D1; EP0274946B1; FR2608051B1; PT86358A; EP0274946A1; DE274946T1; ES2004851A4; GR890300018T1; FR2608051A1

Description

Descrição do objecto do invento que

LABORATOIRE ROGER BELLON, Sociedade Anónima, francesa, industrial, com sede em 159 Avenue A.Pereti, 92200 NEUILLY SUR SEINE (França), pretende obter em Portugal, para:PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO DE HIDRÓLISE ENZIMÃTICA DE PROTEÍNAS RICO EM DI- E TRI-PEPTIDOS UTI LIZÃVEL PRINCIPALMENTE NA NUTRIÇÃO ARTIFICIAL E EM DIETÉTICA.

A presente invenção refere-se a um processo simples e económico de preparação de um produto de hidrólise enzimática de proteínas ri co em di- e tri-péptidos, utilizável principalmente na nutrição artificial, e em dietética.

Hoje em dia admite-se e demonstra-se que os di- e tri-peptidos apresentam um interesse real na nutrição artificial e em dietética.

A nutrição artificial é uma técnica aplicada aos doentes incapazes de se alimentar por via normal devido a danos físicos (acidente, operação cirúrgica, cancro do esófago, etc.) ou devido a um estado fisio lógico geral que não permita uma alimentação normal (coma, infecção grave, traumatismo, queimaduras, etc.)

A nutrição artificial pode ser dada por via natural (via digestiva, trata-se então da nutrição oral ou entérica. Noutros casos, os nutrimentos são introduzidos directamente na circulação sanguínea, trata-se então da nutrição parentérica.

Uma nutrição completa necessita da administração de azoto sob a forma de prótldos (proteínas, peptidos, aminoácidos) em mistura com lípidos, hidratos de carbono, elementos minerais e vitaminas.

Numa alimentação normal, a maior parte do azoto consumido é ingerido sob a forma de proteínas e é digerida pelas enzimas do tracto di gestivo.

Todavia, num grande número de situações citadas em que a nutrição artificial é utilizada, a digestão efectiva de proteínas não é pos

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UTEZíl^

À/ // ✓ / sível no caso de deficiências enzimãticas devidas a doenças ou ã porção limitada do intestino que ainda fica funcional após a doença ou intervenção cirúrgica.

Na nutrição oral ou entérica, utiliza-se, por vezes, aminoãcidos puros como produto proteico mas estes apresentam, contudo, numerosos inconvenientes teóricos e práticos:

- os aminoãcldos são conduzidos desde o intestino por processos de trans_ porte activo. Aminoãcidos diferentes entram em competição pelo transporte, e a absorção intestinal pode ser limitada por esta competição;

- certos estados patológicos podem perturbar o transporte de certos ami noácidos, provocando uma redução da capacidade de absorção.

Demonstrou-se recentemente (Silk D.B.A. Peptide absorption in man - Gut 15 194 (1974); Matthews D.M. Intestinal absorption of peptides-Phys.Rev. 55 537 (1975); Adibi S.A. et Y.S.Kim Peptides absorption and hydrolysis In Physiology of the gastrointestinal tract.Ed.L.R.Johnson, Raven Press New York 1073) que a molécula de peptido compreendendo 2 ou 3 aminoãcidos, ligados por ligações peptidicas (di- ou tri-peptidos, re_s pectivamente) é absorvida intacta a partir do intestino por um mecanismo distinto do desencadeado no transporte dos aminoãcidos.

Parece que as células de superfície no intestino absorvem os di- e tri-péptidos, hidrolisam-nos no local em aminoãcidos e libertam os aminoãcidos assim obtidos no sangue.

A digestão enzimãtica das proteínas foi muito utilizada como um meio de produção de misturas de peptidos inferiores ou pequenos péptidos.

Assim todas as preparações descritas contem um amplo espectro de comprimentos de cadeia peptídica (de 2 a mais de 20 aminoãcidos) mas o teor em di- e tri-peptidos especlalmente indicado é muito baixo (na or dem dos 5 a 20%).

Os peptidos superiores aos di- e tri-peptidos não apresentam vantagens na absorção cinética descrita anteriormente e deste modo estas misturas de peptidos mal definidos não proporcionam uma óptima absorção de azoto nas utilizações clínicas.

Foi igualmente proposta a preparação de produtos de hidrólise de proteínas a partir de enzimas utilizáveis em meio ãcido, mas a diges-259012

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/ tão tem de se prolongar por um longo período de tempo de 8 a 72 horas.Es. tes produtos de hidrólise podem conter peptidos cujo peso molecular é in ferior a 700 daltons. Contudo as enzimas utilizadas não são de uso corren te nas indústrias alimentares e dietéticas e a sua inocuidade não é reconhecida de modo unanime. Alem disso, tida em conta a duração da hidrólise, esta tem de ser efectuada quer em condições de esterilidade (o que au menta francamente o custo da instalação) quer na presença de anti-sépticos) cuja eliminação é posteriormente difícil).

Deste modo os produtos de hidrólise enzimãtica de proteínas clássicas não são apropriados para a produção de misturas contendo essencialmente di- e tri-peptidos.

Podem igualmente preparar-se os di- e tri-peptidos por síntese química e a experiência demonstrou que estas misturas de di-peptidos podem ser utilizadas de modo eficaz na nutrição artificial (FURST P. Peptides in parenteral nutrition - Clinicai Nutrition 4 (Suppl.1985) p.105; KRSYSIK B.A. et ADIBI S.A.Comparison of Metabolism of glycine injected intraveneously in free and di-peptide forms; STEINHARDT H.J., PALEOS G.A. BRANDL M., FEKL W.L.,ADIBI S.A. - Efficacy of synthetic di-peptide mixture as the source of aminoácidos for total parenteral nutrition in a subhuman perimate).

Todavia, esta preparação apresenta igualmente inconvenientes:

- primeiramente, a totalidade dos di-peptidos possíveis (em número de 400) não pode ser razoavelmente sintetizada; a experiência era baseada num número limitado de di-peptidos, contendo a glicina (i. é glicina -X, em que X é um outro aminoácido.

Esta preparação limita os di-peptidos disponíveis e pode provocar um desiquilíbrio devido ao excesso de glicina.

- em segundo lugar, uma outra limitação da preparação por síntese química é o custo da produção dos di-peptidos que é demasiado elevado para uma utilização em nutrição.

A presente invenção permite evitar os inconvenientes dos processos clássicos expostos anteriormente, e diz respeito a um processo de hidrólise enzimática de proteínas para a produção de misturas peptídicas contendo principalmente di- e tri-peptidos.

Como já foi anteriormente mencionado, na alimentação oral ou

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A primeira vantagem é de ordem cinética; a nível intestinal, a preparação azotada é mais rápida quando os prótidos estão sob a forma de di- ou tri-peptidos do que no caso em que estes estão sob a forma ele mentar ou oligomérica (produtos da digestão gástrica e pancreática).

Uma segunda vantagem refere-se ã não-competição a nível da absorção que existe entre os di- e tri-peptidos de um lado e os aminoáci dos de outro.

Uma terceira vantagem está ligada à fraca relação osmolaridade/azoto (duas a três vezes mais fraca do que a dos solutos de aminoácidos, o que permite obter solutos ricos em azoto e cuja osmolaridade não está demasiado afastada dos valores fisológicos de 300 a 500 mOs/1).

Pode-se, pois, crer que em certas condições patológicas em que os sistemas de transporte dos aminoácidos estão perturbados, a absorção dos di- e tri-peptidos pode não ser alterada.

processo de acordo com a presente invenção contempla um passo de hidrólise enzimática de uma proteína, com recurso a uma associação das tres enzimas seguintes, adicionadas simultânea ou sucessivamente:

a) uma protease bacteriana utilizável em meio próximo da neutralidade (pH compreendido entre 5 e 8) extraída geralmente de estirpes de Bacillus Subtilis,seleccionada do grupo que compreende a Neutrase® da firma Novo Industrie Enzymes S.A., a Protêose B500®da firma Ra pidase Gist Brocades, e a H.T.Protéolytique® da firma Miles.

b) uma protease bacteriana utilizável em meio alcalino (pH compreendido entre 7 e 11) extraída, por exemplo, de estirpes de Bacillus Li- ou fir cheniformes ou de estirpe de Bacillus Subtilis, seleccionada de entre o grupo que compreende a Alcalase®da firma Novo Industrie Enzymes S.A., a Protease A£®da firma Rapidase Gist Brocadès, Optimase®da firma Miles,

c)uma enzima pancreática de origem animal, incluindo a tripsina, um concentrado de tripsina ou a preparação comercializada pela ma Novo Industrie Enzymes S.A. sob o nome de PEM*^ as condições da hidrólise enzimática compreendem:

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- um pH entre neutro e alcalino de 7 a 10,

- uma temperatura compreendida entre 20 e 702C, de preferencia entre 30 e 502C,

- um tempo de duração da hidrólise igual ou inferior a 300 minutos.

A concentração da matéria proteica na suspensão aquosa a hidrolisar é de preferencia de 5 a 20% em peso por volume.

passo da hidrólise enzimática está concluído por destruição da actividade enzimática, por exemplo por aquecimento a 95 - 1002C duran

I te 10 a 15 minutos.

produto de hidrólise enzimática de proteínas assim obtido é eventualmente purificado por ultrafiltração.

No ponto de vista industrial, as proteínas utilizáveis para a preparação deste produto de hidrólise compreendem,a título de exemplo, as seguintes:

- clara de ovo (ovalbumina)

- proteínas lácticas: albuminas do leite e caseínas

- proteínas resultantes do abate de animais: albumina do soro, hemaglobina descolorada

- produtos da industria das pescas e das conservas de peixe

- produtos de origem vegetal:proteínas de soja e de luzerna A Neutrase®Novo ê apresentada sob a forma de um líquido castanho claro, preparado a partir de uma cultura purificada de Bacillus Subtilis; a sua actividade proteolítica é de 0,5 unidade Anson/g (uma unidade Anson é uma unidade enzimática que corresponde à quantidade da enzima que liberta nas condições de experiência lmMole de ácidos amina dos Folin - positivos (expresso em tirosina) por minuto.

A alcalase®Novo é apresentada sob a forma de um líquido castanho escuro preparado por purificação e concentração de uma cultura de Bacillus Licheniformis. A sua actividade proteolítica é:

- pelo menos igual a 1800 unidades NF/USP para a actividade trípsica

- pelo menos igual a 350 unidades NF/USP para a actividade quimotripsica

- e a relação tripsina/quimotripsina está compreen

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dida entre 3,75 e 6

A relação enzima/substrato é de 5 - 10% para a Alcalase ou a Neutrase” e de 0,5 - 1% para a PEM.

processo de acordo com a presente invenção pode ser realizado de modo económico na medida em que não necessita de instalações estéreis e de material de centrifugação.

Além disso, as enzimas seleccionadas são todas resultantes de microorganismos bem conhecidos, já utilizados nas indústrias alimenta res e de cuja inocuidade não se duvida.

A presente invenção é baseada na descoberta, pelos inventores de uma associação de proteases capaz de degradar as proteínas num único passo, para resultar directamente numa mistura de prótidos de baixo peso molecular e cuja composição é caracterizada por um elevado teor em di- e tri-peptidos, um baixo teor em aminoácidos livres.

As digestões enzimãticas, de acordo com a presente invenção, são efectuadas em meio entre básico e neutro, a quantidade em sódio e potássio é limitada pelo teor desejado para a utilização prevista, o tempo de duração da hidrólise não excede, de preferencia, 300 minutos, de modo a evitar o aparecimento de uma contaminação bacteriana em condições opera tórias simples.

Como já foi anteriormente mencionado a originalidade da inven ção reside na escolha de uma associação de três enzimas que activam sucessiva ou simultaneamente, de modo sinérgico e complementar.

As experiências seguintes mostram a superioridade desta ass£ ciaçao de enzimas sobre estas enzimas consideradas em separado ou associa das duas a duas no quadro da hidrólise enzimática de proteínas.

quadro I agrupa as enzimas estudadas e as condições de hidró lise (pH - temperatura - concentração) nas quais se utilizam estas enzimas.

quadro II apresenta os resultados de 15 exemplos de hidrólises enzimãticas realizadas quer com a clara de ovo de galinha, quer com a caseína do leite de vaca sob a forma de produtos secos por atomização, utilizando estas enzimas em separado, ou associadas duas a duas ou três a tres.

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QUADRO I

Enzimas ensaiadas e condições de hidrólise utilizadas

enzimas	actividade em unidades	doses de utilisaçao enzima/ /substrato	°C das gx— periencias	zona de utilização pH
pepsina	10 000 NF	lOg/Kg	35-45	1,8-2,5
tripsina	4 700 NF	0,53g/Kg	40-50	7 a 9
PEM R Novo	2 500 NF	lOg/Kg	40-50	7 a 9
Alcalase ^R Novo	0,6 ANSON	0,11/Kg	40-50	7 a 9
Neutrase & Novo	0,5 ANSON	0,11/Kg	40-50	7 a 9

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QUADRO II

N2 de experiências matérias primas ordem da adiçao grau de hidróli se (DH)% clara ovo clara ovo de de caseína caseína clara ovo clara ovo clara ovo clara ovo clara ovo clara ovo clara ovo clara ovo clara ovo caseína caseína de de de de de de de de de

Pepsina

Tripsina

PEM®

Alcalase

Pepsina

Tripsina

Alcalase

Tripsina

Alcalase

Neutrase

Alcalase

PEM®

PEM0 Neutrase ®·

Neutras^©

PEM®

aminoá dos li vres g/lOOg	medidas médias péptiaos
12	5,30
2	12,00
1	11,00
12	3,70
15	4,50
8	3,50
12	3,50
10	3,30
9	3,30
7	3,00
7	3,00
7	3,00
4	3,30
4	3,30
5	3,00

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14.OFZ.1987· » ·

O processo específico realizado para efectuar as 15 experiências agrupadas no quadro II contempla os passos seguintes:

a) colocação em suspensão da matéria prima proteica em água destilada na concentração de 15% (150g/l) numa cuba com termostato munida de um sis tema de agitação e de manutenção do pH;

b) ajustamento e manutenção do pH para 8 e da temperatura pura 452C (pH 2,0; 402C no caso de hidrólises com pepsina),

c) adição das preparações enzimaticas nas doses indicadas no quadro I;

d) hidrólise durante uma duração de tempo que não exceda 300 minutos;

o estado de avanço da hidrólise é seguida pela quantidade de ioes OH- uti lizada (iões H+ no caso da pepsina); a reacção está concluída quando a degradação se alcança desejada;

e) destruição da actividade enzimática por aquecimento a 1002C durante 10 minutos;

f) ultrafiltração do produto da hidrólise e recuperação do ultra-filtrado (ponto de ruptura 10.000 ou 15.000 daltons).

produto de hidrólise ultrafiltrado é analisado com o fim de determinar:

- o grau de hidrólise (ou, do seu inverso, a dimensão média dos pr£ dutos de hidrólise),

- a taxa de aminoácidos livres,

- a taxa de di- e tri-péptidos no produto de hidrólise ultrafiltrado.

quadro II chama a atenção para as seguintes observações:

(1) a utilização de um conjunto de 3 enzimas introduzidas simultaneamente no reactor ou com alguns minutos de intervalo conduz a um grau de hidrólise sempre superior ao obtido por uma única enzima ou por um conjunto de duas enzimas.

(2) no que diz respeito ãs dimensões médias dos peptidos ob tidos, a natureza das enzimas é determinantemente;

(3) em certos casos, a ordem de adição das enzimas pode ser permutada, sem que isso tenha uma incidência sobre os produtos obtidos (comparação das experiências 10 e 11). Contudo, outras experiências mostram que esta ordem pode ser um elemento importante nas condições de hi drólise;

(4) a utilização de uma terceira enzima não se faz acompanhai

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de um elemento significativo da taxa de aminoácidos livres (comparação das experiências 8, 9 com 10 e 14 com 15);

(5) entre estas associações diferentes de enzimas estudadas, aparece-nos uma categoria como a mais adequada quer no que diz respeito ao grau de hidrólise elevado quer a fraca taxa de aminoácidos livres;trata-se da associação de: alcalase®- Neutrase®- PEM®- (experiências 12 e 15) e a associação tripsina - Alcalase®- Neutrase®- (experiên cias 10 e 11);

(6) a associação - Alcalase®, Neutrase® PEM® (ou Tripsica - Alcalase - Neutrase) é utilizável com outras matérias-primas proteicas (albumine de soro bovino ou porcino, proteínas de soja e de luzerna, albumina láctea ou leite de vaca,hemoglobina descolorada, e produto de valorização da indústria das pescas (resíduos de peixe)). Em todos estes casos o grau de hidrólise é da mesma ordem de valor e a taxa de aminoáci dos livres é próxima de 5%, excepto no caso em que a matéria prima é já um produto de hidrólise (hemoglobina descolorada e produto de valorização da indústria das pescas). No caso destes dois últimos exemplos, a taxa de aminoácidos livres é da ordem dos 10 a 15% em peso.

(7) as preparações enzimáticas PEM®- Alcalase® - Neutrase ®podem ser substituídas por outras preparações enzimáticas de activida de e especificidade equivalentes fabricadas por outras firmas: Protéase B500®da firma Rapidase Gist - Brocadès - H.T. Protéolytique®da firma Miles - Protéase A2 da firma Rapidase Gist Brocadès e Optimase ® da fir ma Miles;

(8) em relação às experiências 12 e 15, a concentração da matéria prima proteica no meio da hidrólise não tem valor crítico.

As experiências efectuadas com concentrações compreendidas entre 5 e 20% (em peso por volume) não introduziram variações significativas do grau da hidrólise e da dimensão dos peptidos, sob reserva de que as preparações enzimáticas sejam utilizadas com uma relação enzima/ /substrato constante como é indicado no quadro I.

Os produtos de hidrólise proteicos são geralmente caracterizados pelo seu grau de hidrólise (D.H.) que é o valor em percentagem do número de ligações peptídicas quebradas pelo número de ligações peptí dicas existente na proteína nativa.

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O D.H. é aproximadamente o inverso da dimensão média dos pro dutos de hidrólise; assim a um D.H. de 50% corresponde uma dimensão média de 2, e a um D.H. de 33% corresponde uma dimensão média de 3.

conhecimento do D.H. e da taxa de aminoácidos livres conduz ã determinação da dimensão média de peptidos. Contudo, se a taxa dos aminoácidos é baixa, a dimensão média dos produtos de hidrólise e a dimensão média dos peptidos são praticamente confundíveis.

D.H. (ou a dimensão média dos produtos de hidrólise) é cal culado a partir de dosagens clássicas que permitem a determinação do número de funções aminas primárias antes e após a hidrólise química total do produto de hidrólise enzimática.

Determina-se a taxa de aminoácidos livres de acordo com a técnica AFNOR (NF V 76-115) adaptada aos produtos da hidrólise enzimática de proteínas.

A avaliação da taxa de di- e tri-peptidos é determinada por cromatografia pelo Sephadex - cobre preparado de acordo com a técnica de ROTHENBUHLER E. (Anal.Biochem. 1979. 97 - 387 - 75).

Efectua-se a cromatografia em condições que conduzem ã sele£ ção dos oligopeptidos por dimensões médias decrescentes. Obtem-se, assim, sete fracções para as quais se determina um valor médio (N) e a percentagem de peptidos de dimensões (N) contida no produto de hidrólise.

Os quadros III e IV respectivamente relativos ãs experiências 12 e 15 mostram que os oligopeptidos superiores aos tripeptidos tem uma dimensão média pelo menos igual a cinco o que implica que o teor em die tri-peptidos está próximo ou superior a 50% em peso.

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QUADRO III ►

Hidrólise da clara de ovo

Aferimento com péptidos sintéticos puros

Esta fracção não contem nenhum tripe£ tido e nenhum dipeptido

Estas fracções contem em maioria tetrapeptidos em mistura com peptidos superiores e inferio res

Estas fracções con tem quase exclusivamente tripeptidos e dipeptidos pela Alcalase a Neutrase

N° fracção

I4.0EZ.W r, * O (_/Az-^Z'^K-- ;

/ /

PEM®

Dimensões médias e teores

Para a fracção

8,5+ 0,9 (12%)

(25%) (18%) (12%)

3,0+ 0,6 (8%)

2,6+0,5 (11%)

2,4+ 0,5 (14%)

Acumulações

6,0 (37%)

5,3 (55%)

5,0 (67%)

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QUADRO IV

Aferimento com péptidos sintéticos puros	N2 fracção	Dimensões médias e teores
para a f racção	Acumulações
Esta fracção não contém qualquer tripeptidos e qualquer dipeptido	1	9,0 + 0,9(10%)	6,0 (28%)
Estas fracçoes contêm em maioria tetrapepti dos em mistura com péptidos superiores e inferiores Estas fracçoes contem quase exclusivamente tripeptidos e dipeptidos	2	5,0 + 0,6(18%)
3	4,5 + 0,6(17%)	5,3 (55%)
4 5	3,9 + 0,6(16%) 3,6 + 0,6(11%)	5,0 (60%)
6	2,8 + 0,5(10%)
7	2,4 + 0,5(19%)

Ilustra-se a invenção por exemplos nao limitativos que se se25 guem.

EXEMPLO 1

1· Desnaturação e hidrólise

Colocam-se 600Kg de clara de ovo atomizada em suspensão em 4000 litros de água destilada. O pH é ajustado para 6 com o ácido fosfórico. Leva-se a cuba, sob agitação, a 1052C à pressão de 1 bar de azoto durante 40 minutos. Mantem-se esta temperatura durante uma hora, depois do que se arrefece a suspensão, sob agitação, até 452C. 0 pH é ajustado para 8,00 com uma suspensão de cal a 25%. Adiciona-se, então, sucessiva35 mente:

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- 6Kg de P.E.M.®

- 60 litros de Neutrase ® e

- 60 litros de Alcalase ®

Mantem-se a temperatura a 472C durante 5 horas e o pH em 7,8

2. Separação - sólido líquido

Ajusta-se o pH para 7 com o ácido fosfórico. Eleva-se a tem peratura a 1002C durante 1 hora. A parte insolúvel é separada por filtro rotativo, sob vácuo, em presença de Dicalite ®4146 da firma Dicalite.

3. Descoloração

À fase líquida obtida no estádio precedente, adiciona-se 20 Kg de carvão activo Norit® Extra SX por cada mQ. 0 tratamento efectua-se sob atmosfera de azoto durante 1 hora a 702C.

carvão activo é, em seguida, eliminado por filtro de malhas metálicas verticais em presença de Dicalite® 4146 da firma Dicalite. Esta operação é efectuada a 502C.

4. Ultraf iltração ►

filtrado obtido no passo precedente é submetido ã ultrafiltração utilizando o aparelho PLEIADE da sociedade RHONE-POULENC com membranas íris®3038 com um ponto de ruptura de 15.000 daltons; esta operação é efectuada a uma temperatura de 452C.

ultrafiltrado assim obtido pode ser utilizado como matéria prima para a preparação de um alimento entérico, quer tal e qual, quer após diluição ou concentração em evaporador tubular ou de placas, quer ainda após secagem por atomização.

quadro V apresenta as características de um produto de 15 gramas de azoto/litro.

quadro VI apresenta os aminoácidos da clara de ovo inicial e do ultrafiltrado.

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QUADRO V

Composição e características do produto de acordo com a presente invenção (Produto da hidrólise de ovalbumina)

	Produto de hidrólise ultrafiltrado
Azoto total	15 g/1
Osmolaridade	900 mOs/kg
pH	7,0
Sódio	150 meq/1
Potássio	40 meq/1
Cálcio	550 mg/1
Cloro	20 meq/1
Fosforo total	18 meq/1
Repartição dos peptidos
Aminoácidos livres	11%
Dipéptidos	20,5%
Tripéptidos	20,5%
Tetrapéptidos	20,0%
Teor em di- tri-peptidos	41%
Teor em di- tri-peptidos	61%
Oligopeptidos (superiores
aos tetrapeptidos)	28%

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QUADRO VI ►

Composição em aminoãcidos da matéria prima e do produto de hidrólise de ovalbumina ultrafiltrado

	Matéria prima	Produto da hidróli se ultrafiltrado
Acido aspártico e aspargina	10,1	11,2
Treonina	5,4	5,6
Serina	7,6	8,7
Ácido glutãmico e glutamina	12,1	12,6
Prolina	3,7	6,6
Glicina	6,9	6,6
Alamina	9,1	9,7
Cisteína	1,9	2,0
Valina	7,1	7,5
Metionina	4,0	3,3
Isoleucina	4,2	4,3
Leucina	8,1	7,7
Tirosina	2,8	2,1
Fenilalanina	4,2	3,5
Lisina	5,9	6,0
Histidina	1,8	1,8
Triptofano	0,9	0,7
Arginina	4,2	4,2

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►

EXEMPLO 2

1. Hidrólise

Colocam-se 1500 Kg de caseína láctica em suspensão em 10.000 litros de água. Ajusta-se o pH da suspensão para 9,0 por adição duma solução 5N de soda ou de potassa, cuja composição é determinada pelo teor em sódio ou em potássio desejado no produto final.

Introduz-se sucessivamente, com 5 minutos de interveio, a Alcalase^, a Neutrase e a PEM ®ha concentração indicada no quadro I.

pH é mantido em 8 por adição da solução de alcali durante a primeira hora, e deixa-se , em seguida, o pH evoluir livremente até 7,6. A duração da hidrólise é fixada em 270 minutos.

2. Destruição da actividade enzimática - aquecimento-arrefecimento

Eleva-se o produto da hidrólise a 95-982C por passagem em permutador de placas sobre vapor. 0 produto é mantido à mesma temperatura durante 15 minutos.

Em seguida arrefece-se o produto por passagem em permutador de placas sob água fria a 152C até à temperatura de 502C.

3. Ultraf iltração

A ultrafiltração do produto de hidrólise arrefecido é realiza da em aparelho PLEIADE da sociedade RHONE-POULENC, à temperatura de 492C. As membranas da ultrafiltração são da sociedade RHONE-POULENC e referencia das íris 3038, apresentando um ponto de ruptura de 15.000 daltons.

Como para o exemplo, o ultrafiltrado pode ser, em seguida, quer diluído, quer concentrado.

quadro VII apresenta as características de um produto de hidrólise com 11 gramas de azoto/litro e o quadro VIII aminoácidos gramas da caseína láctica inicial e do ultrafiltrado obtido de acordo com a presente invenção.

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Ref.03/PH/FRP/CCL

H 5718 Cas 189

QUADRO VII

Composição e características do produto de acordo com a presente invenção (Produto da hidrólise da caseína)

	Produto da hidrólise ultrafiltrado
Azoto total	11 g/1
Osmolaridade	490 mOs/KG
pH	7,6
Sódio	80 meq/1
Potássio	35 meq/1
Cálcio	10 meq/1
Amoníaco	25 meq/1
Cloro	25 meq/1
Fósforo total	0,8 mg/1
Repartição dos protidos Aminoácidos livres	7% em peso
Dipeptidos	25%
Tripeptidos	25%
Tetrapeptidos	25%
Teor em di-, tripe£ tidos	50%
Teor em di, tripeptídos	75%
Oligopeptidos (superiores aos tetrapeptidos)	18%

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Ref.03/PH/FRP/CCL

H 5718 Cas 189

QUADRO VIII

Composição em aminoácidos da matéria prima e do produto da hidrólise da caseína ultrafiltrado, de acordo com a presente invenção.

(Resíduos em percentagem)

	Matéria prima	Produto da hidrólise ultrafiltrado
Ácido aspãrtico e aspargina	6,6	7,0
Treonina	5,6	5,7
Serina	7,2	6,8
Ácido glutãmico e glutamina	20,8	19,4
Prolina	12,3	12,0
Glicina	3,0	2,9
Alanina	4,0	4,2
Cisteína	0,5	2,9
Valina	6,9	6,6
Metionina	1,3	1,3
Isoleucina	2,7	3,0
Leucina	8,6	8,3
Tirosina	3,7	3,4
Fenilalanina	4,1	3,9
Lisina	7,4	7,3
Histidina	2,4	2,4
Triptofano	não determina do
Arginina	2,9	2,9

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Ref,03/PH/FRP/CCL

H 5718 Cas 189

EXEMPLO 3

Este exemplo refere-se à apresentação farmacêutica de um alimento dietético para alimentação entérica, pronta a utilizar.

Ao produto de hidrólise ultrafiltrado de acordo com o exemplo 1 ou 2, adicionam-se hidratos de carbono sob a forma de maltodextrinas, lípidos sob a forma de óleos vegetais, vitaminas, sais minerais, oligolementos bem como vários aditivos tecnológicos necessários ã manutenção como emulsão do produto acabado. 0 alimento entérico assim constituído é esterilizado pela técnica UHT (Ultra Alta temperatura) sendo depois repar tido por volumes entre os 200 e os 1000 ml, em embalagens metálicas, ou embalagens de cartão.

A título de exemplo, uma fórmula de 4180 Kj/1 (ou seja 1000 Kcal/1) possuindo uma osmolaridade compreendida entre 300 e 450 mOs/Kg, apresenta a seguinte composição:

Produto de hidrólise de acordo com a presente invenção maltodextrinas amido mistura de lípidos (óleo de soja, colza, ónagra) triglicéridos de cadeias médias mistura vitamínica sulfato de magnésio cloreto de cálcio glicerofosfato de cálcio sulfato de ferro(ferroso) carbonato de manganês sulfato de zinco sulfato de cobre iodeto de potássio emulsionante antioxidantes de óleos água destilada quantidade de produto de hidrólise para fazer 21 g de matéria seca

60g

10g

8g

8,7g

0,lg

0,7g

0,2g

0,8g

0,01g

0,003g

0,008g

0,002g

0,05g l,3g

0,003g

500 ml

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Ref.03/PH/FRP/CCL

H 5718

EXEMPLO

Este exemplo refere-se ã apresentação farmacêutica de um alimento para alimentação entérica, em forma de pó para diluir em água antes da utilização (500 Kcal/500 ml).

A 21 g de produto de hidrólise seco por atomização, adiciona-se maltadextrinas, lípidos, oligolementos e vitaminas bem como os aditivos tecnológicos necessários à colocação adequada em emulsão do pó na água. A composição de uma saqueta para se por em suspensão é idêntica à apresentação no exemplo 3, mas não contém água com excepção da humidade residual da ordem dos 3Z.

depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito, foi efectuado em França, em 15 de Dezembro de 1986 sob o n2.86 17516.

Claims

REIVINDICAÇÕES lâ.- Processo para a preparação de um produto de hidrólise enzimâtica de proteínas rico em di- e tri-peptidos e possuindo um teor reduzido de aminoãcidos livres, utilizável principalmente em nutrição artificial e em dietética caracterizado por incluir um passo de hidrólise enzimâtica de uma proteína utilizando uma associação de três enzimas adicionadas simultaneamente ou sucessivamente:

a) uma proteose bacteriana utilizável em meio próximo da neutralidade (pH compreendido entre 5 e 8) extraída geralmente de estirpes de Ba cillus Subtilis, escolhida do grupo que compreende a Neutrase®, a Protease B500®e a H.T.Proteolítica®,

b) uma protease bacteriana utilizável em meio alcalino (pH compreendido entre 7 e 11) extraída de estirpes de Bacillus Licheniformis ou de Bacillus Subtilis, escolhida de entre o grupo que compreende a Alcalase a Protease A
2® e a Optimase e

c) uma enzima pancreãtica de origem animal incluindo a tripsina ou um concentrado de tripsina ou 0 produto comercializado sob 0 nome PEM nas condições de hidrólise seguintes:

- um pH entre neutro e alcalino de 7 a lo

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Ref,03/PH/FRP/CCL

H 5718

I

- uma temperatura compreendida entre 20 e 7020 de preferencia entre 30 e 502C,

- um tempo de duração da hidrólise igual ou infe rior a 300 minutos.

22,- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a associação de enzimas compreender a Neutrase® a Alcalase®e a PEM®.
3â.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizada por a concentração em proteínas da suspensão de matéria proteica a hidrolisar ser de 5 a 20% em peso por volume.
4â.- Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3 caracterizado por a proporção enzima/substrato ser de 5 - 10% para a Alcalase®ou a Neutrasa®e de 0,5 ~ 1% para a PEM®.

52.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracte rizado por a proteína inicial ser derivada da clara de ovo ou da caseína.

62.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado por o produto de hidrólise enzimática de proteínas obtido se tornar inactivo por aquecimento a 95-1002C durante 10 a 15 minutos.

72,- Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por o produto de hidrólise enzimática inactivo ser submetido a uma ultrafiltração.