KR100264344B1

KR100264344B1 - 혈액내 트리글리세라이드의 농도 증가를 저해하는 펩타이드 및 전기 펩타이드를 활성성분으로 함유하는 혈액내 트리글리세라이드 농도 증가 억제제

Info

Publication number: KR100264344B1
Application number: KR1019970708355A
Authority: KR
Inventors: 교이치 가가와; 히사코 마쓰타카; 지주코 후쿠하마; 히로아키 후지노; 마사히로 누마타; 가즈히사 혼다; 도유 나카무라
Original assignee: 도유 나카무라; 이토햄 가부시키가이샤; 오자키 겐타로; 한큐 교에이 붓산 가부시키가이샤
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1996-06-10
Publication date: 2000-08-16
Also published as: JPH09255698A; CA2221767C; AU5912096A; EP0838473A4; CA2221767A1; EP0838473B1; JP2805194B2; WO1997035875A1; ATE225803T1; NO325836B1; EP0838473A1; AU690853B2; KR19990021880A; DK0838473T3; NO975360D0; NO975360L; US5958885A; ES2184865T3

Abstract

본 발명은 Val-Val-Tyr-Pro의 아미노산 배열을 갖는 펩타이드; 전기 펩타이드를 활성성분으로 함유하는, 혈액내 트리글리세라이드 농도 증가 억제제, 건강식품(기능성 식품) 및 사료를 제공한다. 전기 펩타이드 및 그를 활성 성분으로 함유하는 산물은 인간이나 동물에서 비만, 고지혈증 및 심혈관 질환(고혈압, 동맥경화증 등)을 예방하거나 치료할 수 있으며, 가축과 양식어류의 육질을 개선시킬 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

혈액내 트리글리세라이드의 농도 증가를 저해하는 펩타이드 및 전기 펩타이드를 활성성분으로 함유하는 혈액내 트리글리세라이드 농도 증가 억제제

[기술분야]

본 발명은 혈액내 트리글리세라이드(triglyceride)의 농도 증가를 저해하는 신규 펩타이드; 전기 펩타이드를 활성성분으로 함유하는 혈액내 트리글리세라이드 농도증가 억제제; 혈액내에서 트리글리세라이드의 농도 증가를 저해 하는 기능을 가진 건강식품(기능성 식품); 및, 혈액내에서 트리글리세라이드의 농도 증가를 저해하는 기능을 가지는 사료에 관한 것이다.

[발명의 배경]

과도한 지방과 당분의 섭취는 비만과 고지혈증 등을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 고지혈증에 있어서, 혈액내 트리글리세라이드(이하, ‘TG’로 표기하기로 함)의 농도증가는 고혈압, 동맥경화증과 같은 병을 야기시키는 것으로 알려져 있다. 혈액내의 TG 농도 증가를 저해하는 여러 가지 시도는 비만과 고지혈증에 효과를 나타내고 있다.

현재, 혈액내의 TG농도 증가의 저해를 위하여, 식사량 조절, 다이어트 식품(예를 들면, 저칼로리 식품(LCD) 또는 초저칼로리 식품(VLCD))의 섭취 및 다양한 약물의 투여가 성행하고 있다. 사용되고 있는 약물로는 혈액내의 지단백질(lipoprotein) 리파제 활성을 증가시키는 덱스트란 설페이트, 지질 흡수를 억제하는 니코몰(Nicomol) 및 지질 대사를 증진시키는 클로피브레이트(Clofibrate)와 프라바스타틴(Pravastatin) 등이 있다.

그러나, 식사량의 조절은 매우 고통스러운 방법이며, 전기 약물의 투여는 부작용을 나타내고 있다. 따라서, 부작용이 없으면서, 혈액내 TG 농도의 증가를 강하게 저해할 수 있는 약물의 개발이 요구되어 왔다.

한편, 오늘날에는 가축과 양식어류의 성장을 촉진시려는 목적으로 고칼로리 사료를 이들에게 사용하고 있는데, 그 결과 가축과 양식어류에서 비정상적인 지방대사가 발생하여 혈액내 TG 농도가 상승하게 된다. 이러한 혈액내 TG 농도의 상승 때문에, 가축과 양식어류의 지방 함량은 과도하게 된다. 따라서, 이러한 가축이나 양식어류의 섭취는 과도한 지방 섭취로 이어진다. 더우기, 이러한 가축이나 양식어류는 소비자의 기호에 점차적으로 부합하지 못하고 있다. 또한, 상기에서 언급된 지방함량의 증가로 사료 낭비의 문제와 도살육의 지방 처분 문제가 심각하게 대두되고 있다. 그래서, 혈액내 TG 농도 증가의 저해는 일본내 목축산업과 양식업에서 특히 절박하게 필요하게 되었다.

최근에, 본 발명자들 중의 한 사람을 포함한 몇몇의 연구자들은 올리고 펩타이드 함유 물질을 개발하고 그를 특허출원하였으며(WO420979A1; 일본 특허 공고 제 5-87052호), 이와 유사한 기술은 일본 특허공개 제 2-145693호에 개시되어 있다. 또한, 특정 올리고펩타이드는 혈액내 TG 농도 증가의 저해 뿐만 아니라 지방대사를 개선시키는 효과를 가진다(Kyoichi Kagawa, Food Chemical Monthly, 6:80 (1900); Chizuko Fukuhama 등, FOLIA PHARMACOLOGICA JAPONICA, 97:38 (1991)).

상기 특허문헌에 개시된 올리고펩타이드 함유 물질은 단백질가수분해물의 혼합물로서, 실제 활성성분이 되는 물질의 아미노산 배열은 아직 밝혀지지 않고 있다.

이는 상기 펩타이드 함유 물질이 약물로서의 순도에 미흡하다는 것을 나타낸다. 더우기, 이 물질이 식품과 혼합될 때, 식품내의 다른 펩타이드로부터 이 물질을 정량적으로 분석한다는 것은 어려우며, 정성 조절(quality control)에도 문제가 된다. 따라서, 상기 펩타이드 함유 물질 중에서 활성성분으로서 혈액내 TG 농도의 상승을 저해하는 펩타이드를 확실하게 규명할 필요가 있다.

일본 특허공개 제 7-188284호에는 혈액내에서 트리글리세라이드 농도 증가를 저해하는 펩타이드 및 그를 함유하는 혈액내 트리글리세라이드 농도 증가 억제제가 개시되어 있을지라도, 전기 펩타이드나 억제제에 의한 혈액내 트리글리세라이드 농도 증가의 저해 효과는 아직 만족스럽지 못한 실정이다.

[발명의 개시]

본 발명의 목적은 활성성분으로 매우 높은 활성을 가지는 상기 펩타이드의 아미노산 배열을 분석하고, 전기 펩타이드를 활성성분으로 함유하는 혈액내 트리글리세라이드 농도 증가의 억제제; 혈액내에서 트리글리세라이드의 농도 증가를 저해하는 기능을 가진 기능성 식품; 및, 혈액내에서 트리글리세라이드의 농도 증가를 저해하는 기능을 가지는 사료를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상술한 목적을 만족시키기 위하여 예의 연구노력한 결과, 하기의 발명에 의해 그 목적이 성취되는 것을 확인하였다.

본 발명은 SEQ ID NO: 1에 개시된 아미노산 배열을 가지는 펩타이드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 1에 개시된 아미노산 배열을 가지는 펩타이드를 활성성분으로 함유하는 혈액내 트리글리세라이드 농도 증가 억제제, 건강식품 및 사료에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 펩타이드는 SEQ ID NO: 1에 개시된 아미노산 배열을 가진다.

이 펩타이드는 자연계의 단백질로부터 분리 및 정제될 수 있다. 또는, 이 펩타이드는 공지의 방법에 의해 화학적으로 합성되거나, 전기 펩타이드의 아미노산 배열을 암호화하는 염기배열을 가진 유전자를 제조하고 그를 적절한 발현벡터에 삽입하여 적당한 숙주에서 전기 유전자를 발현시키는 유전공학적 방법에의해 제조할 수도 있다.

본 발명의 펩타이드를 사용함으로써, 혈액내의 트리글리세라이드 농도 증가를 저지 또는 억제하는 것이 가능하다. 이러한 저지 또는 억제는 인간이나 동물의 고혈압, 동맥경화증과 같은 심혈관질환 뿐만 아니라, 비만과 고지혈증을 예방하거나 치료하는 것을 가능케 한다. 더우기, 본 발명의 펩타이드를 이용하여, 가축과 양식어류의 육질을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 혈액내 트리글리세라이드 농도 증가의 억제제, 비만의 예방 또는 억제제, 고지혈증의 예방 또는 치료제 등에 사용될 수 있다.

A. 본 발명의 펩타이드 제조 방법

본 발명의 펩타이드는 예를 들면, 후술하는 방법에 의해 얻을 수 있다.

A-1. 자연계의 단백질로부터 본 발명의 펩타이드를 분리 및 정제하는 방법

본 발명의 펩타이드를 제조하기 위한 원료가 되는 단백질은 어류 단백질, 어분말(fish powder), 글로빈 등과 같은 동물성 단백질, 또는 옥수수 단백질(zein), 콩 단백질, 등과 같은 식물 단백질이 널리 이용된다. 전기 단백질들 중에서 헤모글로빈 및 미오글로빈 등의 글로빈 단백질은 혈액내에서 TG 농도의 증가를 강력하게 저해한다는 점에서 특히 선호되고 있다. 글로빈 단백질은 여러 종류의 동물로부터 얻을 수 있는데, 소, 돼지, 양, 사람, 말 등의 혈액으로부터 광범위하게 얻을 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 제조하기 위하여, 첫째, 상기에서 언급된 단백질을 가수분해한다. 가수분해는 WO89/06970에서 기술된 방법에 따라 수행한다.

가수분해 도중에, 산성, 중성, 알카리성 단백질 가수분해효소로부터 선택되는 1종 이상의 가수분해효소를 사용한다.

글로빈 단백질을 가수분해하기 위해, 예를 들면, 5~30 중량%로 물에 글로빈 단백질을 분산시킨다. 이어, 이 혼합물에 산 또는 염기를 첨가하여 단백질가수분해효소의 최적 pH로 조정한 다음, 단백질가수분해효소(들)을 한 번에 또는 점차적으로 첨가하고 20~70℃에서 3~48시간 동안 반응시킨다.

그런 다음, 가수분해물은 건조시키고, 그 자체대로 또는 카르복시메틸 셀룰로오스나 덱스트린과 같은 충진제를 적당량 첨가하여 케이크 형태로 제조한다. 그리하여, 혈액내 TG 농도의 증가를 저해하는 단백질가수분해물을 얻을 수 있다. 이 단백질가수분해물은 본 발명의 펩타이드를 적어도 0.3 중량% 함유하고 있다.

이와 같이 얻은 단백질가수분해물은 공지의 방법에 따라 정제한다. 예를 들면, 본 발명의 펩타이드 함유 분획을 정제하기 위해, 이온교환, 한외여과, 역상 크로마토그래피 등이 적절히 조합되어 사용될 수 있다. 이온교환 또는 한외여과 크로마토그래피가 반드시 필요한 것은 아니지만, 이들 과정이 분리와 정제도를 향상시킨다는 점에서, 분리 및 정제 과정에 채용하는 것이 바람직하다. 역상 크로마토그래피는 산성과 중성의 역상 크로마토그래피를 수행하는 것이 바람직하다.

분획 내의 단백질 양은 공지의 방법 예를 들면, 닌히드린 방법에 의해 측정한다. 선택된 분획에 대한 아미노산 배열의 결정은 공지의 방법에 따라 수행함으로써, 본 발명의 펩타이드가 존재하는지를 확인한다.

이와 같이 분리된 분획에서 얻은 본 발명의 펩타이드는 혈액내 TG 농도의 상승을 저해하는 억제제의 활성성분으로 사용될 수 있다. 또한, 분획 자체가 상기 억제제의 활성성분으로 직접 사용될 수도 있다.

A-2. 화학적 합성에 의한 본 발명 펩타이드의 제조 방법

본 발명의 펩타이드는 공지의 펩타이드 합성법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 아자이드(azide)를 이용한 방법, 산 염화물(acid chloride)을 이용한 방법, 산 무수물(acid anhydride)을 이용한 방법, 혼합된 산 무수물(mixed acid anhydride)을 이용한 방법, DCC를 이용한 방법, 활성 에스테르(active ester)를 이용한 방법, 카보이미다졸(carboimidazol)을 이용한 방법, 산화-환원 방법(oxidation-reduction method) 및 DCC-첨가물(HOMB, HOBt, HOSu)을 이용한 방법(참조: Schreder & Luhke, “The peptide”, Vol. 1(1966), Academic Press, New York, USA; Izumiya et al., “Peptide Synthesis”, 1975, Maruzen Co., Ltd.) 등을 이용한다. 상기 펩타이드 합성법은 고체상 또는 액체상 합성법을 포함한다.

상기 펩타이드 합성시, 곁사슬 작용기(side-chain functional group)를 갖는 아미노산, 예를 들면 타이로신 및 트레오닌은 그의 작용기가 보호되는 것이 바람직하다. 이러한 보호를 위하여, 벤질옥시카보닐기(Cbz-), t-부톡시카보닐기(Boc-) 및 벤질기(Bz-) 등의 공지된 보호기를 사용할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 합성과정에서, 공지된 방법으로 보호기를 제거한다.

B. 혈액내 TG 농도 증가의 억제제

혈액내 TG 농도 증가의 억제제는 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 함유 분획(참조: 상기 A-1.)을 활성 성분으로 사용함으로써 제조될 수 있다.

전기 혈액내 TG 농도 증가 억제제의 제조시 사용되는 담체는 사용 형태에 따른 제제에 보통 사용되는 부형제(excipient)(충진제(filler), 증량제(extender), 결합체(binder), 흡수제(moistening agent), 봉해제(disintegrating agent), 계면활성제) 또는 희석제 등이 사용될 수 있다. 제형은 본 발명의 펩타이드를 유효한 양으로 포함하기만 하면 특별히 제한되지 않는다. 제형의 구체적인 예로서는 정제(tablet), 분말, 입자(granule) 및 환제(pill)와 같은 고체뿐만 아니라, 주사투여에 적합한 용액(solution), 현탁액(suspension) 및 유탁액(emulsion) 등을 포함한다. 또는, 본 발명의 약물은 사용 전에 적당한 담체를 첨가함으로써 액화될 수 있는 건조형태로도 제조될 수 있다. 전기 모든 약물은 당업계에서 공지된 방법으로 제조한다.

혈액내 TG 농도 증가 억제제의 투여량은 약물의 투여방법, 투여형태, 환자의 증세 등을 고려하여 적절히 선택한다. 일반적으로, 제제는 본 발명의 펩타이드를 0.001 내지 80 중량%의 농도로 포함하도록 제조하며, 바람직하기로는 성인 1인이 하루에 0.1 내지 10mg의 전기 펩타이드를 투여받을 수 있도록 제제를 투여한다. 제제를 반드시 하루에 한 번 투여할 필요는 없고, 하루에 3 내지 4번 나누어 투여할 수 있다.

상기에서 언급한 여러 형태의 약학적 제제는 제형에 따라 적합한 경로를 통하여 투여한다. 예를 들면, 주사에 적합한 형태의 제제는 정맥 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 피부내 주사 또는 복강내 주사 등으로 투여하며, 고체상의 경구 등으로 투여한다.

C. 건강 식품

혈액내 TG 농도의 증가를 저해하는 기능을 가진 건강 식품(소위, 기능성 식품)은 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 함유 분획(참조: 상기 A-1.)을 활성 성분으로 사용함으로써 제조될 수 있다. 그리고, 본 발명의 펩타이드는 일반식품의 첨가제로서 사용될 수 있다.

상기 일반식품의 종류는 구체적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 펩타이드가 첨가될 수 있는 기능성 식품은 우유, 푸딩, 카레요리(curry), 스튜(stew), 미트 소오스(meat sauce), 햄, 케이크 및 쵸코렛 등이 있다. 그 중에서, 풍미 때문에 펩타이드를 직접 섭취하지 않으려는 어린이에게 우유에 첨가하여 펩타이드를 섭취케 할 수 있으므로, 우유는 특히 유용하다. 아울러, 비만을 촉진시키는 케이크 및 쵸콜렉과 같은 식품에 본 발명의 펩타이드를 첨가하면, 전기 식품의 섭취로 인한 비만을 예방할 수 있다.

상기의 기능성 식품에 첨가되는 펩타이드의 양은 식품의 종류, 펩타이드의 첨가 목적, 식품의 섭취로 인한 기대 효과 등을 고려하여 적절히 선택한다. 일반적으로, 본 발명의 펩타이드는 한끼 식사당 0.5 내지 5mg의 펩타이드를 섭취할 수 있도록, 식품에 첨가하는 것이 바람직하다.

D. 사료

가축 등의 혈액내 TG 농도의 증가를 저해하는 기능을 가진 사료는 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 함유 분획(참조: 상기 A-1.)을 활성 성분으로하여 사료에 첨가함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 첨가하는 사료는 소, 돼지, 닭 등의 가축용 사료 및 바다도미(sea breams), 방어새끼(young yellowtails) 등의 양식어류용 사료를 포함하며, 특별히 한정되지 않는있다. 상기 사료에 첨가되는 펩타이드의 양은 사료의 종류, 사료의 섭취로 인한 기대효과 등을 고려하여 적절히 선택한다. 일반적으로, 0.01 내지 0.5중량%의 농도로 본 발명의 펩타이드를 사료에 첨가하는 것이 바람직하다.

상술한 혈액내 TG 농도 증가 억제제, 건강 식품 및 사료은 혈액내의 지질을 감소시키는 작용을 하므로, 이들의 투여는 인간 또는 동물의 비만과 고지혈증, 고혈압 및 동맥경화증과 같은 순환계질환을 예방하거나 치료할 수 있다. 더우기, 전기 사료의 투여는 가축과 양식어류의 육질을 증진시킨다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 글로빈 단백질가수분해물의 젤 크로마토그램을 나타낸다.

제2도는 실시예 1의 역상(산성) 크로마토그램을 나타낸다.

제3도는 실시예 1의 역상(중성) 크로마토그램을 나타낸다.

제4도는 위액 처치 전·후, 위액/췌장액 처치후의 VVYP, VYP 및 VTL의 역상 크로마토그램을 나타낸다.

[발명을 실시하기 위한 바람직한 태양]

본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명되며, 본 발명의 기술 범주가 이에 국한되지 않는다.

[참고예]

[글로빈 단백질가수분해물의 제조]

소의 적혈구를 이용한 글로빈 단백질가수분해물의 제조방법은 다음과 같다.

100kg의 신선한 소 적혈구에 물 250리터를 가하여 충분한 용혈반응이 일어나도록 한 다음, 인산으로 pH 2.8이 되게 조정하고, Aspergillus niger에서 분리한 산성 단백질분해효소를 2.6 ×10⁷units 첨가하여, 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다.

그런 다음, 반응액을 80℃에서 30분간 가열하여 반응을 종결시켰다.

이어, 수산화칼슘 용액을 첨가하여 pH 6.5로 조정하고, 규조토 6.5kg을 가하여 필터 프레스로 여과시켰다. 그 여액을 분무건조시켜 분말형의 글로빈 단백질 가수분해물 23kg을 얻었다. 이렇게 얻은 글로빈 단백질가수분해물의 분자량 분포는 하기의 조건에서 수행한 겔 여과 크로마토그래피로 측정하였다.

기기 : 고속액체크로마토그래피 (Shimazu Coup., 모델 LC-6A)

컬럼 : 폴리하이드록시에틸 A. (5㎛, 9.4 ×200mm, PolyC Inc.)

이동상 : 50mM 포름산

유속 : 0.5ml/min

검출 : 자외선 흡광(221nm)

상기 겔 여과 크로마토그래피로 측정하여 얻은 크로마토그램은 제1도에 나타내었다.

[실시예 1]

[혈액내 TG 농도의 증가를 저해하는 펩타이드의 분획 및 정제]

단백질에서 유래한 본 발명의 펩타이드는 (1) 이온교환, (2) 환외여과, (3) 산성 조건하의 역상 크로마토그래피에 의한 분리, (4) 중성 조건하의 역상 크로마토그래피에 의한 분리 방법을 이용하여 수득하였다.

(1) 이온교환

참고예에서 얻은 글로빈 단백질가수분해물 13.7g이 포함된 10중량% 수용액과 약산성의 양이온 교환 수지(Amberlite IRC₅₀, H⁺form; Japan Organo Co., Ltd.)를 혼합하고, 흡착을 유도하기 위하여 1시간 동안 흔들어준 다음, 흡착되지 않는 분획을 수득하였다.

(2) 한외여과

이온교환 방법으로 수득한 비흡착 분획을 교반형 한외여과 장치(stirring type ultrafiltration equipment; Advantec, Model UHP 90K)와 한외여과막(한외분자량 1000; Advantec, UIIH-1)을 이용하여 한외여과하고, 그 여액을 수득하였다.

수득한 여액 분획은 산 가수분해하여 닌히드린 방법에 의해 단백질을 정량하였다. 이때, 산 가수분해는 단백질 3~5mg을 최종 농도로 갖는 시험관에 6N HCl 1ml를 첨가하고, 대기압하에서 밀봉하여 110℃에서 22시간 동안 가열함으로써 이루어졌다. 닌히드린 방법은 다음과 같이 수행하였다: 가수분해후 시료의 pH를 수산화나트륨으로 5.0으로 조정하고, 0.2M 구연산 완충용액(pH 5.0)에 용해된 닌히드린 시약과 100℃에서 15분간 반응시킨 다음, 570nm에서의 흡광도를 측정하였다. 별도로, 수용성 L-루이신 용액(0.75, 150, 225, 300nmol/ml)을 닌히드린 시약과 반응시켜 측정한 흡광도로부터 표준 용액의 검정곡선을 얻었다. 이 검정곡선을 기준으로 L-루이신에 상당하는 아미노기가 시료에 존재하는 양을 계산하였는데, 그 결과를 후술하는 표 1에 나타내었다. 원료로 사용된 글로빈 단백질가수분해물에 대한 수율 또한 후술하는 표 1에 나타내었다.

(3) 역상(산성) 크로마토그래피

상기 한외여과로 얻은 용액은 다음과 같은 조건하에서 역상(산성) 크로마토그래피하였다.

기기 : 고속액체크로마토그래피 (Shimazu Corp., Model LC-10A)

컬럼 : SuperPac Pep-S(15㎛, 22.5 ×250mm, Pharmacia K.K.)

이동상 : 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유한 아세토니트릴 용액

구배 : 1%/분의 속도로 주입하며, 2% 내지 35% 전기 아세토니트릴 용액의 직선 농도구배를 수행

유속 : 5ml/분

온도 : 40℃

검출 : 220nm에서의 UV 흡광도

분획 A의 유지시간(retension time): 53.8 내지 54.5분

상술한 역상(산성) 크로마토그래피로 얻은 젤 크로마토그램은 제2도에 나타내었다.

수득한 분획은 산 가수분해하여 아미노산 분석함으로써 정량하였다. 이때, 산 가수분해는 단백질 3~5mg을 최종 농도로 갖는 시험관에 6N HCl 1ml를 첨가하고, 감압하에서 밀봉하여 110℃에서 22시간 동안 가열함으로써 이루어졌다. 아미노산 분석은 다음과 같은 조건하에서 수행하였다.

기기 : 고속액체크로마토그래피 (Shimazu Corp., Model LC-6A)

컬럼 : Shim-pack ISC-07/S1504 Na(7㎛, 4.0 ×150mm, Shimazu Corp.)

이동상 : 아미노산 이동상 키트(Na형, Shimazu Corp.)

유속 : 0.3ml/분

온도 : 55℃

반응용액 1 : 분석키트 OPA 시약(Shimazu Corp.)

검출 : 형광 흡광도(Ex 348nm, Em 450nm)

상기에서 산 가수분해된 용액은 농축하여 회전 증발기로 건조 및 케이크화하고, 감압하에서 12시간 이상 추가 건조시켜 HCl을 완전히 제거하였다. 그런 다음, 얻은 케이크는 0.2M 구연산 완충용액(pH 2.20)에 용해시켜 아미노산 함량이 약 100nmoles/ml 되도록 하고, 공경이 0.45㎛인 필터를 통과시켜 얻은 여액 10㎕를 컬럼에 주입하였다. 한편, 표준용액으로서, 18개 구성성분 H-형이 함유된 아미노산 혼합 표준 용액(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 0.2M 구연산 완충용액(pH 2.20)으로 25배 희석하고, 이 희석액의 10㎕를 컬럼에 주입하였다(각 아미노산 : 1nmol/10㎕).

아미노산의 피크면적은 Chromatopac C-R4A(Shimazu Corp.)을 이용하여 계산하였으며, 아미노산의 함량은 시료용액과 표준용액의 피크면적을 비교하여 계산하였다. 그 결과는 글로빈 단백질가수분해물에 대한 수율과 함께 후술하는 표 1에 나타내었다.

(4) 역상(중성) 크로마토그래피

상기 역상(산성) 크로마토그래피에서 용출된 활성분획은 다음과 같은 조건하에서 역상(중성) 크로마토그래피하였다.

기기 : 고속액체크로마토그래피 (Shimazu Corp., Model LC-10A)

컬럼 : SuperPac Pep-S(15㎛, 22.5 ×250mm, Pharmacia K.K.)

이동상 : 20mM 암모늄 아세트산 완충용액(pH6.5)을 포함한 아세토니트릴 용액

구배 : 0.5%/분의 속도로 주입하며, 0% 내지 25% 전기 아세토니트릴 용액의 직선 농도구배를 수행

유속 : 5ml/분

온도 : 40℃

분획 B의 유지시간 : 41.7 내지 43.2분

분획 C의 유지시간 : 45.8 내지 51.0분

상술한 역상(중성) 크로마토그래피로 얻은 젤 크로마토그램은 제3도에 나타내었다.

수득한 분획은 상기 (3)에서와 같이 정량분석하고, 아미노산 조성을 확인하였다. 아미노산 조성은 총 아미노산 함량에 대한 각 아미노산 함량의 비율로서 계산하였다. 그 결과, 분획 B 및 C는 각각 VTL(Val-Thr-Leu) 및 VVYP(Val-Val-Tyr-Pro)이었다. 헤모글로빈의 아미노산 배열과 전기 펩타이드의 아미노산 배열을 비교한 결과, 두가지 펩타이드 배열은 헤모글로빈 배열에 존재하는 것으로 확인되었다.

정량분석의 결과는 글로빈 단백질가수분해물에 대한 수율과 함께 후술하는 표 1에 나타내었다.

[표 1]

[실시예 2]

[SEQ ID NO : 1에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드의 합성]

Val-Val-Tyr-Pro은 SAM2 펩타이드 합성기(Blosearch Corp.)를 이용하여 프로토콜에 따라 합성하였다. 간단히 설명하면, 보호기를 가진 네 번째 아미노산(Boc-Pro-OH)의 수지 1g당 결합양이 0.3mmole인 아실옥시메틸 수지 2g을 전기 합성기의 반응기내에 넣고, 45v/v% 트리플루오로아세트산(TFA), 2.5v/v% 아니솔 및 52.5v/v% 메틸렌 클로라이드(DCM)를 함유한 용액을 첨가하여, 25분 동안 반응시켜 Boc기를 탈리시켰다. 이어, 수지는 DCM으로 세척하고, 10v/v% 디이소프로필에틸렌아민 함유 DCM 용액으로 중화시킨 다음, DCM으로 다시 세척하였다. 그런 다음, 디메틸 포름아마이드(dimethyl formamide: DMF)와 4mmol 디이소프로필 카보디이미드(diisopropyl carbodiimide)(각 6.7배 당량)를 포함한 DCM혼합용액 20ml로 상온에서 2시간 반응시켰다. Boc-Tyr(BrZ)-Pro-PAM 수지를 수득하기 위하여, DMF와 DCM으로 각각 세척하였다.

이어, 상기와 유사한 방법으로 Boc-Val-OH를 2번 커플링시켰다. 전기 커플링 산물인 보호된 펩타이드 수지는 10v/v% 아니솔을 포함한 무수 HF와 0℃에서 1시간 반응시키고, HF를 제거시킨 다음, 에테르로 세척하였다. 50% 아세트산을 이용하여 수득한 펩타이드와 수지의 혼합물로부터 펩타이드를 분리하였다. 분리한 펩타이드를 동결건조시켜 약 250mg의 조 펩타이드(crude peptide)를 얻었다.

조 펩타이드를 0.1% TFA에 용해시켜, ODS(octadecyl silica) 컬럼(Cosmosil 5C₁₈, 250 ×20mm; Nacalai Teaque Inc.)에 주입하고, 0.1% TFA 함유 아세토니트릴 20 내지 70%의 직선농도 구배(50분 소요, 10ml/분)로 용출시킨 결과, 원하는 펩타이드는 약 50% 아세토니트릴에서 용출되었다.

[시험예 1]

[화학합성된 펩타이드가 혈액내 TG 농도 증가의 억제에 미치는 영향] (생체내 조건)

먼저, 참고예 및 실시예 1의 이온교환과 한외여과를 통해 수득한 글로빈 단백질가수분해물(TG)이 혈청내 TG 농도 증가를 억제하는 정도를 하기와 같이 측정하였다.

올리브 오일(10g/kg 체중)과 수용성 펩타이드 용액(0.3ml/마우스)을 에멀젼 형태로 주사기내에서 혼합한 다음, 밤새 금식시킨 웅성 ICR 마우스(6주령, 체중: 25~28g)에 경구 투여하였다. 2시간 경과후, Nembutal로 마취시키고 하대정맥에서 혈액을 채취하여, 혈청내 TG 양을 측정하였다(트리글리세라이드 G Testwaco; Waco Pure Chemical Industries, Ltd.). 투여량에 따른 반응곡선은 펩타이드의 투여량과 TG 억제율로서 표시하였으며, 50% 억제에 필요한 펩타이드 투여량 즉, ID₅₀값을 계산하였다. 이 값은 동일한 방법으로 측정한 글로빈 단백질가수분해물(GD)의 활성과 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

상기 표 2로부터, GD의 혈청 TG 농도 증가 억제능은 GD가 이온교환과 유리 아미노산 제거를 위한 한외여과를 거치면, 그의 활성이 증진됨을 알 수 있었다.

다음으로, 실시예 2에서 합성한 SEQ ID NO: 1에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드(VVYP), 실시예 2와 동일한 방법으로 합성한 VYP(Val-Tyr-Pro) 및 VTL(Val-Thr-Leu), 참고예에서 얻은 글로빈 단백질가수분해물(GD)이 혈청내 TG 농도 증가를 억제하는 정도를 하기와 같이 측정하였다.

올리브 오일(18g/kg 체중)을 밤새 금식시킨 웅성 ICR 마우스(6주령, 체중: 25~28g)에 경구 투여하였다. 1시간 경과후, 상기 펩타이드 수용액(0.3ml/마우스)을 경구 투여하고 다시 1시간 경과후, Nembutal로 마취시키고 하대정맥에서 혈액을 채취하여, 혈청내 TG 양을 측정하였다(트리글리세라이드 G Testwaco; Waco Pure Chemical Industries, Ltd.). 투여량에 따른 반응곡선은 펩타이드의 투여량과 TG 억제율로서 표시하였으며, 50% 억제에 필요한 펩타이드 투여량 즉, ID₅₀값을 계산하였다. 각 펩타이드의 활성은 서로 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

상기 표 3에서 보듯이, 비 활성(mg 단백질에 대한 비율)은 VVYP에서 6500, VYP에서 1130, VTL에서 448이었다. 전기 3가지 펩타이드 모두는 GD의 비활성보다 월등히 높은 비 활성을 나타내었다. 그들 중에서, VVYP가 GD의 6500배에 달하는 가장 높은 비 활성을 나타내었다.

상술한 결과로부터, 글로빈 단백질가수분해물에 존재하는 지방흡수 억제능을 갖는 활성성분은 펩타이드 VVYP일 것으로 예측되었다.

[시험예 2]

[혈액내 TG 농도의 증가를 저해하는 화학합성 펩타이드의 소화효소에 대한 안정성(실험실적 조건)]

실시예 2에서 합성한 SEQ ID NO: 1에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드(VVYP), 실시예 2와 동일한 방법으로 합성한 VYP((Val-Tyr-Pro) 및 VTL(Val-Thr-Leu)의 소화효소에 대한 안정성을 실험실적 조건에서 테스트하였다.

간단히 설명하면, 0.1N HCl에 용해된 상기 펩타이드 VVYP, VYP 및 VTL용액 127.5ml에, 0.1N HCl에 용해된 펩신 용액(인공 위액, 0.67mg/ml) 22.5ml를 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 이어, 0.5N 붕산 완충용액(pH 8.0) 30ml에 용해된 판크레아틴 용액(인공 췌장액, 0.53mg/ml) 75ml를 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 인공 위액에 의한 소화가 진행되지 않은 시료, 인공 위액에 의한 소화가 진행된 후의 시료 및 인공 췌장액에 의한 소화가 진행된 후의 시료는 다음의 조건에서 분석하였다.

기기 : HPLC(Waters; LC Modulel)

컬럼 : SuperPac Pep-S(5㎛, Pharmacia K.K.)

이동상 A : 0.1% 트리플루오로아세트산

B : 아세토니트릴 수용액(50:50, 0.1% 트리플루오로아세트산 함유)

유속 : 0.8ml/분(VYP, VTL), 0.4ml/분(VVYP)

검출 파장 : 220nm

온도 : 상온

주입량 : 50배 희석액 20㎕

상술한 HPLC로 얻은 역상 크로마토그램은 제4도에 나타내었다.

유지시간 및 피크 면적은 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4]

제4도 및 표 4에서 보듯이, VTL의 피크는 인공 위액에 의한 소화후 사라지지만, VYP 및 VVYP의 피크는 인공 췌장액에 의한 소화후에도 그대로 남아있음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 VVYP는 소화관 루멘(lumen) 뿐만 아니라 소장 점막 세포로 이동하며, 이러한 순환은 소화관내에서 전기 펩타이드가 소화효소에 의한 분해없이 그의 활성을 나타냄을 의미한다.

[시험예 3]

[본 발명 펩타이드의 독성 분석]

실시예 2에서 합성한, SEQ ID NO : 1에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드 VVYP는 체중 kg당 10g 이상(최대 투여 가능량)의 양으로 웅성 및 자성 ICR 마우스에 경구 투여하였다. 그 결과, 치사는 없었다.

[실시예 3]

[본 발명의 펩타이드를 함유하는 식품의 제조]

(1) 분유의 제조

혈액내 TG 농도의 증가를 저해하는 활성을 지닌 분유는 유아용 분유 100g에, 실시예 2에서 합성한 SEQ ID NO : 1에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드 VVYP 100mg을 첨가하여 제조하였다.

(2) 쵸콜렛의 제조

혈액내 TG 농도의 증가를 저해하는 활성을 지닌 쵸콜렛은 쵸콜렛 100g에, 실시예 2에서 합성한 SEQ ID NO : 1에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드 VVYP 50mg을 첨가하여 제조하였다.

[실시예 4]

[본 발명의 펩타이드를 함유하는 사료의 제조]

비타민, 미네랄 등을 포함하는 프리믹스에, 실시예 2에서 합성한 SEQ ID NO : 1에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드 VVYP를 0.1중량%로 첨가하였다. 이 혼합물을 양식어류용 상업용 사료에 10중량%로 첨가하여, 혈액내 TG 농도의 증가를 저해하는 활성을 지닌 양식어류용 사료를 제조하였다.

[산업상 이용가능성]

본 발명에서는 혈액내 트리글리세라이드의 농도 증가를 저해하는 펩타이드; 전기 펩타이드를 활성성분으로 함유하는 혈액내 트리글리세라이드 농도 증가 억제제; 혈액내에서 트리글리세라이드의 농도 증가를 저해하는 기능을 가진 건강식품(기능성 식품); 및, 혈액내에서 트리글리세라이드의 농도 증가를 저해하는 기능을 가지는 사료가 제공된다. 이러한 물질을 사용하므로써, 인간이나 동물의 비만과 고지혈증 뿐만 아니라, 고혈압, 동맥경화증과 같은 심혈관 질환을 예방하거나 치료할 수 있다. 더우기, 가축과 양식어류의 육질을 개선시킬 수 있다.

[서열표]

Claims

서열번호 1(SEQ ID NO : 1)에 개시된 아미노산 배열을 가지는 펩타이드.
서열번호 1(SEQ ID NO : 1)에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 활성 성분으로 함유하는 혈액내 트리글리세라이드 농도 증가의 억제제.
서열번호 1(SEQ ID NO : 1)에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 활성 성분으로 함유하여, 혈액내 트리글리세라이드 농도의 증가를 저해하는 기능을 가지는 건강식품.
서열번호 1(SEQ ID NO : 1)에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 활성 성분으로 함유하여, 혈액내 트리글리세라이드 농도의 증가를 저해하는 기능을 가지는 사료.
서열번호 1(SEQ ID NO : 1)에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 예방이나 치료에 유효한 양으로 인간을 제외한 척추동물에 사용하는 단계를 포함하는, 혈액내 트리글리세라이드 농도의 증가를 예방하거나 억제하는 방법.
서열번호 1(SEQ ID NO : 1)에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 예방이나 치료에 유효한 양으로 인간을 제외한 척추동물에 사용하는 단계를 포함하는, 비만을 예방하거나 억제하는 방법.
서열번호 1(SEQ ID NO : 1)에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 예방이나 치료에 유효한 양으로 인간을 제외한 척추동물에 사용하는 단계를 포함하는, 고지혈증을 예방하거나 치료하는 방법.
서열번호 1(SEQ ID NO : 1)에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 활성 성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 억제제.
서열번호 1(SEQ ID NO : 1)에 개시된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 활성 성분으로 함유하는 고지혈증의 예방 또는 억제제.