WO1997035875A1

WO1997035875A1 - Peptide destine a inhiber l'elevation du taux de triglycerides dans le sang et agent d'inhibition contenant ce peptide en tant qu'ingredient actif

Info

Publication number: WO1997035875A1
Application number: PCT/JP1996/001570
Authority: WO
Inventors: Kyoichi Kagawa; Hisako Matsutaka; Chizuko Fukuhama; Hiroaki Fujino; Masahiro Numata; Kazuhisa Honda; Toyoo Nakamura
Original assignee: Hankyu Kyoei Bussan Co., Ltd.; Itoham Foods Inc.
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1996-06-10
Publication date: 1997-10-02
Also published as: EP0838473A1; ATE225803T1; AU690853B2; AU5912096A; ES2184865T3; DK0838473T3; NO325836B1; US5958885A; NO975360L; CA2221767C; JP2805194B2; EP0838473A4; CA2221767A1; NO975360D0; KR100264344B1; KR19990021880A; JPH09255698A; EP0838473B1

Description

明細書血中トリグリセリド濃度上昇抑制べプチド及び当該べプチドを有効成分として含む血中トリグリセリド澳度上昇抑制剤技術分野

本発明は、新規の血中トリグリセリド濃度上昇抑制ペプチド並びに当該べプチドを有効成分として含む血中卜リグリセリド濃度上昇抑制剤、血中トリグリセリド濃度上昇抑制機能を付与した特定保健用食品（いわゆる機能性食品）及び血中トリグリセリド澳度上昇抑制機能を付与した飼料に関する。背景技術

脂肪や糖質を過剰に摂取すると肥満や高脂血症の原因となることが知られている。そして高脂血症における血中トリグリセリド（以下、 T Gと記載することがある）濃度の上昇は、高血圧症や動脈硬化症を引き起こす原因となるといわれている。そこで、 T Gの血中濃度の上昇を抑制して肥満や高脂血症を改善する試みが多くなされている。

現在、 T Gの血中濃度の上昇を抑制するために、食事制限やダイエツト食（例えば、低エネルギー食（L C D ) や超低エネルギー食（V L C D ) ) の摂取、さらには各種の医薬品の投与が行われている。このような医薬品としては、例えば血中リポ蛋白リパーゼ活性を高めるデキス卜ラン硫酸、脂質吸収を抑制するニコモール、脂質代謝改善剤であるクロフィブラートゃブラパスタチン等が用いられている。

しかし、食事制限はそれをする者にとって苦痛であり、また上記医薬品の投与による副作用の惹起も懸念されている。よって、より強力な血中 T G濃度の上昇抑制効果を有し、かつ副作用が起こることが懸念されない血中 T G濃度上昇抑制剤の開発が待たれている。

一方、家畜や養殖魚に対しては、現在、成長の促進を企図して濃厚飼料が与えられている。その結果として、これらの家畜や養殖魚中においても脂肪代謝異常が起こり、血中 T Gの澳度が上昇する傾向にある。この血中 T G濃度の上昇により家畜や養殖魚中の脂肪含有率が過剰になるため、これらを食することは脂肪摂取過多の原因となる。その上、味覚の点でも消費者の嗜好に合わなくなつてきている。また、これらの脂肪含有率の増加は飼料の浪費問題、ひいては屠体に付着した脂肪の廃棄問題等にも関連する重要な問題である。よって血中の T Gの上昇を抑制することは、特に我が国の畜産界ゃ水産界にとって急務となっている。最近では、本発明者の一人が加わって開発したオリゴぺプチド含有物についての出願がされ（国際特許番号 W0420979A1 ，特公平 5-87052 号公報）、それに類似した技術が特開平 2- 154693号公報に記載されている。また、ある種のオリゴぺプチドが血中 T Gの上昇抑制効果を含む脂質代謝改善効果を有することが明らかにされている（香川恭一：月刊フードケミカル， 6， 80(1990), 福浜千津子等：日本薬理学雑誌， 97, p38 (199D ) 。

上記の出願公報等において開示されたオリゴぺプチド含有物は、その組成が蛋白質の分解物の混合物であり、真の有効成分、すなわち有効成分としてのぺプチドのァミノ酸配列は明らかにされていない。

このことは、当該べプチド含有物を医薬品として応用するには純度が低いことを示唆するものである。さらに、食品に配合した場合には食品中のペプチドと区別して定量することが困難であり、品質管理上の問題がある。そのため、当該べプチド含有物の真の有効成分、すなわち有効成分としての血中 T G濃度上昇抑制ぺプチドを探索する必要がある。

なお、特開平 7- 188284号公報には、血中トリグリセリド濃度上昇抑制べプチド及び当該べプチドを有効成分として含む血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤が記載されている力 \ これらのペプチド又は抑制剤による血中卜リグリセリド濃度上昇抑制効果は、依然として十分ではなかった。発明の開示

従って、本発明の課題は、上記有効成分として活性の高いぺプチドのァミノ酸配列を解析すること、並びに当該べプチドを有効成分として含む血中 T G濃度上昇抑制剤、血中 T G濃度上昇抑制機能を付与した機能性食品及び血中 T G濃度上昇抑制機能を付与した飼料を提供することである。

本発明者は上記課題の解決のために鋭意検討した結果、以下の発明により上記課題が解決され得ることを見出した。

すなわち、本発明は、配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。

また、本発明は、配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む血中卜リグリセリド濃度上昇抑制剤、特定保健用食品及び飼料である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のぺプチドは、配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるものである

。このペプチドは、自然界に存在する蛋白質から分離精製することもできるし、公知の方法により直接化学合成することもできる。また、上記ペプチド配列に対応した塩基配列を有する遺伝子を調製してこれを適切な発現ベクターに組み込んで、当該遺伝子を適切な宿主中で発現させることにより本発明のぺプチドを調製することもできる。

本発明のペプチドを用いることにより、血中トリグリセリド濃度の上昇を予防又は抑制することができ、それによつて人若しくは動物の肥満や高脂血症及びそれらに伴う高血圧症や動脈硬化症等の循環器系疾患の予防や治療が可能となる。さらには、家畜や養殖魚の肉質の改善を図ることもできる。

このような本発明のペプチドは、血中トリグリセリド澳度上昇抑制剤、肥満の予防又は抑制剤、高脂血症の予防又は治療剤等として使用することができる。

A . 本発明のぺプチドの製造法

本発明のぺプチドは、例えば以下のような方法により得ることができる。 A-1. 自然界に存在する蛋白質から本発明のぺプチドを分離精製する方法本発明のペプチドの原材料としては、魚肉蛋白、魚粉、グロビン等の動物性蛋白質；コーン蛋白質（ゼイン）、大豆蛋白質等の植物性蛋白質等を広く用いることができる。これらの蛋白質の中でも、ヘモグロビンやミオグロビン等のグロビン蛋白は、血中 T G濃度の上昇を抑制するという所期の効果を強く奏し得るという点において特に好ましい。このグロビン蛋白の提供源である動物の種類は特に限定されず、ゥシ、ブ夕、ヒッジ、ヒト、ゥマ等の血液を広く用いることができる

本発明のペプチドを得るには、まず上記蛋白質を加水分解する。この加水分解に関する操作等は、前出の国際公開番号 W089/06970 公報記載の方法に従って行うことができる。このとき、例えば酸性プロテア一ゼ、中性プロテアーゼ又はァルカリ性プロテア一ゼの 1種若しくは 2種以上の加水分解酵素を用いることがでさ。

グロビン蛋白を加水分解するには、例えば、まずグロビン蛋白含有物を固形分として水に 5〜30重量％になるように分散させ、酸若しくはアル力リによってプ口テア一ゼの至適 pHに調整し、プロテアーゼを一度に若しくは逐次的に添加して、 20〜70°Cの温度で 3〜48時間、当該酵素を反応させればよい。

得られた蛋白分解物は、そのまま又は当該蛋白分解物にカルボキシメチルセルロース若しくはデキストリン等の増量剤を適量加えて、乾燥 '固化する。このようにして、血中 T G濃度上昇抑制効果を有する蛋白分解物を得ることができるが、この蛋白分解物は本発明のぺプチドを最低でも 0. 3重量％含有する。

次に、得られた蛋白分解物の精製を行う。この精製工程は公知の精製工程を採用することができる。例えば、イオン交換樹脂法、限外濾過法、逆相クロマトグラフィ一法等を適宜組み合わせて、本発明のぺプチドを包含するフラクションを精製することができる。ィォン交換樹脂法や限外濾過法による操作は必ずしも必須のものではないが、分離 ·精製度を向上させ得るという観点から分離 ·精製ェ程に組み入れるのが好ましい。また、逆相クロマトグラフィーは、酸性下における逆相クロマトグラフィ一と中性下における逆相クロマトグラフィ一とを組み合わせて行うのが好ましい。

フラクション中の蛋白量は、公知の蛋白定量法、例えばニンヒドリン法等によつて測定することが可能である。また、選別したフラクションのアミノ酸配列は、公知の方法により同定することができ、それによつて本発明のペプチドの存在を確認することができる。

このように分離したフラクションに由来する本発明のぺプチドは、血中 T G濃度上昇抑制剤の有効成分として用いることができる力く、フラクション自体も直接血中 T G濃度上昇抑制剤の有効成分として用いることができる。

A-2. 化学合成により本発日 jのペプチドを製造する方法

本発明のぺプチドは、公知のぺプチド合成法によって化学合成することもできる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、 DCC法、活性エステル法、カルボイミダゾ一ル法、酸化還元法、 DCC-アディディブ（H0M B，H0B t, HOSu)法（「ザペプチド（The Pep t i de) 」第 1巻（1966年）， Schreder & し uhke 著， Academi c Press, New York, USA；あるいは「ペプチド合成」泉谷ら著，丸善株式会社（1975年）等）等のペプチド合成法を例示することができる。これらのぺプチド合成法は、固相合成法又は液相合成法のいずれによっても行うことができる。

上記ペプチド合成法では、側鎖官能基を有するアミノ酸、例えばチロシンゃスレオニンは、当該側鎖官能基を保護しておくのが好ましい。保護基としては、公知の保護基、例えばべンジルォキシカルボニル基（Cbz -)、 t -ブトキンカルボニル基（Boc -)、ベンジル基（Bz- ) 等を用いることができる。この保護基は、本発明のぺプチドの合成工程において、公知の方法により脱保護を行うことができる。

B . 血中 T G濃度上昇抑制剤

本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含むフラクション（A- 1 節参照）を有効成分として、血中 T G濃度上昇抑制剤を調製することができる。

血中 T G濃度上昇抑制剤の担体としては、使用形態に応じた製剤を調製するのに慣用される充塡剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤等の陚形剤ないしは希釈剤をいずれも使用できる。製剤組成形態は、それが本発明のぺプチドを効果的に含有する形態であれば特に限定はなく、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤であってもよいし、液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態とすることもできる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることもできる。これらはいずれも常法に従い調製できる。

このようにして得られる血中 T G濃度上昇抑制剤の投与量は、当該製剤の投与方法、投与形態、投与する患者の症状等に応じて適宜選択される。一般には、本発明のぺプチドを約 0. 001〜80重量％程度を含有する製剤形態に調製して、当該製剤に含有される本発明のペプチドの量が 1 日成人一人当り、約 0. lmg〜10mg程度となる範囲で投与するのが好ましい。なお、当該投与は必ずしも 1 日 1回である必要はなく 1 日 3〜4回に分割して投与することも可能である。

上記各種形態の医薬製剤は、その形態に応じた適切な投与経路、例えば注射剤形態においては、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により、固剤形態の医薬製剤は、経口投与等により投与され得る。

C . 特定保健用食品

本発明のぺプチド又は本発明のぺプチドを含むフラクシヨン（A- 1 節参照）を有効成分として、血中 T G濃度上昇抑制機能を付与した特定保健用食品（いわゆる機能性食品）を調製することができる。また、本発明のペプチドを一般食品の食品添加物として用いることもできる。

上記食品の種類としては特に限定されず、ミノレク、プリン、カレー、シチュー、ミートソース、ハム、ケーキ、チョコレート等に適用することが可能である。特にミルクは、小児が直接摂取することが味覚の点で困難である本発明のぺプチドの摂取を容易にし得るという点において好ましい。また、本発明のペプチドをケーキ、チョコレート等の本来的に肥満を助長する食品に添加することは、当該食品の摂取による肥満を予防し得るという点において好ましい。

本発明のペプチドの上記食品中における配合量は、食品の種類、添加する目的、当該食品の摂取によって期待する効果等に応じて適宜選択される。一般には、本発明のぺプチド換算で一食当たり 0. 5mg〜5 mg程度の摂取が可能な程度に、本発明のぺプチドを上記食品中に含有させるのが好ましい。

D . 飼料

本発明のぺプチド又は本発明のぺプチドを含むフラクシヨン（A- 1 節参照）を飼料に配合することによって、家畜等の血中 T G濃度の上昇抑制能が付与された飼料を調製することができる。

本発明のペプチドが配合される飼料は、牛、豚、鶏等の家畜用飼料であってもよいし、タイ、ハマチ等の養殖魚用飼料であってもよく、特に限定されない。本発明のペプチドの飼料中への配合量は、飼料の種類や、当該飼料の摂取により期待される効果等に応じて適宜選択される。一般には、飼料中に本発明のペプチド換算で 0. 01〜0. 5 重量％の割合で配合するのが好ましい。以上説明した本発明の血中 T G濃度上昇抑制剤、特定保健用食品及び飼料は脂血清浄作用を有するため、それらの投与により、人若しくは動物の肥満や高脂血症及びそれらに伴う高血圧症や動脈硬化症等の循環器系疾患の予防や治療が可能になり、さらには、家畜や養殖魚の肉質の改善が可能になる。図面の簡単な説明

図 1は、グロビン蛋白分解物のゲルクロマ卜グラムである。

図 2は、実施例 1における逆相（酸性）クロマトグラムである。

図 3は、実施例 1における逆相（中性）クロマトグラムである。

図 4は、胃液処理前、胃液処理後、胃液 Z脬液処理後における V V Y P、 V Y P 及び V T Lの逆相クロマトグラムである。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例等を記載して本発明をさらに具体的に説明する。ただし本発明の技術的範囲が本実施例等によって限定されるものではない。

〔参考例〕グロビン蛋白分解物の製造

以下にゥシ赤血球を用いたグロビン蛋白分解物の製法の詳細を示す。

新鮮なゥシ赤血球 100kg に水 250リットルを加えて充分溶血させ、リン酸を加えて pHを 2. 8に調整した後、ァスペルギルス ·ニガ一の酸性プロテアーゼ 2. 6 X 10⁷単位を添加し、 50°Cで 3時間反応させた。

反応後、反応液を 80°Cで 30分間加熱して反応を停止させた後、水酸化カルシゥムの水懸濁液を加えて pHを 6. 5に調整し、硅藻土 10kgを加え、フィルタープレスを用いて濾過し、得られた濾液を噴霧乾燥して、グロビン蛋白分解物の粉末 23kg を得た。得られたグロビン蛋白分解物の分子量分布は、ゲル濾過クロマトグラフィ一法を用いて調べた。当該クロマトグラフィ一は以下の条件で実施した。

高速液体クロマトグラフ（（株）島津製作所， LC-6A型）カラム Po l yHYDROXYETHYL A, 5 m， 9. 4 x 200画， Po l yC I nc製

溶出溶媒 50mMギ酸

流速 0. δπιΐΖ分検出：紫外吸収 221nm

上記ゲル濾過クロマトグラフィ一法によるグロビン蛋白分解物のゲルクロマ卜グラムを図 1に示す。

〔実施例 1〕血中 T G濃度上昇抑制べプチドの分画精製

蛋白質由来の本発明のペプチドは、以下の（1)イオン交換、（2)限外濾過、（ 3)酸性下における逆相カラムクロマトグラフィーによる分離、及び（4)中性下における逆相クロマトグラフィ一による分離という手順を経ることにより得られた

(1) イオン交換

参考例で得られたグロビン蛋白分解物 13. 7 gの 10重量％水溶液を、弱酸性陽ィオン交換樹脂（アンバーライ卜 IRC ₅。， H ⁺ 型，オルガノ（株））に加え、 1時間携拌して吸着させた後、未吸着画分を得た。

(2) 限外濾過

イオン交換処理により得られた未吸着画分について、攪拌型限外濾過装置（ァドバンテック（株）製， UHP 90K) 及び限外濾過膜（アドバンテック（株）製， U I IH- 1 , 分画分子量 1000) を用いて限外濾過を行い、残液を採取した。

得られた画分は、酸加水分解した後ニンヒドリン法を行うことにより定量した。酸加水分解は、蛋白量 3〜5 mgに対して、最終濃度 6 N 塩酸 l mlを試験管に入れ、常圧下にて封管し、 110°Cで 22時間加熱することにより行った。また、ニンヒドリン法は次のようにして行った。すなわち、加水分解後の検体を水酸化ナトリウムにより PH5. 0に調整し、 0. 2Mクェン酸緩衝液（pH5. 0)を含有したニンヒドリン試薬を用いて 100°Cで 15分間反応させ、 570mnにおける吸光度を測定した。別に、標準溶液としていロイシン水溶液（0. 75， 150， 225, 300nmo l/ml ) についてニンヒドリン反応を行い、得られた吸光度から検量線を求め、検体のい口イシン相当アミノ基量を算出した。定量した結果を表 1に示す。また、原料として用いたグロビン蛋白分解物に対する収率を併せて表 1に示す。

(3) 逆相（酸性）クロマトグラフィ

限外濾過で得られた残液について、以下の条件で逆相（酸性）クロマトグラフィを行った。

装置：高速液体クロマートグラフ（（株）島津製作所， LC- 10A 型）カラム： SuperPac Pep-S, 15 urn, 22.5 x 250mm, フアルマシア（株）製溶出溶媒： 0.1%卜リフルォロ酢酸含有ァセ卜二トリル水溶液

グラジェント：ァセトニトリル濃度 2 %から 35%まで直線的濃度勾配

ァセトニトリル濃度変化 1 %Z分

流速 5 mlノ分

温度 40°C

検出紫外吸収 220nm

分取時間 53.8〜54.5分 (画分 A)

上記逆相（酸性）クロマトグラフィによるゲルクロマトグラムを図 2に示す。得られた画分は、酸加水分解した後ァミノ酸分析を行うことにより定量した。酸加水分解は、蛋白量 3〜5mgに対して、最終濃度 6 N 塩酸 1 mlを試験管に入れ、減圧下にて封管し、 110°Cで 22時間加熱することにより行った。また、ァミノ酸分析は以下の条件で次のようにして行った。

高速液体クロマトグラフ（（株）島津製作所， LC-6A型）カラム Shim-pack ISC-07/S1504 Na, 7 zm, 4.0x150麵，（株）島津製作所製

溶出溶媒島津製作所（株）製アミノ酸移動相キッ卜（Na型）

流速 0.3 ml/分

温度 55°C

反応液 1 島津製作所（株）製分析キット 0PA 試薬

検出蛍光吸収（Ex 348nm, Em 450nm)

酸加水分解した溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固し、さらに減圧下で 12時間以上乾燥させ、完全に塩酸を除去した。次に、各アミノ酸含量が 10 0 nmolZml程度となるように 0.2Mクェン酸緩衝液（pH2.20) に溶解し、 0.45〃m フィルター濂液を 10^1 注入した。一方、檩準溶液としては、ァミノ酸混合標準液 18成分 H型（和光純薬工業（株））を 0.2Mクェン酸緩衝液（PH2.20) により 25 倍希釈後、 10 1 注入した（各アミノ酸 1 nmolZlO〃 1 ) 。アミノ酸のピーク面積算出をクロマトパック C-R4A( (株）島津製作所製）により解析し、標準溶液とのピ一—ク面積比によりアミノ酸量を算出した。結果を表 1 に示す。また、グロビン蛋白分解物に対する収率を併せて表 1に示す。

(4) 逆相（中性）クロマトグラフィ

逆相（酸性）クロマトグラフィで溶出し、分取した画分について、さらに以下の条件で逆相（中性）クロマトグラフィを行った。

装置：高速液体クロマ卜グラフ（（株）島津製作所， LC- 10A型）カラム： SuperPac Pep- S， 15 ^ m, 22. 5 x 250mm, フアルマシア（株）製溶出溶媒： 20mM酢酸ァンモニゥム緩衝液（PH6. 5)含有ァセトニトリル水溶液グラジェント：ァセトニトリル濃度 0 %〜25%まで直線的濃度勾配

ァセトニトリル濃度変化 0. 5%/分

流速： δ ηιΐΖ分

温度： 40°C

検出：紫外吸収 220nm

分取時間： 41. 7分〜 43. 2分（画分 B )

45· 8分〜 51. 0分（画分 C )

上記逆相（中性）クロマ卜グラフィによるゲルクロマトグラムを図 3に示す。得られた画分は、上記（3) と同様にして定量するとともに、さらに同定を行つた。アミノ酸組成は、得られたアミノ酸含量の合計に対する各アミノ酸量の比率により算出した。その結果、画分 Bは V T L (Val -Thr-Leu) 、画分 Cは V V Y P (Val -Val -Tyr-Pro) であることが分かった。これらをヘモグロビンのァミノ酸配列と照合したところ、いずれの配列も存在することが確認された。

定量した結果は、グロビン蛋白分解物に対する収率と併せて表 1に示す。表 1

蛋曰重量収率

ぺプチド

(g) (%)

グロビン蛋白分解物 13. 7 100 イオン交換 +限外據過 4. 24 30. 9 逆相クロマ卜グラフィ一

[画分 A] 0. 39 0. 28

[画分 B ] VT L 0. 009 0. 06

[画分 C ] VVY P 0. 006 0. 04

〔実施例 2〕配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドの合成 SAM2ペプチド合成装置（B i osearch社製）により、同装置のプロ卜コールに従つて Va卜 Va卜 Tyr- Proを合成した。すなわち、 1 gあたり 0. 3 麵 olの 4番目の保護アミノ酸 Boc-Pro- 0Hを結合したァシルォキシメチル樹脂 2 gを上記べプチド合成装置の反応容器にセッ卜し、 45v/v %トリフルォロ酢酸（TFA) 、 2. 5v/v%ァニソール及び 52. 5v/v %塩化メチレン（DCM) を含むデブロック液と 20分間接触させて、 Boc 基を除いた。 DCM による洗浄の後、 10v/v %ジイソプロピルエチレンアミンを含む DCM によって樹脂を中和し、これをさらに DCM により洗浄した。その後、 4. Ommol のジイソプロピルカルポジイミド（それぞれ理論当量の 6. 7 倍）を含む 20mlの DCM とジメチルホルムアミド（DMF) の混合液中で 2時間室温にて反応させた。上記 DMF と DCM で順次洗浄して、 Boc- Tyr(BrZ)- Pro- PAM樹脂を得た。同様の工程に従って、 Boc-Va卜 0Hを 2回カップリングした。このようにカップリングした保護ペプチド樹脂を、 ΙΟν/ν %ァ二ソールを含む無水フッ化水素中、 0 °Cで 1時間反応させた後、フッ化水素を留去してエーテルによる洗浄を行った。得られたペプチド及び樹脂の混合物から、 50%酢酸でペプチドを抽出し、凍結乾燥によって約 250mgの粗べプチドを得た。

当該粗ペプチドを 0. 1 %TFA に溶解した後、ォクタデシルシリカ（0DS) カラム (Cosmos i l 5C , a , 250 x 20ram: ナカライテスク社製）により、 0. 1 %の TFA を含むァセトニトリルの直線的濃度勾配（ 20〜70%ノ50 分， 10ml/分）にて展開した。目的とするぺプチドは、ァセトニトリルの '濃度約 50%にて溶出された。〔試験例 1〕血中 TG濃度上昇抑制ペプチド（化学合成品）の効果（in vivo) はじめに、参考例で得られたグロビン蛋白分解物（GD) と、実施例 1でィォン交換及び限外濾過を行って得られた画分について、以下のようにして血清 TG 上昇抑制作用を調べた。

ォリーブ油 lOgZkg体重及びペプチド水溶液（0.3 ml/mouse) を注射筒内で混合し、軽いミセルを形成した後、一夜絶食した ICR 系雄性マウス（ 6週齢，体重 25~28g) に経口投与した。 2時間後、ネンブタール麻酔下で腹部大静脈から採血を行い、血清 TG濃度を測定した（卜リグリセライド Gテストヮコ一，和光純薬工業製）。ペプチド投与量と TG値から用量反応曲線を求め、 50%抑制量 1 Deo を算出し、同様にして測定したグロビン蛋白分解物（GD) の活性と比較した。結果を表 2に示す。表 2

ペプチド (mg蛋白/ mouse) 比活性

グロビン蛋白分解物 26 1

イオン交換 +P艮外據過 13 2

表 2より、 GDをイオン交換処理後、限外濾過により遊離アミノ酸を除去すると、血清 TG上昇抑制活性が高くなることが分かった。

次に、実施例 2で合成した配列番号 1のアミノ酸配列からなるペプチド（VV YP) 、実施例 2と同様の方法により合成したペプチド Va卜 Tyr- Pro (VYP) 及び Val- Thr- Leu (VTL) 並びに参考例で得られたグロビン蛋白分解物（GD ) について、血清 TG上昇抑制作用を検討した。

一夜絶食した ICR 系雄性マウス（6週齢，体重 25〜28g) にォリーブ油 18g/ kg体重を経口投与し、 1時間後に上記ペプチド水溶液（0.3 ml/mouse) を経口投与した。さらに 1時間後、ネンブタール麻酔下で腹部大静脈から採血を行い、血清 TG濃度を測定した（トリグリセライド Gテストヮコ一，和光純薬工業製）。ペプチド投与量と TG値から用量反応曲線を求め、 50%抑制量 ID₅。を算出し活性を比較した。結果を表 3に示す。表 3 グロビン蛋白分解物および合成べプチドにおける血清 TG上昇抑制作用

ぺプチドぺプチド含量 IDso'¹ 比活性

定量値）理論値 (¾)'² (mg蛋白/ ouse)

グロビン蛋白分解物 100 26 1

VTし 0.51 0.05 448

VYP 0.58 0.02 1130

VVYP 0.37'³ 0.74 0 6500

*2 ヘモグロビンのアミノ酸配列より算出した重量比.

*3 HPLCビーク面積により GD中の Va卜 Val- Tyr-Pro を定量した！：

表 3に示されるように、比活性（mg蛋白比）は、 VVYP6500倍、 VYP1130 倍、 VTL448 倍となり、 3種のペプチドとも GDより著しく強い活性が認められたが、なかでも特に VVYPは GDの 6500倍もの高い活性を持つことが分かつた。

以上のことから、グロビン蛋白分解物における脂肪吸収抑制作用の活性本体がテトラべプチド VVYPである可能性が高いことが示唆された。

〔試験例 2〕血中 TG濃度上昇抑制ペプチド（化学合成品）の消化酵素に対する安定性 (in vitro)

実施例 2で合成した配列番号 1のアミノ酸配列からなるぺプチド（VVYP) 並びに実施例 2と同様の方法により合成したペプチド Va卜 Tyr-Pro (VYP) 及び Va卜 Thr-Leu (VTL) について、 in v roにおける消化酵素に対する安定性試験を行った。

上記 VVYP、 VYP及び VTLの 0.1 N 塩酸溶液（ 3 mgZml) 127.5 mlに、同じく 0.1 N 塩酸に溶解した 22.51111の0.671^/1111ぺプシン（人工胃液）を加え、 37°Cで 4時間反応させた。続いて、 30mlの 0.5 N ホウ酸緩衝液 (pH8.0 ) に溶解した 75mlの 0.53mg mlパンクレアチン（人工睇液）を加え、 37°Cで 2時間反応させた。人工胃液消化前、人工胃液消化後及び人工膝液消化後のサンプルを、以下に示す条件で分析した。使用機種 H P L C (Waters. LC Modulel)

カラム SuperPac Pep-S, 5 /zm, フアルマシア（株）製

移動相 A 0.1 % トリフルォロ酢酸

B ァセトニトリルー水（50 : 50， 0.1 %トリフルォロ酢酸含有）流速 0.8 ml/分（VYP， VTL) , 0.4 ml/分（VVYP) 検出波長 220nm

温度

注入量： 50倍希釈液 20 1

上記 H P L Cによる逆相クロマトグラムを図 4に示す。また、消化物の保持時間とピーク面積を表 4に示す。表 4 消化物保持時間とピーク時間処理注入量 VTL VYP VVYP

t R 面積回収率 t R 面積回収率 t _R 面積回収率処理前 1.02 30.44 110 100 27.02 1049 100

胃液 1.02 nd 27.68 1133 108 66.28 3058 108 胃液/厣液 0.60 nd 27.76 671 109 66.39 1675 101

：保持時間（分）、面接：ピーク面 ¾ πν·秒)、 nd:検出されない

図 4及び表 4から明らかなように、 V T Lのピークは人工胃液消化後に消失したが、 VYPと VVYPのピークは人工膝液消化後にも存在した。これらの結果より、本発明のペプチド VVYPは、消化管内において消化酵素により分解を受けることなく、消化管管腔内のみならず小腸粘膜細胞及び血中に移行して効果を発揮する可能性が示唆された。

〔試験例 3〕本発明のぺプチドの安全性試験

雌雄の ICR 系マウスに、実施例 2で合成した配列番号 1のアミノ酸配列からなるペプチド（VVYP) を 10g/Kg体重以上（投与可能最大量）経口投与したが、死亡例はなかった。〔実施例 3〕本発明のぺプチドを含む食品の調製

(1) 粉ミルクの調製

100gの小児用粉ミルクに、実施例 2で合成した配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（VVYP) を lOmg添加して、血中 TG濃度上昇抑制能を有する粉ミルクを調製した。

(2) チョコレー卜の調製

100gのチョコレー卜に、実施例 2で合成した配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（VVYP) を 50mg添加して、血中 TG濃度上昇抑制能を有するチヨコレートを調製した。

〔実施例 4〕本発明のぺプチドを含む飼料の調製

ビタミン、ミネラル等が配合されたプレミックスに、実施例 2で合成した配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（VVYP) を 0.1 重量％の割合で配合して、これを市販の養魚用飼料に 10重量％の割合で添加し、血中 TG濃度上昇抑制能を有する養魚用飼料を調製した。産業上の利用可能性

本発明によれば、血中トリグリセリド濃度上昇抑制ペプチド並びに当該べプチドを有効成分として含む血中卜リグリセリド濃度上昇抑制剤、血中トリグリセリド濃度上昇抑制機能を付与した特定保健用食品（いわゆる機能性食品）及び血中卜リグリセリド濃度上昇抑制機能を付与した飼料が得られ、これらにより人若しくは動物の肥満や高脂血症及びそれらに伴う高血圧症や動脈硬化症等の循環器系疾患の予防や治療が可能になり、さらには家畜や養殖魚の肉質の改善が可能にな。配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 4

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

Val Val Tyr Pro 4 1

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるぺプチド。

2 . 配列番号 1で示されるァミノ酸配列からなるぺプチドを有効成分として含む血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤。

3 . 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを有効成分として含む血中トリグリセリド濃度上昇抑制機能を付与した特定保健用食品。

4 . 配列番号 1で示されるァミノ酸配列からなるぺプチドを有効成分として含む血中トリグリセリド濃度上昇抑制機能を付与した飼料。

5 . 予防又は治療学的に有効な量の配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いることを含む、血中トリグリセリド濃度の上昇を予防又は抑制する方法。

6 . 予防又は治療学的に有効な量の配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを用いることを含む、肥満を予防又は抑制する方法。

7 . 予防又は治療学的に有効な量の配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを用いることを含む、高脂血症を予防又は治療する方法。

8 . 血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤としての、配列番号 1で示されるァミノ酸配列からなるぺプチドの使用。

9 . 肥満の予防又は抑制剤としての、配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるべプチドの使用。

10. 高脂血症の予防又は治療剤としての、配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドの使用。