JP5175484B2

JP5175484B2 - 血中中性脂肪濃度上昇抑制剤

Info

Publication number: JP5175484B2
Application number: JP2007092227A
Authority: JP
Inventors: 孝吉日比
Original assignee: 名古屋製酪株式会社
Priority date: 2007-03-30
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2027-03-30
Also published as: JP2008247838A

Description

本発明は、血中中性脂肪濃度の上昇を抑制する作用に優れた新規なペプチドに関する。

近年の食生活の向上ないし欧米化に伴い、日本人の脂質摂取量が増加している。脂質はタンパク質、糖質と並ぶ三大栄養素の1つであるが、恒常的な過剰摂取は、肥満の原因になる。肥満には皮下脂肪型と内臓脂肪型があるが、このうち内臓脂肪型は生活習慣病の発症リスクを高めることが明らかとなっている。内臓脂肪蓄積に加えて、高血糖、高脂血症、高血圧なども発症した状態は「メタボリックシンドローム」と呼ばれ、動脈硬化による循環器系疾患の発症リスクを高める原因となるため、近年問題視されている。

循環器系疾患発症の原因の大きな危険因子として、食後の血中中性脂肪濃度の上昇が注目されている。一般に食事での脂肪摂取量が多くなるほど、血中中性脂肪値は高くなり、正常値に戻るのにも時間がかかる。脂肪摂取過多になれば、血中中性脂肪値は常に高い状態に維持される。これが動脈硬化を引き起こす要因であると指摘されている。近年の研究では、動脈硬化にはコレステロールよりも中性脂肪の方が、関連性が強いと指摘されている。そこで血中中性脂肪濃度の上昇を抑制するための試みがなされている。

現在では、血中中性脂肪濃度の上昇を抑制するために、食事制限や各種医薬品の投与が行われている。また屠畜赤血球由来のペプチド（特開平７−１８８２８４号、特開平９−２５５６９８号）が食品に用いられている。
特開平７−１８８２８４号公報特開平９−２５５６９８号公報

しかしながら、脂肪やカロリー摂取を抑制した食事制限は風味が劣り、患者にとっては長期的な苦痛を伴うものであり、家族には煩雑な食事管理を強いられる。また、あらかじめ管理された食事を購入する場合においても、食事の種類は制限され、費用も多くかかり不経済となる。

一方、屠畜赤血球由来のペプチドにおいては、その特有の風味のため応用範囲が限られるという欠点がある。
本発明の課題は、食事制限をすることなく食後の血中中性脂肪濃度上昇を抑えることができ、また応用範囲が広い血中中性脂肪濃度上昇抑制剤を提供することにある。

本発明者は、上記目的を達成するために鋭意研究した結果、Phe-Tyr-Ser、Leu-Tyrの配列で表される2種類のペプチドに脂質摂取後の血中中性脂肪濃度上昇抑制効果があることを見出した。本発明は係る知見に基づくものである。

すなわち、第１の発明はアミノ酸配列がPhe-Tyr-Serで表されるペプチドを有効成分とする血中中性脂肪濃度上昇抑制剤、第２の発明はアミノ酸配列がLeu-Tyrで表されるペプチドを有効成分とする血中中性脂肪濃度上昇抑制剤である。なお、アミノ酸表記はＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める３文字表記により表示した。

第１の発明の有効成分であるペプチド（Phe-Tyr-Ser）及び第２の発明の有効成分であるペプチド（Leu-Tyr）には血中中性脂肪濃度の上昇を抑制する作用がある。これらのペプチドの一方又は双方を有効成分とする血中中性脂肪濃度上昇抑制剤によれば、食事制限をすることなく、食後の血中中性脂肪濃度上昇が抑えられるから、肥満や高脂血症などの疾病を予防し、又は症状を改善させることが期待できる。しかも、応用範囲が広い。

第１の発明の有効成分であるペプチド（Phe-Tyr-Ser）及び第２の発明の有効成分であるペプチド（Leu-Tyr）を、例えばコーヒー生豆タンパク質分解物から精製する等により、コーヒー生豆由来とすれば家畜伝染病などの危険性を回避でき、安全性が高まる。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
第１の発明の有効成分であるペプチド（Phe-Tyr-Ser）及び第２の発明の有効成分であるペプチド（Leu-Tyr）は、広く自然界に存在するタンパク質から分離精製することが可能である。タンパク質から分離精製する場合、その原材料は、動物性タンパク質、植物性タンパク質、微生物起源のタンパク質等、本発明を達成できる限り、何れも用いることが可能である。

ところで、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）や口蹄疫、豚コレラ、鳥インフルエンザ等、家畜における伝染性疾病の世界的伝播と人への感染の危険性も懸念されており、動物性タンパク質の場合は衛生管理が極めて重要になる。特許文献１、２に開示の屠畜赤血球由来のペプチドも家畜の衛生管理という問題がある。

従って、家畜伝染病などの危険性を回避するには、植物性の原材料を用いることが望ましい。請求項３記載の血中中性脂肪濃度上昇抑制剤の有効成分であるペプチドはコーヒー生豆由来であるから、家畜伝染病などの危険性から解放されている。

植物性の原材料は、例えば小麦、米、コーン、大豆などの穀類、豆類が使用可能であるが、本発明のペプチドを効率よく創出するためには、コーヒー生豆を使用することが好ましい。

また、本発明のペプチドは公知の方法により直接化学合成することもできる。或いは、ペプチド配列に対応した塩基配列を有する遺伝子を用いた遺伝子工学的手法によって製造することができる。更には、細胞抽出液を使った無細胞合成によって得ることも可能である。

コーヒー生豆を出発原料とするペプチドの製造は、以下のように行われる。なお、出発原料としてのコーヒー生豆は、特に品種を問うことなく使用できる。
まずコーヒー生豆を粉砕する。これは公知のいかなる方法でもよいが、凍結粉砕等により出来るだけ細かく粉砕することが好ましい。

この粉砕物を5~70重量％となるように水に懸濁し、プロテアーゼを添加して酵素反応を行う。使用するプロテアーゼは微生物由来の酵素、動物由来の酵素、植物由来の酵素何れを用いてもよく、特に限定されない。２種以上のタンパク質分解酵素を組み合わせて用いてもよい。プロテアーゼを使用せず、酸を用いてもよいが、反応の特異性と再現性を考慮すると酵素を用いることが好ましい。プロテアーゼで加水分解する場合には、ｐH、反応温度を酵素の至適値に調整することが好ましいが、酵素量、反応時間でも制御可能であるため、特定の条件に限定されるものではない。

酵素反応の終わったコーヒー生豆酵素分解物は、そのまま懸濁液の状態でも使用可能であるが、乾燥して粉末化して使用してもよい。
さらに公知の方法で必要に応じて精製を行い、本発明のペプチドの含有量を高めることも出来る。例えば、酵素反応溶液を90〜100℃に加熱してプロテアーゼを失活させた後、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど公知の手法によって分画し、得られた血中中性脂肪濃度上昇抑制活性を有する画分を、更に逆相高速液体クロマトグラフィー（以下、HPLCと略す）にて処理して有効成分を分離、精製するこ
とも出来る。

本発明のペプチドを化学的に合成する場合には、従来の公知の方法を用いることができる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等である。これらのペプチド合成法は固相合成法、液相合成法の何れでも行うことができる。

上記ペプチド合成法においては、側鎖官能基を有するアミノ酸、例えばチロシンは、当該側鎖官能基を保護しておくのが好ましい。保護基としてはｔ-ブチル(t-Bu)基などを用いることができる。これらの保護基は公知の方法で本発明のペプチドの合成工程において脱保護を行うことができる。合成によって得られたペプチドは、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いたHPLC等を用いた通常の方法で精製することができる。

血中中性脂肪濃度上昇抑制剤は、適当な賦形剤、結合剤、希釈剤と混合して成るものであってもよく、さらに、必要に応じて他の薬剤と調合してあってもよい。上記の賦形剤、結合剤、希釈剤は特に限定されず、通常用いられるものを使用することができる。また、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤などの形態で経口投与されるものであっても、注射剤などの非経口的に投与されるものであってもよい。

また、本発明の血中中性脂肪濃度上昇抑制剤は、医薬品という形態に限るものではなく、一般の食品類あるいは健康食品として調製することも可能である。
食品とする場合は、有効成分となるペプチドを直接任意の食品に添加するか、有効成分となるペプチドに任意の食品添加物または香料等を添加して、粉末、顆粒、塊状の固形食品あるいは飲料食品として加工することができる。

健康食品として調製する場合は、有効成分となるペプチドに任意の賦形剤、結合剤、希釈剤を混合して、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、飲料等の形態に加工してもよい。
以下、具体例にて本発明の実施形態をより詳しく具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の各例によって限定されるものではない。
［コーヒー生豆タンパク質分解物の調製］
コーヒー生豆を高速粉砕機にて330メッシュに微粉化したもの100ｇに蒸留水1Lを加えてよく懸濁し、水酸化ナトリウムを加えてpHを7.0に調製した後、天野エンザイム製プロテアーゼNアマノG 0.1ｇを添加し、55℃で20時間反応を行なった。反応後、90℃で10分間加熱して反応を停止させた。その反応液を遠心分離後、上澄み液をろ紙及びセライト等を用いてろ過し、ろ液を凍結乾燥してコーヒー生豆粉末タンパク質分解物10.38gを得た。

これとは別にプロテアーゼを加えず、同様の処理をしてコーヒー生豆抽出物10.15gを得た。
［コーヒー生豆タンパク質分解物の効果］
上記で調製したコーヒー生豆粉末タンパク質分解物は、以下に示す試験によって血中中
性脂肪濃度上昇抑制効果を確認した。

一夜絶食させたICR系雄性マウス（7週齢、体重32〜34g）の尾静脈から採血を行い、コーヒー生豆粉末のタンパク質分解物水溶液またはプロテアーゼ未処理のコーヒー生豆粉末抽出液をそれぞれ経口投与(800mg/kg体重)した。対照群には水を投与した。各群とも、その後オリーブオイルを経口投与（5ml/kg体重）した。その2、4、6時間後に採血し、血中中性脂肪値を測定した（トリグリセライド E−テストワコー、和光純薬）。コーヒー生豆のタンパク質分解物投与群とプロテアーゼ未処理のコーヒー生豆抽出物投与群の曲線下面積を対照群と比較した。結果を表1に示す。

表１に示すとおり、コーヒー生豆粉末のタンパク質分解物には血中中性脂肪濃度上昇抑制効果が認められた。
［ペプチドの分画精製］
コーヒー生豆タンパク質分解物に含まれる有効成分を以下の手順により分画精製した。

上記のコーヒー生豆タンパク質分解物の調製で得られたコーヒー生豆粉末タンパク質分解物10.38gのうち2.27gを、限外ろ過装置（ペリコンラボカセット：ミリポア社製）と限外ろ過膜（ミリポア社製、PT型膜、分画分子量１万）を用いて限外濾過し、分子量1万以下の画分を得た。

限外濾過したろ液の凍結乾燥物を蒸留水に再溶解し、Sephadex G-15（GE Healthcare社製）を充填したカラム（1.0×100cm）に負荷し、流速12ml/h、画分画量3mlでゲルろ過を行った。

これらのフラクションから、血中中性脂肪濃度上昇抑制活性の強い画分を回収し、減圧濃縮後、水溶液を、0.01M Tris-HCl(pH8.0)で緩衝化した弱陰イオン交換樹脂（Macro-Prep DEAE BIO-RAD社)に加え、よく撹拌させた後、未吸着画分を得た。

この未吸着画分に関して逆相HPLCを行った。カラムとしてYMC社製のJ’・sphereODS−H80（4.6mmID×250mmL）を用いた。移動相としてA液に0.05％トリフルオロ酢酸（以下、TFAと略す）、B液に50％アセトニトリル/0.05％TFAを用いて、B液濃度を60分間で10％から30％への直線濃度勾配法により、流速1.0ml/min、検出波長220nmでクロマトグラム処理した。装置には島津社製高速液体クロマトグラフィーSCL-10Aを用いた。その結果、ペプチドフラグメントとして溶出時間32.3分（画分A）と38.2分（画分B）に強い血中中性脂肪濃度上昇抑制効果を有する画分を分離することができた。上記逆相HPLCによるクロマトグラムを図1に示す。これら2つのピークの画分をそれぞれ、再度、同条件による逆相HPLCに供し、単一のペプチドが含まれるようにした。
［ペプチドフラグメントの構造決定］
このようにして得られたペプチドフラグメントは、島津社製のプロテインシーケンサーPPSQ-23型を用いてペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、画分AはLeu-Tyr、画分BはPhe-Tyr-Serで示されるL体のアミノ酸残基からなる配列を有するペプチドであることを確認した。
［コーヒー生豆由来ペプチドの効果］
上記で得られたコーヒー生豆由来ペプチドの画分A、画分Bは、以下に示す試験によって血中中性脂肪濃度上昇抑制効果を確認した。

一夜絶食させたICR系雄性マウス（7週齢、体重32〜34g）の尾静脈から採血を行い、コーヒー生豆由来ペプチドの画分A、画分Bをそれぞれ経口投与(12.5mg/kg体重)した。対照群には水を投与した。各群とも、その後オリーブオイルを経口投与（5ml/kg体重）した。その2、4、6時間後に採血し、血中中性脂肪値を測定した（トリグリセライド E−テストワコー、和光純薬）。画分Aと画分Bの曲線下面積を対照群と比較した。結果を表2に示す。

表２に示すとおり、画分Ａ（Leu-Tyr）、画分Ｂ（Phe-Tyr-Ser）には血中中性脂肪濃度上昇抑制効果があることが確かめられた。
［ペプチドの合成］
次にコーヒー生豆タンパク質分解物から精製した画分Ａ（Leu-Tyr）、画分Ｂ（Phe-Tyr-Ser）のアミノ酸配列に基づいてペプチドを合成した。

ペプチド合成装置PSSM-8（島津社製）により、同装置のプロトコールに従い、当該ペプチドを合成した。すなわち、Phe-Tyr-Serについてはαアミノ基を9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）で、カルボキシル基を活性エステルで保護したSer誘導体を結合させた樹脂をペプチド合成装置の反応容器にセットした。ピペリジンによってアミノ基を保護していたFmoc基を外し、アミノ基を遊離させて、Tyr誘導体を加えて伸張反応を行った。反応性を有する側鎖はt-Buで保護した。続いてPhe誘導体を用いて同様に伸張反応を行った。全ての合成が終了した時点でTFAでクリーベイジを行った。Leu-Tyrも同様の方法により合成した。合成したペプチドはHPLCにより精製した。
［ペプチド（化学合成品）の効果］
上に示した方法によって合成したペプチドにつき、以下に示す試験によって血中中性脂肪濃度上昇抑制効果を検討した。

ICR系雄性マウス（7週齢、体重32〜34g）に対する血中中性脂肪濃度を測定した。試験前日より絶食させたマウスにペプチド水溶液(10ml/kg体重)を経口投与した。その後オリーブオイル（5ml/kg体重）を経口投与した。投与前及び投与から２時間後に尾静脈より採
血し、血中中性脂肪濃度を測定した。ペプチド投与量とトリグリセリド値から用量反応曲線を求め、50％抑制量ID₅₀を算出し、同様にして測定したコーヒー生豆タンパク質分解物と比較した。結果を表3に示す。

表3に示されるようにPhe-Tyr-SerとLeu-Tyrは、コーヒー生豆タンパク質分解物より高い比活性を示した。このことからコーヒー生豆タンパク質分解物の脂肪吸収抑制作用はPhe-Tyr-SerとLeu-Tyrが主要な役割を担っていることが示された。

ペプチドの分画精製で実施した逆相HPLCによるクロマトグラム。

Claims

アミノ酸配列がPhe-Tyr-Serで表されるペプチドを有効成分とする血中中性脂肪濃度上昇抑制剤。
アミノ酸配列がLeu-Tyrで表されるペプチドを有効成分とする血中中性脂肪濃度上昇抑制剤。
前記ペプチドがコーヒー生豆由来である請求項1に記載の血中中性脂肪濃度上昇抑制剤。