CN107551258B - 用于预防和/或治疗肝损伤的vvyp - Google Patents

Abstract

本发明涉及序列Val‑Val‑Tyr‑Pro所示的肽在制备预防和/或治疗肝损伤的药物中的用途以及在制备降低转氨酶的药物中的用途。

Description

用于预防和/或治疗肝损伤的VVYP

技术领域

本发明涉及VVYP(即，序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽)在制备预防和/或治疗肝损伤的药物中的用途。

背景技术

近年来，病毒感染、药物、化学毒物(如环境中的化学污染物等)、酗酒等因素引起的肝损伤，正越来越严重地危害人们的身体健康。肝损伤会诱发肝炎、肝硬化甚至肝癌，严重影响生活质量和健康水平。中国是世界公认的肝炎大国，约有1.3亿的肝炎病毒携带者。中国经济快速发展带来的环境污染，饮酒消费的不断增大，药物不合理使用和滥用，由此产生的化学性、酒精性和药物性肝损伤在我国有逐年增加的趋势。因此治疗肝损伤药物有着巨大的市场需求。

肝损伤通常会引起血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的升高，降低转氨酶水平是缓解和治疗肝损伤，修复肝功能的重要手段。ALT以肝脏细胞含量最高,主要分布于细胞浆水溶性部分,少量存在于线粒体中,AST主要分布于心肌，其次为肝脏、骨骼肌和肾脏等组织中，在肝脏细胞中约有80％以上存在于线粒体，在轻、中度肝损伤时,以ALT升高为明显,ALT升高远大于AST升高，当严重肝细胞损伤时,线粒体受损,可导致线粒体内的酶被释放入血,此时以AST升高更明显,血清中AST/ALT比值升高。由酒精和药物代谢过程中产生的自由基可损伤线粒体膜脂质，导致线粒体AST外泄。

目前降低转氨酶的临床一线用药双环醇，是联苯双酯结构类似物，具有很好的保肝作用和一定的抗乙肝病毒活性，它对四氯化碳(CCl₄)、D-氨基半乳糖和对乙酰氨基酚引起的肝损伤以及卡介苗加脂多糖引起的小鼠免疫性肝炎均有降低转氨酶的作用。但是临床应用发现，双环醇对ALT水平的降低作用远大于AST，患者服用双环醇后，ALT水平显著降低，AST水平不降甚至出现升高的现象，使得谷丙转氨酶/谷草转氨酶的比值升高。经过大量临床应用之后，很多医生仅将双环醇用于轻度肝损伤患者，主要治疗ALT水平的升高。双环醇的水溶性非常差，口服生物利用度低且波动大，不能制成注射剂，病毒株产生耐药现象等。主要降低ALT水平和差的水溶性限制了双环醇的临床使用，临床上针对保护肝线粒体从而降低AST水平的药物有待开发。目前用于治疗重度肝损伤的药物，较常用的有静脉给药的甘利欣、甘草酸制剂，细胞膜保护剂多稀磷脂酰胆碱等，这些化学药物有一定的副作用，且远期治疗效果差，此外，重度肝损伤时，肝脏对许多药物的清除能力下降，使用药物过多易造成肝损伤，因此寻找更好降酶效果且毒性低的肝修复药物迫在眉睫。

Val-Val-Tyr-Pro肽(即，VVYP，其中，Y代表：L-酪氨酸；V代表：L-缬氨酸；P代表：L-脯氨酸)在日本多项专利文献中均有报道：Val-Val-Tyr-Pro肽具有抑制血中甘油三酯浓度作用，可预防或治疗人或动物的肥胖症、高血脂症及其并发的高血压症和动脉硬化等循环器官类疾病(特开平9-255698)。此外，Val-Val-Tyr-Pro肽具有降低处于高血糖状态的受试者血糖水平的作用，可用于预防或治疗由高血糖引起的疾病(特表2008-519758)。除此之外，Val-Val-Tyr-Pro肽具有抑制处于高胆固醇状态或该前阶段的患者的胆固醇再上升的作用，可用于预防或治疗由于胆固醇再上升导致的高胆固醇状态引起的病态或疾患，并且Val-Val-Tyr-Pro肽具有降血压作用(2007-137816)。在中国专利文献中也有报道，Val-Val-Tyr-Pro肽具有抗紧张、不安、应急力低下等功能作用(CN 101633945A)。

但现有技术中没有关于Val-Val-Tyr-Pro肽对预防和治疗肝损伤保护作用中的记载。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明人进行了深入的研究，发现多肽类化合物VVYP(序列Val-Val-Tyr-Pro表示的肽)具有优异的保肝护肝的作用，降低转氨酶尤其是降低AST水平，减轻肝脏组织病理性改变和修复肝损伤的作用，对于肝损伤，例如化学性、病毒性、药物性、或酒精性(例如急、慢性)肝损伤、以及急性酒精性中毒的预防和治疗具有优异的效果，从而完成了本发明。

本发明涉及以下方面。

[1].序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备预防或治疗肝损伤的药物中的用途。

[2].项[1]所述的用途，其中，肝损伤是病毒性肝损伤。

[3].项[1]所述的用途，其中，肝损伤是药物性肝损伤。

[4].项[1]所述的用途，其中，肝损伤是急、慢性酒精性肝损伤。

[5].序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备预防或治疗急性酒精中毒的药物中的用途。

[6].序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备降低转氨酶的药物中的用途。

[7].项[6]的用途，其中，转氨酶是AST(谷草转氨酶)，也包含ALT(谷丙转氨酶)。

[8].用于预防或治疗肝损伤的药物组合物，其包含序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽。

[9].项[8]的药物组合物，其是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂或微粒给药系统。

[10]序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽，其用于预防或治疗肝损伤。

[11].项[10]所述的肽，其中，肝损伤是病毒性肝损伤。

[12].项[10]所述的肽，其中，肝损伤是药物性肝损伤。

[13].项[10]所述的肽，其中，肝损伤是急、慢性酒精性肝损伤。

[14].肝损伤的预防和/或治疗方法，该方法包括向需要的哺乳动物中或患者中给于有效量的序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽。

[15].项[14]所述的方法，其中，肝损伤是病毒性肝损伤。

[16].项[14]所述的方法，其中，肝损伤是药物性肝损伤。

[17].项[14]所述的方法，其中，肝损伤是急、慢性酒精性肝损伤。

[18].序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽，其用于降低转氨酶，特别是降低AST(谷草转氨酶)。

[19].降低转氨酶的方法，该方法包括向需要的哺乳动物中或患者中给于有效量的序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽。

[20].用于预防或治疗急性酒精中毒的药物组合物，其包含序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽。

[21].序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备抑制SOD和/或GSH-Px活性的药物中的用途。

[22].序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备抗氧化的药物中的用途。

[23].序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备抑制氧化应激损伤的药物中的用途。

[24].序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备抗肝癌药物中的用途。

[25].序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备预防和/或治疗化学性肝损伤的药物中的用途。

本发明建立了四氯化碳、对乙酰氨基酚和酒精性的急性肝损伤模型，观察Val-Val-Tyr-Pro肽对四氯化碳、对乙酰氨基酚和酒精性肝损伤的保护作用及其作用机理，药理实验结果表明,在上述三种肝损伤模型中，Val-Val-Tyr-Pro肽具有非常好的保肝护肝，降低转氨酶尤其是降低AST水平，减轻肝脏组织病理性改变和修复肝损伤的作用。本发明的VVYP可以用于制备抗肝癌活性药物。

附图说明

图1.Val-Val-Tyr-Pro肽对0.1％CCl₄致急性肝损伤小鼠肝脏病理改变的影响

具体实施方式

多肽类药物VVYP(即，Val-Val-Tyr-Pro所示的肽)可以按照本身已知的制备方法制备得到，也可以按照改进的制备方法获得，还可以商业购买得到。该化合物具有很好的水溶性。

本发明的一个方面涉及本发明化合物VVYP对于化学性物质引起的肝损伤(化学性肝损伤)肝损伤的作用。

在0.1％CCl₄引起的小鼠肝损伤模型中，分别测定血清中丙氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST),总胆红素(TBIL),总胆固醇(CHOl)和甘油三酯(TG)的水平，并处死动物,剖腹取肝,制备肝匀浆。检测肝匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平，同时对肝组织进行病理学检查。

实验结果表明Val-Val-Tyr-Pro肽能显著降低ALT、AST和总胆红素(TBIL)的水平，降低ALT、AST和TBIL效果均明显优于阳性药双环醇，而双环醇对AST和TBIL水平降低效果不明显。

此外，CCl₄模型组中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力显著降低，与正常对照组动物相比分别降低82.5％和23％，Val-Val-Tyr-Pro肽保护组(8mg/kg，16mg/kg，32mg/kg)能明显升高SOD和GSH-Px活力，SOD活性分别恢复至对照组的99％，50.89％和44.54％，GSH-Px活性分别恢复至对照组96.8％,94.9％和111.2％因此，Val-Val-Tyr-Pro肽的保护作用机制与减轻提高抗氧化酶活性，从而抑制氧化应激有关。

肝组织病理切片进一步显示，Val-Val-Tyr-Pro肽(32mg/kg，16mg/kg，8mg/kg)剂量依赖性减轻肝脏组织病理性改变，病理积分明显降低,分别降低至正常的34％，49％和45％。

本发明的另一个方面涉及本发明化合物VVYP对于酒精性肝损伤的作用。

众所周知,我国近年来由酒精所导致的急性肝损伤呈逐年上升趋势,酒精已经成为继病毒性肝炎之后的第二大导致肝损伤的病因。

本发明人在酒精引起的肝损伤小鼠模型中，通过用56％的红星二锅头灌胃小鼠造成急性酒精性肝损伤模型，通过检测血清肝功能生化指标(AST、ALT、TBIL、CHO1及TG)的变化评价Val-Val-Tyr-Pro肽对酒精性肝损伤的保护作用。

Val-Val-Tyr-Pro肽能显著降低动物给予酒精组小鼠血清中AST、ALT及TG的升高，显示了良好的作用，其中Val-Val-Tyr-Pro肽降低TG效果与双环醇相当，Val-Val-Tyr-Pro肽降低ALT和AST水平优于双环醇，而双环醇降低酒精性肝损伤小鼠AST水平无显著性差异。

本发明的又一个方面涉及本发明化合物VVYP对于病毒性和/或药物性肝损伤的作用。

在对乙酰氨基酚诱发小鼠急性肝损伤模型中，以双环醇(25mg/kg)作为阳性对照,用不同剂量(6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg)的Val-Val-Tyr-Pro肽给药3次，每天2次，第二天下午用对乙酰氨基酚(140mg/kg)腹腔注射诱发小鼠急性肝损伤,16h后测定血清肝功能和肝匀浆线粒体中谷草转氨酶(AST)，判定Val-Val-Tyr-Pro肽对对乙酰氨基酚诱发肝损伤的保护作用。

Val-Val-Tyr-Pro肽各剂量灌胃均能保护对乙酰氨基酚引起的小鼠肝损伤,使升高的血清转氨酶(ALT和AST)水平和总胆红素(TBIL)显著降低,并且Val-Val-Tyr-Pro肽能防止肝线粒体中AST水平的降低。

含有本发明的化合物(Val-Val-Tyr-Pro肽)的药物可以单独使用，或以药物组合物形式使用，这种药物组合物是如下制备的：按照本身已知的方法作为药物制剂的制备方法，将所述化合物和药理学可接受的载体混合，例如，得到片剂(包括糖包衣片剂，混悬剂，气雾剂，膜剂，膜包衣片剂，舌下片剂，口中可分解的片剂，口含片等等)，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂(包括软胶囊，微囊)，糖浆剂，液剂，乳剂，小丸剂，鼻制剂，肺制剂(吸入剂)，注射剂(例如，皮下注射，静脉注射，肌内注射，腹膜内注射)，静脉滴注，透皮吸收制剂，软膏剂，洗剂，粘附剂，栓剂(例如，直肠栓剂，阴道栓剂)，滴眼剂，控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂，缓释制剂，缓释微囊)，等等。

含有本发明的化合物的药物可以安全地口服或胃肠外给药(例如，静脉内，肌内，皮下，器官内，鼻内，皮内，滴注，脑内，直肠，阴道，腹膜内，肿瘤体内，肿瘤近端给药，直接给药到病变，等等)。

在本发明的制剂中，本发明化合物的含量根据制剂形式而不同，但相对于每个制剂的总重量，作为本发明化合物的含量通常约为0.01至100％重量，优选0.1至50％重量，更优选0.5至20％重量。

尽管剂量根据给药途径、症状、患者年龄等等而不同，但剂量是，例如，每1千克体重每天口服给药患有肝损伤的成年患者大约0.005-50mg，优选大约0.05-10mg，更优选大约0.2-4mg的本发明化合物，可以将其分为1至3份给药。

当本发明的药物组合物是缓释制剂时，其剂量根据本发明化合物的种类和含量、剂型、药物释放的持续时间、给药目标动物(例如，哺乳动物，例如人类，大鼠，小鼠，狗，兔子等等)和给药目的而不同。对于肠胃外给药，例如，一周释放大约0.1-大约100mg的本发明化合物。

上述药理学可接受的载体的例子包括赋形剂(例如，淀粉，乳糖，蔗糖，碳酸钙，磷酸钙等等)，粘合剂(例如，淀粉，阿拉伯胶，羧甲纤维素，羟丙基纤维素，结晶纤维素，海藻酸，凝胶，聚乙烯吡咯烷酮等等)，润滑剂(例如，硬脂酸镁，硬脂酸钙，滑石粉等等)，崩解剂(例如，羧甲纤维素钙，滑石粉等等)，稀释剂(例如，注射用水，盐水等等)，添加剂(例如，稳定剂，防腐剂，着色剂，调味剂，溶解助剂，乳化剂，缓冲剂，等渗剂等等)，等等。

本发明的预防或治疗药物还可以与其它药物一起使用。在本发明化合物和其他药物的组合形式中，对本发明化合物和其他药物的给药时间没有限制，本发明化合物或其药物组合物和其他药物或其药物组合物可以同时给药患者，或可以在不同的时间给药患者。可以按照临床上使用的给药数量来确定其他药物的剂量，并且可以根据给药患者、给药途径、疾病、组合药等等恰当地选择。

对其他药物的给药模式没有特别限制，只要本发明的化合物和其他药物在给药过程中组合即可。这种给药模式的例子包括下列方法∶

(1)同时配制本发明的化合物或其药物组合物和其他药物，得到单一给药制剂。(2)单独配制本发明的化合物或其药物组合物和其他药物或其药物组合物，得到两种制剂，通过相同给药途径同时给药。(3)单独配制本发明的化合物或其药物组合物和其他药物或其药物组合物，得到两种制剂，通过相同给药途径、在不同时间给药。(4)单独配制本发明的化合物或其药物组合物和其他药物或其药物组合物，得到两种制剂，通过不同给药途径同时给药。(5)单独配制本发明的化合物或其药物组合物和其他药物或其药物组合物，得到两种制剂，通过不同给药途径、在不同时间给药(例如，以本发明的化合物或其药物组合物和其他药物或其药物组合物的顺序给药，或反顺序给药)。

在本发明的组合药物中，可以恰当地按照给药患者、给药途径、疾病等等来确定本发明化合物和其他药物的混合比例。

例如，尽管本发明化合物在本发明组合药物中的含量根据制剂形式而变化，但相对于整个制剂，通常为大约0.01至大约100wt％，优选大约0.1至大约50wt％，更优选大约0.5至大约20wt％。

其他药物在本发明组合药物中的含量根据制剂形式而变化，但相对于整个制剂，通常为大约0.01至大约100wt％，优选大约0.1至大约50wt％，更优选大约0.5至大约20wt％。

添加剂(例如载体等等)在本发明组合药物中的含量根据制剂形式而变化，但相对于整个制剂，通常为大约1至大约99.99wt％，优选大约10至大约90wt％。

实施例

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不局限于此。

实施例1Val-Val-Tyr-Pro肽对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用

一、材料与方法

(1)材料与主要试剂

受试动物：清洁级KM小鼠，雄性，120只，18-22g

受试药物：

Val-Val-Tyr-Pro肽：99％纯度，由江西本草天工科技有限责任公司提供

双环醇片：国药准字H20040467，北京协和药厂

水飞蓟宾：国药准字H20040299，天津天士力圣特制药有限公司。

四氯化碳购于天津市福晨化学试剂厂

谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、总胆固醇(CHO1)和甘油三脂(TG)试剂盒购于日本和光纯药工业株式会社

超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购于南京建成生物工程研究所

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所

(2)主要仪器

RM2016型石蜡切片机(德国Leica公司)

LEICA DM 1000光学显微镜

上海恒平FB224电子天平

德国Sigma1-16K高速离心机

日立7100全自动生化分析仪

(3)方法

实验动物分组：将昆明小鼠随机分为空白对照组，模型组，水飞蓟宾组(150mg/kg)，双环醇组(25mg/kg)Val-Val-Tyr-Pro肽高剂量组，Val-Val-Tyr-Pro肽中剂量组，Val-Val-Tyr-Pro肽低剂量组，每组12只动物。

实验动物给药：给药组各组小鼠，按随机顺序每天上午给予相应药物1次，给药方式为灌胃给药，给药容量2ml/100g，模型组和空白组给予等量的0.5％羧甲基纤维素钠。连续给药5天。

实验动物造模：给药第4天下午4点开始，模型组和给药组腹腔注射0.1％四氯化碳(10ml/kg)，造模第二天上午8点继续给药1次，给药3h眼眶静脉采血和取肝脏。

肝功能测定：采集到的血样(约600μl)在室温放置2h后，以3500rpm离心10min分离出血清，多功能生化仪测定血清中ALT、AST和ALP的活性。

肝脏切片检测：肝组织病理学检查取小鼠肝大叶大致相同部位的一小块肝组织，用10％甲醛溶液固定后，石蜡包埋，切片(片厚5μm)，苏木素-伊红(HE)染色，然后在光镜下观察肝脏组织病理学改变。根据肝脏病变程度以半定量方法积分,并按各种病变重要性乘以不同加权数。加权数：肝细胞坏死×3,肝细胞水样变×1，淤血、出血×l，炎性细胞浸润×l。计算每只动物肝病变的总积分,然后进行统计学处理。

GSH-Px、SOD测定：按试剂盒说明书进行。

(4)统计学方法

采用SPSS 16.0进行统计学分析，剂量资料多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVN)，各组均数的多重比较采用最小显著插值法(LSD)，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

(1)Val-Val-Tyr-Pro肽对0.1％CCl₄所致小鼠急性肝损伤中血清ALT,AST,TBIL,CHO1和TG的影响

模型组小鼠血清中ALT和AST的活性较正常对照组明显升高，且具有统计学差异，说明本次实验模型造模成功。Val-Val-Tyr-Pro肽高、中、低剂量均能降低肝损伤小鼠血清中ALT,AST的活性，与模型组比较均具有统计学差异(^*P<0.05，^**P<0.01)，高、中、低剂量降转氨酶效果优于阳性药水飞蓟宾和双环醇组，25mg/kg双环醇不具有降低AST效果。

此外，Val-Val-Tyr-Pro肽高剂量能降低四氯化碳损伤小鼠TBIL的增加，双环醇能降低正常和模型组小鼠TG的含量，而模型组和给药组对CHOl含量无影响(表1)。

以上结果表明，在0.1％四氯化碳造模下，昆明小鼠口服Val-Val-Tyr-Pro肽高剂量、中剂量和低剂量都具有保肝降酶效果，对抗四氯化碳诱导肝损伤小鼠的作用优于阳性药双环醇和水飞蓟宾。

表1Val-Val-Tyr-Pro肽对0.1％CCl4所致小鼠急性肝损伤中血清ALT,AST,TBIL,CHO1和TG的影响

注：与正常对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01.

(2)Val-Val-Tyr-Pro肽对0.1％CCl₄致急性肝损伤小鼠肝脏病理改变的影响

病理切片结果表明，正常对照组小鼠的肝组织结构正常，肝细胞没有变性、坏死等病理性变化(图1)，模型组小鼠肝脏切片结果显示：肝索状排列紊乱或细胞索变窄或溶解，出现以中央静脉为中心的局灶性肝细胞变性坏死及伴炎性细胞浸润，细胞核固缩等病理性改变(病理积分为1.00士0.00)。阳性药和Val-Val-Tyr-Pro肽各剂量组小鼠的肝细胞坏死，变性以及炎性细胞浸润等病变得到了很大程度的减轻。病理积分明显降低(0.34士0.25；0.49士0.22；0.45士0.32)，与模型组比较有显著差异(表2)，以上结果进一步表明Val-Val-Tyr-Pro肽具有较好的保护肝细胞作用，减轻上述病理改变。

表2.Val-Val-Tyr-Pro肽对0.1％CCl4致急性肝损伤小鼠肝脏病理积分的影响

注：与正常对照组比较，^#P<0.05；与模型组比较*P<0.05.

(3)Val-Val-Tyr-Pro肽对0.1％CCl₄致急性肝损伤小鼠肝组织的SOD，GSH-Px水平的影响

机体中还存在多种抗氧化物酶,包括SOD，GSH-Px，过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽还原酶(GR)等，可分别催化不同的氧化还原反应，使机体维持相对稳定的氧化还原状态。本研究表明，四氯化碳造模组SOD和GSH-Px活性均发生显著变化，与正常对照组动物相比分别降低82.5％和23％。

Val-Val-Tyr-Pro肽给药(8，16和32mg/kg)可显著抑制SOD和GSH-Px活性的降低,使SOD活性分别恢复至对照组的99％，50.89％和44.54％，GSH-Px活性分别恢复至对照组96.8％,94.9％和111.2％(表3).

表3.Val-Val-Tyr-Pro肽对0.1％CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织的SOD，GSH-Px水平的影响

注：与正常对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01.

结果表明，0.1％CCl4肝损伤模型组小鼠血清中ALT和AST水平较正常对照组明显升高(##P<0.01)，Val-Val-Tyr-Pro肽高、中、低剂量均能降低肝损伤小鼠血清中ALT和AST的活性，与模型组比较均具有统计学差异(^*P<0.05，^**P<0.01)，高、中、低剂量降酶效果优于阳性药水飞蓟宾和双环醇组。此外，Val-Val-Tyr-Pro肽高剂量能防止CCl₄引起的小鼠血清总胆红素含量的升高。0.1％CCl₄肝损伤模型组小鼠的肝组织出现严重的损伤，肝大叶结构有明显的破坏，大量炎性细胞浸润其中，大部分肝细胞出现浑浊肿胀等病理性改变(病理积分为1.00士0.00)，并且血清中AST、ALT水平也显著升高。

Val-Val-Tyr-Pro肽各剂量组小鼠肝细胞受损程度明显减少，其中，Val-Val-Tyr-Pro肽高、中剂量血清中ALT和AST的水平显著低于CCl₄模型组，且降酶效果具有剂量依赖性，表明Val-Val-Tyr-Pro肽具有保护肝细胞膜，明显对抗0.1％CCl₄诱导的肝损伤的作用。SOD是体内重要的抗氧化酶，已知真核细胞中，根据SOD活性中心所含金属离子不同，分为铜锌超氧化物岐化酶(Cu，Zn-SOD)存在胞外和胞液中；锰超氧化物岐化酶(Mn-SOD)存在于线粒体中，氧自由基(O₂-)生成过多时可诱导Mn-SOD的合成。当体内代谢过程中产生自由基时，SOD可催化氧自由基(O₂-)反应产生过氧化氢，过氧化氢与GSH在GSH-Px催化下生成水，从而清除自由基。

本研究发现模型组SOD和GSH-Px活力显著降低，Val-Val-Tyr-Pro肽保护组能明显升高SOD和GSH-Px活力，因此，Val-Val-Tyr-Pro肽的保护作用机制与减轻提高抗氧化酶活性，从而抑制氧化应激有关。

实施例2：Val-Val-Tyr-Pro肽对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

一、材料与方法

(1)材料

酒精度56％，购自北京红星酒业有限公司

其他同实施例1

(2)主要仪器

同实施例1

(3)方法

实验动物分组：将70只昆明小鼠随机分为空白对照组，模型组，阳性药水飞蓟宾组(75mg/kg)，阳性药双环醇组(25mg/kg)，Val-Val-Tyr-Pro肽高剂量组(25mg/kg)，Val-Val-Tyr-Pro肽中剂量组(12.5mg/kg)，Val-Val-Tyr-Pro肽低剂量组(6.25mg/kg)，每组10只动物。

实验动物给药：给药组各组小鼠，按随机顺序首日上午、下午和次日上午给予相应药物1次，给药方式为灌胃给药，给药容量2ml/100g。

实验动物造模：末次给药8h,除正常组外,每组灌胃给予红星二锅头20ml/kg造模，正常组给予等体积的蒸馏水,禁食不禁水16h后眼眶静脉采血。

血清肝功能测定：采集到的血样(约600μl)在室温放置2h后，以3 000rpm离心10min分离出血清，多功能生化仪测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、胆固醇(CHO1)和甘油三酯(TG)的水平。

二、结果

Val-Val-Tyr-Pro肽对急性酒精性肝损伤小鼠血清ALT/AST/TBIL/CHO1/TG的影响：与正常组比较,模型组小鼠血清中ALT、AST和TG的水平显著上升，Val-Val-Tyr-Pro肽高、中、低剂量组预先灌胃3次能使二锅头所引起的血清ALT和TG水平的升高明显降低,且高剂量Val-Val-Tyr-Pro肽能降低血清AST水平，双环醇25mg/kg和水飞蓟宾75mg/kg可明显降低ALT水平,但降AST水平的作用不明显,结果见表4。

表4.Val-Val-Tyr-Pro肽对急性酒精性肝损伤小鼠血清ALT/AST/TBIL/CHO1/TG的影响

注：与正常对照组比较，^##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01.

本实验采用二锅头灌胃的方法诱导小鼠急性酒精性肝损伤模型，肝脏ALT、AST和TG水平显著上升，说明本实验成功制备了小鼠急性酒精性肝损伤模型，且小鼠酒精灌胃后肝脏出现明显的脂质蓄积,血清的ALT和AST是反映肝细胞受损的重要指标,本研究表明Val-Val-Tyr-Pro肽组能显著降低血清ALT、AST水平,且可显著抑制肝脏甘油三酯蓄积，显示Val-Val-Tyr-Pro肽对小鼠的急性酒精性肝损伤有保护作用。

实施例3Val-Val-Tyr-Pro肽对对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝损伤的保护作用

一、材料与方法

(1)材料

酒精度56％，购自北京红星酒业有限公司

其他同实施例1

(2)主要仪器：同实施例1

(3)方法

实验动物分组：将72只昆明小鼠随机分为空白对照组，模型组，双环醇低剂量组(25mg/kg)，双环醇高剂量组(50mg/kg)，Val-Val-Tyr-Pro肽高剂量组(32mg/kg)，Val-Val-Tyr-Pro肽中剂量组(16mg/kg)，Val-Val-Tyr-Pro肽低剂量组(8mg/kg)，每组12只动物。

实验动物给药：给药组各组小鼠，按随机顺序首日上午、下午和次日上午给予相应药物1次，给药方式为灌胃给药，给药容量2ml/100g。

实验动物造模：末次给药8h后腹腔注射对乙酰氨基酚120mg/kg，注射16h后眼眶静脉采血和取肝脏。

血清和肝线粒体转氨酶测定：采集到的血样(约600μl)在室温放置2h后，以3000rpm离心10min分离出血清，多功能生化仪测定血清中ALT、AST、TBIL、CHO1和TG的水平。

二、结果

(1)Val-Val-Tyr-Pro肽对小鼠腹腔注射AP 16h后血清ALT/AST/TBIL/TG的影响

小鼠于腹腔注射AP16h后,血清转氨酶水平明显升高,Val-Val-Tyr-Pro肽高、中、低剂量组预先灌胃3次能使AP所引起的ALT、AST和TBIL水平的升高明显降低,双环醇25mg/kg可明显降低ALT，但降AST的作用不明显,结果见表5。

表5.Val-Val-Tyr-Pro肽对小鼠腹腔注射AP 16h后血清ALT/AST/TBIL/TG的影响

注：与正常对照组比较，^##P<0.01，^##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01.

(2)Val-Val-Tyr-Pro肽对对AP引起小鼠肝线粒体AST降低的保护作用

小鼠腹腔注射AP16h后线粒体中AST水平均显著下降,而预先给予双环醇25mg/kg×3次能防止肝脏线粒体中AST的降低，当给予不同剂量Val-Val-Tyr-Pro肽后，与模型组相比，肝线粒体中AST水平均显著升高且升高水平高于阳性药双环醇组，给药组各组间没有显著差异(P>0.05)，结果见表6.

表6.Val-Val-Tyr-Pro肽对小鼠腹腔注射AP后不同时间肝线粒体中AST水平的影响

本实验中,小鼠腹腔注射对乙酰氨基酚(AP)16h后ALT和AST水平均显著增加,而预先给予Val-Val-Tyr-Pro肽高、中、低剂量灌胃3次后，血清中ALT、AST和TBIL水平均降低,几乎保持在正常水平,AP毒性机制主要是AP转化为半醌自由基(NAPQI)造成的，由于线粒体氧化呼吸功能可被多种醌类化合物所抑制,因此AP代谢产生的半醌自由基能影响肝脏线粒体的功能,造成线粒体的损伤。Val-Val-Tyr-Pro肽对AP引起的肝损伤有明显的保护作用,表现在血清AST转氨酶的升高明显减轻，另外，本实验中观察到,在AP损伤肝线粒体晚期(16h),Val-Val-Tyr-Pro肽可明显防止AP引起的肝线粒体中AST的降低，阻止了线粒体内AST的外泄。

综上所述,Val-Val-Tyr-Pro肽既能明显减轻AP引起的整个肝细胞的损伤,又能通过对线粒体膜的保护作用而防止线粒体结构和功能的损伤从而阻止线粒体内AST等酶的释放。

本发明如上所述进行了描述。当然本发明在其范围中包含各种方式的变化，这些变化并不偏离本发明的范围。此外，对于对本领域技术人员而言明显是本发明的变形的改变，都包括在权利要求的范围内。

Claims (10)

1.序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备预防或治疗肝损伤的药物中的用途。

2.权利要求1所述的用途，其中，肝损伤是病毒性肝损伤。

3.权利要求1所述的用途，其中，肝损伤是药物性肝损伤。

4.权利要求1所述的用途，其中，肝损伤是酒精性肝损伤。

5.权利要求1所述的用途，其中，肝损伤是化学性肝损伤。

6.序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备预防或治疗急性酒精中毒的药物中的用途。

7.序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备降低谷草转氨酶的药物中的用途。

8.序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备降低谷丙转氨酶的药物中的用途。

9.序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备抗氧化的药物中的用途。

10.序列Val-Val-Tyr-Pro所示的肽在制备抑制氧化应激损伤的药物中的用途。

Images