KR100588357B1 - 신규한 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르앙굴리스포러스 ｃｒｍ000232, 및 이로부터 분리·정제한뎁시드계 화합물을 유효성분으로 하는 단백질 티로신탈인산화 효소 1ｂ 저해제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 (Micromucor ramannianus var. angulisporus) CRM000232 (KCTC 10696BP), 및 이로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물을 유효성분으로 하는 단백질 티로신 탈인산화 효소 1Ｂ 저해제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물은 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해 활성이 우수하고, 혈당강하효과가 우수함으로 당뇨병 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있으며, 특히 제 2형 당뇨병인 인슐린 비의존형 당뇨병에 대하여 치료효과가 뛰어나다.

Description

신규한 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 ＣＲＭ000232, 및 이로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물을 유효성분으로 하는 단백질 티로신 탈인산화 효소 1Ｂ 저해제{A novel fungal species of Micromucor ramannianus var. angulisporus CRM000232 and protein tyrosin phosphatase 1B inhibitor comprising depside compounds isolated and purified from them}

도 1은 본 발명에 따른 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물의 혈당치를 나타낸 도이다.

본 발명은 신규한 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 CRM000232, 및 이로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물을 유효성분으로 하는 단백질 티로신 탈인산화 효소 1Ｂ 저해제에 관한 것이다.

당뇨병은 비전염성 만성질환으로, 췌장의 β세포에서 분비되는 인슐린이 부 족하거나 그 기능을 제대로 발휘하지 못하여 체내에서 포도당이 에너지원으로 이용되지 못하고 혈액내에 고농도로 남아 있다가 소변으로 배설되는 질환이다.

당뇨병은 그 발병원인 및 증상의 치료방법에 따라 크게 제 1형 당뇨병인 인슐린 의존형 당뇨병(Insulin dependent diabetes mellitus, IDDM)과 제 2형 당뇨병인 인슐린 비의존형 당뇨병(Non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM)으로 분류된다.

제 1형 당뇨병은 유전적 원인, 바이러스 감염 등에 의해 췌장 β세포의 기능이 저하되어 인슐린이 거의 분비되지 않은 상태로서, 인슐린을 공급해주어야만 혈당이 조절되고, 주로 10~20대에 갑자기 발병하며, 소아형 당뇨병이라고도 한다.

제 2형 당뇨병은 가족력, 비만, 스트레스, 식사의 잘못 또는 인슐린과 길항하는 약물 등에 의해 발병되는 것으로, 인슐린 공급에 의해 혈당이 조절되지 않고 혈당강하제나 식이요법 등에 의해 혈당을 조절할 수 있고, 40대 이후에 잘 나타나며, 성인형 당뇨병이라고도 한다. 췌장에서의 인슐린 분비는 충분하지만 인슐린 내성과 포도당 이용율이 정상인과 달라서 고인슐린혈증임에도 불구하고 혈당이 정상화 되지 않는다. 우리나라의 경우 당뇨병 환자의 90~95% 이상이 제 2형 당뇨병 환자이다.

생활 수준의 향상으로 인하여 생활 여건이 향상되면서 전반적인 식생활의 향상으로 섭취 열량이 크게 증가하고 운동부족 현상을 초래하며 과도한 스트레스에 노출되는 생활이 지속되면서 인슐린의 성능이 떨어지며, 또한 이러한 생활방식에 의해 심각한 비만이 발생하게되므로, 이에 따라 야기되는 제 2형 당뇨병(인슐린 비 의존형 당뇨병)이 증가하고 있다. 제 2형 당뇨병이 오래 지속되면 혈당의 증가 이외에도 혈중 지질 농도가 증가하여 지방간, 동맥경화, 관상 심장질환 등의 심혈관 질환, 당뇨병성 신증 및 망막질환, 당뇨병성 말초 신경증으로 인해 인체의 전반적인 대사기능 및 감각기능이 저하되어 합병증을 유발하게 되므로, 이의 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

현재 사용되고 있는 당뇨병 치료제는 경구용 혈당강하제와 인슐린 주사제로 크게 구분된다. 일반적으로, 체내에서 인슐린 분비가 없는 인슐린 의존형 당뇨병 환자나 임신성 당뇨병 환자, 경구용 혈당강하제로 혈당조절이 제대로 안되는 인슐린 비의존형 당뇨병 환자에게는 인슐린 주사를 투여하고, 식사요법과 운동요법을 병행함에도 불구하고 적절한 혈당조절이 되지 않는 인슐린 비의존형 당뇨병 환자에게는 경구용 혈당강하제를 복용하게 하는 것이 통설이다.

일반적으로 이용되는 경구용 혈당강하제는 치료기전 및 작용 약물의 작용점에 따라 설포닐우레아계(sulfonylureas) 약물, 비구아니드계(biguanides) 약물, 아카보스계(acarbose) 약물 및 티아졸리딘디온계(thiazolidinedione) 약물로 나눌 수 있다.

설포닐우레아계 약물로는 글리피자이드, 글리클라자이드, 글리퀴돈, 글리벤클라마이드, 클로르프로파마이드 등이 있으며, 췌장에서 인슐린 분비를 촉진하는 작용을 나타낸다. 그러므로, 이들은 췌장에서 인슐린 분비가 전혀 없는 인슐린 의존형 당뇨병 환자, 췌장에서 인슐린 분비능력이 상대적으로 감소된 인슐린 비의존형 당뇨병 환자, 가임기 여성에게는 사용할 수 없는 문제점이 있다. 또한, 이들 약 물은 과용량을 투여하거나, 공복시에 투여하는 경우에는 저혈당을 초래하며 피부발진, 황달, 식욕부진, 오심(구역), 설사 등의 부작용도 나타난다. 특히 클로르프로파마이드와 같은 반감기가 긴 약물(12~36시간)은 체내에 축적되어 저혈당을 일으킬 위험이 매우 높다. 또한, 대부분의 설포닐우레아계 약물은 간에서 대사되어 신장으로 배설되므로 간기능 및 신기능장애 환자에게는 주의하여 사용하여야 한다.

비구아니드계 약물로는 메트포르민 등이 있으며, 작용기전은 정확하진 않지만 췌장에서 인슐린 분비를 증가시키는 작용은 없는 것으로 밝혀졌으며, 간에서의 포도당 신생합성을 감소시킨다. 비구아니드계 약물은 설포닐우레아계 약물보다 혈당강하효과가 약한 반면에, 저혈당을 일으키지 않는 장점을 갖고 있다. 그러나 소화기계 부작용의 발생빈도가 높아 치료초기에 오심, 구토, 설사, 발진 등이 나타나며, 락트산혈증(lactic acidosis)을 유발하여 생명을 위협하는 치명적인 부작용을 일으키므로, 고령자와 심혈관 질환 환자에게는 주의해야 한다. 현재 미국에서는 실험용 약제로만 사용하고 있다.

아카보스계 약물은 탄수화물 섭취 후 탄수화물의 소화를 방해하여 혈당의 상승을 방해하는 작용을 나타낸다. 아카보스계 약물은 알파-글루코아밀라제 억제제로 가역적으로 알파-D-글리코시다제 활성을 억제시키며, 주로 소장 세포의 점막에 존재하는 말타제의 활성을 억제시켜 식후에 일시적으로 혈당이 급상승하는 것을 막아준다. 부작용이 심하지 않은 편이어서 경증 당뇨병 치료에 이용된다.

티아졸리딘디온계 약물은 최근에 개발된 것으로, 핵막 수용체이면서 유전자 전사 촉진인자인 피피에이알 감마(PPAR-Υ, Peroxisome proliferator activated receptor Υ)를 활성화하여 인슐린 내성을 개선시키는 효과가 있다.

그러나, 경구용 혈당강하제만으로는 혈당이 효과적으로 떨어지지 않고 이미 알려진 대부분의 약물에서 부작용이 나타나므로, 보다 안전한 당뇨병 치료제나 당뇨병 예방제의 개발이 시급한 실정이다.

최근에는 제 2형 당뇨병과 인슐린 신호전달에서 음성조절(negative regulation)을 담당하고 있는 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B(protein tyrosin phosphatase 1B, PTP1B)와의 관련성이 밝혀지면서, 이의 저해물질이 당뇨병 치료제로서의 개발 가능성이 대두되고 있다. 케네디 및 라마찬드란(Kennedy and Ramachandran)은 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 유전자가 결여된 쥐에서 인슐린에 대해 민감한 성질을 보인다고 보고한 바 있다(Elchevly et al., Science, 283, 1544 ~ 1548, 1999). 즉, 쥐에게 인슐린을 투여하였을 때 간과 근육 세포에서 인슐린 수용체의 인산화가 증가하고 오래 지속된다는 사실을 보였으며, 이는 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B가 활성화된 인슐린 수용체의 탈인산화에서 결정적인 역할을 하므로 이 효소의 억제가 제 2형 당뇨병 치료에 매우 효과적이라는 것을 보여준다. 또한, 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해물질이 제 2형 당뇨병 질환모델 쥐에서 혈당강하나 인슐린 내성의 극복 등 제 2형 당뇨병에 효과가 있음이 보고되었다(J. Med. Chem. 42, 3199-3202, 1999; J. Biol. Chem. 275, 10300 ~ 10307, 2000).

따라서, 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B의 저해제를 당뇨병 치료제로 개발하기 위한 노력이 활발히 진행되고 있다[Nature Review Drug Discovery, 1,696 ~ 709].

일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법론 중에서도, 기존약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 자연계의 토양미생물이 생산하는 다양한 대사산물에서 새로운 약제 성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높으며 실제로 항생제, 항암제등의 많은 약제들이 미생물에서 개발되어 왔다. 그러나, 지금까지 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해제로서 미생물에서 분리된 화합물에 대한 보고는 극히 미비한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 적으며 제 2형 당뇨병 치료에 효과적인 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B의 활성을 억제하는 물질에 대해 여러 가지 미생물로부터 탐색하던 중, 토양으로부터 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스[Micromucor ramannianus var. angulisporus) CRM000232 (KCTC 10696BP)]를 선별하였고, 이로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물이 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B의 활성을 억제하여 혈당강하에 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신규한 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 (Micromucor ramannianus var. angulisporus) CRM000232 (KCTC 10696BP)를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 CRM000232 배양액으로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물을 유효성분으로 하는 단 백질 티로신 탈인산화 효소 1Ｂ 저해제를 제공하고자 한다.

본 발명은 신규한 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스(Micromucor ramannianus var. angulisporus) CRM000232 (KCTC 10696BP)를 제공한다.

본 발명의 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 CRM000232는 토양으로부터 분리하며, 분리방법은 다음과 같다.

멸균 생리 식염수에 풍건한 토양시료를 넣고 교반한 다음 10^-2 ~ 10^－4 배로 희석하고, 희석액을 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar) 배지에 도말한 후 25℃에서 7~10일간 배양하여 나타난 집락을 순수 분리한다. 상기 분리한 신균주 곰팡이를 여러 가지 고체배지에서 배양하여 포자를 생성시킨다.

성숙된 포자낭의 벽의 모양은 분화구 모양을 하며, 그 모서리는 뾰족한 면을 갖는 가시모양의 벽이 특징이다. 포자낭 내에는 다수의 포자낭포자(sporangiospore, C)가 발견되며 특히 여러 면의 각(isodiametric)을 갖는 포자낭포자로 가득차 있어 뮤코알레스 목에 속하는 마이크로뮤코 속(Micromucor) 곰팡이로 판정할 수 있어, 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스(Micromucor ramannianus var. angulisporus ) 균으로 동정한다. 따라서, 본 발명의 토양으로부터 분리한 신균주를 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스(Micromucor ramannianus var. angulisporus ) CRM00232로 명명한다(수탁번호 : KCTC 10696BP).

또한, 본 발명은 상기 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 CRM000232 배양액으로부터 분리·정제한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 하는 단백질 티로신 탈인산화 효소 1Ｂ 저해제를 제공한다.

(상기 화학식 1에서, R은

, 또는 -(CH₂)₂COCH₃ 이다.)

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 뎁시드계 화합물은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 뎁시드계 화합물은 통상적인 모든 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 시약을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 신규한 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 CRM000232로부터 분리·정제하여 사용한다.

본 발명의 신규한 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스(Micromucor ramannianus var. angulisporus) CRM000232로부터 뎁시드계 화합물을 분리·정제하는 방법은 다음과 같다.

토양으로부터 분리한 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙길리스포러스 CRM000232 (KCTC 10696BP)를 배양하기 위하여, 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 CRM000232의 종배지 및 생산배지로서 이스트 엑기스(0.3％), 말트 엑기스(0.3％), 펩톤(0.5％), 포도당(2％), 마그네슘 썰페이트·7H₂O(0.05％), 포타슘디하이드로겐 포스페이트(0.1％)가 함유된 배지를 사용한다.

삼각플라스크에 종배지를 분주하고 121℃에서 20분간 가압멸균한 후, 포테이토덱스트로스 또는 와이엠 배지에서 사면배양한 CRM000232 균주를 백금이로 접종하고 26℃에서 4일간 진탕배양하여 배양기의 종배양으로 한다.

생산배지를 함유한 배양기를 121℃에서 1시간 가압멸균한 다음 상기의 종배양액을 접종한 뒤 26℃에서 300rpm의 속도로 교반과 함께 1.0 vvm의 통기하의 호기적 조건에서 7일간 배양한다.

CRM000232의 성장은 액상배지에서 배양 7일째에 최고치에 도달하며, 뎁시드계 화합물의 생산은 7일 배양 시 극대화 된다. 생산을 위한 최적 배양온도는 26℃ 이며 pH 6.8에서 배양이 시작되었을 때 3일 후 약산성인 pH 5.5 정도로 떨어졌다가 시간이 경과하면서 서서히 증가되어 배양 종료 시 pH 7.5~8.0으로 된다.

상기 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙길리스포러스 CRM000232 (KCTC 10696BP)의 배양액을 에틸 아세테이트로 추출, 농축한다. 상기 농축액을 오디에스 알피 18 컬럼크로마토그래피(ODS RP-18 column chromatography) 하여 메탄올／물(1／9 ~ 10/0, v/v)을 혼합용매로 하여 단계적으로 메탄올 농도를 증가시키면서 용출시킨다. 이때 화합물 1을 함유한 활성분획은 90% 메탄올에서, 화합물 2를 함유한 활성분획은 80% 메탄올에서 용출한다.

각각의 활성분획만을 모아 감압농축한 후, 화합물 1을 함유한 분획을 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 용매로 아세토니트릴과 물을 60:40 ~ 100:0 농도구배로 용출유속 2㎖/분 조건으로 용출하여 254㎚의 UV 흡수피크를 26분에서 보이는 화합물 1을 분리한다.

화합물 2를 함유한 분획의 경우 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 용매로 아세토니트릴과 물을 50:50 ~ 100:0 농도구배로 용출유속 2㎖/분 조건으로 용출하여 254㎚의 UV 흡수피크를 22분에서 보이는 화합물 2를 분리한다.

본 발명에 따른 뎁시드계 화합물의 단백질 티로신 탈인산효소 1B의 활성을 50％ 저해하는 농도(IC₅₀)는 화합물 1의 경우 4.9 μM 이고, 화합물 2의 경우 69.9 μM 로 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해 활성이 우수함을 알 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 뎁시드계 화합물의 혈당치는 대조군의 혈당치(500 ~ 542 mg/㎗)와 비교하여 화합물 1의 경우 1주 후에는 16%가 낮아진 수준(430 mg/㎗)을 나타내고, 4주후에는 8%가 낮아진 500mg/㎗를 나타낸다. 화합물 2의 경우 화합물 1에 비해서는 미약하나 1주 후에 10% 정도 낮아진 수준(450 mg/㎗)을 나타내고, 4주 후에는 4% 낮아진 수준(480 mg/㎗)을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 뎁시드계 화합물의 혈당강하효과가 우수함을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물은 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해 활성이 우수하고, 혈당강하효과가 우수함으로 당뇨병 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 뎁시드계 화합물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 화학식 1의 뎁시드계 화합물의 일일 투여량은 약 10~500 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 20~300 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 뎁시드계 화합물을 마우스에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 10g/kg 이상인 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 조성물은 당뇨병의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)의 분리

멸균 생리 식염수 10㎖에 풍건한 토양시료 1g을 넣고 30분간 교반한 다음 10^-2 ~ 10^－4 배로 희석한 다음, 희석액 0.1㎖를 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar) 배지에 도말한 후 25℃에서 7~10일간 배양하여 나타난 집락을 순수 분리하였다.

상기에서 분리한 신균주 곰팡이를 여러 가지 고체배지(V-8 주스, 와이엠, 차이펙, 몰트 배지, 포테이토 덱스트로스)에서 배양하여 포자를 생성시킨 후 포자를 관찰하여, 성장정도, 콜로니 모양, 형상 및 색소의 형성 등을 조사하였다.

분리한 곰팡이 000232의 형태학적, 배양학적 특징을 표 1에 나타내었다.

배지	균체 성장도	콜로니 모양	표면배지색	배면모양과 배지색
V-8 주스	우수	가루의 포자생성 심한 주름	중심부 갈색 주변부 백색	심한 주름 미색
와이엠(YM)	우수	가루의 포자생성 약한 주름	백색	주름 미색
차이펙	양호	가루	크림색	크림색
몰트 배지	양호	가루	중심부 크림색 주변부 미색	미색
포테이토 덱스트로스	양호	가루	미색	미색

표 1에 나타난 바와 같이, 성숙된 포자낭(sporangia)의 벽(wall)의 모양은 분화구 모양을 하며, 그 모서리는 뾰족한 면을 갖는 가시모양의 벽(echinulate wall)이 특징이다. 포자낭 내에는 다수의 포자낭포자(sporangiospore, C)가 발견되며 특히 여러면의 각(isodiametric)을 갖는 포자낭포자로 가득차 있어 뮤코알레스 목에 속하는 마이크로뮤코 속(Micromucor) 곰팡이로 판정할 수 있어, 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스(Micromucor ramannianus var. angulisporus )균 으로 동정하였다.

따라서, 본 발명에서 분리한 신균주를 마이크로뮤코 라마니아너스 바르 앙굴리스포러스(Micromucor ramannianus var. angulisporus ) CRM00232로 명명하였다.이에, 2004년 9월 17일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구원내 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10696BP를 부여 받았다.

실시예 2 : 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 뎁시드계 화합물의 분리 및 정제

1. 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)의 배양

곰팡이 균주 CRM000232를 배양하기 위하여, 통상적으로 미생물이 이용하는 영양원을 함유하는 배지를 준비하였다.

곰팡이 균주 CRM000232의 종배지 및 생산배지로서 이스트 엑기스(0.3％), 말트 엑기스(0.3％), 펩톤(0.5％), 포도당(2％), 마그네슘 썰페이트·7H₂O(0.05％), 포타슘디하이드로겐 포스페이트(0.1％)가 함유된 배지를 사용하였다.

1ℓ의 삼각플라스크에 종배지 200㎖를 분주하고 121℃에서 20분간 가압멸균한 후, 포테이토덱스트로스 또는 와이엠 배지에서 사면배양한 CRM000232 균주를 백금이로 접종하고 26℃에서 4일간 진탕배양하여 배양기의 종배양으로 하였다.

10ℓ의 생산배지를 함유한 15ℓ배양기(fermentor)를 121℃에서 1시간 가압멸균한 다음, 상기의 종배양액 200㎖를 접종한 뒤 26℃에서 300rpm의 속도로 교반과 함께 1.0 vvm의 통기하의 호기적 조건에서 7일간 배양하였다.

2. 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 뎁시드계 화합물의 분리 및 정제

상기 1에서 배양한 곰팡이 CRM000232(KCTC 10696BP)의 배양액을 동량의 에틸아세테이트 용매로 추출하고, 수득된 추출액을 감압건조기를 이용하여 감압증발 방법으로 농축하였다. 이 농축액을 오디에스 알피 18에 흡착시켜 오디에스 알피 18 컬럼크로마토그래피(ODS RP-18 column chromatography)를 실시하였으며, 이때, 메탄올／물(1／9 ~ 10/0, v/v)을 혼합용매로 하여 단계적으로 메탄올 농도를 증가시키면서 용출시켰다. 이때 화합물 1을 함유한 활성분획은 90% 메탄올에서, 화합물 2를 함유한 활성분획은 80% 메탄올에서 용출하였다.

각각의 활성분획만을 모아 감압농축한 후, 화합물 1을 함유한 분획을 고속 액체 크로마토그래피(칼럼: Capcell C18, 길이 250㎜, 직경 10㎜)를 이용하여 용매로 아세토니트릴과 물을 60:40 ~ 100:0 농도구배로 용출유속 2㎖/분 조건으로 용출하여 254㎚의 UV 흡수피크를 26분에서 보이는 화합물 1을 분리하였다.

화합물 2를 함유한 분획의 경우 고속 액체 크로마토그래피(칼럼: Capcell C18, 길이 250㎜, 직경 10㎜)를 이용하여 용매로 아세토니트릴과 물을 50:50 ~ 100:0 농도구배로 용출유속 2㎖/분 조건으로 용출하여 254㎚의 UV 흡수피크를 22분에서 보이는 화합물 2를 분리하였다.

3. 구조 분석

상기 곰팡이 CRM000232(KCTC 10696BP)의 배양액으로부터 분리한 화합물 1과 화합물 2는, ESI 질량분석기(Electrospray Ionization mass spectrometer) 또는 FAB-MS 질량분석기를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한 핵자기공명(NMR) 분석(Bruker AMX 300)을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR, 호모-코지(HOMO-COSY), HMQC(1H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization) 스펙트럼을 얻고, 분자구조를 결정하였다.

측정 결과는 하기와 같으며, 발표된 문헌의 것과 비교 분석한 결과, 상기 곰팡이 CRM000232(KCTC 10696BP)의 배양액으로부터 분리한 물질은 화합물 1과 화합물 2로 동정하였다[유럽특허 0 335 386 A1,(1989. 3. 30)].

화합물 1 : [비스(2,4-디히드록시-3,5,6-트리메틸-벤조산 3-히드록시-2,4,5-트리메틸-6-카보닐-페닐 에스터)디설파이드]

1) 물성 : 흰색 분말

2) 분자량 : 778

3) 분자식 : C₄₀H₄₂O₁₂S₂

4) ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 11.35(1H, s, 2,2'-OH), 2.47(3H, s, H-10, 10'), 2.31(3H, s, H-18, 18'), 2.18(3H, s, H-19, 19'), 2.13(3H, s, H-9, 9'), 2.12(3H, s, H-8, 8'), 2.00(3H, s, H-20, 20')

5) ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 188.5(C-17,17'), 170.5(C-7,7'), 161.1(C-2,2'), 157.8(C-4,4'), 154.8(C-15,15'), 143.7(C-11,11'), 138.8(C-6,6'), 133.6(C-13,13'), 124.1(C-12,12'), 121.1(C-14,14'), 115.4(C-5,5'), 114.8(C-16,16'), 107.5(C-3,3'), 104.6(C-1,1'), 19.1(C-10,10'), 16.8(C-18,18'), 12.0(C-9,9'), 11.9(C-19,19'), 9.9(C-20,20'), 8.1(C-8,8')

6) ESI-MS(rel. int.) m/z [M+Na]⁺ = 801

화합물 2 : [2,4-디히드록시-3,5,6-트리메틸-벤조산 3-히드록시-2,4,5-트리메틸-6-(3-옥소-부틸설파닐카보닐)-페닐 에스터]

1) 물성 : 흰색 분말

2) 분자량 : 460

3) 분자식 : C₂₄H₂₈O₇S

4) ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 11.43(1H, s, 2'-OH), 5.34(1H, s, 4-OH), 5.05(1H, s, 15-OH), 3.06(2H, m, H-21), 2.54(3H, s, H-10), 2.51(2H, m, H-22), 2.21(3H, s, H-18), 2.18(3H, s, H-9), 2.16(3H, s, H-9), 2.14(3H, s, H-8),, 2.04(3H, s, H-20), 1.93(3H, s, H-24)

5) ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 206.2(C-23), 194.7(C-17), 170.5(C-7), 161.1(C-2), 157.8(C-4), 153.8(C-15), 143.4(C-11), 138.5(C-6), 132.4(C-13), 126.4(C-12), 120.9(C-14), 115.5(C-5), 114.8(C-16), 107.6(C-3), 107.6(C-3), 104.8(C-1), 43.0(C-22), 29.5(C-24), 23.5(C-21), 19.1(C-10), 16.8(C-18), 12.0(C-9), 11.9(C-19), 9.9(C-20), 8.1(C-8)

6) FAB-MS(rel. int.) m/z [M+Na]⁺ = 483

실험예 1 : 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해 활성 측정

본 발명에 따른 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물의 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해 활성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

단백질 티로신 탈인산화 효소 1B는 바이오몰(BIOMOL)에서 제조한 제품을 구입하여 실험에 사용하였다.

분광학적으로 효소 활성을 측정하기 위하여, 0.5 ㎍/㎖ 농도의 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B, 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 완충용액(50 mM 시트레이트, pH 6.0, 0.1M NaCl, 1 mM EDTA, 1mM DTT), 저해제, 20 mM pNPP를 첨가하고 가볍게 흔들어 준 다음 1시간동안 30℃에서 반응시킨 후 410㎚에서 흡광도를 측정하였다.

효소 저해율은 하기 수학식 1로 계산하였으며, IC₅₀ 값은 효소 활성의 저해율이 50 %에 달하는 저해제의 농도로 결정하였다.

결과는 표 2에 나타내었다.

저해율(%) = [(A-B)/(A-C)] ×100

※ A : 효소를 넣은 것의 반응 후 흡광도,

B : 저해제를 넣은 것의 반응 후 흡광도,

C : 저해제와 효소를 넣지 않은 것의 반응 후 흡광도.

	IC50(μM)
화합물 1	4.9
화합물 2	69.9

표 2에 나타난 바와 같이, 화합물 1의 단백질 티로신 탈인산효소 1B의 활성을 50％ 저해하는 농도(IC₅₀)는 4.9 μM 이었고, 화합물 2는 69.9 μM 이었다. 따라서, 본 발명에 따른 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물의 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해 활성이 우수함을 알 수 있다.

실험예 2 : 당뇨 모델동물인 Leprdb/Leprdb 마우스에서 혈당강하 효과 측정

본 발명에 따른 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물의 혈당강하 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

식욕조절 홀몬인 렙틴의 수용체(leptin receptor) 이상으로 비만 및 당뇨를 일으키는 모델동물인 Leprdb/Leprdb 마우스는 비만과 더불어 매우 높은 고혈당과 이에 따른 당뇨증상을 동반한다. 따라서, 뎁시드계 화합물의 혈당강하 효과를 알아보기 위하여 2개월령의 성숙한 Leprdb/Leprdb 마우스 21마리를 대상으로 실험을 실시하였다.

2군의 실험군에 각각 7마리씩 넣고, 상기 실시예 2에서 얻은 뎁시드계 화합물을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 희석하여 30㎎/㎏ 농도로 1일 1회씩 복강으로 투여하였으며, 대조군 7마리의 경우에는 동일량의 DMSO만을 투여하였다.

투여 후 1주일 간격으로 헤파린으로 처리한 모세유리관(carpillary tube)을 이용하여 후안와정맥총(retro-orbital sinus)으로부터 혈액을 채취하여 혈당측정기(ACCU-CHEK Active blood glucose monitor, Roche, Germany)로 혈당(blood glucose)을 측정하여 대조군과 실험군의 차이를 분석하였다.

결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 대조군의 혈당치(500 ~ 542 mg/㎗)와 비교하여 화합물 1의 경우 1주 후에는 16%가 낮아진 수준(430 mg/㎗)을 나타내었고, 4주후에는 8%가 낮아진 500mg/㎗ 나타내었다.

또한, 화합물 2의 경우 화합물 1에 비해서는 미약하나 1주 후에 10% 정도 낮아진 수준(450 mg/㎗)을 나타내었고, 4주 후에는 4% 낮아진 수준(480 mg/㎗)을 나타내었다.

따라서, 본 발명에 따른 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물의 혈당강하효과가 우수함을 알 수 있다.

실험예 3 : 마우스에 대한 경구투여 급성 독성실험

본 발명에 따른 뎁시드계 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법으로 급성독성실험을 하였다.

실험동물로 2개월령의 Leprdb/Leprdb 마우스를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 10 마리씩의 동물에 상기 실시예 2에서 얻은 뎁시드계 화합물을 각각 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 10g/㎏/㎖의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

따라서, 본 발명의 조성물은 모두 마우스에서 10g/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 뎁시드계 화합물 10g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

화학식 1의 뎁시드계 화합물 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

화학식 1의 뎁시드계 화합물 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

화학식 1의 뎁시드계 화합물 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

본 발명에 따른 곰팡이 균주 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 분리·정제한 뎁시드계 화합물은 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해 활성이 우수하고, 혈당강하효과가 우수함으로 당뇨병 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있으며, 특히 제 2형 당뇨병인 인슐린 비의존형 당뇨병에 대하여 치료효과가 뛰어나다.

Claims (5)

1. 토양으로부터 분리한 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스(Micromucor ramannianus var. angulisporus) CRM000232 (KCTC 10696BP).
2. 하기 화학식 1로 표시되는 뎁시드계 화합물을 유효성분으로 하는 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해제.

   <화학식 1>

   

   (상기 화학식 1에서, R은

   

   , 또는 -(CH₂)₂COCH₃ 이다.)
3. 제 2항에 있어서, 상기 뎁시드계 화합물은 제 1항의 곰팡이 균주 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙굴리스포러스 CRM000232(KCTC 10696BP)로부터 분리·정제한 것임을 특징으로 하는 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해제.
4. 제 2항에 있어서, 상기 저해제가 당뇨병의 예방 및 치료에 유용한 것임을 특징으로 하는 단백질 티로신 탈인산화 효소 1B 저해제.
5. 1) 제 1항의 마이크로뮤코 라만니아너스 바르 앙길리스포러스 CRM000232 (KCTC 10696BP)의 배양액을 에틸 아세테이트로 추출, 농축하는 단계,

   2) 상기 농축액을 메탄올／물을 혼합용매로 하여 컬럼크로마토그래피로 용출하는 단계, 및

   3) 상기 용출액을 감압농축한 후, 아세토니트릴과 물을 혼합용매로 하여 고속 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계로 이루어지는 하기 화학식 1로 표시되는 뎁시드계 화합물의 분리방법.

   <화학식 1>

   

   (상기 화학식 1에서, R은

   

   , 또는 -(CH₂)₂COCH₃ 이다.)

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