NO318683B1 - Peptidblanding og middel som inhiberer okning av triglyceridniva i blod, samt matvare og fôr som omfatter peptidblandingen. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en peptidblanding og et middel som inhiberer økning av triglyceridnivåer i blod; middelet for inhibering av økningen av triglyceridnivået i blod omfatter nevnte peptidblanding som aktiv bestanddel; en matvare for spesifisert helseanvendelse (en såkalt fysiologisk funksjonell matvare) som har den funksjon at den vil inhibere økning av triglyceridnivået i blod; og et får med den funksjon å inhibere økning av triglyceridnivået i blod.

Ved administrering av middelet ifølge denne oppfinnelse for inhibering av

økning av triglyceridnivået i blod for derved å rense fettholdig blod, blir det mulig å forebygge eller behandle fedme og hyperlipidemi hos mennesker og dyr såvel som kardiovaskulære sykdommer slik som hypertensjon og arteriosklerose i forbindelse dermed. Videre blir det mulig å forbedre kjøttkvaliteten av husdyr og oppdrettsfisk.

For høyt inntak av fett og sukker er kjent for å forårsake fedme, hyperlipidemi og lignende. Økning av triglycerid-, i det følgende av og til referert til som «TG», nivået i blod ved hyperlipidemi blir sagt å være en årsak som fører til forstyrrelser som hypertensjon og arteriosklerose. Det er derfor blitt gjort flere forsøk på å inhibere økning av TG-nivået i blod for å motvirke fedme og hyperlipidemi.

For å inhibere økning av TG-nivået i blod utføres for tiden diettrestriksjon, inntak av diettmatvarer (slik som fibre) og administrering av forskjellige farmasøytika. Som slike farmasøytika anvendes dekstransulfat som øker lipo-proteinlipaseaktiviteten i blodet, nikomol som inhiberer lipidabsorpsjonen, klofibrat og pravastatin som er midler som forbedrer lipidmetabolismen, og lignende.

Diettrestriksjon forårsaker imidlertid smerte for dem som praktiserer den, og bivirkninger forårsaket ved administreringen av de ovennevnte farmasøytika blir også fryktet. Det blir således ønsket utvikling av et middel for inhibering av økning av blodets TG-nivå og som har en sterkere effekt på inhibering av økningen av blodets TG-nivå og hvori det ikke er noen frykt for å forårsake bivirkninger.

På den annen side gis det for tiden konsentrert rør til husdyr og oppdrettsfisk for å befordre deres vekst. Som resultat forekommer det også abnormaliteter i fettmetabolismen hos slike husdyr og fisk, og TG-nivået i deres blod har tendens til å øke. På grunn av denne økning av TG-nivået i blodet vil fettinnholdet hos husdyr og oppdrettsfisk bli for høyt. Det å spise slike husdyr eller fisk vil således føre til for høyt fettinntak. Slike husdyr og fisk har videre gradvis sviktet når det gjelder å tilfredsstille forbrukerens krav til smak. I tillegg vil økningen av fettinnholdet beskrevet ovenfor være et alvorlig spørsmål i forbindelse med problemet med foravfall og også når det gjelder problemet med disponering av det fett som finnes i de slaktede skrotter. Inhibering av økningen av TG-nivået i blod er således et påtrengende behov spesielt i husdyravlen og i fiskeindustrien i Japan.

Nylig er det blitt innlevert en patentsøknad for et oligopeptidholdig materiale utviklet av noen forskere innbefattet en av de foreliggende oppfinnere (internasjonal publikasjon nr. WO89/06970), og en teknologi i likhet med denne er beskrevet i japansk ikke gransket patentsøknad nr. 2-154693.

Det er også gjort klart at spesifikke oligopeptider har lipidmetabolisme-forbedrende effekter innbefattet inhibering av økning i blodets TG-nivå (Kyoichi Kagawa, Food Chemical Monthly, 6:80 (1990); Chizuko Fukuhama et al., FOLIA PHARMACOLOGICA JAPONICA, 97:38 (1991)).

De oligopeptidholdige materialer beskrevet i patentpublikasjonen ovenfor, osv er blandinger av proteolysater, og således er aminosyresekvensene for deres virkelig aktive komponenter (dvs peptidene som deres aktive komponenter) enda ikke blitt oppklart.

Dette antyder at de ovennevnte peptidholdige materialer har lav renhet som farmasøytika. Når et slikt materiale blir tilsatt til en matvare, vil det dessuten være vanskelig kvantitativt å bestemme materialet separat fra andre peptider som inneholdes i matvaren, og kvalitetskontrollen vil således være et problem.

Det er derfor nødvendig å bestemme de virkelig aktive komponenter i de ovennevnte peptidholdige materialer, dvs de peptider som inhiberer økningen av TG-nivået i blod som aktive komponenter.

Det er formål ifølge den foreliggende oppfinnelse å analysere aminosyresekvensene for de ovenfor beskrevne peptider som aktive komponenter. Det er et annet formål ifølge den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et middel for å inhibere økningen av triglyceridnivået i blod omfattende de ovennevnte peptider som aktive komponenter; en fysiologisk funksjonell matvare som har den funksjon at den vil inhibere økning av triglyceridnivået i blod; og et for som har den funksjon at det vil inhibere økning av triglyceridnivået i blod.

Som resultat av intensiv og utstrakt forskning for å finne løsningen på problemene ovenfor, har de foreliggende oppfinnere funnet at problemene ovenfor kan løses ved oppfinnelsen beskrevet nedenfor.

Hovedinnholdet i den foreliggende oppfinnelse er som følger. I et første aspekt omfattes en peptidblanding bestående av et peptid som har en aminosyresekvens som vist i Sekvens ID Nr: 1 og minst ett av peptidene Val-Tyr-Pro og Val-Thr-Leu for inhibering av økning av triglyceridnivåer i blod.

I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse omfattes et middel for å inhibere økningen av triglyceridnivået i blod omfattende peptidblandingen i henhold til krav 1 som aktiv komponent.

I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse omfattes en matvare for spesiell helseanvendelse som har den funksjon å inhibere økningen av triglyceridnivået i blod, ved å omfatte en peptidblanding i henhold tilkrav 1 som aktiv komponent.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et for som har den funksjon at det vil inhibere økningen av triglyceridnivået i blod, ved å omfatte en peptidblanding i henhold til krav 1 som aktiv komponent.

Den foreliggende oppfinnelse skal beskrives i detalj heri nedenfor.

Peptidene ifølge denne oppfinnelse som har aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 og peptidene Val-Tyr-Pro og Val-Thr-Leu som kan inneholdes i middelet ifølge denne oppfinnelse som inhiberer økningen av triglyceridnivået i blod som aktive komponenter (i det følgende referert til som «peptidene ifølge denne oppfinnelse») kan separeres og renses fra naturlilg forekommende proteiner. Alternativt kan de syntetiseres direkte kjemisk ved konvensjonelle metoder. Det er også mulig å fremstille peptidene ifølge denne oppfinnelse ved modifisering av et gen som har en basesekvens tilsvarende peptidsekvensen ovenfor, ved innsetting av genet i en egnet ekspresjonsvektor, og uttrykke genet i en hensiktsmessig vert.

A. En fremgangsmåte for separasjon og rensing av peptidene ovenfor fra naturlig forekommende proteiner skal beskrives heri nedenfor.

Som utgangsmateriale for fremstilling av peptidene ifølge denne oppfinnelse kan anvendes en rekke forskjellige proteiner. For eksempel kan det anvendes et dyreprotein slik som fiskemelprotein, fiskepulver, globin osv eller et planteprotein slik som hvetegluten, soyabønnekasein osv.

Blant disse proteiner foretrekkes spesielt globinproteiner slik som hemoglobin og myoglobin, ved at de i høy grad kan frembringe den ønskede effekt ved å inhibere økningen av TG-nivået i blod.

Den dyreart som er kilden for et slikt globinprotein er ikke spesielt begrenset. Blod fra storfe, svin, sau, menneske, hest osv kan anvendes.

Det ovenfor nevnte protein bør deretter hydrolyseres. Operasjoner for denne hydrolyse gjennomføres ifølge fremgangsmåten beskrevet i internasjonal publikasjon nr. WO89/06970 ovenfor. Som hydrolase for denne hydrolyse kan det anvendes en eller flere hydrolaser valgt fra syreproteaser, nøytrale proteaser eller alkaliske proteaser.

De betingelser osv som skal anvendes ved hydrolyse av et globinprotein er beskrevet nedenfor.

Først dispergeres et globinproteinholdig materiale i vann under dannelse av et fastinnhold på 5-30 vekt%. Deretter justeres pH av denne blanding med syre eller alkali for å gi en optimal pH for protease(r). Deretter tilsettes protease(r) til denne blanding med en gang eller gradvis og omsettes ved 20-70°C i 3-48 timer for derved å oppnå hydrolyse.

Deretter blir det resulterende proteolysat tørket og kåket som det er, eller etter tilsetning dertil av en hensiktsmessig mengde fyllstoff slik som karboksymetylcellulose eller dekstrin. Således kan det oppnås et proteolysat som har den effekt at det vil inhibere økning av TG-nivået i blod.

Dette proteolysat inneholder peptidene ifølge denne oppfinnelse i minst 0,1 vekt%.

Deretter blir det enzymbehandlede proteolysat ifølge denne oppfinnelse renset. For slik rensning kan det anvendes konvensjonelle rensefremgangsmåter.

For eksempel kan det hensiktsmessig kombineres ioneveksling, ultrafiltrering, reversfasekromatografi osv for å rense de fraksjoner som inneholder et ønsket peptid.

Selv om operasjonene ved hjelp av ioneveksling eller ultrafiltrering ikke nødvendigvis er essensielle, blir det foretrukket å inkorporere dem i separasjons-og renseprosessen utifrå det synspunkt at de kan forbedre graden av separasjon og rensning.

Disse fraksjoner kan separeres og renses ved å kombinere reversfasekromatografi under sure betingelser og tilsvarende under nøytrale betingelser. Mengden av det ønskede peptid i en fraksjon kan bestemmes ved kjente metoder for proteinbestemmelse, f.eks ninhydrinmetoden.

Aminosyresekvensen for den således utvalgte fraksjon kan identifiseres ved kjente fremgangsmåter, og derved kan tilstedeværelsen av peptidene ifølge denne oppfinnelse bekreftes.

Peptidene ifølge denne oppfinnelse avledet fra den således separerte fraksjon, kan anvendes om en aktiv komponent av et middel for inhibering av økningen av TG-nivået i blod.

Fraksjonen selv kan også anvendes direkte som en aktiv komponent av middelet ovenfor.

Peptidene ifølge denne oppfinnelse kan syntetiseres kjemisk ved konvensjonelle peptidsyntesefremgangsmåter. For eksempel kan nevnes azid-metoden, syrekloridmetoden, syreanhydridmetoden, den blandede syreanhydrid-metode, DCC-metoden, den aktive estermetoden, karboimidazolmetoden, oksydasjons-reduksjonsmetoden, DCC-additiv (HOMB, HOBt, HOSu) metoden (se f.eks Schreder & Luhke, The Peptide. vol. 1 (1966), Academic Press, New York, USA; eller Izumiya et al., Pe<p>tide Svnthesis. Maruzen Co., Ltd. (1975)) og lignende.

I peptidsyntesemetoden angitt ovenfor kan det anvendes enten fastfase-syntese eller flytende fasesyntese.

I disse peptidsyntesemetoder blir aminosyrer med en sidekjedefunksjonell gruppe slik som tyrosin og treonin fortrinnsvis beskyttet i sine sidekjede-funksjonelle grupper. Som beskyttelsesgruppe kan det anvendes kjente beskyttelsesgrupper slik som en benzyloksykarbonylgruppe (Cbz-), t-butoksykarbonylgruppe (Boe-), benzylgruppe (Bz-), osv.

Avblokkering av en slik beskyttelsesgruppe kan gjennomføres under syntesefremgangsmåten for peptidene ifølge denne oppfinnelse ved konvensjonelle metoder.

B. Et middel for inhibering av økningen av TG-nivået i blod kan fremstilles ved anvendelse av peptidene ifølge denne oppfinnelse som aktive komponenter.

Som en bærer for middelet for inhibering av økningen av TG-nivået i blod kan det anvendes de eksipienter (slik som fyllstoffer, ekstendere, bindemidler, fuktighetsdannende midler, disintegreringsmidler, tensider) eller fortynningsmidler som vanligvis anvendes ved fremstilling av formuleringer, avhengig av formen for anvendelse av formuleringen. Fonnen av en formulering er ikke spesielt begrenset så lenge som formuleringen effektivt inneholder peptidene ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan formuleringen være i form av et fast middel slik som tabletter, pulver, granuler, piller; eller i form av et injeksjonsmiddel slik som løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Alternativt kan middelet ifølge denne oppfinnelse ha form av et tørt produkt som kan omdannes til flytende form ved tilsetning av en hensiktsmessig bærer før anvendelse. Hvilken som helst av disse former kan fremstilles ved konvensjonelle metoder.

Dosen av det således oppnådde middel for inhibering av økningen av TG-nivået i blod, blir hensiktsmessig valgt avhengig av fremgangsmåten og fonnen for administrering av formuleringen, tilstanden til pasienten som mottar formuleringen osv.

Generelt fremstilles en formulering inneholdende peptidene ifølge denne oppfinnelsen i ca 0,001 til 80 vekt%, og formuleringen administreres fortrinnsvis slik at mengden av peptidene ifølge oppfinnelsen blir administrert i ca 1 til 100 mg for en voksen pr dag. Administreringen gjennomføres ikke nødvendigvis bare en gang om dagen. Den kan gjennomføres 3 til 4 ganger om dagen.

De farmasøytiske formuleringer av forskjellige former som beskrevet ovenfor, kan administreres på en hensiktsmessig administreringsmåte avhengig av formen. For eksempel kan formuleringen i form av et injeksjonsmiddel administreres ved intravenøs, intramuskulær, subkutan, intrakutan eller intra-peritoneal administrering osv, og den farmasøytiske formulering i form av et fast middel kan administreres ved oral administrering osv.

C. En matvare for spesiell helseanvendelse (den såkalte fysiologisk

funksjonelle matvare) som har den funksjon at den inhiberer økningen av TG-nivå i blod, kan fremstilles ved anvendelse av peptidene ifølge denne oppfinnelse som aktive komponenter. Og peptidet ifølge denne oppfinnelse kan anvendes som en matvaretilsetning i vanlige matvarer.

Typene av matvarene ovenfor er ikke spesielt begrenset. Helsematvaren kan være anvendbar for melk, pudding, karryretter, lapskaus, stuing, kjøttsaus, skinke, kake, sjokolade og lignende.

Spesielt foretrekkes melk siden den kan lette inntaket av peptidene ifølge denne oppfinnelse som er vanskelige for barn å innta direkte pga smaken derav. Tilsetningen av peptidene ifølge denne oppfinnelse til matvarer slik som kake og sjokolade som i alt vesentlig befordrer fedme, vil også være ønskelig utifrå det synspunkt at fedmen som forårsakes ved inntaket av matvarene ovenfor, kan forebygges.

Den mengde av peptidene ifølge denne oppfinnelse som tilsettes til den fysiologisk funksjonelle matvare, blir hensiktsmessig valgt avhengig av typen av matvare, hensikten med tilsetningen, den effekt som ventes å fremkomme ved inntaket av matvaren osv.

Vanligvis blir det foretrukket å tillate matvaren å inneholde peptidene ifølge denne oppfinnelse slik at ca 0,1 til 4 mg av peptid(ene) ifølge oppfinnelsen kan tas pr måltid. D. Et for som har den funksjon å inhibere økningen av TG-nivå i blod hos husdyr osv, kan fremstilles ved å kombinere peptidene ifølge denne oppfinnelse som aktive komponenter med et for.

Det for som peptidene ifølge denne oppfinnelse blir kombinert med, kan være enten et for for husdyr slik som kuer, svin, kyllinger osv eller et f dr for oppdrettsfisk slik som sjøbrasme, unge "yellowtails" osv.

Mengden av peptidene ifølge denne oppfinnelse som blandes inn i et for, velges hensiktsmessig ut i fra typen av foret, den forventede effekt som skal frembringes ved inntaket av foret osv.

Generelt blir det foretrukket at peptidene ifølge denne oppfinnelse blir blandet inn i et f&r i en mengde på 0,1 til 4 vek%.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et gel kromatogram av et globinproteolysat.

Fig. 2 er et reversfase surt kromatogram i eksempel 1.

Fig. 3 er et reversfase nøytralt kromatogram i eksempel 1.

Den beste fremgangsmåte til å utføre oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse skal nå beskrives mere spesielt nedenfor med referanse til følgende eksempler.

Referanse-eksempel

Fremstilling av et globinproteolysat

En fremgangsmåte for fremstilling av et globinproteolysat ved anvendelse av bovine erytrocytter skal nå beskrives nedenfor i detalj. Molekylvektfordelingen av det resulterende globinproteolysat ble undersøkt ved gel filtreringskromatografi (fig. 1).

Gel filtreringskromatografien ble gjennomført under følgende betingelser. Utstyr: Høytrykks-væskekromatograf (SHIMADZU CORP.; modell LC-6A) Kolonne: PolyHYDROXYETHYL A, 5 nm, 9,4 x 200 mm (PolyC Inc.)

Mobilfase: 50 mM maursyre

Strømningshastighet: 0,5 ml/min

Påvisning: UV-absorpsjon (221 nm).

I korthet ble 250 I vann tilsatt til 100 kg friske bovine erytrocytter for å tillate tilstrekkelig hemolyse. Etter justering av pH til 2,8 med fosforsyre, ble tilsatt 2,6 x 10<7> enheter av syreprotease fra Aspergillus niger til løsningen og omsatt ved 50°C i 3 timer.

Etter reaksjonen ovenfor ble reaksjonsløsningen oppvarmet i 80°C i 30 min for å avslutte reaksjonen. Deretter ble tilsatt en vandig suspensjon av kalsium-hydroksyd til reaksjonsløsningen for å justere pH til 6,5. Deretter ble tilsatt 10 kg kiselgur og filtrert med en filterpresse. Det resulterende filtrat ble forstøvnings-tørket for derved å oppnå 23 kg av et globinproteolysat i pulverform.

Eksempel 1

Fraksjonering og rensning av peptider

Inhibering av økning av TG-nivået i blod

Peptidene ifølge denne oppfinnelse ble oppnådd ved fremgangsmåtene ifølge (1) ioneveksling, (2) ultrafiltrering, (3) separasjon ved reversfasekromatografi under sure betingelser, og (4) separasjon ved reversfasekromatografi under nøytrale betingelser.

Gjenvinningsforholdene etter disse fremgangsmåter er vist i tabell 1. Proteinmengdene ble bestemt ved ninhydrinmetoden.

(1) Ioneveksling

En 10 vekt% vandig løsning av globinproteolysatet ble tilsatt til en svakt sur kationbytterharpiks (Amberlite IRC50, H+<->form; Organo)og omrørt i 1 time for å tillate adsorpsjon. Deretter ble oppnådd den ikke-adsorberte fraksjon.

(2) Ultrafiltrering

Den ikke-adsorberte fraksjon oppnådd ved ioneveksling ble underkastet ultrafiltrering ved anvendelse av u It raf i Itre ri n gs utstyr av omrøringstypen (Advantec; modell UHP 90K) og en ultrafiltreirngsmembran (Advantec; UIIH-1; fraksjons-molekylvekt: 1000), og filtratet ble oppsamlet.

(3) Reversfase (sur) kromatografi (fig. 2)

Utstyr: Høytrykks-væskekromatograf (SHIMADZU CORP.; modell LC-10A) Kolonne: SuperPac Pep-S, 15 nm, 22,5 x 250 mm (PHARMACIA K.K.) Mobilfase: Vandig acetronitrilløsning inneholdende 0,1% trifluoreddiksyre; lineær konsentrasjonsgradient på 2-35% acetonitril; acetonitrilkonsentrasjonen ble forandret med en hastighet på 1 %/min Strømningshastighet: 5 ml/min

Temperatur: 40°C

Påvisning: UV-absorpsjon 220 nm

Retensjonstid: Fraksjon A: 39,9-40,9 min

Fraksjon A': (Sekvens ID Nr: 1): 53,8-54,5 min

(4) Reversfase (nøytral) kromatografi (fig. 3)

Utstyr: Høytrykks-væskekromatograf (SHIMADZU CORP.; modell LC-10A) Kolonne: SuperPac Pep-S, 15 um, 22,5 x 250 mm (PHARMACIA K.K.) Mobilfase: Vandig acetronitrilløsning inneholdende 20 mM ammoniumacetat-buffer (pH 6,5); lineær konsentrasjonsgradient på 0-25% acetonitril;

acetonitrilkonsentrasjonen ble forandret med en hastighet på

0,5%/min

Strømningshastighet: 5 ml/min

Temperatur: 40°C

Påvisning: UV-absorpsjon 220 nm

Retensjonstid: Fraksjon B: 41,7-43,2 min (Val-Thr-Leu)

FraksjonC: 45,8-51,0 min (Val-Tyr-Pro)

Eksempel 2

Kvantitativ bestemmelse av peptidene

Inhibering av økning av TG-konsentrasjonen i blod

Kvantitativ bestemmelse av peptidf raksjonene som har en aktivitet for å inhibere økningen av blod TG-konsentrasjonene i globinproteolysatet oppnådd i referanse-eksemplet ble gjennomført ifølge rensefremgangsmåtene for effektive peptider i eksempel 1.

Syrehydrolyse

En milliliter 6 N HCI ved sluttkonsentrasjonen ble tilsatt til 3-5 mg protein i et prøverør som ble forseglet under atmosfærisk trykk i ninhydrinmetoden og under redusert trykk for å gjennomføre aminosyreanalyse. Deretter ble røret oppvarmet ved 110°Ci 22 timer.

Ninhydrinmetoden

Prøvens pH etter hydrolyse ble justert til 5,0 med natriumhydroksyd, og deretter ble prøven omsatt med et ninhydrinreagens løst i 0,2 M citratbuffer (pH 5,0) ved 110°C i 15 minutter. Absorbansen ved 570 nm ble målt. Separat, som standardløsninger, ble vandige L-leucinløsninger (0,75, 150, 225, 300 nmol/ml) underkastet en ninhydrinreaksjon. Kalibreringskurver ble oppnådd fra den målte absorbans, og mengden av aminogrupper i prøven tilsvarende L-leucin ble beregnet.

Peptidkart

Utstyr: Høytrykks-væskekromatograf (SHIMADZU CORP.; modell LC-10A) Kolonne: Shim-pack ISC-07/S1504 Na, 7 um, 4,0 x 150 mm (SHIMADZU CORP.) Elueringsløsning: Aminosyre mobilfasekit (Na-type) fra SHIMADZU CORP.

Strømningshastighet: 0,3 ml/min

Temperatur: 55°C

Reaksjonsløsning 1: Analysekit OPA-reagens fra SHIMADZU CORP.

Påvisning: Fluorescensabsorpsjon (Ex 348 nm, Em 450 nm)

Standardløsning

Som standardløsning ble aminosyre blandet standardløsning omfattende 18 komponenter H-type (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) fortynnet 1:25 med 0,2 M citratbuffer (pH 2,20) og 10 uJ av denne fortynning ble påsatt (hver aminosyre:

1 nmol/10uJ).

Prøveløsning

Den syrehydrolyserte løsning ble konsentrert, tørket og kåket ved anvendelse av en rotasjonsfordamper, og tørket ytterligere under redusert trykk i mer enn 12 timer for derved å fjerne HCI fullstendig. Deretter ble den resulterende kake løst i 0,2 M citratbuffer (pH 2,20) slik at innholdet av hver aminosyre ble ca 100 nmol/ml. identifiseringen av aminosyrene og beregningen av topparealene ble gjennomført med Chromatopack C-R4A (SHIMADZU CORP.). Mengden av en aminosyre ble bestemt ved sammenligning med mengden av standardløsningen. Aminosyresammensetningen ble beregnet ut i fra forholdet av enkelte aminosyrer mot det totalt oppnådde aminosyretnnhold.

Resultatene er vist som utbytter i tabell 1 ovenfor.

Eksempel 3

Fremstilling av H-Val-Thr-Leu-OH ved kjemisk syntese

H-Val-Thr-Leu-OH ble syntetisert med en SAM2 peptid syntesemaskin (Biosearch) ifølge protokollen for denne syntesemaskin. I korthet ble 2 g acyloksymetylharpiks til hvilken var bundet 0,3 mmol av den 3. beskyttede aminosyre Boc-Leu-OH pr g, innført i reaktoren til peptidsyntesemaskinen ovenfor, og bragt i kontakt med en avblokkeringsløsning inneholdende 45% (v/v) trifluoreddiksyre (TFA), 2,5% (v/v) anisol og 52,5% (v/v) metylenklorid (DCM) i 20 min for derved å fjerne Boc-gruppen. Etter vasking med DCM ble harpiksen nøytralisert med DCM inneholdende 10% (v/v) diisopropyletylenamin og ytterligere vasket med DCM. Deretter ble harpiksen omsatt i en blandet løsning av 20 ml av DCM inneholdende 4,0 mmol av hver av Boc-Thr (Bz)-OH og henholdsvis diisopropylkarbodiimid (6,7 ganger den teoretiske ekvivalent) og dimetylformamid (DMF) i 2 timer ved romtemperatur. Deretter ble harpiksen vasket med DMF og DCM i rekkefølge for derved å oppnå Boc-Thr(Bz)-Leu-PAM-harpiks.

Ifølge en lignende fremgangsmåte ble Boc-Val-OH koplet.

Den således koplede beskyttede peptidharpiks ble omsatt i vannfri hydrogenfluorid inneholdende 10% (v/v) anisol ved 0°C i 1 time. Deretter ble hydrogenfluorid destillert av, og harpiksen ble vasket med eter. Ut i fra den resulterende blanding av peptider og harpiks ble peptidene ekstrahert med 50% eddiksyre og frysetørket for derved å oppnå ca 250 mg rå peptider.

De rå peptider ble løst i 0,1% TFA og deretter påsatt på en oktadecyl silika (ODS) kolonne (Cosmosil 5Cie, 250 x 20 mm; Nacalai Tesque) med en lineær konsentrasjonsgradient av acetonitril inneholdende 0,1% TFA (20-70%/50 min, 10 ml/min). Peptidet av interesse ble eluert ved en acetonitrilkonsentrasjon på ca 50%.

Eksempel 4

Fremstilling av et peptid med aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 ved kjemisk syntese

Et peptid med aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 ble syntetisert med SAM2 peptidsynteseapparatet beskrevet ovenfor ifølge protokollen for dette synteseapparat. I korthet ble 2 g acyloksymetylharpiks hvortil var bundet 0,3 mmol av den 7. beskyttede aminosyre Boc-Thr(Bz)-OH pr g, innført i reaktoren til peptidsynteseapparatet ovenfor, og bragt i kontakt med en avblokkeringsløsning inneholdende 45% (v/v) trifluoreddiksyre (TFA), 2,5% (v/v) anisol og 52,5% (v/v) metylenklorid (DCM)i 20 min for derved å fjerne Boc-gruppen. Etter vasking med DCM ble harpiksen nøytralisert med DCM inneholdende 10% (v/v) diisopropyletylenamin og ytterligere vasket med DCM. Deretter ble harpiksen omsatt i en blandet løsning av 20 ml av DCM inneholdende 4,0 mmol av hver av Boc-Trp-OH og henholdsvis diisopropylkarbodiimid (6,7 ganger den teoretiske ekvivalent) og DMF i 2 timer ved romtemperatur. Deretter ble harpiksen vasket med DMF og DCM i rekkefølge for derved å oppnå Boc-Trp-Thr(Bz)-PAM-harpiks.

Ifølge en lignende fremgangsmåte ble Boc-Pro-OH, Boc-Tyr(BrZ)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Val-OH og Boc-Leu-OH koplet i denne rekkefølge.

Deretter ble peptidene ekstrahert som beskrevet i eksempel 3 ovenfor og frysetørket for derved å oppnå ca 500 mg rå peptider. Disse rå peptider ble fremkalt i en ODS-kolonne som beskrevet i eksempel 3 ovenfor. Peptidet av interesse ble eluert ved en acetonitrilkonsentrasjon på ca 30%.

Eksempel 5

Fremstilling av matvarer inneholdende peptidene ifølge denne oppfinnelse (1) Fremstilling av melkepulver i. Til 100 g melkepulver for spebarn ble tilsatt 0,1 g av peptidet H-Val-Thr-Leu-OH syntetisert i eksempel 3 ovenfor, for derved å fremstille et melkepulver som har den funksjon å inhibere økning av TG-nivået i blod. ii. Til 100 g melkepulver for spebarn ble tilsatt 0,1 g av peptidet som har aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 syntetisert i eksempel 4 ovenfor, for derved å fremstille et melkepulver med den funksjon å inhibere økning av TG-nivået i blod.

(2) Fremstilling av sjokolade

i. Til 100 g sjokolade ble tilsatt 0,5 g av peptidet H-Val-Thr-Leu-OH syntetisert i eksempel 3 ovenfor, for derved å fremstille en sjokolade med den funksjon å inhibere økning av TG-nivået i blod. ii. Til 100 g sjokolade ble tilsatt 0,5 g av peptidet med aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 syntetisert i eksempel 4, for derved å fremstille en sjokolade med funksjonen å inhibere økning av TG-nivået i blod.

Eksempel 6

Fremstilling av et for inneholdende peptidene ifølge denne oppfinnelse

Peptidet H-Val-Thr-Leu-OH syntetisert i eksempel 3 og peptidet med aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 ble enkeltvis tilsatt til en forblanding inneholdende vitaminer, mineraler osv i en mengde på 1 vekt%. Hver av de resulterende forblandinger ble tilsatt til et kommersielt for for oppdrettsfisk med en mengde på 10 vekt% for derved å fremstille et for for oppdrettsfisk og med den funksjon å inhibere økning av TG-nivået i blod.

Testeksempel 1

Effekt ( in vivo) av de kjemisk syntetiserte midler for inhibering av økningen av TG-nivået i blod

Serum TG-økningsinhiberingsvirkningen på tidspunktet for in vivo lipid-administrering ble undersøkt på de tre peptider ifølge oppfinnelsen som inhiberer økningen av TG-nivået i blod (dvs peptidet med aminosyresekvensen av Sekvens !D Nr: 1 og peptidene Val-Thr-Leu og Val-Tyr-Pro syntetisert ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4). Friske albinomus (5-10 uker gamle; kroppsvekt ca 20-30

g) ble anvendt i dette eksperiment. Til hver mus ble administrert oralt 250 mg olilvenolje og en vandig løsning av peptidet ovenfor. Tre timer deretter ble blod

oppsamlet under anestesi med Nembutal. Etter separasjon av blodet ble TG-nivået i blod bestemt. Resultatene er vist i tabell 2.

Det viser seg at alle de tre peptider ifølge oppfinnelsen inhiberte økning av TG-nivået i blod. Spesielt peptidet med aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 hadde en spesifikk aktivitet 50000 ganger så høy som den for proteolysatpeptidet. På den annen side, selv om spesifikke aktiviteter for de andre to peptider var ca 1/1000 sammenlignet med peptidet med Sekvens ID Nr: 1, hadde de spesifikke aktiviteter mer enn 50 ganger aktiviteten av proteolysatpeptidet.

Testeksempel 2

Sikkerhetstest for peptidene ifølge oppfinnelsen

Peptidene ifølge denne oppfinnelse (dvs peptidet med aminosyresekvensen i Sekvens ID Nr: 1 og peptidene Val-Thr-Leu og Val-Tyr-Pro) ble administrert oralt til ICR hannmus og hunmus med en dose på 10 g/kg kroppsvekt eller mer (maksimal mulig dose) i forskjellige forhold (0:1,1:1,1:0). Resultatet var at ingen døde.

Industriell anvendbarhet

Ifølge den foreliggende oppfinnelse oppnås en peptidblanding som inhiberer økning av triglyceridnivået i blod, et middel for inhibering av økningen av triglyceridnivået i blod omfattende peptidblandingen som en aktiv komponent; en matvare for spesifisert helseanvendelse (den såkalte fysiologisk funksjonelle matvare) med den funksjon å inhibere økning av triglyceridnivået i blod; og et for med den funksjon å inhibere økning av triglyceridnivået i blod.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse blir det mulig å forebygge eller behandle fedme og hyperlipidemi hos mennesker eller dyr, og kardiovaskulære sykdommer slik som hypertensjon og arteriosklerose i forbindelse dermed. Dessuten blir det mulig å forbedre kjøttkvaliteten av husdyr og oppdrettsfisk.

Claims (4)

1. Peptidblanding bestående av et peptid som har en aminosyresekvens som vist i Sekvens ID Nr: 1 og minst ett av peptidene Val-Tyr-Pro og Val-Thr-Leu for inhibering av økning av triglyceridnivåer i blod.

2. Middel for inhibering av økning av triglyceridnivåer i blod, karakterisert ved at det omfatter peptidblandingen i henhold til krav 1 som aktiv komponent.

3. Matvare for spesifisert helseanvendelse og som har den funksjon å inhibere økning av triglyceridnivåer i blod, karakterisert ved at den omfatter en peptidblanding i henhold til krav 1 som aktiv komponent.

4. For som har den funksjon at det inhiberer økning av triglyceridnivåer i blod, karakterisert ved at det omfatteren peptidblanding i henhold til krav 1 som aktiv komponent.