NO318683B1

NO318683B1 - Peptide composition and agent which inhibits the increase of blood triglyceride levels, as well as food and feed comprising the peptide mixture.

Info

Publication number: NO318683B1
Application number: NO19976042A
Authority: NO
Inventors: Kyoichi Kagawa; Hisako Matsutaka; Chizuko Fukuhama; Masahiro Numata; Toyoo Nakamura; Shigeaki Watanabe; Kazuhisa Honda
Original assignee: Mg Pharma Inc
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1997-12-22
Publication date: 2005-04-25
Also published as: NO976042D0; NO976042L

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en peptidblanding og et middel som inhiberer økning av triglyceridnivåer i blod; middelet for inhibering av økningen av triglyceridnivået i blod omfatter nevnte peptidblanding som aktiv bestanddel; en matvare for spesifisert helseanvendelse (en såkalt fysiologisk funksjonell matvare) som har den funksjon at den vil inhibere økning av triglyceridnivået i blod; og et får med den funksjon å inhibere økning av triglyceridnivået i blod. The present invention relates to a peptide mixture and an agent that inhibits the increase of triglyceride levels in blood; the agent for inhibiting the increase of the triglyceride level in blood comprises said peptide mixture as an active ingredient; a foodstuff for specified health use (a so-called physiologically functional foodstuff) which has the function of inhibiting the increase of the triglyceride level in the blood; and a sheep with the function of inhibiting an increase in the triglyceride level in the blood.

Ved administrering av middelet ifølge denne oppfinnelse for inhibering av When administering the agent according to this invention for the inhibition of

økning av triglyceridnivået i blod for derved å rense fettholdig blod, blir det mulig å forebygge eller behandle fedme og hyperlipidemi hos mennesker og dyr såvel som kardiovaskulære sykdommer slik som hypertensjon og arteriosklerose i forbindelse dermed. Videre blir det mulig å forbedre kjøttkvaliteten av husdyr og oppdrettsfisk. increasing the triglyceride level in blood to thereby purify fatty blood, it becomes possible to prevent or treat obesity and hyperlipidemia in humans and animals as well as cardiovascular diseases such as hypertension and arteriosclerosis in connection therewith. Furthermore, it will be possible to improve the meat quality of livestock and farmed fish.

For høyt inntak av fett og sukker er kjent for å forårsake fedme, hyperlipidemi og lignende. Økning av triglycerid-, i det følgende av og til referert til som «TG», nivået i blod ved hyperlipidemi blir sagt å være en årsak som fører til forstyrrelser som hypertensjon og arteriosklerose. Det er derfor blitt gjort flere forsøk på å inhibere økning av TG-nivået i blod for å motvirke fedme og hyperlipidemi. Excessive intake of fat and sugar is known to cause obesity, hyperlipidaemia and the like. An increase in triglyceride, hereinafter sometimes referred to as "TG", level in blood in hyperlipidemia is said to be a cause leading to disorders such as hypertension and arteriosclerosis. Several attempts have therefore been made to inhibit increases in the TG level in blood to counteract obesity and hyperlipidaemia.

For å inhibere økning av TG-nivået i blod utføres for tiden diettrestriksjon, inntak av diettmatvarer (slik som fibre) og administrering av forskjellige farmasøytika. Som slike farmasøytika anvendes dekstransulfat som øker lipo-proteinlipaseaktiviteten i blodet, nikomol som inhiberer lipidabsorpsjonen, klofibrat og pravastatin som er midler som forbedrer lipidmetabolismen, og lignende. In order to inhibit the increase of the TG level in blood, dietary restriction, intake of diet foods (such as fibres) and administration of various pharmaceuticals are currently carried out. As such pharmaceuticals, dextran sulphate is used which increases lipoprotein lipase activity in the blood, nicomol which inhibits lipid absorption, clofibrate and pravastatin which are agents which improve lipid metabolism, and the like.

Diettrestriksjon forårsaker imidlertid smerte for dem som praktiserer den, og bivirkninger forårsaket ved administreringen av de ovennevnte farmasøytika blir også fryktet. Det blir således ønsket utvikling av et middel for inhibering av økning av blodets TG-nivå og som har en sterkere effekt på inhibering av økningen av blodets TG-nivå og hvori det ikke er noen frykt for å forårsake bivirkninger. However, dietary restriction causes pain to those who practice it, and side effects caused by the administration of the above pharmaceuticals are also feared. The development of an agent for inhibiting the increase of the blood TG level and which has a stronger effect on inhibiting the increase of the blood TG level and in which there is no fear of causing side effects is thus desired.

På den annen side gis det for tiden konsentrert rør til husdyr og oppdrettsfisk for å befordre deres vekst. Som resultat forekommer det også abnormaliteter i fettmetabolismen hos slike husdyr og fisk, og TG-nivået i deres blod har tendens til å øke. På grunn av denne økning av TG-nivået i blodet vil fettinnholdet hos husdyr og oppdrettsfisk bli for høyt. Det å spise slike husdyr eller fisk vil således føre til for høyt fettinntak. Slike husdyr og fisk har videre gradvis sviktet når det gjelder å tilfredsstille forbrukerens krav til smak. I tillegg vil økningen av fettinnholdet beskrevet ovenfor være et alvorlig spørsmål i forbindelse med problemet med foravfall og også når det gjelder problemet med disponering av det fett som finnes i de slaktede skrotter. Inhibering av økningen av TG-nivået i blod er således et påtrengende behov spesielt i husdyravlen og i fiskeindustrien i Japan. On the other hand, concentrated sugarcane is currently given to livestock and farmed fish to promote their growth. As a result, abnormalities in fat metabolism also occur in such livestock and fish, and the TG level in their blood tends to increase. Due to this increase in the TG level in the blood, the fat content of livestock and farmed fish will be too high. Eating such livestock or fish will thus lead to excessive fat intake. Such livestock and fish have also gradually failed when it comes to satisfying the consumer's taste requirements. In addition, the increase in fat content described above will be a serious issue in connection with the problem of waste and also with regard to the problem of disposal of the fat found in the slaughtered carcasses. Inhibition of the increase of the TG level in blood is thus an urgent need especially in livestock breeding and in the fishing industry in Japan.

Nylig er det blitt innlevert en patentsøknad for et oligopeptidholdig materiale utviklet av noen forskere innbefattet en av de foreliggende oppfinnere (internasjonal publikasjon nr. WO89/06970), og en teknologi i likhet med denne er beskrevet i japansk ikke gransket patentsøknad nr. 2-154693. Recently, a patent application has been filed for an oligopeptide-containing material developed by some researchers including one of the present inventors (International Publication No. WO89/06970), and a technology similar to this is described in Japanese Unexamined Patent Application No. 2-154693 .

Det er også gjort klart at spesifikke oligopeptider har lipidmetabolisme-forbedrende effekter innbefattet inhibering av økning i blodets TG-nivå (Kyoichi Kagawa, Food Chemical Monthly, 6:80 (1990); Chizuko Fukuhama et al., FOLIA PHARMACOLOGICA JAPONICA, 97:38 (1991)). It has also been made clear that specific oligopeptides have lipid metabolism-improving effects including inhibition of increases in blood TG levels (Kyoichi Kagawa, Food Chemical Monthly, 6:80 (1990); Chizuko Fukuhama et al., FOLIA PHARMACOLOGICA JAPONICA, 97:38 (1991)).

De oligopeptidholdige materialer beskrevet i patentpublikasjonen ovenfor, osv er blandinger av proteolysater, og således er aminosyresekvensene for deres virkelig aktive komponenter (dvs peptidene som deres aktive komponenter) enda ikke blitt oppklart. The oligopeptide-containing materials described in the patent publication above, etc. are mixtures of proteolysates, and thus the amino acid sequences of their truly active components (ie the peptides as their active components) have not yet been elucidated.

Dette antyder at de ovennevnte peptidholdige materialer har lav renhet som farmasøytika. Når et slikt materiale blir tilsatt til en matvare, vil det dessuten være vanskelig kvantitativt å bestemme materialet separat fra andre peptider som inneholdes i matvaren, og kvalitetskontrollen vil således være et problem. This suggests that the above peptide-containing materials are of low purity as pharmaceuticals. When such a material is added to a food, it will also be difficult to quantitatively determine the material separately from other peptides contained in the food, and quality control will thus be a problem.

Det er derfor nødvendig å bestemme de virkelig aktive komponenter i de ovennevnte peptidholdige materialer, dvs de peptider som inhiberer økningen av TG-nivået i blod som aktive komponenter. It is therefore necessary to determine the truly active components in the above-mentioned peptide-containing materials, i.e. the peptides that inhibit the increase of the TG level in blood as active components.

Det er formål ifølge den foreliggende oppfinnelse å analysere aminosyresekvensene for de ovenfor beskrevne peptider som aktive komponenter. Det er et annet formål ifølge den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et middel for å inhibere økningen av triglyceridnivået i blod omfattende de ovennevnte peptider som aktive komponenter; en fysiologisk funksjonell matvare som har den funksjon at den vil inhibere økning av triglyceridnivået i blod; og et for som har den funksjon at det vil inhibere økning av triglyceridnivået i blod. It is the purpose of the present invention to analyze the amino acid sequences for the above-described peptides as active components. It is another object according to the present invention to provide a means for inhibiting the increase of the triglyceride level in blood comprising the above-mentioned peptides as active components; a physiologically functional food which has the function of inhibiting the increase of the triglyceride level in the blood; and one for which has the function of inhibiting an increase in the triglyceride level in the blood.

Som resultat av intensiv og utstrakt forskning for å finne løsningen på problemene ovenfor, har de foreliggende oppfinnere funnet at problemene ovenfor kan løses ved oppfinnelsen beskrevet nedenfor. As a result of intensive and extensive research to find the solution to the above problems, the present inventors have found that the above problems can be solved by the invention described below.

Hovedinnholdet i den foreliggende oppfinnelse er som følger. I et første aspekt omfattes en peptidblanding bestående av et peptid som har en aminosyresekvens som vist i Sekvens ID Nr: 1 og minst ett av peptidene Val-Tyr-Pro og Val-Thr-Leu for inhibering av økning av triglyceridnivåer i blod. The main content of the present invention is as follows. In a first aspect, a peptide mixture consisting of a peptide having an amino acid sequence as shown in Sequence ID No: 1 and at least one of the peptides Val-Tyr-Pro and Val-Thr-Leu is included for inhibiting the increase of triglyceride levels in blood.

I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse omfattes et middel for å inhibere økningen av triglyceridnivået i blod omfattende peptidblandingen i henhold til krav 1 som aktiv komponent. In another aspect of the present invention, an agent for inhibiting the increase of the triglyceride level in blood comprising the peptide mixture according to claim 1 as active component is included.

I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse omfattes en matvare for spesiell helseanvendelse som har den funksjon å inhibere økningen av triglyceridnivået i blod, ved å omfatte en peptidblanding i henhold tilkrav 1 som aktiv komponent. In a further aspect of the present invention, a food product for special health use is included which has the function of inhibiting the increase of the triglyceride level in blood, by including a peptide mixture according to claim 1 as an active component.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et for som har den funksjon at det vil inhibere økningen av triglyceridnivået i blod, ved å omfatte en peptidblanding i henhold til krav 1 som aktiv komponent. The present invention also relates to a lining which has the function of inhibiting the increase of the triglyceride level in blood, by including a peptide mixture according to claim 1 as an active component.

Den foreliggende oppfinnelse skal beskrives i detalj heri nedenfor. The present invention shall be described in detail hereinbelow.

Peptidene ifølge denne oppfinnelse som har aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 og peptidene Val-Tyr-Pro og Val-Thr-Leu som kan inneholdes i middelet ifølge denne oppfinnelse som inhiberer økningen av triglyceridnivået i blod som aktive komponenter (i det følgende referert til som «peptidene ifølge denne oppfinnelse») kan separeres og renses fra naturlilg forekommende proteiner. Alternativt kan de syntetiseres direkte kjemisk ved konvensjonelle metoder. Det er også mulig å fremstille peptidene ifølge denne oppfinnelse ved modifisering av et gen som har en basesekvens tilsvarende peptidsekvensen ovenfor, ved innsetting av genet i en egnet ekspresjonsvektor, og uttrykke genet i en hensiktsmessig vert. The peptides according to this invention which have the amino acid sequence shown in Sequence ID No: 1 and the peptides Val-Tyr-Pro and Val-Thr-Leu which can be contained in the agent according to this invention which inhibits the increase of the triglyceride level in blood as active components (hereinafter referred to to which "the peptides according to this invention") can be separated and purified from naturally occurring proteins. Alternatively, they can be synthesized directly chemically by conventional methods. It is also possible to produce the peptides according to this invention by modifying a gene which has a base sequence corresponding to the peptide sequence above, by inserting the gene into a suitable expression vector, and expressing the gene in a suitable host.

A. En fremgangsmåte for separasjon og rensing av peptidene ovenfor fra naturlig forekommende proteiner skal beskrives heri nedenfor. A. A method for the separation and purification of the above peptides from naturally occurring proteins shall be described hereinbelow.

Som utgangsmateriale for fremstilling av peptidene ifølge denne oppfinnelse kan anvendes en rekke forskjellige proteiner. For eksempel kan det anvendes et dyreprotein slik som fiskemelprotein, fiskepulver, globin osv eller et planteprotein slik som hvetegluten, soyabønnekasein osv. A number of different proteins can be used as starting material for the production of the peptides according to this invention. For example, an animal protein such as fish meal protein, fish powder, globin etc. or a plant protein such as wheat gluten, soybean casein etc. can be used.

Blant disse proteiner foretrekkes spesielt globinproteiner slik som hemoglobin og myoglobin, ved at de i høy grad kan frembringe den ønskede effekt ved å inhibere økningen av TG-nivået i blod. Among these proteins, globin proteins such as hemoglobin and myoglobin are particularly preferred, in that they can produce the desired effect to a high degree by inhibiting the increase in the TG level in blood.

Den dyreart som er kilden for et slikt globinprotein er ikke spesielt begrenset. Blod fra storfe, svin, sau, menneske, hest osv kan anvendes. The animal species which is the source of such a globin protein is not particularly limited. Blood from cattle, pigs, sheep, humans, horses, etc. can be used.

Det ovenfor nevnte protein bør deretter hydrolyseres. Operasjoner for denne hydrolyse gjennomføres ifølge fremgangsmåten beskrevet i internasjonal publikasjon nr. WO89/06970 ovenfor. Som hydrolase for denne hydrolyse kan det anvendes en eller flere hydrolaser valgt fra syreproteaser, nøytrale proteaser eller alkaliske proteaser. The above-mentioned protein should then be hydrolysed. Operations for this hydrolysis are carried out according to the method described in International Publication No. WO89/06970 above. As hydrolase for this hydrolysis, one or more hydrolases selected from acid proteases, neutral proteases or alkaline proteases can be used.

De betingelser osv som skal anvendes ved hydrolyse av et globinprotein er beskrevet nedenfor. The conditions etc. to be used for hydrolysis of a globin protein are described below.

Først dispergeres et globinproteinholdig materiale i vann under dannelse av et fastinnhold på 5-30 vekt%. Deretter justeres pH av denne blanding med syre eller alkali for å gi en optimal pH for protease(r). Deretter tilsettes protease(r) til denne blanding med en gang eller gradvis og omsettes ved 20-70°C i 3-48 timer for derved å oppnå hydrolyse. First, a globin protein-containing material is dispersed in water, forming a solids content of 5-30% by weight. The pH of this mixture is then adjusted with acid or alkali to provide an optimal pH for protease(s). Protease(s) are then added to this mixture at once or gradually and reacted at 20-70°C for 3-48 hours to thereby achieve hydrolysis.

Deretter blir det resulterende proteolysat tørket og kåket som det er, eller etter tilsetning dertil av en hensiktsmessig mengde fyllstoff slik som karboksymetylcellulose eller dekstrin. Således kan det oppnås et proteolysat som har den effekt at det vil inhibere økning av TG-nivået i blod. The resulting proteolysate is then dried and digested as it is, or after adding thereto an appropriate amount of filler such as carboxymethyl cellulose or dextrin. Thus, a proteolysate can be obtained which has the effect of inhibiting an increase in the TG level in blood.

Dette proteolysat inneholder peptidene ifølge denne oppfinnelse i minst 0,1 vekt%. This proteolysate contains the peptides according to this invention in at least 0.1% by weight.

Deretter blir det enzymbehandlede proteolysat ifølge denne oppfinnelse renset. For slik rensning kan det anvendes konvensjonelle rensefremgangsmåter. The enzyme-treated proteolysate according to this invention is then purified. Conventional cleaning methods can be used for such cleaning.

For eksempel kan det hensiktsmessig kombineres ioneveksling, ultrafiltrering, reversfasekromatografi osv for å rense de fraksjoner som inneholder et ønsket peptid. For example, ion exchange, ultrafiltration, reverse phase chromatography, etc. can be suitably combined to purify the fractions containing a desired peptide.

Selv om operasjonene ved hjelp av ioneveksling eller ultrafiltrering ikke nødvendigvis er essensielle, blir det foretrukket å inkorporere dem i separasjons-og renseprosessen utifrå det synspunkt at de kan forbedre graden av separasjon og rensning. Although the operations by means of ion exchange or ultrafiltration are not necessarily essential, it is preferred to incorporate them into the separation and purification process from the point of view that they can improve the degree of separation and purification.

Disse fraksjoner kan separeres og renses ved å kombinere reversfasekromatografi under sure betingelser og tilsvarende under nøytrale betingelser. Mengden av det ønskede peptid i en fraksjon kan bestemmes ved kjente metoder for proteinbestemmelse, f.eks ninhydrinmetoden. These fractions can be separated and purified by combining reverse phase chromatography under acidic conditions and correspondingly under neutral conditions. The amount of the desired peptide in a fraction can be determined by known methods for protein determination, for example the ninhydrin method.

Aminosyresekvensen for den således utvalgte fraksjon kan identifiseres ved kjente fremgangsmåter, og derved kan tilstedeværelsen av peptidene ifølge denne oppfinnelse bekreftes. The amino acid sequence for the thus selected fraction can be identified by known methods, and thereby the presence of the peptides according to this invention can be confirmed.

Peptidene ifølge denne oppfinnelse avledet fra den således separerte fraksjon, kan anvendes om en aktiv komponent av et middel for inhibering av økningen av TG-nivået i blod. The peptides according to this invention, derived from the thus separated fraction, can be used as an active component of an agent for inhibiting the increase of the TG level in blood.

Fraksjonen selv kan også anvendes direkte som en aktiv komponent av middelet ovenfor. The fraction itself can also be used directly as an active component of the above remedy.

Peptidene ifølge denne oppfinnelse kan syntetiseres kjemisk ved konvensjonelle peptidsyntesefremgangsmåter. For eksempel kan nevnes azid-metoden, syrekloridmetoden, syreanhydridmetoden, den blandede syreanhydrid-metode, DCC-metoden, den aktive estermetoden, karboimidazolmetoden, oksydasjons-reduksjonsmetoden, DCC-additiv (HOMB, HOBt, HOSu) metoden (se f.eks Schreder & Luhke, The Peptide. vol. 1 (1966), Academic Press, New York, USA; eller Izumiya et al., Pe<p>tide Svnthesis. Maruzen Co., Ltd. (1975)) og lignende. The peptides of this invention can be synthesized chemically by conventional peptide synthesis methods. Examples include the azide method, the acid chloride method, the acid anhydride method, the mixed acid anhydride method, the DCC method, the active ester method, the carboimidazole method, the oxidation-reduction method, the DCC additive (HOMB, HOBt, HOSu) method (see e.g. Schreder & Luhke, The Peptide. vol. 1 (1966), Academic Press, New York, USA; or Izumiya et al., Peptide Synthesis. Maruzen Co., Ltd. (1975)) and the like.

I peptidsyntesemetoden angitt ovenfor kan det anvendes enten fastfase-syntese eller flytende fasesyntese. In the peptide synthesis method indicated above, either solid phase synthesis or liquid phase synthesis can be used.

I disse peptidsyntesemetoder blir aminosyrer med en sidekjedefunksjonell gruppe slik som tyrosin og treonin fortrinnsvis beskyttet i sine sidekjede-funksjonelle grupper. Som beskyttelsesgruppe kan det anvendes kjente beskyttelsesgrupper slik som en benzyloksykarbonylgruppe (Cbz-), t-butoksykarbonylgruppe (Boe-), benzylgruppe (Bz-), osv. In these peptide synthesis methods, amino acids with a side chain functional group such as tyrosine and threonine are preferably protected in their side chain functional groups. As a protecting group, known protecting groups such as a benzyloxycarbonyl group (Cbz-), t-butoxycarbonyl group (Boe-), benzyl group (Bz-), etc. can be used.

Avblokkering av en slik beskyttelsesgruppe kan gjennomføres under syntesefremgangsmåten for peptidene ifølge denne oppfinnelse ved konvensjonelle metoder. Unblocking of such a protecting group can be carried out during the synthesis process for the peptides according to this invention by conventional methods.

B. Et middel for inhibering av økningen av TG-nivået i blod kan fremstilles ved anvendelse av peptidene ifølge denne oppfinnelse som aktive komponenter. B. An agent for inhibiting the increase of the TG level in blood can be prepared by using the peptides according to this invention as active components.

Som en bærer for middelet for inhibering av økningen av TG-nivået i blod kan det anvendes de eksipienter (slik som fyllstoffer, ekstendere, bindemidler, fuktighetsdannende midler, disintegreringsmidler, tensider) eller fortynningsmidler som vanligvis anvendes ved fremstilling av formuleringer, avhengig av formen for anvendelse av formuleringen. Fonnen av en formulering er ikke spesielt begrenset så lenge som formuleringen effektivt inneholder peptidene ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan formuleringen være i form av et fast middel slik som tabletter, pulver, granuler, piller; eller i form av et injeksjonsmiddel slik som løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Alternativt kan middelet ifølge denne oppfinnelse ha form av et tørt produkt som kan omdannes til flytende form ved tilsetning av en hensiktsmessig bærer før anvendelse. Hvilken som helst av disse former kan fremstilles ved konvensjonelle metoder. As a carrier for the agent for inhibiting the increase of the TG level in blood, the excipients (such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, surfactants) or diluents that are usually used in the preparation of formulations can be used, depending on the form of application of the formulation. The nature of a formulation is not particularly limited as long as the formulation effectively contains the peptides according to the invention. For example, the formulation may be in the form of a solid agent such as tablets, powders, granules, pills; or in the form of an injectable such as solutions, suspensions and emulsions. Alternatively, the agent according to this invention can take the form of a dry product which can be converted into liquid form by adding a suitable carrier before use. Any of these forms can be produced by conventional methods.

Dosen av det således oppnådde middel for inhibering av økningen av TG-nivået i blod, blir hensiktsmessig valgt avhengig av fremgangsmåten og fonnen for administrering av formuleringen, tilstanden til pasienten som mottar formuleringen osv. The dose of the thus obtained agent for inhibiting the increase of the TG level in blood is appropriately selected depending on the method and mode of administration of the formulation, the condition of the patient receiving the formulation, etc.

Generelt fremstilles en formulering inneholdende peptidene ifølge denne oppfinnelsen i ca 0,001 til 80 vekt%, og formuleringen administreres fortrinnsvis slik at mengden av peptidene ifølge oppfinnelsen blir administrert i ca 1 til 100 mg for en voksen pr dag. Administreringen gjennomføres ikke nødvendigvis bare en gang om dagen. Den kan gjennomføres 3 til 4 ganger om dagen. In general, a formulation is prepared containing the peptides according to this invention in about 0.001 to 80% by weight, and the formulation is preferably administered so that the amount of the peptides according to the invention is administered in about 1 to 100 mg for an adult per day. The administration is not necessarily carried out only once a day. It can be carried out 3 to 4 times a day.

De farmasøytiske formuleringer av forskjellige former som beskrevet ovenfor, kan administreres på en hensiktsmessig administreringsmåte avhengig av formen. For eksempel kan formuleringen i form av et injeksjonsmiddel administreres ved intravenøs, intramuskulær, subkutan, intrakutan eller intra-peritoneal administrering osv, og den farmasøytiske formulering i form av et fast middel kan administreres ved oral administrering osv. The pharmaceutical formulations of various forms as described above can be administered in an appropriate mode of administration depending on the form. For example, the formulation in the form of an injectable agent can be administered by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intracutaneous or intra-peritoneal administration, etc., and the pharmaceutical formulation in the form of a solid agent can be administered by oral administration, etc.

C. En matvare for spesiell helseanvendelse (den såkalte fysiologisk C. A food product for special health use (the so-called physiological

funksjonelle matvare) som har den funksjon at den inhiberer økningen av TG-nivå i blod, kan fremstilles ved anvendelse av peptidene ifølge denne oppfinnelse som aktive komponenter. Og peptidet ifølge denne oppfinnelse kan anvendes som en matvaretilsetning i vanlige matvarer. functional food) which has the function of inhibiting the increase of TG level in blood, can be produced by using the peptides according to this invention as active components. And the peptide according to this invention can be used as a food additive in ordinary foods.

Typene av matvarene ovenfor er ikke spesielt begrenset. Helsematvaren kan være anvendbar for melk, pudding, karryretter, lapskaus, stuing, kjøttsaus, skinke, kake, sjokolade og lignende. The types of the above foods are not particularly limited. The health food can be used for milk, pudding, curries, stew, stew, meat sauce, ham, cake, chocolate and the like.

Spesielt foretrekkes melk siden den kan lette inntaket av peptidene ifølge denne oppfinnelse som er vanskelige for barn å innta direkte pga smaken derav. Tilsetningen av peptidene ifølge denne oppfinnelse til matvarer slik som kake og sjokolade som i alt vesentlig befordrer fedme, vil også være ønskelig utifrå det synspunkt at fedmen som forårsakes ved inntaket av matvarene ovenfor, kan forebygges. In particular, milk is preferred since it can facilitate the intake of the peptides according to this invention which are difficult for children to ingest directly due to their taste. The addition of the peptides according to this invention to foods such as cake and chocolate, which essentially promote obesity, would also be desirable from the point of view that the obesity caused by the consumption of the above foods can be prevented.

Den mengde av peptidene ifølge denne oppfinnelse som tilsettes til den fysiologisk funksjonelle matvare, blir hensiktsmessig valgt avhengig av typen av matvare, hensikten med tilsetningen, den effekt som ventes å fremkomme ved inntaket av matvaren osv. The amount of the peptides according to this invention that is added to the physiologically functional foodstuff is suitably chosen depending on the type of foodstuff, the purpose of the addition, the effect that is expected to occur when the foodstuff is consumed, etc.

Vanligvis blir det foretrukket å tillate matvaren å inneholde peptidene ifølge denne oppfinnelse slik at ca 0,1 til 4 mg av peptid(ene) ifølge oppfinnelsen kan tas pr måltid. D. Et for som har den funksjon å inhibere økningen av TG-nivå i blod hos husdyr osv, kan fremstilles ved å kombinere peptidene ifølge denne oppfinnelse som aktive komponenter med et for. Usually it is preferred to allow the food to contain the peptides according to this invention so that about 0.1 to 4 mg of the peptide(s) according to the invention can be taken per meal. D. A lining which has the function of inhibiting the increase of TG level in the blood of livestock, etc., can be prepared by combining the peptides according to this invention as active components with a lining.

Det for som peptidene ifølge denne oppfinnelse blir kombinert med, kan være enten et for for husdyr slik som kuer, svin, kyllinger osv eller et f dr for oppdrettsfisk slik som sjøbrasme, unge "yellowtails" osv. The feed with which the peptides according to this invention are combined can be either a feed for livestock such as cows, pigs, chickens, etc. or a feed for farmed fish such as sea bream, young yellowtails, etc.

Mengden av peptidene ifølge denne oppfinnelse som blandes inn i et for, velges hensiktsmessig ut i fra typen av foret, den forventede effekt som skal frembringes ved inntaket av foret osv. The amount of the peptides according to this invention that is mixed into a feed is appropriately selected based on the type of feed, the expected effect to be produced when the feed is ingested, etc.

Generelt blir det foretrukket at peptidene ifølge denne oppfinnelse blir blandet inn i et f&r i en mengde på 0,1 til 4 vek%. In general, it is preferred that the peptides according to this invention are mixed into a f&r in an amount of 0.1 to 4% by weight.

Kort beskrivelse av tegningene Brief description of the drawings

Fig. 1 er et gel kromatogram av et globinproteolysat. Fig. 1 is a gel chromatogram of a globin proteolysate.

Fig. 2 er et reversfase surt kromatogram i eksempel 1. Fig. 2 is a reverse phase acid chromatogram in example 1.

Fig. 3 er et reversfase nøytralt kromatogram i eksempel 1. Fig. 3 is a reverse phase neutral chromatogram in example 1.

Den beste fremgangsmåte til å utføre oppfinnelsen The best method for carrying out the invention

Den foreliggende oppfinnelse skal nå beskrives mere spesielt nedenfor med referanse til følgende eksempler. The present invention will now be described more specifically below with reference to the following examples.

Referanse-eksempel Reference example

Fremstilling av et globinproteolysat Preparation of a globin proteolysate

En fremgangsmåte for fremstilling av et globinproteolysat ved anvendelse av bovine erytrocytter skal nå beskrives nedenfor i detalj. Molekylvektfordelingen av det resulterende globinproteolysat ble undersøkt ved gel filtreringskromatografi (fig. 1). A method for producing a globin proteolysate using bovine erythrocytes will now be described below in detail. The molecular weight distribution of the resulting globin proteolysate was examined by gel filtration chromatography (Fig. 1).

Gel filtreringskromatografien ble gjennomført under følgende betingelser. Utstyr: Høytrykks-væskekromatograf (SHIMADZU CORP.; modell LC-6A) Kolonne: PolyHYDROXYETHYL A, 5 nm, 9,4 x 200 mm (PolyC Inc.) The gel filtration chromatography was carried out under the following conditions. Equipment: High-pressure liquid chromatograph (SHIMADZU CORP.; model LC-6A) Column: PolyHYDROXYETHYL A, 5 nm, 9.4 x 200 mm (PolyC Inc.)

Mobilfase: 50 mM maursyre Mobile phase: 50 mM formic acid

Strømningshastighet: 0,5 ml/min Flow rate: 0.5 ml/min

Påvisning: UV-absorpsjon (221 nm). Detection: UV absorption (221 nm).

I korthet ble 250 I vann tilsatt til 100 kg friske bovine erytrocytter for å tillate tilstrekkelig hemolyse. Etter justering av pH til 2,8 med fosforsyre, ble tilsatt 2,6 x 10<7> enheter av syreprotease fra Aspergillus niger til løsningen og omsatt ved 50°C i 3 timer. Briefly, 250 I of water was added to 100 kg of fresh bovine erythrocytes to allow sufficient hemolysis. After adjusting the pH to 2.8 with phosphoric acid, 2.6 x 10<7> units of acid protease from Aspergillus niger were added to the solution and reacted at 50°C for 3 hours.

Etter reaksjonen ovenfor ble reaksjonsløsningen oppvarmet i 80°C i 30 min for å avslutte reaksjonen. Deretter ble tilsatt en vandig suspensjon av kalsium-hydroksyd til reaksjonsløsningen for å justere pH til 6,5. Deretter ble tilsatt 10 kg kiselgur og filtrert med en filterpresse. Det resulterende filtrat ble forstøvnings-tørket for derved å oppnå 23 kg av et globinproteolysat i pulverform. After the above reaction, the reaction solution was heated at 80°C for 30 min to terminate the reaction. Then, an aqueous suspension of calcium hydroxide was added to the reaction solution to adjust the pH to 6.5. Then 10 kg of diatomaceous earth was added and filtered with a filter press. The resulting filtrate was spray-dried to thereby obtain 23 kg of a globin proteolysate in powder form.

Eksempel 1 Example 1

Fraksjonering og rensning av peptider Fractionation and purification of peptides

Inhibering av økning av TG-nivået i blod Inhibition of increase of TG level in blood

Peptidene ifølge denne oppfinnelse ble oppnådd ved fremgangsmåtene ifølge (1) ioneveksling, (2) ultrafiltrering, (3) separasjon ved reversfasekromatografi under sure betingelser, og (4) separasjon ved reversfasekromatografi under nøytrale betingelser. The peptides according to this invention were obtained by the methods of (1) ion exchange, (2) ultrafiltration, (3) separation by reverse phase chromatography under acidic conditions, and (4) separation by reverse phase chromatography under neutral conditions.

Gjenvinningsforholdene etter disse fremgangsmåter er vist i tabell 1. Proteinmengdene ble bestemt ved ninhydrinmetoden. The recovery conditions according to these methods are shown in table 1. The protein amounts were determined by the ninhydrin method.

(1) Ioneveksling (1) Ion exchange

En 10 vekt% vandig løsning av globinproteolysatet ble tilsatt til en svakt sur kationbytterharpiks (Amberlite IRC50, H+<->form; Organo)og omrørt i 1 time for å tillate adsorpsjon. Deretter ble oppnådd den ikke-adsorberte fraksjon. A 10% by weight aqueous solution of the globin proteolysate was added to a weakly acidic cation exchange resin (Amberlite IRC50, H+<-> form; Organo) and stirred for 1 hour to allow adsorption. Then the non-adsorbed fraction was obtained.

(2) Ultrafiltrering (2) Ultrafiltration

Den ikke-adsorberte fraksjon oppnådd ved ioneveksling ble underkastet ultrafiltrering ved anvendelse av u It raf i Itre ri n gs utstyr av omrøringstypen (Advantec; modell UHP 90K) og en ultrafiltreirngsmembran (Advantec; UIIH-1; fraksjons-molekylvekt: 1000), og filtratet ble oppsamlet. The non-adsorbed fraction obtained by ion exchange was subjected to ultrafiltration using u Itraf i Itreri n g's stirring type equipment (Advantec; model UHP 90K) and an ultrafiltration membrane (Advantec; UIIH-1; fraction molecular weight: 1000), and the filtrate was collected.

(3) Reversfase (sur) kromatografi (fig. 2) (3) Reverse phase (acidic) chromatography (Fig. 2)

Utstyr: Høytrykks-væskekromatograf (SHIMADZU CORP.; modell LC-10A) Kolonne: SuperPac Pep-S, 15 nm, 22,5 x 250 mm (PHARMACIA K.K.) Mobilfase: Vandig acetronitrilløsning inneholdende 0,1% trifluoreddiksyre; lineær konsentrasjonsgradient på 2-35% acetonitril; acetonitrilkonsentrasjonen ble forandret med en hastighet på 1 %/min Strømningshastighet: 5 ml/min Equipment: High-pressure liquid chromatograph (SHIMADZU CORP.; model LC-10A) Column: SuperPac Pep-S, 15 nm, 22.5 x 250 mm (PHARMACIA K.K.) Mobile phase: Aqueous acetronitrile solution containing 0.1% trifluoroacetic acid; linear concentration gradient of 2-35% acetonitrile; the acetonitrile concentration was changed at a rate of 1%/min Flow rate: 5 ml/min

Temperatur: 40°C Temperature: 40°C

Påvisning: UV-absorpsjon 220 nm Detection: UV absorption 220 nm

Retensjonstid: Fraksjon A: 39,9-40,9 min Retention time: Fraction A: 39.9-40.9 min

Fraksjon A': (Sekvens ID Nr: 1): 53,8-54,5 min Fraction A': (Sequence ID No: 1): 53.8-54.5 min

(4) Reversfase (nøytral) kromatografi (fig. 3) (4) Reverse phase (neutral) chromatography (Fig. 3)

Utstyr: Høytrykks-væskekromatograf (SHIMADZU CORP.; modell LC-10A) Kolonne: SuperPac Pep-S, 15 um, 22,5 x 250 mm (PHARMACIA K.K.) Mobilfase: Vandig acetronitrilløsning inneholdende 20 mM ammoniumacetat-buffer (pH 6,5); lineær konsentrasjonsgradient på 0-25% acetonitril; Equipment: High-pressure liquid chromatograph (SHIMADZU CORP.; model LC-10A) Column: SuperPac Pep-S, 15 µm, 22.5 x 250 mm (PHARMACIA K.K.) Mobile phase: Aqueous acetronitrile solution containing 20 mM ammonium acetate buffer (pH 6.5 ); linear concentration gradient of 0-25% acetonitrile;

acetonitrilkonsentrasjonen ble forandret med en hastighet på the acetonitrile concentration was changed at a rate of

0,5%/min 0.5%/min

Strømningshastighet: 5 ml/min Flow rate: 5 ml/min

Temperatur: 40°C Temperature: 40°C

Påvisning: UV-absorpsjon 220 nm Detection: UV absorption 220 nm

Retensjonstid: Fraksjon B: 41,7-43,2 min (Val-Thr-Leu) Retention time: Fraction B: 41.7-43.2 min (Val-Thr-Leu)

FraksjonC: 45,8-51,0 min (Val-Tyr-Pro) Fraction C: 45.8-51.0 min (Val-Tyr-Pro)

Eksempel 2 Example 2

Kvantitativ bestemmelse av peptidene Quantitative determination of the peptides

Inhibering av økning av TG-konsentrasjonen i blod Inhibition of increase of TG concentration in blood

Kvantitativ bestemmelse av peptidf raksjonene som har en aktivitet for å inhibere økningen av blod TG-konsentrasjonene i globinproteolysatet oppnådd i referanse-eksemplet ble gjennomført ifølge rensefremgangsmåtene for effektive peptider i eksempel 1. Quantitative determination of the peptide fractions having an activity to inhibit the increase of blood TG concentrations in the globin proteolysate obtained in the reference example was carried out according to the purification procedures for effective peptides in example 1.

Syrehydrolyse Acid hydrolysis

En milliliter 6 N HCI ved sluttkonsentrasjonen ble tilsatt til 3-5 mg protein i et prøverør som ble forseglet under atmosfærisk trykk i ninhydrinmetoden og under redusert trykk for å gjennomføre aminosyreanalyse. Deretter ble røret oppvarmet ved 110°Ci 22 timer. One milliliter of 6 N HCI at the final concentration was added to 3-5 mg of protein in a test tube that was sealed under atmospheric pressure in the ninhydrin method and under reduced pressure to perform amino acid analysis. The tube was then heated at 110°Ci for 22 hours.

Ninhydrinmetoden The ninhydrin method

Prøvens pH etter hydrolyse ble justert til 5,0 med natriumhydroksyd, og deretter ble prøven omsatt med et ninhydrinreagens løst i 0,2 M citratbuffer (pH 5,0) ved 110°C i 15 minutter. Absorbansen ved 570 nm ble målt. Separat, som standardløsninger, ble vandige L-leucinløsninger (0,75, 150, 225, 300 nmol/ml) underkastet en ninhydrinreaksjon. Kalibreringskurver ble oppnådd fra den målte absorbans, og mengden av aminogrupper i prøven tilsvarende L-leucin ble beregnet. The pH of the sample after hydrolysis was adjusted to 5.0 with sodium hydroxide, and then the sample was reacted with a ninhydrin reagent dissolved in 0.2 M citrate buffer (pH 5.0) at 110°C for 15 minutes. The absorbance at 570 nm was measured. Separately, as standard solutions, aqueous L-leucine solutions (0.75, 150, 225, 300 nmol/ml) were subjected to a ninhydrin reaction. Calibration curves were obtained from the measured absorbance, and the amount of amino groups in the sample corresponding to L-leucine was calculated.

Peptidkart Peptide map

Utstyr: Høytrykks-væskekromatograf (SHIMADZU CORP.; modell LC-10A) Kolonne: Shim-pack ISC-07/S1504 Na, 7 um, 4,0 x 150 mm (SHIMADZU CORP.) Elueringsløsning: Aminosyre mobilfasekit (Na-type) fra SHIMADZU CORP. Equipment: High-pressure liquid chromatograph (SHIMADZU CORP.; model LC-10A) Column: Shim-pack ISC-07/S1504 Na, 7 µm, 4.0 x 150 mm (SHIMADZU CORP.) Elution solution: Amino acid mobile phase kit (Na type) from SHIMADZU CORP.

Strømningshastighet: 0,3 ml/min Flow rate: 0.3 ml/min

Temperatur: 55°C Temperature: 55°C

Reaksjonsløsning 1: Analysekit OPA-reagens fra SHIMADZU CORP. Reaction solution 1: Analysis kit OPA reagent from SHIMADZU CORP.

Påvisning: Fluorescensabsorpsjon (Ex 348 nm, Em 450 nm) Detection: Fluorescence absorption (Ex 348 nm, Em 450 nm)

Standardløsning Standard solution

Som standardløsning ble aminosyre blandet standardløsning omfattende 18 komponenter H-type (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) fortynnet 1:25 med 0,2 M citratbuffer (pH 2,20) og 10 uJ av denne fortynning ble påsatt (hver aminosyre: As a standard solution, amino acid mixed standard solution comprising 18 components H-type (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was diluted 1:25 with 0.2 M citrate buffer (pH 2.20) and 10 uJ of this dilution was applied (each amino acid:

1 nmol/10uJ). 1 nmol/10uJ).

Prøveløsning Sample solution

Den syrehydrolyserte løsning ble konsentrert, tørket og kåket ved anvendelse av en rotasjonsfordamper, og tørket ytterligere under redusert trykk i mer enn 12 timer for derved å fjerne HCI fullstendig. Deretter ble den resulterende kake løst i 0,2 M citratbuffer (pH 2,20) slik at innholdet av hver aminosyre ble ca 100 nmol/ml. identifiseringen av aminosyrene og beregningen av topparealene ble gjennomført med Chromatopack C-R4A (SHIMADZU CORP.). Mengden av en aminosyre ble bestemt ved sammenligning med mengden av standardløsningen. Aminosyresammensetningen ble beregnet ut i fra forholdet av enkelte aminosyrer mot det totalt oppnådde aminosyretnnhold. The acid hydrolyzed solution was concentrated, dried and concentrated using a rotary evaporator, and further dried under reduced pressure for more than 12 hours to completely remove the HCl. The resulting cake was then dissolved in 0.2 M citrate buffer (pH 2.20) so that the content of each amino acid was approximately 100 nmol/ml. the identification of the amino acids and the calculation of the peak areas were carried out with Chromatopack C-R4A (SHIMADZU CORP.). The amount of an amino acid was determined by comparison with the amount of the standard solution. The amino acid composition was calculated from the ratio of individual amino acids to the total amino acid content achieved.

Resultatene er vist som utbytter i tabell 1 ovenfor. The results are shown as yields in table 1 above.

Eksempel 3 Example 3

Fremstilling av H-Val-Thr-Leu-OH ved kjemisk syntese Preparation of H-Val-Thr-Leu-OH by chemical synthesis

H-Val-Thr-Leu-OH ble syntetisert med en SAM2 peptid syntesemaskin (Biosearch) ifølge protokollen for denne syntesemaskin. I korthet ble 2 g acyloksymetylharpiks til hvilken var bundet 0,3 mmol av den 3. beskyttede aminosyre Boc-Leu-OH pr g, innført i reaktoren til peptidsyntesemaskinen ovenfor, og bragt i kontakt med en avblokkeringsløsning inneholdende 45% (v/v) trifluoreddiksyre (TFA), 2,5% (v/v) anisol og 52,5% (v/v) metylenklorid (DCM) i 20 min for derved å fjerne Boc-gruppen. Etter vasking med DCM ble harpiksen nøytralisert med DCM inneholdende 10% (v/v) diisopropyletylenamin og ytterligere vasket med DCM. Deretter ble harpiksen omsatt i en blandet løsning av 20 ml av DCM inneholdende 4,0 mmol av hver av Boc-Thr (Bz)-OH og henholdsvis diisopropylkarbodiimid (6,7 ganger den teoretiske ekvivalent) og dimetylformamid (DMF) i 2 timer ved romtemperatur. Deretter ble harpiksen vasket med DMF og DCM i rekkefølge for derved å oppnå Boc-Thr(Bz)-Leu-PAM-harpiks. H-Val-Thr-Leu-OH was synthesized with a SAM2 peptide synthesizer (Biosearch) according to the protocol for this synthesizer. Briefly, 2 g of acyloxymethyl resin to which was bound 0.3 mmol of the 3rd protected amino acid Boc-Leu-OH per g was introduced into the reactor of the peptide synthesis machine above, and brought into contact with an unblocking solution containing 45% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA), 2.5% (v/v) anisole and 52.5% (v/v) methylene chloride (DCM) for 20 min to thereby remove the Boc group. After washing with DCM, the resin was neutralized with DCM containing 10% (v/v) diisopropylethyleneamine and further washed with DCM. Then the resin was reacted in a mixed solution of 20 mL of DCM containing 4.0 mmol each of Boc-Thr (Bz)-OH and diisopropylcarbodiimide (6.7 times the theoretical equivalent) and dimethylformamide (DMF), respectively, for 2 h at room temperature. Then, the resin was washed with DMF and DCM in order to thereby obtain Boc-Thr(Bz)-Leu-PAM resin.

Ifølge en lignende fremgangsmåte ble Boc-Val-OH koplet. According to a similar procedure, Boc-Val-OH was coupled.

Den således koplede beskyttede peptidharpiks ble omsatt i vannfri hydrogenfluorid inneholdende 10% (v/v) anisol ved 0°C i 1 time. Deretter ble hydrogenfluorid destillert av, og harpiksen ble vasket med eter. Ut i fra den resulterende blanding av peptider og harpiks ble peptidene ekstrahert med 50% eddiksyre og frysetørket for derved å oppnå ca 250 mg rå peptider. The thus coupled protected peptide resin was reacted in anhydrous hydrogen fluoride containing 10% (v/v) anisole at 0°C for 1 hour. Hydrogen fluoride was then distilled off, and the resin was washed with ether. From the resulting mixture of peptides and resin, the peptides were extracted with 50% acetic acid and freeze-dried to thereby obtain approximately 250 mg of crude peptides.

De rå peptider ble løst i 0,1% TFA og deretter påsatt på en oktadecyl silika (ODS) kolonne (Cosmosil 5Cie, 250 x 20 mm; Nacalai Tesque) med en lineær konsentrasjonsgradient av acetonitril inneholdende 0,1% TFA (20-70%/50 min, 10 ml/min). Peptidet av interesse ble eluert ved en acetonitrilkonsentrasjon på ca 50%. The crude peptides were dissolved in 0.1% TFA and then applied to an octadecyl silica (ODS) column (Cosmosil 5Cie, 250 x 20 mm; Nacalai Tesque) with a linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% TFA (20-70 %/50 min, 10 ml/min). The peptide of interest was eluted at an acetonitrile concentration of about 50%.

Eksempel 4 Example 4

Fremstilling av et peptid med aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 ved kjemisk syntese Preparation of a peptide with the amino acid sequence shown in Sequence ID No: 1 by chemical synthesis

Et peptid med aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 ble syntetisert med SAM2 peptidsynteseapparatet beskrevet ovenfor ifølge protokollen for dette synteseapparat. I korthet ble 2 g acyloksymetylharpiks hvortil var bundet 0,3 mmol av den 7. beskyttede aminosyre Boc-Thr(Bz)-OH pr g, innført i reaktoren til peptidsynteseapparatet ovenfor, og bragt i kontakt med en avblokkeringsløsning inneholdende 45% (v/v) trifluoreddiksyre (TFA), 2,5% (v/v) anisol og 52,5% (v/v) metylenklorid (DCM)i 20 min for derved å fjerne Boc-gruppen. Etter vasking med DCM ble harpiksen nøytralisert med DCM inneholdende 10% (v/v) diisopropyletylenamin og ytterligere vasket med DCM. Deretter ble harpiksen omsatt i en blandet løsning av 20 ml av DCM inneholdende 4,0 mmol av hver av Boc-Trp-OH og henholdsvis diisopropylkarbodiimid (6,7 ganger den teoretiske ekvivalent) og DMF i 2 timer ved romtemperatur. Deretter ble harpiksen vasket med DMF og DCM i rekkefølge for derved å oppnå Boc-Trp-Thr(Bz)-PAM-harpiks. A peptide with the amino acid sequence shown in Sequence ID No: 1 was synthesized with the SAM2 peptide synthesizer described above according to the protocol for this synthesizer. Briefly, 2 g of acyloxymethyl resin to which was bound 0.3 mmol of the 7th protected amino acid Boc-Thr(Bz)-OH per g were introduced into the reactor of the above peptide synthesis apparatus and brought into contact with an unblocking solution containing 45% (v/ v) trifluoroacetic acid (TFA), 2.5% (v/v) anisole and 52.5% (v/v) methylene chloride (DCM) for 20 min to thereby remove the Boc group. After washing with DCM, the resin was neutralized with DCM containing 10% (v/v) diisopropylethyleneamine and further washed with DCM. Then the resin was reacted in a mixed solution of 20 ml of DCM containing 4.0 mmol each of Boc-Trp-OH and diisopropylcarbodiimide (6.7 times the theoretical equivalent) and DMF, respectively, for 2 hours at room temperature. Then, the resin was washed with DMF and DCM in order to thereby obtain Boc-Trp-Thr(Bz)-PAM resin.

Ifølge en lignende fremgangsmåte ble Boc-Pro-OH, Boc-Tyr(BrZ)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Val-OH og Boc-Leu-OH koplet i denne rekkefølge. According to a similar procedure, Boc-Pro-OH, Boc-Tyr(BrZ)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Val-OH and Boc-Leu-OH were coupled in this order.

Deretter ble peptidene ekstrahert som beskrevet i eksempel 3 ovenfor og frysetørket for derved å oppnå ca 500 mg rå peptider. Disse rå peptider ble fremkalt i en ODS-kolonne som beskrevet i eksempel 3 ovenfor. Peptidet av interesse ble eluert ved en acetonitrilkonsentrasjon på ca 30%. The peptides were then extracted as described in example 3 above and freeze-dried to thereby obtain approximately 500 mg of crude peptides. These crude peptides were developed on an ODS column as described in Example 3 above. The peptide of interest was eluted at an acetonitrile concentration of about 30%.

Eksempel 5 Example 5

Fremstilling av matvarer inneholdende peptidene ifølge denne oppfinnelse (1) Fremstilling av melkepulver i. Til 100 g melkepulver for spebarn ble tilsatt 0,1 g av peptidet H-Val-Thr-Leu-OH syntetisert i eksempel 3 ovenfor, for derved å fremstille et melkepulver som har den funksjon å inhibere økning av TG-nivået i blod. ii. Til 100 g melkepulver for spebarn ble tilsatt 0,1 g av peptidet som har aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 syntetisert i eksempel 4 ovenfor, for derved å fremstille et melkepulver med den funksjon å inhibere økning av TG-nivået i blod. Production of foodstuffs containing the peptides according to this invention (1) Production of milk powder i. To 100 g of milk powder for infants was added 0.1 g of the peptide H-Val-Thr-Leu-OH synthesized in example 3 above, in order to thereby produce a milk powder which has the function of inhibiting the increase of the TG level in the blood. ii. To 100 g of milk powder for infants was added 0.1 g of the peptide having the amino acid sequence shown in Sequence ID No: 1 synthesized in example 4 above, thereby producing a milk powder with the function of inhibiting an increase in the TG level in blood.

(2) Fremstilling av sjokolade (2) Manufacture of chocolate

i. Til 100 g sjokolade ble tilsatt 0,5 g av peptidet H-Val-Thr-Leu-OH syntetisert i eksempel 3 ovenfor, for derved å fremstille en sjokolade med den funksjon å inhibere økning av TG-nivået i blod. ii. Til 100 g sjokolade ble tilsatt 0,5 g av peptidet med aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 syntetisert i eksempel 4, for derved å fremstille en sjokolade med funksjonen å inhibere økning av TG-nivået i blod. i. To 100 g of chocolate was added 0.5 g of the peptide H-Val-Thr-Leu-OH synthesized in example 3 above, thereby producing a chocolate with the function of inhibiting an increase in the TG level in blood. ii. To 100 g of chocolate was added 0.5 g of the peptide with the amino acid sequence shown in Sequence ID No: 1 synthesized in example 4, thereby producing a chocolate with the function of inhibiting the increase of the TG level in blood.

Eksempel 6 Example 6

Fremstilling av et for inneholdende peptidene ifølge denne oppfinnelse Preparation of a for containing the peptides according to this invention

Peptidet H-Val-Thr-Leu-OH syntetisert i eksempel 3 og peptidet med aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 ble enkeltvis tilsatt til en forblanding inneholdende vitaminer, mineraler osv i en mengde på 1 vekt%. Hver av de resulterende forblandinger ble tilsatt til et kommersielt for for oppdrettsfisk med en mengde på 10 vekt% for derved å fremstille et for for oppdrettsfisk og med den funksjon å inhibere økning av TG-nivået i blod. The peptide H-Val-Thr-Leu-OH synthesized in Example 3 and the peptide with the amino acid sequence shown in Sequence ID No: 1 were individually added to a premix containing vitamins, minerals, etc. in an amount of 1% by weight. Each of the resulting premixes was added to a commercial feed for farmed fish in an amount of 10% by weight to thereby prepare a feed for farmed fish and with the function of inhibiting the increase of the TG level in blood.

Testeksempel 1 Test example 1

Effekt ( in vivo) av de kjemisk syntetiserte midler for inhibering av økningen av TG-nivået i blod Effect (in vivo) of the chemically synthesized agents for inhibiting the increase of the TG level in blood

Serum TG-økningsinhiberingsvirkningen på tidspunktet for in vivo lipid-administrering ble undersøkt på de tre peptider ifølge oppfinnelsen som inhiberer økningen av TG-nivået i blod (dvs peptidet med aminosyresekvensen av Sekvens !D Nr: 1 og peptidene Val-Thr-Leu og Val-Tyr-Pro syntetisert ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4). Friske albinomus (5-10 uker gamle; kroppsvekt ca 20-30 The serum TG increase inhibition effect at the time of in vivo lipid administration was investigated on the three peptides according to the invention which inhibit the increase of the TG level in blood (ie the peptide with the amino acid sequence of Sequence !D No: 1 and the peptides Val-Thr-Leu and Val -Tyr-Pro synthesized by the method described in example 4). Healthy albino mice (5-10 weeks old; body weight approx. 20-30

g) ble anvendt i dette eksperiment. Til hver mus ble administrert oralt 250 mg olilvenolje og en vandig løsning av peptidet ovenfor. Tre timer deretter ble blod g) was used in this experiment. Each mouse was orally administered 250 mg of olive oil and an aqueous solution of the above peptide. Three hours later became blood

oppsamlet under anestesi med Nembutal. Etter separasjon av blodet ble TG-nivået i blod bestemt. Resultatene er vist i tabell 2. collected under anesthesia with Nembutal. After separation of the blood, the TG level in blood was determined. The results are shown in table 2.

Det viser seg at alle de tre peptider ifølge oppfinnelsen inhiberte økning av TG-nivået i blod. Spesielt peptidet med aminosyresekvensen vist i Sekvens ID Nr: 1 hadde en spesifikk aktivitet 50000 ganger så høy som den for proteolysatpeptidet. På den annen side, selv om spesifikke aktiviteter for de andre to peptider var ca 1/1000 sammenlignet med peptidet med Sekvens ID Nr: 1, hadde de spesifikke aktiviteter mer enn 50 ganger aktiviteten av proteolysatpeptidet. It turns out that all three peptides according to the invention inhibited the increase of the TG level in blood. In particular, the peptide with the amino acid sequence shown in Sequence ID No: 1 had a specific activity 50,000 times that of the proteolysate peptide. On the other hand, although specific activities of the other two peptides were about 1/1000 compared to the peptide of Sequence ID No: 1, they had specific activities more than 50 times the activity of the proteolysate peptide.

Testeksempel 2 Test example 2

Sikkerhetstest for peptidene ifølge oppfinnelsen Safety test for the peptides according to the invention

Peptidene ifølge denne oppfinnelse (dvs peptidet med aminosyresekvensen i Sekvens ID Nr: 1 og peptidene Val-Thr-Leu og Val-Tyr-Pro) ble administrert oralt til ICR hannmus og hunmus med en dose på 10 g/kg kroppsvekt eller mer (maksimal mulig dose) i forskjellige forhold (0:1,1:1,1:0). Resultatet var at ingen døde. The peptides of this invention (ie the peptide with the amino acid sequence in Sequence ID No: 1 and the peptides Val-Thr-Leu and Val-Tyr-Pro) were administered orally to ICR male and female mice at a dose of 10 g/kg body weight or more (maximum possible dose) in different ratios (0:1,1:1,1:0). The result was that no one died.

Industriell anvendbarhet Industrial applicability

Ifølge den foreliggende oppfinnelse oppnås en peptidblanding som inhiberer økning av triglyceridnivået i blod, et middel for inhibering av økningen av triglyceridnivået i blod omfattende peptidblandingen som en aktiv komponent; en matvare for spesifisert helseanvendelse (den såkalte fysiologisk funksjonelle matvare) med den funksjon å inhibere økning av triglyceridnivået i blod; og et for med den funksjon å inhibere økning av triglyceridnivået i blod. According to the present invention, a peptide mixture is obtained which inhibits the increase of the triglyceride level in blood, a means for inhibiting the increase of the triglyceride level in blood comprising the peptide mixture as an active component; a foodstuff for specified health use (the so-called physiologically functional foodstuff) with the function of inhibiting the increase of the triglyceride level in the blood; and one for with the function of inhibiting the increase of the triglyceride level in the blood.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse blir det mulig å forebygge eller behandle fedme og hyperlipidemi hos mennesker eller dyr, og kardiovaskulære sykdommer slik som hypertensjon og arteriosklerose i forbindelse dermed. Dessuten blir det mulig å forbedre kjøttkvaliteten av husdyr og oppdrettsfisk. According to the present invention, it becomes possible to prevent or treat obesity and hyperlipidemia in humans or animals, and cardiovascular diseases such as hypertension and arteriosclerosis in connection therewith. In addition, it will be possible to improve the meat quality of livestock and farmed fish.

Claims

1. Peptide mixture consisting of a peptide having an amino acid sequence as shown in Sequence ID No: 1 and at least one of the peptides Val-Tyr-Pro and Val-Thr-Leu for inhibiting the increase of triglyceride levels in blood.

2. Means for inhibiting an increase in triglyceride levels in blood, characterized in that it comprises the peptide mixture according to claim 1 as an active component.

3. Food for specified health use and which has the function of inhibiting increases in triglyceride levels in blood, characterized in that it comprises a peptide mixture according to claim 1 as an active component.

4. For which has the function of inhibiting an increase in triglyceride levels in blood, characterized in that it comprises a peptide mixture according to claim 1 as an active component.