TWI805800B - 含有縮醛磷脂之組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種可穩定地長期保存縮醛磷脂之方法。更具體而言，提供一種含有縮醛磷脂之固體組成物，含有縮醛磷脂、γ-環糊精、及pH鹼調整劑；作成1質量%之水懸浮液時的pH為6~8。

Description

含有縮醛磷脂之組成物
本發明有關於含有縮醛磷脂之組成物及其製造方法等。再者，本說明書記載之所有文獻內容均藉由參照導入本說明書內。
縮醛磷脂為甘油骨架第1位具有乙烯基醚鍵之醚型甘油磷脂質的1種。縮醛磷脂廣泛分布於動物全體及某種厭氧微生物中，已知在人類中，於神經、心血管、免疫系統等存在許多。此外，已知縮醛磷脂亦存在於細胞核或突觸間隙，暗示縮醛磷脂廣泛地作用於神經活動。
迄今，縮醛磷脂之機能已知有腦神經細胞新生作用(專利文獻1)、抗中樞神經系統炎症作用(專利文獻2)、健全之學習記憶能力增強作用(專利文獻3)等。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開第2011/083827號 專利文獻2：國際公開第2012/039472號 專利文獻3：日本特開2016-210696號公報 專利文獻4：國際公開第2017/187540號 非專利文獻
非專利文獻1：日本畜產會報85(2)；153-161；2014
發明概要 發明欲解決之課題 如上述，已知縮醛磷脂可達成許多有利的功效，其使用範圍之增加正受到期待。另一方面，相較於其他甘油磷脂質，縮醛磷脂中特殊結構之乙烯基醚鍵與活性氧或自由基之反應性高，實際上易氧化，故縮醛磷脂之經時穩定性差，不易穩定地長期保存。
因此，本發明人等為開發可穩定地長期保存縮醛磷脂之方法，而進行研究。 用以解決課題之手段
本發明人等發現藉於縮醛磷脂中添加pH鹼調整劑及γ-環糊精，可長期穩定地保持縮醛磷脂，並更加反覆改良而完成本發明。
本發明包含例如以下項記載之主題。 第1項.一種含有縮醛磷脂之固體組成物，含有：縮醛磷脂、γ-環糊精、及pH鹼調整劑；且作成1質量%之水懸浮液時的pH為6~8。 第2項.一種含有縮醛磷脂之固體組成物，含有：縮醛磷脂、γ-環糊精、以及選自於由檸檬酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、及磷酸氫鈉所構成群組中之至少1種；且作成1質量%之水懸浮液時的pH為6~8。 第3項.如第1或2項之組成物，其係乾燥組成物。 第4項.如第1至3項中任一項之組成物，其係粉末狀。 第5項.如第1至4項中任一項之組成物，其含有縮醛磷脂0.1~10質量%。 第6項.一種懸浮液，含有：縮醛磷脂、γ-環糊精、及pH鹼調整劑；且pH為6~8。 第7項.一種懸浮液，含有：縮醛磷脂、γ-環糊精、以及選自於由檸檬酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、及磷酸氫鈉所構成群組中之至少1種；且pH為6~8。 第8項.如第6或7項之懸浮液，其溶劑為水。 第9項. 一種含有縮醛磷脂之組成物的製造方法，包含(A)步驟，其係至少混合縮醛磷脂、γ-環糊精、pH調整劑、及水，調製pH6~8之懸浮液。 第10項. 如第9項之方法，其更包含(B)步驟，其係使步驟(A)中得到之懸浮液乾燥而得到乾燥組成物。 第11項.一種提高縮醛磷脂穩定性之方法，包含(A)步驟，其係至少混合縮醛磷脂、γ-環糊精、pH調整劑、及水，調製pH6~8之懸浮液。 第12項.如第11項之方法，其更包含(B)步驟，其係使步驟(A)中得到之懸浮液乾燥而得到乾燥組成物。 發明效果
提供一種可穩定地長期保存縮醛磷脂之方法。
此外，縮醛磷脂藉由純化黏度將提高，而成為非常不易處理之物質，但藉於縮醛磷脂中添加pH鹼調整劑及γ-環糊精並使其乾燥，可做成固體組成物(以乾燥組成物為佳，較佳者為粉末組成物)，藉此，可穩定地長期保存縮醛磷脂，並且可提供一種黏度高等處理不便性經降低之組成物。又，亦提供其製造方法等。
用以實施發明之形態 以下，更詳細地說明本發明包含之各實施形態。本發明較佳地包含含有縮醛磷脂之組成物、含有縮醛磷脂之組成物的製造方法、及提高縮醛磷脂穩定性之方法等，但並未受該等所限定，本發明包含本說明書所揭示且習於此藝者所知的全部。
本發明包含之含有縮醛磷脂之組成物含有縮醛磷脂、γ-環糊精、及pH鹼調整劑。以下，將該組成物稱作「含有Pls-γCD-pH劑之組成物」。
縮醛磷脂通常係指甘油骨架第1位(sn-1位)為介著乙烯基醚鍵具有長鏈烯基之甘油磷脂質。以下顯示縮醛磷脂之通式。
[化1]
Figure 02_image001
[式中，R1 及R2 表示脂肪族羥基。R1 為通常碳數1~20(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20)之脂肪族羥基，可舉十二基、十四基、十六基、十八基、二十基(icosanyl)等為例。R2 為通常來自脂肪酸殘基之脂肪族羥基，可舉十八碳二烯醯基、十八碳三烯醯基、二十碳四烯醯基、二十二碳四烯醯基、二十二碳五烯醯基、二十二碳六烯醯基等為例。又，式中，X表示極性基。X以乙醇胺、膽鹼、絲胺酸、肌醇、或甘油為佳。]。
特別是，前述式中，X為乙醇胺之乙醇胺縮醛磷脂、及X為膽鹼之膽鹼縮醛磷脂為自然界廣泛存在之縮醛磷脂，宜作為本發明使用之縮醛磷脂。
含有Pls-γCD-pH劑之組成物中使用之縮醛磷脂，可使用例如合成品及萃取物等，並未特別限制，但其中亦以自生體組織萃取者為佳。生體組織指生物中含有縮醛磷脂的組織。用以萃取縮醛磷脂之生物可舉動物及微生物為例。微生物以厭氧性細菌為佳，以例如腸內細菌之Acidaminococcaceae(胺基酸球菌)科細菌等特佳。再者，細菌的情況，「生體組織」即為細菌。動物則以鳥類、哺乳類、魚類、貝類等為佳。哺乳類方面，由供給穩定性及安全性之觀點來看，以家畜或家禽為佳，可舉牛、豬、馬、羊、山羊、鳥類等為例。哺乳類的情況，含有縮醛磷脂的組織主要可舉皮膚、腦、腸、心臓、生殖器等為例，可由該等組織萃取　縮醛磷脂。又，鳥類可舉雞、家鴨、鶉、鴨、雉、火雞等為例。考量到取得容易度、成本面、及入口接受度等，則以雞特佳。又，鳥組織並未特別限制，以例如，鳥肉(特別是鳥胸肉)、鳥皮、鳥內臓等為佳。貝類以例如帆立貝為佳。再者，亦可組合2種以上的1或多數種生物之相異組織。
自生體組織萃取之縮醛磷脂，以使用自鳥組織萃取之縮醛磷脂特佳。其中亦以食用至今之鳥(家禽)因安全性受到確認，亦容易穩定供給，故為佳。其中亦以雞最適合。
自生體組織萃取縮醛磷脂之方法只要可萃取(及視需要純化)縮醛磷脂即可，並未特別限定。例如，可藉由眾所皆知的方法或由眾所皆知的方法可輕易想到的方法萃取。
以下，舉2個具體例作為自生體組織萃取縮醛磷脂之方法，但萃取方法並未受該等所限定。又，含有Pls-γCD-pH劑之組成物中使用的縮醛磷脂亦可由購入市售品後使用。
>縮醛磷脂萃取方法之例1> 縮醛磷脂之萃取及純化方法之1例，可舉專利文獻3(日本特開2016-210696號公報)等記載之方法為例。更具體而言，可舉包含以下步驟之方法為例：(1)自生體組織萃取縮醛磷脂的步驟、(2)純化萃取物中之縮醛磷脂的步驟(具體而言，去除中性脂質及/或神經鞘脂質之步驟)、及(3)水解處理萃取物後純化的步驟(具體而言，水解二醯基型甘油磷脂質後，去除自由脂肪酸及溶血磷脂質之步驟)。此處，步驟(1)可稱為縮醛磷脂的萃取步驟，步驟(2)及(3)可稱為縮醛磷脂的純化步驟。因此，步驟(2)及(3)為任意之步驟，亦可未含有各該等步驟，但以使用經純化濃縮之縮醛磷脂為佳，故以包含該等(2)及(3)步驟中之至少1者為佳。特別以包含步驟(1)~(3)全部為佳。
該方法中，萃取縮醛磷脂之際使用的溶劑以水、有機溶劑、或含水有機溶劑為佳。有機溶劑可舉例如甲醇、乙醇、異丙醇、己烷等、或選自於由該等所構成群組中之至少2種以上的混合溶劑。含水有機溶劑之含水率並未特別限制，可舉含水率10~90%(v/v)之含水有機溶劑為例。該等中，亦以乙醇或含水乙醇為佳。又，萃取所使用之生體組織可為生的，亦可為預先經過某種處理而成者。例如，可為預先經過乾燥處理及/或去油處理而成者。
萃取處理方法並未特別限制，例如，可藉由冷浸、溫浸等浸漬法或滲濾法等進行萃取處理。較佳之例可舉以下方法為例：相對於雞胸肉1kg，添加1~10L，以1~6L為佳，較佳者為2~4L之乙醇，並進行30℃以上且60分鐘以上，較佳為40℃以上且180分鐘以上之靜置或攪拌。
以將所得之有機溶劑萃取液濃縮乾燥後，用於水解處理步驟為佳。濃縮乾燥可藉由眾所皆知的方法進行，例如，可使用蒸發器進行。如此所得之有機溶劑萃取物(有機溶劑萃取乾燥物)中濃縮包含有縮醛磷脂等脂質。
此外，將該有機溶劑萃取乾燥物，例如，經丙酮離心處理後回收沉澱物，更以混合有己烷及丙酮之溶劑(己烷/丙酮混合溶劑)離心處理後回收液體層為佳。雖非限定之解釋，但藉由丙酮離心處理後回收沉澱物，可去除中性脂質，而藉由己烷/丙酮混合溶劑離心處理後回收液體層，可去除神經鞘脂質。
藉由濃縮乾燥如此所得之液體層，可得磷脂質濃縮乾燥物。藉將該磷脂質濃縮乾燥物供於水解處理步驟水解二醯基型甘油磷脂質，可較佳地濃縮縮醛磷脂。
水解處理可舉利用磷脂酶A1(PLA1)之處理為例。PLA1將專一地水解二醯基型甘油磷脂質中sn-1位之脂肪酸與甘油骨架間的酯鍵。經水解之二醯基型甘油磷脂質將分解成自由脂肪酸及溶血磷脂質。另一方面，縮醛磷脂因sn-1位為乙烯基醚鍵故不受PLA1作用。因此，藉由PLA1處理，可不分解縮醛磷脂而專一地分解二醯基型甘油磷脂質。藉由PLA1將與縮醛磷脂共存之二醯基型甘油磷脂質變換成溶解體(lyso body)，去除自由脂肪酸及溶血磷脂質，而可純化縮醛磷脂。去除自由脂肪酸及溶血磷脂質例如，可藉由使用有丙酮及己烷之分配進行。
PLA1只要為可得上述作用者即可，並未特別限制其來源等。可舉來自Aspergillus orizae(米麴菌)之PLA1為例。又，PLA1亦可使用市售品，例如，可自三菱化學食品股份有限公司等購入。又，PLA1之使用量可視用以水解處理之有機溶劑萃取乾燥物量適當地設定。例如，有機溶劑萃取乾燥物每1mg，可設為0.2~200unit左右，以設為2~200unit左右為佳。再者，1unit指每1分鐘使1μmol之基質(二醯基型甘油磷脂質)變化的量(1μmol/min)之意。
又，使用之緩衝劑亦可視使用之PLA1種類適當地設定。緩衝劑可舉0.1M檸檬酸+HCl緩衝劑(pH4.5)等為例。緩衝劑之使用量只要為可使酵素反應進行之量即可，並未特別限制。例如，有機溶劑萃取乾燥物每1g，可設為1~30mL左右，以設為5~15mL左右為佳。再者，PLA1可於有機溶劑萃取乾燥物中添加緩衝劑並溶解後添加。
此外，亦可適當地設定反應條件，以在50℃下一面攪拌一面反應1~2小時為佳。
再者，亦可對PLA1施行去活化處理。例如，水解反應後藉使溫度上升至70℃左右，即可進行PLA1之去活化處理。
藉由前述方法，可得分解有二醯基型甘油磷脂質之處理液(水解處理液)。該水解處理液中，例如，藉由添加2~3倍量左右之己烷，離心處理後再回收上層(己烷層)，可去除酵素緩衝劑及酵素蛋白質(酵素緩衝劑及酵素蛋白質溶解於下層之水層，己烷層中未含有。)。
此外，縮醛磷脂可溶解於己烷中，但難溶於丙酮中，藉由適當組合該等溶劑及水進行分配，更利用水或水溶液進行溶液分配，可去除溶血磷脂質而得到縮醛磷脂。換言之，可藉由丙酮去除磷脂質以外之中性脂質，並可利用液-液分配分離縮醛磷脂與溶血磷脂質。
再者，由以上記載可知，若更具體記載前述步驟(1)~(3)，例如，將如下述。 (1)將生體組織以乙醇或含水乙醇進行萃取處理的步驟； (2)將步驟(1)所得之萃取物以丙酮離心處理後回收沉澱物，更以己烷/丙酮混合溶劑離心處理後回收液體層的步驟；及 (3)藉由磷脂酶A1(PLA1)處理步驟(2)中回收之液體的步驟(更視需要，藉由使用丙酮及己烷之分配，去除自由脂肪酸及溶血磷脂質的步驟)。
>縮醛磷脂萃取方法之例2> 縮醛磷脂之萃取及純化方法的另1例，可舉包含以下步驟之方法為例，該步驟為以特定條件靜置生體組織之乙醇萃取液濃縮物與特定之含水乙醇的混合液的步驟。更具體而言可舉包含以下步驟之方法為例，該步驟為以40~60℃靜置生體組織之乙醇萃取液濃縮物與40~60質量%乙醇水溶液之質量比1：0.8~1.2的混合液。再者，並未特別限制，但用於該方法之生體組織，以雞之生體組織為佳，其中亦以雞胸肉為佳。
該方法中，生體組織之乙醇萃取的方法並未特別限定，可使用眾所皆知的方法或可輕易由眾所皆知的方法想到之方法。例如，可對生體組織添加質量比1~5倍左右之乙醇後進行攪拌或靜置。攪拌或靜置亦可於加溫後進行。加溫可以例如，30~50℃、或35~45℃左右進行。又，攪拌或靜置之時間雖無特別限制，但可舉0.5~24小時、或1~12小時左右為例。所得之萃取液亦可視需要藉由過濾等分離固體液體。又，亦可對萃取殘渣進行相同操作，再度得到萃取液後，再與先前所得之萃取液合計。
再者，氣溫低(特別是冬季)的情況下，有該萃取步驟中產生析出的疑慮。如此之溫度只要為可產生析出之溫度即算，並未限制，具體而言可舉例如：10℃以下、9℃以下、8℃以下、7℃以下、6℃以下、5℃以下、4℃以下、3℃以下、2℃以下、1℃以下、或0℃以下。因該析出中含有磷脂質，故若於析出的情況下持續乙醇萃取操作的話，析出所含之磷脂質將不會包含於乙醇萃取液中，於是有最終所得之磷脂質濃縮物所含的磷脂質量難以統計的疑慮。因此，於產生有析出的情況，以首先進行加溫使析出熔解、或於不會產生析出之溫度下進行該步驟為佳。加溫使析出熔解的情況，加溫溫度於只要可使析出熔解，且不會影響品質之範圍內即可，並未特別限制，可例示如20~30℃左右。又，於不會產生析出之溫度下進行乙醇萃取步驟的情況，例如，可於20~30℃左右之溫度下進行該步驟。
濃縮所得之乙醇萃取液的方法並未特別限定，可使用眾所皆知的方法或由眾所皆知的方法可輕易想到的方法。可舉減壓濃縮、或加熱濃縮等為例。
濃縮以進行至所得之乙醇萃取液濃縮物的水分含量為1質量%以下為佳，以進行至為0.9質量%以下、0.8質量%以下、0.7質量%以下、0.6質量%以下、或0.5質量%以下較佳，以進行至為0.4質量%以下、0.3質量%以下、或0.2質量%以下更佳。再者，該水分含量為藉由卡耳費雪法求出之值。
又，所得之乙醇萃取液濃縮物的乙醇含量以15質量%以下為佳，以14質量%以下、13質量%以下、12質量%以下、11質量%以下、10質量%以下、9質量%以下、或8質量%以下較佳。再者，該乙醇含量為自乾熱乾燥法(105℃，3小時)求出之乾燥損失減去前述水分含量的值。例如，該乾熱乾燥損失為90質量%，若前述水分含量為1質量%，乙醇含量為100-90-1=9(質量%)。
將生體組織的乙醇萃取液濃縮物與40~60質量%乙醇水溶液以質量比1：0.8~1.2混合。該質量比之下限可為例如1：0.85、0.9、0.95、或1。又，該質量比之上限可為例如1：1.15、1.1、1.05、或1。又，使用之乙醇水溶液濃度之下限可為例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50質量%。又，使用之乙醇水溶液濃度之上限可為例如59、58、57、56、55、54、53、52、51、或50質量%。
將如此所得之混合液於40~60℃下靜置。藉此，混合液分離成3層(上層、中層、下層)，下層濃縮有縮醛磷脂。
靜置時溫度之下限可為例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50℃。又，靜置時溫度之上限可為例如59、58、57、56、55、54、53、52、51、或50℃。又，靜置時之溫度可於該溫度範圍內變化，但盡量以一定為佳，即使有變化亦以變化幅度小(例如變化幅度1~5℃、或1~3℃左右)為佳，又變化速度亦以緩慢為佳。
靜置時間只要於混合液層分離之範圍內即可，並未特別限制，例如以1小時以上為佳。亦可為2小時以上、3小時以上、4小時以上、5小時以上、或6小時以上。靜置時間之上限雖無特別限制，但可例示如24小時以下、18小時以下、12小時以下、或10小時以下。
如上述，分離成3層之混合液的下層濃縮有縮醛磷脂。因此，該縮醛磷脂萃取方法更可包含自靜置後分離成3層之混合液回收下層的步驟。
下層之回收可如下進行：(i)自分離成3層之混合液去除上層，並以10℃以下之溫度靜置至下層呈凝膠狀後去除中層；抑或(ii)將分離成3層之混合液以10℃以下之溫度靜置至下層呈凝膠狀後，去除上層及中層。
(i)及(ii)中，於該等步驟下靜置溫度為10℃以下，亦可為例如9℃以下、8℃以下、7℃以下、6℃以下、5℃以下、4℃以下。又，該靜置時間只要於下層呈凝膠狀之範圍內即可，並未特別限制，可例示如12小時以上。
又，生體組織的乙醇萃取液濃縮物與40~60質量%乙醇水溶液之質量比1：0.8~1.2的混合液，考量到前述乙醇萃取液濃縮物之乙醇含量的較佳範圍，可為例如，含有生體組織的乙醇萃取物、乙醇、及水之混合液為乙醇含量為20~43.5質量%之混合液。該混合液之乙醇含量的下限可為21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30質量%。又，該混合液之乙醇含量的上限可為43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、或33質量%。又，該混合液之水含量，考量到前述乙醇萃取液濃縮物之水分含量的較佳範圍，可為例如16~36.5質量%。該混合液之水含量的下限可為17、18、19、20、21、22、23、或24質量%。又，該混合液之水含量的上限可為36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、或26質量%。
例如可將以如前述之方法萃取(更視需要純化)的含有縮醛磷脂之萃取物較佳地使用於含有Pls-γCD-pH劑之組成物。
環糊精為數個分子的D-葡萄糖藉由α-1,4糖苷鍵鍵結，成為環狀結構之環狀低聚醣，6個分子鍵結而成者為α-環糊精、7個分子鍵結而成者為β-環糊精、8個分子鍵結而成者為γ-環糊精。該等為眾所皆知的化合物。又，γ-環糊精亦可購入市售品後使用於含有Pls-γCD-pH劑之組成物。
pH鹼調整劑為具大幅影響酸性pH值之作用的化合物。未必要調整至鹼性，例如可將強酸性調整至弱酸性或中性之化合物亦包含於pH鹼調整劑內。pH鹼調整劑可使用眾所皆知者，其中亦以藥理學或食品衛生學上可容許之pH鹼調整劑為佳。具體而言，可較佳地例示如檸檬酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、及磷酸氫鈉等。再者，檸檬酸鈉可使用檸檬酸一鈉、檸檬酸二鈉、及檸檬酸三鈉之任一者，其中又以檸檬酸三鈉為佳。又，磷酸氫鈉可使用磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉之任一者，其中亦以磷酸氫二鈉為佳。pH鹼調整劑可單獨使用1種或組合2種以上使用。
含有Pls-γCD-pH劑之組成物可為例如液狀組成物及固體組成物，以固體組成物為佳。固體組成物中亦以乾燥組成物為佳，特別以粉末狀組成物為佳。
又，含有Pls-γCD-pH劑之組成物以pH為6~8為佳。
例如，若含有Pls-γCD-pH劑之組成物為固體組成物，使其分散於水中做成1質量%之水懸浮液時，pH為6~8。該分散操作藉於55℃之水浴中震動1小時進行。該pH於25℃下藉由pH計測定。分散於水中做成1質量%之水懸浮液時，以pH為6~8的含有Pls-γCD-pH劑之組成物含有的縮醛磷脂之穩定性高而為佳。該pH範圍之下限可為6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、或6.8，又上限可為7.9、7.8、7.7、7.6、7.5、7.4、7.3、或7.2。如下述，該固體組成物例如，可藉由乾燥處理含有縮醛磷脂、γ-環糊精、及pH鹼調整劑之液狀組成物調製，並以於調製該原料之液狀組成物時適當地摻合pH鹼調整劑，使其於該pH範圍內為佳。再者，本說明書中若無特別說明，質量%以w/w%表示。
又，例如，若含有Pls-γCD-pH劑之組成物為液狀組成物，以該組成物之pH為6~8為佳。另，該液狀組成物之溶劑只要為可使縮醛磷脂分散且pH為6~8者即可，並未限制，例如以水為佳。該液狀組成物特別以水懸浮液為佳。與前述同樣地，該pH於25℃下藉由pH計測定。pH為6~8之含有Pls-γCD-pH劑之液狀組成物含有的縮醛磷脂之穩定性高而為佳。該pH範圍之下限可為6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、或6.8，又上限可為7.9、7.8、7.7、7.6、7.5、7.4、7.3、或7.2。再者，因該液狀組成物之pH為6~8，故乾燥處理該液狀組成物即可較佳地調製前述固體組成物。換言之，該液狀組成物可較佳地作為前述固體組成物之原料使用。
含有Pls-γCD-pH劑之組成物可藉由例如，將縮醛磷脂(亦可為自生體組織萃取之含有縮醛磷脂之萃取物等)、γ-環糊精、及pH鹼調整劑與視需要之溶劑(特以水為佳)混合調製。藉由該方法所得之組成物為液狀組成物，若欲將組成物做成固體組成物的話，可例如藉由將所得之混合物乾燥處理即可做成固體組成物。乾燥處理可使用眾所皆知的方法，可舉冷凍乾燥及噴霧乾燥等為例。又，亦可於乾燥處理前進行濃縮處理，濃縮處理方法可舉減壓濃縮等為例。乾燥處理後亦可將所得之固體組成物進行視需要之粉碎等做成粉末狀。又，藉由噴霧乾燥進行乾燥處理的情況下，可直接得到粉末狀組成物。
含有Pls-γCD-pH劑之組成物中各含有物之含量，只要於可得含有之縮醛磷脂穩定性提升的效果之範圍內的話，並未特別限制。例如為固體組成物(特別是乾燥組成物)的情況下，以含有縮醛磷脂0.1~10質量%為佳。該範圍之下限可為例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1質量%。又，該範圍之上限可為例如9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、或3質量%。
又，含有Pls-γCD-pH劑之組成物中，相對於縮醛磷脂1質量份，γ-環糊精以含有10~100質量份左右為佳，以含有15~100質量份左右較佳。又，特別於固體組成物(特別是乾燥組成物)中以含有40~95質量%左右為佳。該下限可為例如45、50、55、60、或65質量%。又，該上限可為例如90、85、80、或75質量%。
又，含有Pls-γCD-pH劑之組成物中，可適當摻合pH鹼調整劑，以使組成物之pH為6~8，可視使用之pH鹼調整劑種類適當地設定。特別是，含有Pls-γCD-pH劑之組成物為固體組成物(特別是乾燥組成物)，若使用之pH鹼調整劑為檸檬酸鈉(特別是檸檬酸三鈉)，例如以含有0.5~20質量%左右為佳。該範圍之下限亦可為例如1或1.5質量%。又，該範圍之上限可為例如19、18、17、16、15、14、或13質量%。
含有Pls-γCD-pH劑之組成物中除了縮醛磷脂、γ-環糊精、及pH調整劑之外，亦可於不損及本發明效果之範圍內摻合其他成分。如此之成分可使用醫藥品領域或食品領域中眾所皆知的各種成分。可使用例如，藥理學或食品衛生學上容許之載體等。又，更具體而言，可舉眾所皆知的賦形劑、甘味劑、黏合劑、崩散劑等為例，但並未特別受該等所限制。摻合該等其成分的情況，例如於調製組成物時除了縮醛磷脂、γ-環糊精、及pH調整劑之外亦可混合其他成分(及視需要之溶劑)。
又，含有Pls-γCD-pH劑之組成物可較佳地使用於例如醫藥品或食品之製造。
又，本發明亦包含含有縮醛磷脂之組成物的製造方法，該方法包含(A)至少混合縮醛磷脂、γ-環糊精、pH調整劑、及溶劑(以水為佳)調製pH6~8之懸浮液的步驟。可將該步驟(A)所得之懸浮液直接作為含有縮醛磷脂之組成物使用，更亦可將之乾燥處理後做成固體組成物。以步驟(A)之後更包含步驟(B)為佳，該步驟(B)為使步驟(A)中得到之懸浮液乾燥後得到乾燥組成物。
又，本發明亦包含提高縮醛磷脂穩定性之方法，該方法包含(A)至少混合縮醛磷脂、γ-環糊精、pH調整劑、及溶劑(以水為佳)調製pH6~8之懸浮液的步驟。以步驟(A) 之後更包含步驟(B)為佳，該步驟(B)為使步驟(A)中得到之懸浮液乾燥後得到乾燥組成物。
關於該等方法，前述含有Pls-γCD-pH劑之組成物的說明可直接較佳地引用。
再者，本說明書中「包含/含有」包含「基本上構成」與「構成」(The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of.")。又，本發明包含本說明書說明之構成要件的全部任意組合。
又，針對上述本發明各實施形態說明之各種特性(性質、結構、機能等)，於特定本發明包含之主題時，可為任意組合。換言之，本發明包含所有本說明書記載之組合可能之各種特性的任意組合所構成的主題。 [實施例]
以下，更具體地說明本發明，但本發明並未受下述例所限定。再者，萃取縮醛磷脂之原料，使用經冷凍乾燥之雞胸肉(FD雞胸肉)。又，若無特別說明，%表示質量(w/w)%。
乙醇萃取 將FD雞胸肉42kg置入萃取釜。將FD雞胸肉4倍量(w/v)之99%乙醇(168L)置入萃取釜並氮取代後，一面攪拌一面加溫，到達40℃溫度後保持90分鐘。以30篩目過濾後，將萃取液回收至鋼桶。將第1次之萃取殘渣置入萃取釜後，將FD雞胸肉2.5倍量(w/v)之99%乙醇(105L)置入釜並氮取代後，一面攪拌一面加溫，到達40℃溫度後保持90分鐘。以30篩目過濾後，將萃取液回收至鋼桶。以10S濾紙抽氣過濾該萃取液。將所得之溶液作為乙醇萃取液使用。
乙醇萃取液之減壓濃縮 將乙醇萃取液以內溫40℃以下減壓，減壓濃縮至能全量倒入50L槽左右之量(約8kg)。將該一次濃縮液倒入50L槽內以外溫50~60℃減壓。將所得之濃縮液以30篩目過濾後，測定重量為5.12kg。將該濃縮液作為乙醇萃取液濃縮物，並以4℃保管至使用前。
再者，分別以乾熱乾燥法(105℃，3小時)測定乙醇萃取液濃縮物之乾燥損失，以卡耳費雪法測定含水量。又，以扣除法算出乙醇濃度。結果如下述。乾燥損失：8.05%、水分：0.15%、乙醇：7.9%。
乙醇萃取液濃縮物與乙醇水溶液之混合檢討 >分離研討1> 相對於乙醇萃取液濃縮物15g，等量添加(w/w)50、60、70、或80%乙醇水溶液，並於室溫下攪拌。室溫下靜置3小時後，確認分離狀況。 >分離研討2> 相對於乙醇萃取液濃縮物10g，等量添加(w/w)25、50、或75%乙醇水溶液，並加溫攪拌至50℃。於50℃下靜置3小時後確認分離狀況。 >TLC分析> 以薄層層析法(TLC)確認各研討中分離後之層所含的成分。更詳細而言，使用薄層板(矽膠)做成之薄層，以流動相(氯仿/甲醇/水=65/25/4)分散研討1及研討2中分離之各層，分離中性脂質與磷脂質。檢測溶液使用10%硫酸。
研討1中等量混合有50%乙醇水溶液的情況，成為乳化狀態未能確認分離。等量混合有60、70、或80%乙醇水溶液的情況，可見2層分離但以TLC確認各層之脂質分布後，任一層中均存在有中性脂質與磷脂質，分離不充分。由此可知，室溫條件下之分離不充分。
研討2中等量混合有25%乙醇水溶液的情況，成為乳化狀態未能確認分離，但等量混合有50或75%乙醇水溶液的情況則分離成3層(圖1)。依據TLC分析，等量混合有75%乙醇的情況，磷脂質最多之下層部分中亦存在許多中性脂質或膽固醇。另一方面，等量混合有50%乙醇水溶液的情況，可知上層主要存在有中性脂質、下層主要存在有磷脂質(圖2)。再者，圖2中(A)表示上層、(B)表示中層、(C)表示下層。
由此可知，藉由當量混合50%乙醇水溶液後於50℃下靜置，鳥胸肉之乙醇萃取液濃縮物即使未使用離心分離，仍可有效地得到磷脂質濃縮物。
因此，如前述，相對於乙醇萃取液濃縮物等量添加(w/w)50%乙醇水溶液，並加溫攪拌至成為50℃，於50℃下靜置3小時後，將分離成3層後回收該下層者作為含有縮醛磷脂之雞胸肉萃取物，使用於以下研討中。再者，以下，「雞胸肉萃取物」之標記係該含有縮醛磷脂之雞胸肉萃取物之意。
雞胸肉萃取物之研討 於雞胸肉萃取物0.2g中加入氯仿/甲醇(2：1v/v)30mL萃取脂質，然後加入0.9%氯化鉀溶液7.5mL並震動後，離心分離將溶液分成二層。之後，回收下層，藉由蒸餾去除溶劑以僅回收脂質(約0.13g)。重複數次雞胸肉萃取物之調製，並調查所含之脂質量，發現雞胸肉萃取物之約60~70質量%為脂質。 又，之後，以矽凝膠管柱分區，僅取出包含磷脂質之區份，並依據已知方法(參照前述非專利文獻1：日本畜產學會報85(2)；153-161；2014)將其以HPLC分離，進行Pls之定量。具體而言，如下地進行。將萃取之脂質20mg溶解於少量之氯仿中，使氯仿30mL溶液通過矽凝膠管柱溶出中性脂質部分。之後，使氯仿/甲醇(2：1v/v)及甲醇30mL溶液通過該矽凝膠管柱，取出極性脂質區份(含有磷脂質之部分)。此外，將該含有磷脂質之區份用於下述條件的HPLC分析，測定縮醛磷脂量。
[HPLC分析] 機器：LC-20AD(島津製作所，京都)，流動相：A溶液；己烷/2-丙醇：醋酸(82：17：1，v/v/v)，B溶液；2-丙醇/水/醋酸(85：14：1；v/v/v)+0.2%三乙胺，梯度條件(B溶液%)：0-1分(0-5%)，1-25分(5-40%)，25-28分(40-0%)，管柱：LiChrospher 100-Diol(250mm×4mm，粒徑5μm；Merck Millipore)，流速：1mL/分，試樣量：10μg，管柱溫度：50℃，檢測器：ELSD-LTII(50℃，350kPa；島津製作所)
再者，縮醛磷脂之定量依據HPLC之層析圖中檢測之縮醛磷脂的波峰面積進行。更具體而言，縮醛磷脂之波峰位置藉由預先分析標準物質來確認，又，自波峰面積之定量藉由分析已知濃度之標準物質，由所得之面積值與標準物質濃度做成標準曲線來進行。再者，使用C18(Plasm)-18：1PE、C18(Plasm)-18：1PC[Avanti Polar Lipids公司]作為縮醛磷脂之標準物質。
雞胸肉萃取物0.2g中包含縮醛磷脂約0.025g。重複數次縮醛磷脂定量研討後，可知雞胸肉萃取物之約10~15質量%為縮醛磷脂。
縮醛磷脂穩定性提升方法之研討1 為發現可提升縮醛磷脂穩定性之物質，首先檢討了環糊精。環糊精具有數個葡萄糖利用α-1,4鍵結連結成環狀的結構，藉由該特殊之結構，環之外側顯示親水性，內側之空洞則顯示親油性，故可將水中之脂溶性物資擷取至該空洞內。該現象一般稱為包合，可期待環糊精提升包合之脂溶性物質的穩定性。因此，環糊精可利用於例如，輔酶Q10或二硫辛酸等具抗氧化能之機能性食品素材的穩定化。
再者，環糊精可標記成「CD」。又，可將α-環糊精及γ-環糊精分別標記成「αCD」及「γCD」。又，可將縮醛磷脂標記成「Pls」。
>穩定化研討1> 相對於雞胸肉萃取物175g，加入αCD或γCD(Cyclochem)500g、及去離子水1500g後使用均質機攪拌(6000rpm、20分鐘、室溫)。使攪拌後之試樣冷凍，冷凍乾燥後藉由粉碎調製粉末。
再者，分別求出以105℃將雞胸肉萃取物及CD加熱1小時後的乾燥損失。然後，將自原本之量減去該乾燥損失之值作為固體成分量。雞胸肉萃取物因其大部分為水、乙醇、及脂質，故固體成分量顯示與含有脂質量大致相同之值。又，CD包含若干水分，固體成分量即顯示去除水分狀態的CD量。如本研討，將含有縮醛磷脂之組成物作為乾燥組成物調製的情況，該固體成分量反映該乾燥組成物中所含之脂質量及CD量。
表1顯示雞胸肉萃取物、CDα與CDγ之摻合量、及固體成分量與固體成分量比(質量%)。又，一併顯示含有之Pls的摻合量、及固體成分量與固體成分量比(質量%)。
[表1]
Figure 02_image003
將所得之粉末用於40℃之加速試驗，並於第30天進行Pls量的測定。具體而言，如下地測定。對所得之粉末0.1g加入0.1M之磷酸緩衝液(pH7.0)24mL，在55℃下震動30分鐘。之後，加入甲醇32mL更震動15分鐘後，加入氯仿64mL後萃取脂質。與前述同樣地將所得之脂質以矽凝膠管柱及HPLC分離解析，進行Pls之定量。於表2顯示結果。又，該結果中，以相對於調製粉末後粉末中之Pls定量值(初期值)的各保存期間結束後Pls定量值之比例(Pls殘存率%)評價Pls之穩定性。於表3顯示結果。又將表3圖表化後顯示於圖3。
[表2]
Figure 02_image005
[表3]
Figure 02_image007
40℃第30天之殘存率，於使用有αCD的情況為54質量%，於使用有γCD的情況為77質量%。此次使用之兩種CD於40℃第30天均發現Pls殘存率下降，該下降於αCD中顯著地確認。由此可知，效果雖不大但γCD為適合穩定化Pls之成分。
縮醛磷脂穩定性提升方法之研討2 如前述，γCD雖有助於穩定化Pls，但該效果並不充分。因此，更加檢討可提升Pls穩定性之方法。具體而言，更加摻合各種成分來檢討不僅γCD，藉由更摻合其他成分能否更加提升Pls之穩定性。結果，發現藉由更加摻合檸檬酸鈉，可更加提升Pls穩定性的可能性。
具體而言，如下地檢討。使用檸檬酸三鈉作為檸檬酸鈉。無檸檬酸鈉之試樣(對照組)則使用於雞胸肉萃取物2.43g中加入γCD(Cyclochem)30.8g、去離子水適量，使用攪拌機攪拌後調製懸浮液。以pH計測定25℃下所得懸浮液之pH為5.0。之後，將試樣冷凍，於冷凍乾燥後粉碎調製粉末。有檸檬酸鈉之試樣中，於與對照組相同之原料中追加檸檬酸鈉0.55g，並同樣地攪拌調製懸浮液。以pH計測定25℃下所得懸浮液之pH為7.0。之後，使用該懸浮液以與對照組相同之方法調製粉末。將所得之各粉末用於60℃之加速試驗，自開始保存1週後、2週後、及4週後與前述同樣地進行Pls量之測定。於表4顯示使用有檸檬酸鈉之粉末的組成。(由表4可知，使用之雞胸肉萃取物2.4g中含有Pls0.30g。)
[表4]
Figure 02_image009
再者，將雞胸肉萃取物中加入γCD及檸檬酸鈉調製而成之粉末再分散於水中，測定pH。具體而言，於該粉末0.1g加入離子交換水10mL後於55℃之水浴中震動1小時使其分散後，以pH計測定25℃下所得懸浮液之pH的結果為7.08。
於表5顯示各保存期間結束後之Pls殘存率。又，將表5圖表化後顯示於圖4。
[表5]
Figure 02_image011
對照組(無檸檬酸鈉)方面，自開始保存之1週後Pls殘存率下降，4週後下降至71%。另一方面，添加有檸檬酸鈉之粉末相較於對照組，幾未發現Pls殘存率下降，4週後時仍高達94%。由該結果可知，不僅γCD，亦添加有檸檬酸鈉之粉末可更加提升Pls之穩定性。
縮醛磷脂穩定性提升方法之研討3 前述研討中，藉於冷凍乾燥後粉碎來調製粉末，但還研討了藉由可更簡便地大量調製之噴霧乾燥來調製粉末後，所得之效果能否無變化。
具體而言，如以下地進行。對雞胸肉萃取物323.6g加入γCD(Cyclochem)873.8g、檸檬酸鈉145g、去離子水1800g後，使用均質機攪拌(3500rpm，20分鐘，室溫)得到懸浮液。以pH計測定25℃下所得之懸浮液之pH為6.8。使用噴霧乾燥機乾燥該懸浮液得到粉末(表6)。將所得之粉末用於60℃之加速試驗，自開始保存之1週後及2週後與前述同樣地進行Pls量之測定。於表6顯示使用有檸檬酸鈉之粉末的摻合值。(由表6可知，使用之雞胸肉萃取物323.6g中含有Pls40.5g。)。
[表6]
Figure 02_image013
再者，將該粉末再分散於水中後測定pH。具體而言，於該粉末0.1g加入離子交換水10mL後於55℃之水浴中震動1小時使其分散後，以pH計測定25℃下所得懸浮液之pH的結果為7.16。
於圖5顯示各保存期間結束後之Pls殘存率。直至2週後仍未發現Pls殘存率下降，藉由噴霧乾燥調製之粉末亦顯示與冷凍乾燥調製之粉末同等或其以上之優異穩定性。
縮醛磷脂穩定性提升方法之研討4 由前述研討結果可知，將所得之粉末組成物分散於水時之pH為中性附近，對於用以使縮醛磷脂穩定地存在於該組成物中來說係為重要。因此，研討了使用檸檬酸鈉以外之pH鹼調整劑的情況下，能否同樣地提升縮醛磷脂之穩定性。
與前述同樣地攪拌雞胸肉萃取物γCD、水、及各種pH鹼調整劑，調製懸浮液，冷凍乾燥該懸浮液後調製粉末。此時，調整組成使冷凍乾燥前懸浮液之pH(25℃下pH計測定)為中性(7附近：6.5~7.5左右)。於下述表7顯示各個組成。與前述同樣地將所得之各粉末用於60℃之加速試驗，自開始保存開始1週後、2週後、及4週後，與前述同樣地進行Pls量之測定。於表7顯示使用有各種pH鹼調整劑之粉末組成。(由表7可知使用之雞胸肉萃取物2.4g中含有Pls0.30g。)
[表7]
Figure 02_image015
於表8顯示各保存期間結束後之Pls殘存率。又，於圖6顯示基於表8描繪之圖表。
[表8]
Figure 02_image017
又，將各粉末再分散於水中後測定pH。具體而言，於該粉末0.1g加入離子交換水10mL，於55℃之水浴中震動1小時使其分散後，以pH計測定25℃下所得懸浮液之pH。於表9顯示結果。
[表9]
Figure 02_image019
由該等結果可知，除了γCD，使用pH鹼調整劑將pH調整至中性附近，藉此可更加提升縮醛磷脂之穩定性。又，可知pH鹼調整劑中亦以檸檬酸鈉之縮醛磷脂穩定性提升效果特優。
圖1顯示將雞胸肉之乙醇萃取液濃縮物與乙醇水溶液進行混合及靜置，並將混合液進行分離的結果。 圖2顯示將圖1之各分離層進行TLC分析的結果。 圖3顯示組合縮醛磷脂與環糊精(α-環糊精或γ-環糊精)調製粉末時，縮醛磷脂的經時穩定性。 圖4顯示組合縮醛磷脂、γ-環糊精、及檸檬酸鈉，藉由冷凍乾燥法調製粉末時，縮醛磷脂的經時穩定性。 圖5顯示組合縮醛磷脂、γ-環糊精、及檸檬酸鈉，藉由噴霧乾燥法調製粉末時，縮醛磷脂的經時穩定性。 圖6顯示組合縮醛磷脂、γ-環糊精、及各種pH鹼調整劑，藉由冷凍乾燥法調製粉末時，縮醛磷脂的經時穩定性。
(無)

Claims (5)

  1. 一種含有縮醛磷脂之乾燥固體組成物，含有：縮醛磷脂、γ-環糊精、以及選自於由檸檬酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、及磷酸氫鈉所構成群組中之至少1種；且作成1質量%之水懸浮液時的pH為6~8。
  2. 如請求項1之組成物，其係粉末狀。
  3. 如請求項1或2之組成物，其含有縮醛磷脂0.1~10質量%。
  4. 一種含有縮醛磷脂之乾燥組成物的製造方法，包含：(A)步驟，其係至少將縮醛磷脂、γ-環糊精、選自於由檸檬酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、及磷酸氫鈉所構成群組中之至少1種，以及水，進行混合並調製pH6~8之懸浮液；及(B)步驟，其係使步驟(A)中得到之懸浮液乾燥而得到乾燥組成物。
  5. 一種提高乾燥組成物中縮醛磷脂之穩定性之方法，包含：(A)步驟，其係至少將縮醛磷脂、 γ-環糊精、選自於由檸檬酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、及磷酸氫鈉所構成群組中之至少1種、以及水，進行混合並調製pH6~8之懸浮液；及(B)步驟，其係使步驟(A)中得到之懸浮液乾燥而得到乾燥組成物。
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