KR102260525B1

KR102260525B1 - 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물

Info

Publication number: KR102260525B1
Application number: KR1020200103024A
Authority: KR
Inventors: 조병성
Original assignee: 주식회사 엑소코바이오
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2021-06-03
Also published as: KR20210059599A; KR20210065925A; KR102308576B1

Abstract

본 발명은 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선 효능 효능을 증강시키는 조성물로서, 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 함유함으로써 줄기세포 유래 엑소좀 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드만을 함유한 조성물 보다 우수한 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선 효능 효능을 나타낼 수 있다.

Description

줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물 {New composition comprising exosomes derived from stem cell and polydeoxyribonucleotide}

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 함유함으로써 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선 효능 등을 증강시킬 수 있는 새로운 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부주름개선, 피부탄력개선 또는 피부재생용 화장료 조성물, 미백용 화장료 조성물, 및 피부재생, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물, 의약 외품 또는 피부 외용제에 관한 것이다.

피부 노화가 일어나면, 피부탄력이 감소하고 피부주름이 증가하게 된다. 특히, 일광 및 자외선이 피부에 직접 조사될 경우 자유라디칼을 많이 발생시키며, 이러한 자유라디칼에 의해 피부의 항산화 방어체계는 손상을 받게 되어 주름을 증가시키고, 피부를 이완시키는 등 피부노화를 가속화시킨다. 따라서, 피부주름 감소 및 탄력 유지를 위해서는 활성산소종 및 자유라디칼 생성 억제, 염증 반응 억제 및 상처로부터 피부재생을 촉진시켜 피부를 보호하여야 한다. 피부주름개선에 효과적이라고 알려진 물질로는 아데노신, 레티노인산(retinoic acid) 등이 있으나, 아데노신은 임상에서의 효능이 미미하고, 레티노인산은 가임여성에게 사용할 수 없고 홍반 등의 부작용이 있다.

사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌 농도와 분포에 따라 결정된다. 멜라닌은 티로시나아제에 의해 티로신으로부터 도파(DOPA), 도파퀴논으로 전환된 후 비효소적인 산화 반응을 거쳐 합성된다. 멜라닌이 과량 생성되면 색소 침착이 일어나고 얼굴, 목, 팔 등에 기미, 점, 주근깨 등이 생겨 외관상 보기 좋지 않다. 기미, 주근깨, 어두운 피부톤을 개선하기 위한 피부 미백제가 개발되고 있으나, 미백 효과가 우수하면서도 부작용이 없는 피부 미백제의 개발은 어려운 것이 현실이다. 예를 들어, 멜라닌을 생성하는 멜라노사이트를 선택적으로 공격하는 피부 미백제는 미백 효과는 탁월하지만 피부 독성의 부작용이 있다.

최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 엑소좀(exosome) 또는 세포외 소포체(extracellular vesicle)가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.

엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).

즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다.

그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀의 생리활성을 증가시키면서 안정적으로 유지시켜 주는 기술의 개발, 엑소좀의 사용 편의성 개선 관련 기술 개발, 및 다른 물질들과의 조합에 따른 생리활성 증강과 같은 기술의 개발은 미진한 상황이다.

특히, 현재까지 줄기세포 유래 엑소좀을 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN)와 접목시켜 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선 등에 활용하고자 한 연구는 알려진 바가 없다.

이와 관련하여, 대한민국 공개특허 제10-2019-0114620호에서는 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 폴리데옥시리보뉴클레오티드(PDRN)를 함유하는 화장료 조성물를 개시하고 있으나, 인체 지방줄기세포 배양액에는 세포가 성장하면서 분비한 노폐물, 오염방지를 위해 첨가된 항생제, 동물유래 혈청 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 피부나 상처 부위 등에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 높다.

본 발명자들은 엑소좀의 새로운 응용분야 및 의료 내지는 미용기술과의 접목을 통해 엑소좀의 생리활성을 증가시킬 수 있는 기술 등에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 조합한 경우 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선 효능을 효과적으로 증강시킬 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.

대한민국 등록특허공보 제10-1722181호 (2017.03.31) 대한민국 공개특허공보 제10-2018-0048520호 (2018.05.10) 대한민국 공개특허공보 제10-2019-0114620호 (2019.10.10)

본 발명의 목적은 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 함유함으로써 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선 효능 등을 증강시킬 수 있는 새로운 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부주름개선, 피부탄력개선 또는 피부재생용 화장료 조성물, 및 미백용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부재생, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물, 의약 외품 또는 피부 외용제를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여, 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선에 관한 미용 방법 내지는 치료 방법을 제공하는데 있다.

그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선 효능을 증강시키는 조성물로서, 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)"는 통상 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다. 분리 환경, 조건 및 방법 등에 따라 세포외 소포체는 엑소좀과 동일한 의미를 가질 수도 있고 엑소좀과 크기는 동일 내지는 유사하지만 엑소좀의 조성을 갖지 않는 나노베지클까지 포함하는 의미를 가질 수도 있다.

본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.

한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 성체줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간 유래 줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 인간 지방조직 유래 줄기세포일 수 있다.

그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래 엑소좀은 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.

본 명세서에서 용어, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(Polydeoxyribonucleotide; PDRN)는 데옥시리보뉴클레오티드 중합체가 포함된 물질로서, 특별히 다르게 정의하지 않는 한 DNA 중합체 단편 복합체 또는 DNA 중합체 단편 혼합물을 포함하는 의미로 사용된다. 폴리데옥시리보뉴클레오티드는 일반적으로 연어 정액으로부터 추출하여 제조되는데, 이외에도 연어, 송어, 청어, 참치 등의 어류의 정액, 정소, 이리(milt) 및/또는 알 등으로부터 추출되어 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리데옥시리보뉴클레오티드는 정자(spermatozoa)에서 추출하여 고열 처리함으로써 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 탄력"은 외력에 의해 변형된 피부가 해당 외력이 제거되었을 때 쉽게 원형으로 복귀되는 특성을 의미한다. "피부 주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐과 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화하는 것을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어인 "미백"은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소한 피부의 명도를 증가시키거나, 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 것을 포함한다.

본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학 조성물, 의약 외품 또는 피부 외용제일 수 있다.

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 포함하는 피부주름개선, 피부탄력개선 또는 피부재생용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 예를 들어, 크림 또는 로션일 수 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 포함하는 피부재생, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물, 의약 외품 또는 피부 외용제를 제공한다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형일 수 있고, 상기 의약 외품 또는 상기 피부외용제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 피부재생, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예의 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합 이외에, 그 작용(예를 들어, 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 개선제, 미백제, 창상 치료제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 미백, 피부주름개선, 피부탄력개선 또는 피부재생 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예의 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 상기 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부탄력개선, 피부주름 개선, 피부 미백 및/또는 피부재생일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (a) 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함한다. 상기 (a) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.

대안으로, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하거나, 상기 의약 외품 또는 상기 피부외용제를 포유동물의 피부 또는 창상 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 피부재생, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진(accelerating wound healing)을 위한 방법을 제공한다. 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.

본 발명의 조성물은 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 함유함으로써 줄기세포 유래 엑소좀 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드만을 함유한 조성물 보다 우수한 미백, 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름개선 및/또는 피부탄력개선 효능을 나타낼 수 있다.

한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 NTA(nanoparticle tracking analysis)에 의해 얻어진 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 TEM(transmitted electron microscopy)으로 촬영된 입자 이미지 사진이다. "도 1C"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD9, CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합(PDRN+EXO)을 스크래치-운드(Scratch-Wound)에 처리한 경우 엑소좀 단독 처리(EXO) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 단독 처리(PDRN)한 경우에 비해 인체 피부 섬유아세포의 이동을 훨씬 증가시키는 것을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합(PDRN+EXO)을 멜라닌 생성 세포에 처리한 경우 엑소좀 단독 처리(EXO) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 단독 처리(PDRN)한 경우 보다 멜라닌 생성량을 현저히 감소시키는 것을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

실시예

실시예 1: 세포의 배양

인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO₂, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.

인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast; HDF)는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO₂, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.

마우스 멜라노마세포(mus musculus melanoma)인 B16F10 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입), 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입), L-글루타민 (ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 소듐 피루베이트 (sodium pyruvate; ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM, 무페놀레드 (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO₂, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.

당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO₂, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.

엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.

실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제

실시예 1에서 0.22 ㎛ 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff;MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.

엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.

분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다.

실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석

분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 및 도 1B에 도시하였다.

도 1C는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD63, CD9, CD81, Alix 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD63, 항-CD9, 항-CD81, 항-Alix 및 항-TSG101을 사용하였다.

도 1D는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과이다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-GM130 및 항-칼넥신(Calnexin)을 사용하였다. GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 엑소좀의 특성 분석 시 엑소좀에 존재하지 않아야 하는 네거티브 마커이다. 도 1D에 도시된 바와 같이 GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 지방줄기세포의 파쇄물에서는 존재하는 것으로 확인되었지만, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에서는 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 도 1C 및 도 1D의 결과를 종합할 때, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 포지티브 마커 및 네거티브 마커 특성분석을 만족하는 엑소좀임을 알 수 있다.

도 1E는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD9, CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD81에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD81 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD9 (PE-Mouse anti-human CD9)(BD에서 구입), PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.

실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정

인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.

비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).

실시예 5: 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합 제조

실시예 2와 같이 준비된 줄기세포 유래 엑소좀을 폴리데옥시리보뉴클레오티드(제품명: "라푸른", 주식회사 엑소코바이오 제조)와 혼합하여 상온에서 15분 반응시킨 후 사용하였다{이하, "PDRN-엑소좀 혼합액 (PDRN+EXO)"이라 함}.

본 발명을 한정하지 않는 일례로서, 폴리데옥시리보뉴클레오티드는 주식회사 엑소코바이오(대한민국 서울시 소재)에서 제조한 "라푸른" 제품을 사용하였으나 이에 제한되는 것이 아니며 상업적으로 입수가능한 다양한 폴리데옥시리보뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 상기 조성물 내의 줄기세포 유래 엑소좀의 농도는, 예를 들어, 단백질 농도로 대략 1 내지 10,000 μg/mL로 조정될 수 있다.

실시예 6: 피부 섬유아세포를 이용한 피부 재생 효능의 확인

실시예 5와 같이 준비된 PDRN-엑소좀 혼합액이 인체 피부 섬유아세포(HDF)에서 상처 회복능을 촉진하는지 여부를 평가하기 위하여 스크래치-운드 어세이(Scratch-Wound Assay)를 시행하였다. 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 분산된 HDF를 상처 유도용 컬처 플레이트(ImageLock Plate; EssenBio에서 구입)에 7,500 세포/웰의 밀도로 분주하고 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24시간 배양하여 90% 이상의 밀집도를 확인한 후, 운드메이커(WoundMaker; EssenBio에서 구입)를 이용하여 스크래치를 유발하였다. 피부 섬유아세포를 이용한 피부 재생 효능의 확인을 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다:

(1) 음성대조군 (Control): 무혈청 배지만 스크래치-운드에 처리한 실험군;

(2) 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (PDRN): 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 무혈청 배지에 희석하여 스크래치-운드에 처리한 실험군 (최종 처리농도: 폴리데옥시리보뉴클레오티드 100 μg/mL);

(3) 줄기세포 유래 엑소좀 (EXO): 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀을 무혈청 배지에 희석하여 스크래치-운드에 처리한 실험군 (최종 처리농도: 줄기세포 유래 엑소좀 20 μg/mL);

(4) PDRN-엑소좀 혼합액 (PDRN + EXO): 실시예 5에서 준비된 PDRN-엑소좀 혼합액을 무혈청 배지에 희석하여 스크래치-운드에 처리한 실험군 (최종 처리농도: 폴리데옥시리보뉴클레오티드 100 μg/mL + 줄기세포 유래 엑소좀 20 μg/mL).

상기 실험군 각각을 스크래치-운드(Scratch-Wound)에 처리한 후 5% CO₂, 37℃ 조건에서 12시간 동안 HDF를 배양하였다.

상처 회복능을 측정한 결과, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합(PDRN+EXO)을 처리한 경우 엑소좀 단독 처리(EXO) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 단독 처리(PDRN)한 경우에 비해 인체 피부 섬유아세포의 이동을 훨씬 증가시킨 것을 확인하였다(도 3 참조).

따라서, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부재생, 상처 치유, 상처 치유 촉진, 피부주름 개선 및/또는 피부탄력 개선용으로 유용할 것으로 기대된다.

실시예 7: 멜라닌 생성 억제 효과

줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합에 의한 미백효과를 마우스 멜라노마 세포에서 멜라닌 생성 억제 정도를 통해 확인하였다. 상기 멜라노마 세포는 마우스 흑색종에서 유래한 세포이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다. 멜라노마 세포를 48-웰 플레이트에 단위 면적당 7,000 세포씩 분주한 후 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24시간 배양하였다.

멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생성 억제 효과의 확인을 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다:

(1) 음성대조군 (Control): α-MSH (멜라닌 합성 자극제)가 혼합된 배양배지만 멜라노마 세포에 처리한 실험군;

(2) 알부틴 (Arbutin): 양성대조군인 1 mM 알부틴(Arbutin)을α-MSH가 혼합된 배양배지에 희석하여 멜라노마 세포에 처리한 실험군;

(3) 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (PDRN): 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 α-MSH가 혼합된 배양배지에 희석하여 멜라노마 세포에 처리한 실험군 (최종 처리농도: 폴리데옥시리보뉴클레오티드 600 μg/mL);

(4) 줄기세포 유래 엑소좀 (EXO): 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀을 α-MSH가 혼합된 배양배지에 희석하여 멜라노마 세포에 처리한 실험군 (최종 처리농도: 줄기세포 유래 엑소좀 6 mg/mL);

(5) PDRN-엑소좀 혼합액 (PDRN + EXO): 실시예 5에서 준비된 PDRN-엑소좀 혼합액을 α-MSH가 혼합된 배양배지에 희석하여 멜라노마 세포에 처리한 실험군 (최종 처리농도: 폴리데옥시리보뉴클레오티드 600 μg/mL + 줄기세포 유래 엑소좀 6 mg/mL).

상기 실험군 각각을 멜라노마 세포에 처리한 후 5% CO₂, 37℃ 조건에서 48시간 멜라노마 세포를 배양하였다. 이후, 배양액을 회수하고 세척용액(PBS; ThermoFisher에서 구입)을 이용하여 멜라노마 세포를 세척하였다.

상기 회수된 배양배지와 CCK-8 어세이 시약(Dojindo)을 혼합하였고, 5% CO₂, 37℃ 조건에서 1시간 30분 동안 인큐베이션한 후 상층액을 96-웰 플레이트로 옮겨 405 nm 흡광도를 측정하였다. 또한, 48-웰 플레이트 내 멜라노마 세포를 세척용액으로 세척한 후, 세척된 멜라노마 세포에 대해 10% DMSO를 혼합한 1 N NaOH(MerckMillipore에서 구입)를 처리한 후 플레이트를 밀봉하고 80℃ 조건에서 30분간 가열하여 멜라노마 세포 내 멜라닌을 추출하였다. 추출한 멜라닌은 405 nm 흡광도를 측정하여 멜라닌 양을 계산하였다.

그 결과, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합(PDRN+EXO)은 엑소좀 단독 처리(EXO) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 단독 처리(PDRN) 보다 멜라노마 세포에서의 멜라닌 합성을 현저히 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조). 따라서, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드와의 조합을 유효성분으로 포함하는 조성물은 미백 효과를 가지며, 미백용 화장료 조성물의 유효 성분으로서 유용하게 활용될 수 있다.

이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims

줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 조합을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
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제1항에 있어서,
크림 또는 로션인 미백용 화장료 조성물.
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청구항 제1항에 기재된 미백용 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부미백을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법.
제8항에 있어서,
(a) 상기 미백용 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 미백용 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 미용방법.
제9항에 있어서,
상기 (a) 단계에서는 미백용 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
(c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 미백용 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는, 미용방법.
제11항에 있어서,
상기 (c) 단계에서는 미백용 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 미용방법.
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