KR20220130182A

KR20220130182A - 지방질-유래된 줄기 세포의 조건화 배지로부터의 단백질 농축물을 지닌 화장 조성물

Info

Publication number: KR20220130182A
Application number: KR1020227028450A
Authority: KR
Inventors: 요나 게펜; 에후드 마롬
Original assignee: 스템 셀 메디슨 리미티드
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2022-09-26
Also published as: CN115461447A; IL272145A; EP4093856A1; JP2023511352A; US20230018711A1; WO2021149047A1; EP4093856A4

Abstract

지방질-유래된 줄기 세포의 조건화된 배지로부터 제조된 항-노화 화장 조성물이 제공된다. 화장 조성물은 바람직하게는 2개의 별개의 구성성분: 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 정제된 단백질 분획을 포함하는, 생성물의 향장학적으로 활성인 성분으로서 제공된 건조된 형태의 단백질 구성성분; 및 피부에 적용하기 직전에 동결건조된 단백질 구성성분을 재구성하기 위한, 재구성 구성성분을 포함하는 즉석 혼합형 조성물(ready-to-mix composition)이다.

Description

지방질-유래된 줄기 세포의 조건화 배지로부터의 단백질 농축물을 지닌 화장 조성물

발명의 분야

본 발명은 지방질-유래된 줄기 세포(adipose-derived stem cell)의 조건화 배지(conditioned medium)로부터 제조된 항-노화 화장품(anti-aging cosmetic product)에 관한 것이며, 이는 특히 효과적이면서도 장기간 저장 수명(long shelf-life) 및 장기간 안정성에 의해 특징화된다. 본 발명의 항-노화 화장품은 조건화 배지로부터 정제되고 화장용 부형제와 함께 제형화된 단백질 농축물을 기반으로 한다. 본 발명의 화장품은 건조된 형태의 조건화 배지로부터 유래된 단백질 조성물, 및 사용 전 재구성시키기 위한 재구성 배지를 포함하는 2개-구성성분 화장 조성물(two-component cosmetic composition)로서 제공될 수 있다.

발명의 배경

피부 노화는 검버섯, 잔 주름(fine line) 및 주름, 감소된 볼륨(volume) 및 탄력성, 및 피부 결(texture of the skin)의 변화에 의해 특징화된다.

다양한 처방전이 필요없는(over-the-counter) 항-노화 화장품이 피부 색조(skin tone), 피부 외관(skin appearance) 등과 같은 매개변수를 개선시키고, 보다 건강하고 젊어보이는 피부를 유지하는데 이용가능하다. 이는 일반적으로 지방산 및 알코올, 다양한 비타민 및 비타민 유도체, 필러(filler), 예를 들면, 콜라겐 및 하이알루론산, 및 식물 추출물을 함유한다. 화장품 산업이 발전하면서, 새로운 화장 성분(cosmetic ingredient)이 개발되어 있다.

줄기 세포 조건화 배지를 기반으로 한 항-노화 화장 조성물, 예를 들면, 세럼(serum), 크림, 로션, 토너(toner) 및 클렌저(cleanser)가 개발되어 왔다. 이러한 생성물은 예를 들면, 문헌: Amirthalingam and Seetharam (2016) MJMS., 1(2):46-52. Additional exemplary products include ADIOStem^TM(Celprogen Inc.)에서 검토되며, 이는 지방질 유래된 줄기 세포 조건화 배지, 정제수 및 글리세린을 함유하는 보습 크림(moisturizing cream)이다(Product Protocol, www.celprogen.com).

제EP 2257272호는 개체(individual)에게 향장학적으로(cosmetically) 활성인 양의 잇몸 섬유아세포-유래된 생성물, 예를 들면, 잇몸 섬유아세포 전체 세포(gingival fibroblast whole cell), 잇몸 섬유아세포 배양물 및 잇몸 섬유아세포 조건화 배지를 투여함을 포함하여, 상기 개체에서 피부 노화의 향장학적 예방 또는 치료를 위한 방법을 개시하고 있다.

제US 7,160,726호는 3-차원 배양물 속에서 성장시킨 세포, 특히, 피부 섬유아세포, 각질세포, 상피 세포, 연골세포, 평활근 세포 및 근세포에 의해 조건화된 세포 배양 배지를 포함하는 조성물을 개시하고 있다. 조건화된 세포 배지는 다른 것들 중에서, 화장 적용, 코스메슈티칼(cosmeceutical) 적용 및 약제학적 적용을 위해 사용될 수 있다.

제US 8,101,167호는 염증의 징후(sign) 및/또는 면역 장애의 치료에 사용하기 위한 조성물을 제조하기 위한, 및 이의 이러한 용도를 위한 적어도 하나의 조건화된 세포 배양 배지 또는 이의 추출물의 용도를 개시하고 있으며, 상기 배지는 소화관 세포의 적어도 하나의 배양물 및 적어도 하나의 프로바이오틱 미생물(probiotic microorganism)과 접촉시켜 수득할 수 있다.

제US 8,361,485호는 조건화 세포 배양 배지 조성물 및 사용 방법을 개시하고 있다. 배지는 기질 세포(stromal cell), 실질 세포(parenchymal cell), 간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell), 간 저장 세포(liver reserve cell), 천연 줄기 세포(neural stem cell), 췌장 줄기 세포(pancreatic stem cell) 및/또는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell)에 의해 조건화될 수 있다. 세포는 유전적으로 변형될 수 있다. 3-차원 조직 작제물이 바람직하다. 조건화 배지의 물리적 구현예는 동결되거나, 동결건조되거나 분말로 건조된, 액체 또는 고체를 포함한다. 배지는 내부 투여용 비히클(vehicle)로서 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되거나, 식품 항목 또는 생성물에 직접 적용되거나, 국소 적용을 위한 고약(salve) 또는 연고제로 제형화되거나, 예를 들면, 수술용 접착제(surgical glue)로 제조되거나 이에 첨가되어 칩입성 과정 후 봉합의 치유를 가속화시킨다. 배지는 농축물로 추가로 가공되거나 배지 내에 함유된 하나 이상의 인자 또는 구성성분을 감소시킬 수 있다.

제US 8,586,540호는 양수 속의 태아-유래된 간엽성 줄기 세포용 배양 배지를 개시하고 있다. 또한 활성 성분으로서 양수 속에 태아-유래된 간엽성 줄기 세포의 배양 배지를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 개시하고 있으며, 여기서 개선될 피부 상태는 미백(whitening), 주름, UV 선 또는 피부 리프팅(skin lifting)에 의해 유발된 피부 손상을 포함한다.

제US 9,109,045호는 적합한 배지 및 조건에서 사람 지방질 세포로부터의 지방질-유래된 줄기 세포를 배양함으로써 유의적으로 다량의 사람 성장 인자(human growth factor)를 합성할 수 있는 방법을 개시하고 있다. 또한, 발명의 방법에 따라 생산된 줄기 세포 배양 배지, 및 배양 배지로부터 단리된 사람 성장 인자는 약물 및 화장품용 원료 물질로서 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 출원인에게 양도된 제WO 2018/211498호는 특히 지방질-유래된 줄기 세포(adipose-derived stem cell; ADSC)를 수득하는 방법을 개시하고 있으며, 이는 보다 비용 효율적이고 현재 사용된 방법과 비교하여 보다 높은 수율을 제공한다.

대부분의 화장품, 특히 천연적으로 존재하는 성분을 기반으로 한 화장품은 제한된 저장 수명 및 안정성을 가지며, 전형적으로, 일단 개봉하면, 실온에서 12개월까지만 지속될 수 있고, 많은 경우 단지 6개월 이하까지만 지속될 수 있다.

피부 원기회복(skin rejuvenation), 피부 외관, 피부 색조 등의 개선에 효과적이고 유용하며, 또한 다양한 저장 조건 하에서 긴 저장 수명 및 개선된 안정성에 의해 특징화되는, 화장 조성물이 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은 지방질-유래된 줄기 세포의 조건화 배지로부터 제조된 항-노화 화장 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장 조성물은 조건화 배지로부터 정제되고 화장 부형제와 함께 제형화된 단백질 농축물을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 화장 조성물은 2개의 별도의 구성성분: 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 정제된 단백질 분획을 포함하는, 생성물의 향장학적으로 활성인 성분으로서 제공되는 건조된(예컨대, 동결건조된) 형태의 단백질 구성성분, 및 피부에 적용하기 직전에 건조된 단백질 구성성분을 재구성하기 위한 재구성 구성성분을 포함하는, 즉석-혼합형 조성물(ready-to-mix composition)로서 제공된다. 2개의 구성성분은 생산, 선적 및 저장 동안 별개로 유지되고, 사용 전에 직접 혼합된다. 본 발명은 안정하고 혼합되어 사용 직전에 국소 적용하기 위한 조성물을 형성하는 2개의 별개의 구성성분으로 구성된 생성물을 제공함으로써 화장 조성물의 불안정성 및 제한된 저장 수명의 문제점을 극복한다.

유리하게는, 2개의 별개의 구성성분으로서, 재구성 배지로부터 분리된 건조된 단백질 조성물을 유지하는 것은 활성 단백질 분획의 효능을 유지하면서, 상승된 습도 및/또는 온도의 조건하에서도 현저한 안정성을 제공한다. 하기에 예시된 바와 같이, 안정성 검정은 건조된 단백질 조성물 및 재구성 조성물 둘 다가 40℃/75% RH에서 저장하는 경우, 실온에서 표준 저장 조건 하에 적어도 1.5년의 저장 수명과 동일한, 적어도 6개월 동안 안정함을 나타내었다.

본 발명의 일부 구현예에 따른 단백질 분획은 배지의 수집 전에 혈청-함유 배지 및 후속적으로 혈청이 없는 배지(serum-free medium) 속에서 적어도 48시간 동안 성장시킨 지방질-유래된 줄기 세포에 의해 조건화된 세포 배양 배지로부터 정제된다. 단백질 분획은 조건화된 배지를 농축시키고 1kDa보다 더 작은 구성성분을 제거함으로써 수득된다. 일부 구현예에서, 단백질 분획은 3kDa보다 더 작은 구성성분을 제거함으로써 수득된다. 바람직하게는, 단백질 분획은 화장 부형제(cosmetic excipient)와 함께 제형화되며 세포 배양 배지의 구성성분은 실질적으로 포함되지 않는다.

일부 예시적인 구현예에서, 단백질 분획은 조건화된 배지를 농축시키고 적절한 분자량 컷오프(molecular weight cutoff)(예컨대, 1kDa 또는 3kDa)를 사용하는 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration; TFF)로 여과하여, 보유물(retentate)로서 단백질 분획을 수득함으로써 수득된다. 일부 구현예에서, 수득된 단백질 분획은 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 제형에 대해 정용여과(diafiltration)하여, 세포 배양 배지 구성성분으로부터 정제되고 화장 부형제와 함께 제형화된 단백질 분획을 수득한다.

화장 부형제와 함께 제형화된 단백질 분획은 본원에서 하기 예시된 바와 같은, 세포 배양 배지의 구성성분, 예를 들면, 다양한 금속을 실질적으로 포함하지 않는다. 유리하게는, 제형화된 단백질 분획은 또한 줄기 세포의 성장 동안에 사용되었던 임의의 항생제를 실질적으로 포함하지 않는다. 이는 조건화 배지를 기반으로 하는 전술된 화장품과는 대조되는 것이며, 여기서 조건화 배지는 수집되어 배지 구성성분의 임의의 정제 또는 분리없이 다양한 부형제와 함께 제형화된다.

본 발명에 따른 단백질 분획은 본원의 하기에 예시된 바와 같이, 시험관 내(in vitro) 내에서 사람 각질세포의 생존능을 증가시키고 이의 증식을 유도하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 사람 대상체(subject)에서 사용되는 경우, 본 발명에 따른 건조된 단백질 구성성분과 재구성 배지를 혼합한 후 수득된 재구성된 화장 조성물은 안전하고 비-자극성인 것으로 밝혀졌으며, 더욱이, 사용 6주 후에 이미 보다 더 부드러운 피부, 및 주름 깊이의 감소를 나타내었다. 주름의 깊이의 감소는 사용 12주 후에서도 관찰되었다. 또한, 피부의 부드러움은 사용 6주 후 관찰되었고, 이는 사용 12주 후까지 지속되었다.

따라서, 본 발명은 피부 원기회복, 피부 외관, 피부 색조 등의 개선에 특히 효과적이고 유용하며, 또한 개선된 안정성 및 연장된 저장 수명을 특징으로 하는 화장 조성물을 제공한다.

일 양태에 따라서, 본 발명은 사람 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 정제된 건조된 단백질 분획 및 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 분말 형태의 화장 조성물을 제공하며, 여기서 단백질 분획은 1kDa보다 작은 구성성분의 제거 후에 잔류하는 단백질 및 입자를 포함한다.

일부 구현예에서, 단백질 분획은 3kDa보다 작은 구성성분의 제거 후 잔류하는 단백질 및 입자를 포함한다.

일부 구현예에서, 화장 조성물은 단백질 mg 당 적어도 10⁹개의 엑소좀(exosome)을 포함한다.

일부 구현예에서, 단백질 분획은 사람 지방질-유래된 줄기 세포가 성장한 세포 배양 배지의 구성성분을 실질적으로 함유하지 않는다.

일부 구현예에서, 사람 지방질-유래된 줄기 세포는 배지의 수집 전 적어도 24시간 동안 혈청-함유 배지 속에서 및 연속적으로 적어도 48시간 동안 혈청이 없는 배지 속에서 성장시켰다.

일부 구현예에서, 건조된 단백질 분획은 동결건조된 단백질 분획이다.

일부 구현예에서, 조성물의 단백질 함량은 적어도 0.2 μg/mg 분말이다.

일부 구현예에서, 조성물은 5 중량% 미만의 잔류 수(residual water)를 함유한다.

일부 구현예에서, 화장 조성물은 다음의 단계를 포함하는 공정에 의해 수득된다: (a) 사람 지방질-유래된 줄기 세포(hADSC)를 수득하는 단계; (b) hADSC를 혈청-함유 배지 속에서 적어도 24시간 동안 배양하는 단계; (c) hADSC를 혈정이 없는 배지 속에서 적어도 48시간 동안 아-배양(sub-culturing)하여 조건화 배지를 수득하는 단계; (d) hADSC 및 세포 부스러기를 분리하고 조건화 배지를 수집하는 단계; (e) 조건화 배지를 농축시키고 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 여과함으로써 1kDa 보다 작은 구성성분을 제거하고 단백질 분획을 보유물(retentate)로 수득하는 단계; (f) 단백질 분획을 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 증량제(bulking agent) 및 임의로 적어도 하나의 추가의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 제형을 사용하여 정용여과함으로써, 세포 배양 구성성분으로부터 정제되고 수성 제형과 함께 제형화된 단백질 분획을 수득하는 단계; 및 (g) 수득된 단백질 분획을 건조시키는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 화장 조성물은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다: (a) 사람 지방질-유래된 줄기 세포(hADSC)를 수득하는 단계; (b) hADSC를 혈청-함유 배지 속에서 적어도 24시간 동안 배양하는 단계; (c) hADSC를 혈청이 없는 배지 속에서 적어도 48시간 동안 아-배양하여 조건화 배지를 수득하는 단계; (d) hADSC 및 세포 부스러기를 분리하고 조건화 배지를 수집하는 단계; (e) 조건화 배지를 농축시키고 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 여과함으로써 3kDa 보다 작은 구성성분을 제거하고 단백질 분획을 보유물로서 수득하는 단계; (f) 단백질 분획을 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 증량제 및 임의로 적어도 하나의 추가의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 제형을 사용하여 정용여과함으로써, 세포 배양 배지 구성성분으로부터 정제되고 수성 제형으로 제형화된 단백질 분획을 수득하는 단계; 및 (g) 수득된 단백질 분획을 건조시키는 단계.

일부 구현예에서, 수성 제형은 2% 내지 10%(w/v)의 적어도 하나의 증량제를 포함한다. 일부 구현예에서, 증량제는 만니톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 제형은 적어도 하나의 안정화제 및 적어도 하나의 강직성 제제(tonicity agent)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 제형은 0.01 내지 1%(w/v)의 적어도 하나의 안정화제를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 안정화제는 EDTA를 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 제형은 0.1 내지 1%(w/v)의 적어도 하나의 강직성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 강직성 제제는 염화나트륨을 포함한다.

일부 구현예에서, 배지는 다음의 단계를 포함하는 공정에 의해 수득된 사람 지방질-유래된 줄기 세포에 의해 조건화된다: (a) 지질흡인물(lipoaspirate)을 동결시키는 단계; (b) 지질흡인물을 해동시키고 조직-해리 효소(tissue-dissociation enzyme) 또는 기계적 파열에 의해 해리시키는 단계; (c) ADSC를 포함하는 세포 분획을 원심분리로 펠렛화(pelleting)하고, 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁액 배지로 임의로 세척하고 현탁액을 적어도 하나의 추가의 원심분리에 적용시키는 단계; (d) 단계 (c)에서 수득된 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁액 배지 속에서 재현탁시키고 재현탁된 펠렛 속의 세포의 집단으로부터 ADSC를 선택하는 단계; (e) 임의로 ADSC 선택 전에 적어도 하나의 여과를 수행하는 단계; 및 (f) 임의로 ADSC를 적어도 3회 계대배양(passage) 동안 배양시키는 단계.

일부 구현예에서, 배지는 세포의 적어도 90%까지 CD73, CD90 및 CD105의 양성 발현, 및 세포의 5% 미만까지 CD45의 양성 발현에 의해 특징화된 사람 지방질-유래된 줄기 세포의 집단에 의해 조건화된다.

다른 양태에 따라서, 본 발명은 노화(aging)와 관련된 적어도 하나의 피부 상태를 개선시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본원에 개시된 바와 같은 화장 조성물을 제공하는 단계; 조성물을 재구성하여 피부에 적용하기에 적합한 조성물을 수득하는 단계; 및 피부에 적용시키는 단계를 포함한다.

추가의 양태에 따라서, 본 발명은 혼합을 위해 준비된 별개의 조성물로서,

(a) 사람 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 정제된 단백질 분획 및 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 분말 형태의 건조된 단백질 조성물로서, 여기서 단백질 분획이 1kDa보다 더 작은 구성성분의 제거 후 잔류하는 단백질 및 입자를 포함하는, 건조된 단백질 조성물; 및

(b) 동결건조된 단백질 조성물을 재구성시켜 대상체의 피부에 국소 적용하기에 적합한 조성물을 형성시키기 위한, 물 및 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 재구성 조성물을 포함하는 2개-구성성분 화장품을 제공하고,

여기서 2개의 구성성분은 별도로 유지되고 사용 전에 혼합된다.

일부 구현예에서, 단백질 분획은 3kDa보다 더 작은 구성성분을 제거한 후 단백질 및 입자를 포함한다.

일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물은 단백질 mg 당 적어도 10⁹개의 엑소좀을 포함한다.

일부 구현예에서, 사람 지방질-유래된 줄기 세포는 혈청-함유 배지 속에서 적어도 24시간 동안 및 후속적으로 배지의 수집 전에 적어도 48시간 동안 혈청이 없는 배지 속에서 성장되었다.

일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물의 단백질 함량은 적어도 0.2 μg/mg 분말이다.

일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물은 5 중량% 미만의 잔류 물을 함유한다.

일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다: 조건화 배지를 농축시키고 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 여과함으로써 1kDa 보다 더 작은 구성성분을 제거하고 단백질 분획을 보유물로서 수득하는 단계; 단백질 분획을 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 증량제 및 임의로 적어도 하나의 추가의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 제형을 사용하여 정용여과함으로써 세포 배양 배지 구성성분으로부터 정제되고 수성 제형으로 제형화된 단백질 분획을 수득하는 단계; 및 제형화된 단백질 분획을 건조시키는 단계.

일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다: 조건화 배지를 농축시키고 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 여과함으로써 3kDa 보다 작은 구성성분을 제거하고 단백질 분획을 보유물로서 수득하는 단계; 단백질 분획을 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 증량제 및 임의로 적어도 하나의 추가의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 제형을 사용하여 정용여과함으로써 세포 배양 배지 구성성분으로부터 정제되고 수성 제형으로 제형화된 단백질 분획을 수득하는 단계; 및 제형화된 단백질 분획을 건조시키는 단계.

일부 구현예에서, 수성 제형은 2% 내지 10%(w/v)의 적어도 하나의 증량제를 포함한다. 일부 구현예에서, 증량제는 만니톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 제형은 적어도 하나의 안정화제 및 적어도 하나의 강직성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 제형은 0.01 내지 1%(w/v)의 적어도 하나의 안정화제를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 안정화제는 EDTA를 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 제형은 0.1 내지 1%(w/v)의 적어도 하나의 강직성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 강직성 제제는 염화나트륨을 포함한다.

일부 구현예에서, 배지는 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 사람 지방질-유래된 줄기 세포에 의해 조건화된다: (a) 지질흡인물을 동결시키는 단계; (b) 지질흡인물을 해동시키고 조직-해리 효소 또는 기계적 파열에 의해 해리시키는 단계; (c) ADSC를 포함하는 세포 분획을 원심분리로 펠렛화하고, 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁액 배지로 임의로 세척하고 현탁액을 적어도 하나의 추가의 원심분리에 적용시키는 단계; (d) 단계 (c)에서 수득된 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁액 배지 속에서 재현탁시키고 재현탁된 펠렛 속의 세포의 집단으로부터 ADSC를 선택하는 단계; (e) 임의로 ADSC 선택 전에 적어도 하나의 여과를 수행하는 단계; 및 (f) 임의로 ADSC를 적어도 3회 계대배양 동안 배양시키는 단계.

일부 구현예에서, 배지는 세포의 적어도 90% 까지 CD73, CD90 및 CD105의 양성 발현, 및 세포의 5% 미만까지 CD45의 양성 발현에 의해 특징화된 사람 지방질-유래된 줄기 세포의 집단에 의해 조건화된다.

일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물은 동결건조된 단백질 조성물이다.

일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물과 혼합하기 전에 재구성 조성물의 점도 매개변수는 실온에서 Brookfield 점도계를 사용하여 측정하여, 12 RPM: 1800-2700 cP; 18 RPM: 1400-2000 cP; 60 RPM: 700-1000 cP; 100 RPM: 500-800 cP이다.

일부 구현예에서, 수성 재구성 조성물은 증류수 및 적어도 하나의 유화제 및 적어도 하나의 연화제(emollient)를 포함하는 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 재구성 조성물은 2 내지 10%(w/w)의 적어도 하나의 유화제(emulsifier), 예를 들면, 2 내지 5%(w/w)의 적어도 하나의 유화제를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 수성 재구성 조성물은 2 내지 10%(w/w)의 적어도 하나의 연화제(emollient), 예를 들면, 2 내지 5%(w/w)의 적어도 하나의 연화제를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 수성 재구성 조성물은 습윤제(humectant), pH 조절제, 증점제 및 방부제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 향장학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물과 수성 재구성 조성물 사이의 중량비는 적어도 1:20, 예를 들면, 적어도 1:25, 1:20 내지 1:100의 범위, 1:20 내지 1:50의 범위이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물과 수성 재구성 조성물 사이의 중량비는 1:20 내지 1:50의 범위이다.

일부 구현예에서, 혼합 후, 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물은 30초 이내, 예를 들면, 20초 이내에 재구성된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.

일부 구현예에서, 수성 재구성 조성물과 혼합하기 전에 건조된 단백질 조성물의 pH는 7.0 내지 7.6의 범위이다.

일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물과 혼합하기 전에 수성 재구성 조성물의 pH는 7.0 내지 7.6의 범위이다.

일부 구현예에서, 2개의 조성물의 혼합 후 재구성된 조성물의 pH는 7.0 내지 7.6의 범위이다.

혼합 후 수득된 최종의 재구성된 조성물은 바람직하게는 등장성(isotonic)임이 이해될 것이다.

국소 적용에 적합한 재구성된 조성물은 전형적으로 로션, 크림 및 겔로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형태로 존재한다. 각각의 가능성은 별개의 구현예를 나타낸다. 현재의 바람직한 구현예에서, 재구성된 조성물은 로션이다.

본 발명의 화장 조성물은 예를 들면, 얼굴, 목, 팔 및 손을 포함하는, 임의의 피부 부분에 적용하기에 적합하다.

일부 구현예에서, 화장품은 예비충전된 주사기(prefilled syringe)로서 제공되며, 여기서 주사기는 수성 재구성 조성물을 포함하는 제1의 챔버(chamber), 건조된 단백질 조성물을 포함하는 제2의 챔버, 및 플런저(plunger)를 포함하고, 여기서 플런저의 운동시 수성 재구성 조성물이 제1의 챔버로부터 제2의 챔버로 전달되어 재구성용의 건조된 단백질 조성물과 혼합된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 노화와 관련된 적어도 하나의 피부 상태를 개선시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본원에 개시된 바와 같은 2개-구성성분 화장품을 제공하는 단계; 건조된 단백질 조성물을 수성 재구성 조성물과 혼합하여 피부에 적용하기에 적합한 재구성된 조성물을 형성시키는 단계; 및 피부에 적용시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 이러한 및 추가의 양태 및 특징은 이어지는 상세한 설명, 실시예 및 청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1. 단백질 분획의 제형 - 증량제의 선택. F1 내지 F17 제형의 조성. 값은 %w/v를 나타낸다.
도 2. 증량제 특성화. 조성물 F1 내지 F7의 동결건조 동안 물질 손실, 동결건조 후 질감(texture) 및 재구성 시간.
도 3. 증량제 특성화. 조성물 F8 내지 F17의 동결건조 후 잔류 물 함량(residual water content) 및 재구성 시간.
도 4. 조성물 F8 내지 F17의 동결건조 후 (A) 구성 시간; 및 (B) 잔류 물 함량의 그래프 표시.
도 5. 단백질 분획의 예시적인 수성 제형. 값은 내용에 명시된 바와 같이, 각각의 스톡 용액(stock solution)으로부터 취한 용적을 나타낸다.
도 6. 주요 표피 각화세포: 정상, 사람, 성체(NHPEK) 세포의 증식에서 조건화 배지("CM")의 효과. (A,B) 세포의 상대적인 증식, NHPEK 세포 각각 100k/ml 또는 50k/ml; (C,D) 집단 델타, NHPEK 세포 각각 100k/ml 또는 50k/ml; (E,F) 배가 시간(Doubling time), NHPEK 세포 각각 100k/ml 또는 50k/ml; (G, H) 생존능(Viability)(MPI), NHPEK 세포 각각 100k/ml 또는 50k/ml.
도 7. NHPEK 세포 증식에서 조건화 배지("CM") 및 제형화된 단백질 분획("F19")의 효과. (A) 세포의 상대적인 증식; (B) 집단 델타; (C) 배가 시간; (D) 생존능(MPI).
도 8. 여과에 의한 성장 배지 청소(clearance).
도 9. 안정성 검정. 본 발명에 따른 동결건조된 단백질 조성물의 (A) 장기간 안정성 검정 및 (B) 가속화된 안정성 검정. 본 발명에 따른 재구성 조성물의 (C) 장기간 안정성 검정 및 (D) 가속화된 안정성 검정.
도 10. 본 발명에 따른 화장품의 소비자 인식 - 설문 응답. (A) 질의 1 내지 12; (B) 질의 13.
도 11. 예비충전된 주사기로서 제공된, 본 발명의 일부 구현예에 따른 화장품.
도 12. 생성물 특성화 - 엑소좀 함량. (A) 엑소좀 마커 발현의 유동 세포분석법 분석(flow cytometry analysis)의 개략도; (B) 엑소좀 마커 발현 결과; (C) NanoSight^TM을 사용한 엑소좀 정량화.

발명의 상세한 설명

본 발명은 긴 저장 수명 및 장기간 안정성을 특징으로 하는, 지방질-유래된 줄기 세포의 조건화 배지로부터 제조된 항-노화 화장품(anti-aging cosmetic product)을 제공한다. 본 발명은 일부 구현예에 따라서, 안정하고 혼합되어 사용 직전에 국소 적용을 위한 조성물을 형성하는 2개의 별개의 구성성분으로 구성된 생성물을 제공함으로써, 화장 조성물의 불안정성 및 제한된 반감기를 극복한다.

보다 특히, 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 화장 조성물은 2개의 별개의 구성성분: 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 정제된 단백질 분획을 포함하는, 생성물의 향장학적으로 활성인 활성 성분으로서 제공되는 건조된 형태(예컨대, 동결건조된 형태)의 단백질 조성물, 및 피부에 적용 직전에 건조된 단백질 구성성분을 재구성시키기 위한 재구성 조성물을 포함하는, 즉석 혼합(ready-to-mix) 조성물이다. 2개의 구성성분은 생산, 선적 및 저장 동안 별개로 유지되고, 사용 전에 직접 혼합된다.

본 발명의 단백질 조성물은, 농축 및 분리 후 남아서 1kDa보다 작은 구성성분을 제거하는 단백질 및 입자를 포함하는 단백질 분획을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 분획은 농축 및 분리 후 남아서 3kDa보다 더 작은 구성성분을 제거하는 단백질 및 입자를 포함한다. 일부 특수한 구현예에서, 단백질 분획은 적절한 분자량 컷오프(예컨대, 1kDa 또는 3kDa)를 지닌 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 수득된다. 본 발명에 따르는 단백질 분획은 이미 사용 6주 후에, 피부를 연화시키고 주름의 깊이를 감소시키는데 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 개선된 안정성 및 연장된 반감기를 지닌 효과적인 항-노화 화장품을 제공한다.

지방질-유래된 줄기 세포 단리 및 조건화 배지의 제조

피하 지방으로부터 지방질-유래된 줄기 세포(ADSC)를 수득하기 위한 예시적인 공정은 하기 실시예 단락에 기술되어 있다. 일반적으로, ADSC는:

(a) 지질흡인물을 수득하는 단계;

(b) 조직-해리 효소를 사용하거나 기계적 파열에 의해 지질흡인물을 해리시키는 단계;

(c) 원심분리에 의해 ADSC를 포함하는 세포 분획을 펠렛화하고, 임의로 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁 배지(예컨대, 등장성 완충제 또는 배양 배지)를 사용하여 세척하고 현탁액을 적어도 하나의 추가의 원심분리에 적용시키는 단계;

(d) 단계 (c)에서 수득된 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁 배지(예컨대, 등장성 완충제 또는 배양 배지) 속에 재현탁시키고 재현탁된 펠렛 속의 세포의 집단(population)으로부터 ADSC를 선택하는 단계;

(e) 임의로 ADSC 선택 전에 적어도 하나의 여과를 수행하는 단계; 및

(f) 임의로 ADSC를 적어도 3회 계대배양(passage) 동안 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 피하 지방으로부터 수득될 수 있다.

일부 구현예에서, 신선한 지방흡인물이 사용된다. 다른 구현에에서, 동결된 지방흡인물이 사용된다. 이러한 구현예에 따라서, ADSC를 수득하는 것은 다음의 단계를 포함할 수 있다:

(a) 지방흡인물을 동결시키는 단계;

(b) 지방흡인물을 해동시키고 조직-해리 효소를 사용하거나 기계적 파열에 의해 해리시키는 단계;

(c) ADSC를 포함하는 세포 분획을 원심분리로 펠렛화시키고, 임의로 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁 배지(예컨대, 등장성 완충제 또는 배양 배지)를 사용하여 세척하고 현탁액을 적어도 하나의 추가의 원심분리에 적용시키는 단계;

(d) 단계 (c)에서 수득된 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁 배지(예컨대, 등장성 완충제 또는 배양 배지) 속에서 재현탁시키고 재현탁된 펠렛 속의 세포 집단으로부터 ADSC를 선택하는 단계;

(f) 임의로 ADSC를 적어도 3회 계대배양 동안 배양시키는 단계.

본 발명은 지방질-유래된 단엽성 줄기 세포, 특히 사람 지방질-유래된 간엽성 줄기 세포를 활용한다. 본원에 사용된 바와 같이, "ADSC" 또는 "hADSC"(즉, 사람 지방질-유래된 줄기 세포)로 약칭된, 용어 "지방질-유래된 간엽성 줄기 세포" 또는 "지방질-유래된 줄기 세포"는 지방 조직으로부터 수거된 가소성-점착성(plastic-adherent), 다능성(multipotent) 세포 집단을 지칭한다. 세포 집단은 세포의 적어도 90%까지 CD73, CD90 및 CD105의 양성 발현, 및 세포의 5% 미만까지 CD45의 양성 발현에 의해 특징화된다. 사람 지방질-유래된 줄기 세포의 집단은 전형적으로 적어도 70% 생존능 및 섬유아세포 유사 형태학에 의해 추가로 특징화된다.

세포 표면 마커 발현의 특성화는 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 형광성-활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 수행될 수 있다. FACS 프로토콜은 예를 들면, 문헌: Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology Volume 699 2011, Editors: Teresa S. Hawley, Robert G. Hawley Humana Press에서 고찰된다. 예시적인 과정은 하기 기술되어 있다.

본 발명에 따른 ADSC는 바람직하게는 비-유전적으로 변형된다.

본 발명의 구현예에 따른 ADSC는 사람 피하 지방으로부터 유래된다. 특수한 구현예에 따라서, 세포는 지방흡인술 흡인(liposuction aspiration)에 의해 수득된 사람 피하 지방으로부터 유래된다. ADSC는 위, 둔부(hip), 넙적다리, 팔, 목 및 엉덩이(buttock)의 다양한 부위에서 지방흡인술에 의해 수득될 수 있다. 레이저, 초음파 및 복강형성술(abdominoplasty)에 의한 지방 제거를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 임의의 지방흡인술의 과정이 ADSC를 수득하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

지방질 조직은 가공하여 지방질-유래된 줄기 세포를 단리한다. 제조 방법은 전형적으로 조직을 PBS 및 염수와 같은 완충제, 및/또는 성장 배지(전형적으로 외부 사이토킨 또는 성장 인자와 같은 임의의 첨가제가 들어있지 않음), 예컨대, DMEM, StemMACS^TM 또는 Plasma-Lyte를 사용하여 세척하는 단계, 및 조직을 조직-해리 효소, 예를 들면, 콜라게나제로 처리하는 단계 및/또는 조직을 비-효소적 기계적 파열에, 예를 들면, Tulip Nano Transfer^TM와 같은 장치를 사용하여 적용시키는 단계를 포함한다. 샘플의 효소적 분해는 또한 디스파제 및 콜라게나제의 조합을 사용하여 수행할 수 있다. 일반적으로 응집된 리포좀은 줄기 세포 및 적혈 세포, 내피 세포, 및 섬유아세포와 같은 다른 세포를 포함하는 유리 간질 세포로부터 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 적혈구(erythrocyte)는 현탁된 펠렛으로부터 적합한 분해 완충제를 사용하여 분해할 수 있고 잔류하는 세포는 여과 또는 원심분리될 수 있다.

일부 구현예에서, ADSC는 완충제를 적용시켜 지질흡인물에서 원래 발견된 적혈 세포의 분해를 유발하지 않고 수득할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 지질흡인물을 가공하여 적혈 세포 분해 완충제를 적용하지 않고 지방질-유래된 줄기 세포를 단리한다. 적혈 세포 분해 완충제 없이 지방질-유래된 줄기 세포를 단리하는 방법은 본 발명의 출원인에게 양도된 제WO 2018/211498호에 기술된 바와 같은, 추가의 가공 전에 지방질 조직을 동결 및 해동시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 적혈 세포 분해 완충제는 hADSC를 포함하는 세포 분획을 원심분리로 펠렛화한 후 및 세포의 집단으로부터 hADSC를 선택하기 전에 적용된다.

일부 구현예에 따른 지질흡인물을 동결시키는 것은 다음과 같이 수행된다: 지질흡인물을 동결 백(freezing bag) 속에 두고 DMSO를 10%의 최종 농도에서 가한다. 동결 백을 동결 캐니스터(freezing canister) 속에 두고 샘플을 -80℃에서 밤새(~24 시간) 유지시킨다. 이후에, 동결된 샘플을 증기 상 액체 질소 탱크로 이동시킨다. 안정성 시험은 저장 기간 동안 수행할 수 있다. 해동에 있어서, 일부 구현예에 따라서, 샘플을 꺼내어 실온에 수분 동안, 전형적으로 5 내지 10분 동안 둔다. 이후에, 샘플을 수조 속에서 37℃에서 수분 동안, 전형적으로 5 내지 10분 동안, 또는 샘플의 대부분이 해동될 때까지 해동시킨다. 이후에, 샘플을 본원에 등장성 완충제 또는 간엽성 줄기 세포에 적합한 배양 배지, 예를 들면, PBS와 같은 완충제로서 정의된, 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁제 배지로 37℃에서 세척한다. 샘플은 전형적으로 2회 세척한다.

일부 구현예에서, 공정은 적어도 하나의 여과를 수행함을 포함한다. 여과는, 일부 구현예에서, 100 마이크론 메쉬(micron mesh)를 통해 및 후속적으로 40 마이크론 메쉬를 통해 수행하여 조직을 추가로 해리시키고 SVF 분획의 수집을 촉진시킨다.

SVF 분획 속의 세포의 집단 내로부터 ADSC를 단리하기 위하여, 세포 배양 용기에 대한 점착에 의한(예컨대, 플라스틱 점착에 의한) 및/또는 비드/항체를 통한 선택과 같은 공정이 전형적으로 적용된다. 임의로, 세포는 세포 분류에 의해 분리할 수 있거나 면역조직학적으로 분리할 수 있다. 문헌: Bunnell et al. (2008) Methods., 45(2): 115-120은 ADSC의 단리를 위한 방법을 검토한다.

배양 용기에 대한 점착에 의한 선택은 전형적으로: SVF 세포를 임의의 코팅없이 적합한 배양 배지가 들어있는 배양 플라스크(예컨대, 플라스틱 플라스크) 속에 씨딩(seeding)하는 단계; 씨딩된 세포를 밤새(일부 구현예에서, 적어도 12시간 동안, 또는 24 내지 48시간 사이에) 항온처리(incubating)하는 단계; 플라스크를 세척하고 비-점착성 세포 및 조직 부스러기를 제거하는 단계; 및 신선한 배양 배지를 플라스크에 가하는 단계에 의해 전형적으로 수행된다. 점착성 세포(ADSC)는 목적한 수준의 합치성(confluency)으로 배양한 후, 이를 수집하여 저장하거나 추가의 계대배양으로 아-배양(sub-culturing)할 수 있다. 전형적으로, 세포는 3 내지 10회, 바람직하게는 3 내지 5회 또는 3 내지 4회의 계대배양 수로 아-배양한다. 세포는 사용할 때까지 동결시켜 저장할 수 있다.

조건화 배지의 생산을 위해, 동결된 세포의 샘플을 해동시키고 세포를 세포 배양 용기 속에서 씨딩하고 세포 배양 배지 - 우선 혈청-함유 세포 배양 배지 및 후속적으로 혈청이 없는 세포 배양 배지 속에서 배양한다. 세포 배양 배지는 배양되는 세포의 영양 요구도에 적절하게 초점맞추어진 것이다. 간엽성 줄기 세포용 배양 배지는 상업적으로 이용가능하다. 예를 들면, 배지는 혈청이 첨가되거나 첨가되지 않은 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM)를 기반으로 할 수 있다. 혈청으로서, 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)을 가할 수 있다. FBS가 첨가되지 않은 DMEM은 혈청이 없는 배지이다. FBS는, L-글루타민 및 항생제(예컨대, 젠타마이신-설페이트)와 함께 DMEM 배지에 가하여 "완전한 혈청 배지" 또는 "완전한 배지"를 수득할 수 있다.

일부 구현예에서, 세포를 혈청-함유 배지 속에서 대략 24시간 동안 배양한 후, 배지를 혈청이 없는 배지와 교환한다. 혈청이 없는 배지는 바람직하게는 동물 생성물이 없는 배지(제노-프리(xeno-free))이다.

세포 배양은 바람직하게는 항온처리기 속에서 35 내지 39℃의 온도에서 5±1% CO₂의 조건 하에 수행한다. 세포 배양은 전형적으로 2-차원 세포 배양이다.

배양 배지를 세포와 함께 항온처리하면, 이는 당해 분야의 숙련가에게 "소비된" 또는 "조건화 배지"로 알려져 있다. 조건화 배지는 배지의 많은 원래 구성성분 뿐만 아니라 다양한 세포 물질대사물 및 예를 들면, 생물학적으로 활성인 성장 인자를 포함하는 분비된 단백질을 함유한다.

세포는 배지의 수집 전에 적어도 48시간 동안 및 바람직하게는 72시간 이하 동안 혈청이 없는 배지 속에서 배양한다. 일부 구현예에서, 세포는 혈청이 없는 배지 속에서 배지의 수집 전에 48 내지 96시간 동안 배양한다. 다른 구현예에서, 세포는 혈청이 없는 배지 속에서 배지의 수집 전에 48 내지 72시간 동안 배양한다. 혈청이 없는 배지 속에서 항온처리 후, 세포 및 임의의 세포 부스러기를 배지(예컨대, 원심분리 또는 여과에 의해)로부터 분리하고 조건화 배지를 수집한다. 수집된 조건화 배지는 수집 후 즉시 가공하거나 사용할 때까지 동결하여 저장할 수 있다.

단백질 분획의 정제 및 건조된 단백질 조성물의 생산

본 발명의 단백질 분획은 조건화 배지를 가공하여 1kDa 보다 작은 구성성분을 제거함으로써, 바람직하게는 3kDa보다 더 작은 구성성분을 제거함으로써 수득한다. 단백질 분획은 바람직하게는 세포 배양 배지의 성분으로부터 정제하고 화장 부형제와 함께 제형화한다. 후속된 단락은 본 발명의 일부 구현예에 따른 단백질 분획의 정제를 기술하며, 이는 접선 유동 여과(TFF) 시스템을 사용한 농축, 여과 및 정용여과를 기반으로 한다. 당해 분야의 숙련가는 예를 들면, 원심분리 여과, 투석, 침전 및 이의 조합을 포함하는, 단백질 분획을 정제하기 위한 다른 방법이 본 발명과 함께 사용될 수 있음을 인식할 수 있다.

조건화 배지(신선한 또는 해동된)는 바람직하게는 농축에 적용시켜 농축된 조건화 배지의 목적한 용적을 수득한다. 농축 인자는 전형적으로 조건화 배지의 초기 용적에 따라 2 내지 10배의 범위이다. 조건화 배지의 농축은 단백질 분획의 정제 전 또는 후에 수행할 수 있다.

일부 구현예에서, 조건화 배지는 접선 유동 여과(TFF) 시스템을 사용하여 가공함으로써, 조건화 배지를 농축시키고 1kDa 보다 더 작은 구성성분을 제거하고, 바람직하게는 3kDa 보다 더 작은 구성성분을 제거한다. 정제된 단백질 분획은 보유물로서 수득된다. 일부 구현예에서, 조건화 배지는 1kDa의 분자량 컷오프를 지닌 TFF 시스템을 사용하여 가공한다. 추가의 구현예에서, 조건화 배지는 3kDa의 분자량 컷오프를 지닌 TFF 시스템을 사용하여 가공한다. 일부 구현예에서, 보다 높은 분자량 컷오프, 10kDa 이하(예컨대, 5kDa 컷오프 또는 10kDa 컷오프)를 사용할 수 있다.

보유물(정제된 단백질 분획)은 단백질, 예를 들면, 다양한 성장 인자, 및 엑소좀을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 분획의 엑소좀 함량은 1mg의 총 단백질 당 적어도 10⁹개의 엑소좀이다. 추가의 구현예에서, 단백질 분획의 엑소좀 함량은 1mg의 총 단백질 당 적어도 10⁸개의 엑소좀이다.

일부 구현예에서, 보유물(단백질 분획)을 정용여과에 적용시켜 조건화 배지를 화장 부형제를 포함하는 액체 제형으로 대체시키고, 화장 부형제와 함께 제형화된 정제된 단백질 분획을 수득한다.

일부 구현예에서, 조건화 배지로부터 단백질 분획을 정제하기 위하여, 여과를 1kDa의 분자량 컷오프를 지닌 여과 시스템을 사용하여 수행함으로써 보유물을 수득하고 이로부터 1kDa 보다 더 작은 분자 및 입자가 제거된다. 일부 구현예에서, 여과를 3kDa의 분자량 컷오프를 지닌 여과 시스템을 사용하여 수행함으로써, 보유물을 수득하고 이로부터 3kDa보다 더 작은 분자 및 입자가 제거된다. 일부 구현예에서, 10kDa 이하(예컨대, 5kDa 컷오프 또는 10kDa 컷오프)의 더 높은 분자량 컷오프를 사용할 수 있다.

일부 구현예에서, 단백질 분획은 1kDa의 분자량 컷오프를 지닌 여과에 의해 사람 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 정제된 단백질 분획이다. 일부 구현예에서, 단백질 분획은 3kDa의 분자량 컷오프를 지닌 여과에 의해 사람 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 정제된 단백질 분획이다. 일부 구현예에서, 10kDa 이하(예컨대, 5kDa 컷오프 또는 10kDa 컷오프)의 보다 높은 분자량 컷오프를 사용할 수 있다.

정제된 단백질 분획은 또한 "간엽성 성장 인자(mesenchymal growth factor; MGF) 분획", "MGF 베제" 등으로 본원에서 지칭된다.

본원에 개시된 바와 같은 정제된 단백질 분획은 세포 배양 배지로부터 기원하는 구성성분, 예를 들면, 본원에 이후 예시된 바와 같은, 다양한 금속을 실질적으로 포함하지 않는다. 예를 들면, 단백질 분획은 실질적으로 Mg, Ca 및 K를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물은 Mg, Ca 및 K를 실질적으로 포함하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 "실질적으로 포함하지 않는(substantially devoid)"은 검출가능한 양 이하, 예를 들면, Ca 및 K의 경우 1 mg/kg 이하, 및 Mg의 경우 0.2 mg/kg 이하의 양을 나타낸다.

정제된 단백질 분획 및 화장 부형제를 포함하는 액체 제형을 이후에 건조, 예를 들면, 동결건조(또한 "냉동-건조(freeze-drying)")에 적용시켜 분말 형태의 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물을 수득한다. 본 발명에 따른 건조된 단백질 조성물은 바람직하게는 5% wt 미만의 잔류성 물을 함유한다. 일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물은 2% wt 미만의 잔류성 물을 함유한다.

일부 구현예에서, 사람 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 정제된 단백질 분획을 포함하는 화장 조성물을 생산하는 공정이 본원에 제공되고, 이러한 공정은 사람 지방질-유래된 줄기 세포(hADSC)를 수득하는 단계; hADSC를 혈청-함유 배지 속에서 적어도 24시간 동안 배양하는 단계; hADSC를 혈청이 없는 배지 속에서 적어도 48 시간 동안 아-배양하여 조건화 배지를 수득하는 단계; hADSC(세포 부스러기 포함)를 분리하고 1kDa 보다 작은 구성성분을 제거하여 단백질 분획을 수득하는 단계; 단백질 분획을 화장 부형제와 함께 제형화하는 단계; 및 제형화된 단백질 분획을 건조(예컨대, 동결건조)시키는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 사람 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 정제된 단백질 분획을 포함하는 화장 조성물을 생산하는 공정이 본원에 제공되며, 이러한 공정은 사람 지방질-유래된 줄기 세포(hADSC)를 수득하는 단계; hADSC를 혈청을 함유하는 배지 속에서 적어도 24시간 동안 배양하는 단계; hADSC를 혈청이 없는 배지 속에서 적어도 48시간 동안 아배양하여 조건화 배지를 수득하는 단계; hADSC(세포 부스러기 포함)를 분리하고 조건화 배지를 수집하는 단계; 조건화 배지를 농축시키고 3kDa보다 작은 구성성분을 제거하여 단백질 분획을 수득하는 단계; 단백질 분획을 화장 부형제와 함께 제형화하는 단계; 및 제형화된 단백질 분획을 건조(예컨대, 동결건조)시키는 단계.

일부 구현예에서, 조건화 배지를 농축시키고 1kDa 보다 작은 구성성분을 제거하는 단계는 1kDa의 분자량 컷오프를 지닌 여과 시스템을 사용하여 수행한다. 일부 구현예에서, 조건화 배지를 농축시키고 1kDa 보다 작은 구성성분을 제거하는 단계는 1kDa의 분자량 컷오프를 지닌 접선 유동 여과(TFF) 시스템을 사용하여 수행한다.

일부 구현예에서, 조건화 배지를 농축시키고 3kDa 보다 작은 구성성분을 제거하는 단계는 3kDa의 분자량 컷오프를 지닌 여과 시스템을 사용하여 수행한다. 일부 구현예에서, 조건화 배지를 농축시키고 3kDa 보다 작은 구성성분을 제거하는 단계는 3kDa의 분자량 컷오프를 지닌 접선 유동 여과(TFF) 시스템을 사용하여 수행한다.

일부 구현예에서, 단백질 분획을 화장 부형제과 함께 제형화하는 단계는 투석을 사용하여 수행한다. 일부 구현예에서, 단백질 분획을 화장 부형제와 함께 제형화하는 단계는 정용여과를 사용하여 수행한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 공정에 의해 생산된 화장 조성물이 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 공정으로 수득된 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물을 포함하는 2개-구성성분 화장품 및 재구성 조성물이 본원에 제공된다.

건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물

용어 "단백질 조성물" 또는 "단백질 구성성분"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 본 발명의 단백질 분획(즉, 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지로부터 정제된 단백질 분획)과, 단백질 분획을 대상체의 피부에 적용하기 위해 안정성을 유지하고 재구성을 촉진시키도록 고안된 하나 이상의 향장학적으로 허용되는 부형제의 제제를 지칭한다. 본 발명에 따라 대상체는 전형적으로 인간 대상체이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "향장학적으로 허용되는 부형제"는 피부에 대해 유의적인 자극을 유발하지 않고 본 발명의 단백질 분획의 유리한 활성 및 특성을 저해(abrogating)하지 않는 부형제를 지칭한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 화장품은 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물을 함유하는 바이알(vial), 즉, 단백질 바이알, 및 재구성 조성물을 함유하는 재구성 바이알의 쌍으로서 제공되며, 여기서 각각의 바이알 속의 양은 혼합 및 재구성하여 피부에 적용하기에 적합한 화장 조성물을 수득하기에 적합하다. 다른 구현예에서, 본 발명의 화장품은 예를 들면, 도 11에 나타낸 바와 같이, 예비충전된 주사기로서 제공된다. 예시된 실시예에서, 예비충전된 주사기는 수성 재구성 조성물을 포함하는 제1의 챔버(chamber); 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물을 포함하는 제2의 챔버; 및 플런저(plunger)를 포함하고, 여기서 플런저의 이동시 수성 재구성 조성물은 제1의 챔버로부터 제2의 챔버로 전달되어 재구성을 위해 건조된 단백질 조성물과 혼합된다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물의 함량은 적어도 0.2 μg/mg 분말이다. 추가의 구현예에서, 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물의 단백질 함량은 적어도 0.25 μg/mg 분말이다. 일부 구현예에서, 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물의 단백질 함량은 0.2 내지 0.5μg/mg 분말의 범위이다.

본 발명의 즉석 혼합(ready-to mix)용의 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물의 단백질 함량은 바람직하게는 적어도 0.2 μg/mg의 분말이며, 이는 재구성 조성물과 혼합하기 위해 준비된 건조된 단백질 조성물의 분취량(예컨대, 동결건조된 단백질 조성물을 포함하는 바이알 또는 단백질 조성물을 포함하는 주사기 챔버)의 단백질 함량이 mg 분말 당 적어도 0.2 μg임을 의미한다. 추가의 구현예에서, 건조된 단백질 조성물의 단백질 함량은 적어도 0.25 μg/mg 분말이다. 일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물의 단백질 함량은 0.2 내지 0.5μg/mg 분말의 범위이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단백질 조성물은 비-사람 동물 단백질을 포함하지 않는다.

단백질 조성물 속에 포함된 부형제는 전형적으로 증량제를 포함한다. 증량제는 덩어리(mass)를 전형적으로 건조된(예컨대, 동결건조된) 제형에 가하기 위해 사용된다. 증량제는 건조된(예컨대, 동결건조된) 케이크(cake)의 물리적 구조, 균일성, 및 안정성에 기여할 수 있다. 용어 "케이크"는 액체 제형이 본원에 기술된 바와 같이 건조(예컨대, 동결건조)된 경우 생성되는 무수 펠렛을 지칭한다. 증량제는 바이알 당 적은 양을 필요로하는 강력한 생물학적 제제에 특히 요구된다. 흔히, 증량제는 또한 제형 속에 추가의 기능(function), 예를 들면, 안정화제 및/또는 강직성 제제를 제공할 수 있다.

펩타이드 및/또는 단백질의 건조된 제형에 대해 적합한 증량제의 예는 만니톨, 소르비톨, 락토스, 글루코스, 슈크로스 및 트레할로스를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 펩타이드 및/또는 단백질의 건조된 제형을 위한 증량제의 다른 예는 아미노산, 예를 들면, 히스티딘, 아르기닌 및 글리신을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 이들 중 일부는 완충제 및/또는 안정화제로서 제공될 수 있다. 알부민은 증량제 뿐만 아니라 안정화제로서도 제공될 수 있는 여전히 또 다른 부형제이다. 일부 바람직한 구현예에 따라서, 본 발명의 단백질 조성물에 사용된 증량제는 단백질 이외의 것이다. 일부 구현예에서, 증량제는 당(sugar)을 포함한다. 일부 구현예에서, 증량제는 당이다.

단백질 조성물 속에 포함된 부형제는 전형적으로 또한 강직성 제제를 포함한다. 이는 본 발명의 화장 조성물이 피부에 적용하기 전에 및 혼합시 등장성이 되도록 하는 것이 일반적으로 바람직하다. 염화나트륨 염은 강직성 제제의 예이다. 최종 조성물 및 재구성 용적을 선택하여 등장성을 달성하여야 한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단백질 조성물은 증량제로서 당을 포함하고, 이는 또한 강직성 제제로서 제공된다. 예를 들면, 만니톨은 강직성 제제로서 또한 제공되는 당 증량제이다. 일부 구현예에서, 단백질 조성물은 당 증량제 및 적어도 하나의 강직성 제제, 예를 들면, 염화나트륨을 포함한다.

본 발명의 단백질 조성물 속에 가해질 수 있고/포함될 수 있는 추가의 부형제는 다음을 포함한다: 안정화제(예컨대, EDTA), 완충제, 예를 들면, 시트레이트(예컨대, 시트르산나트륨), 포스페이트(예컨대, 인산이수소나트륨 일수화물), 트리스(Tris), 및 아세테이트, 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 시트르산), 계면활성제, 예를 들면, 비-이온성 표면활성제(예컨대, 폴리소르베이트) 및 이의 조합. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 단백질 조성물 속의 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 부형제는 적어도 하나의 증량제, 적어도 하나의 안정화제 및 적어도 하나의 강직성 제제를 포함한다.

상기 나타낸 바와 같이, 일부 구현예에서, 단백질 분획은 조건화 배지로부터 정제되고 화장 부형제를 포함하는 액체 제형(수성 제형) 속에서 제형화되며, 후속적으로 액체 제형은 건조(예컨대, 동결건조)에 적용된다. 일부 구현예에서, 조건화 배지로부터 정제된 단백질 분획을 정용여과에 적용하여 단백질 분획을 수성 제형과 함께 제형화한다.

일부 구현예에서, 수성 제형은 2% 내지 10%(w/v)의 증량제 또는 증량제의 조합, 예를 들면, 2% 내지 5%(w/v)의 증량제 또는 명시된 범위내의 각각의 값을 포함하는, 증량제의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 건조(예컨대, 동결건조) 후, 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물은 70% 내지 85%(w/w)의 증량제 또는 증량제의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 수성 제형은 명시된 범위 내의 각각의 값을 포함하는, 0.01 내지 1%(w/v)의 안정화제, 예를 들면, EDTA, 예를 들면, 0.025 내지 0.5%(w/v)의 안정화제를 포함한다. 일부 구현예에서, 건조(예컨대, 동결건조) 후, 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물은 1.0% 내지 1.5%(w/w)의 안정화제를 포함한다.

일부 구현예에서, 수성 제형은 명시된 범위 내의 각각의 값을 포함하는, 0.1 내지 1%(w/v)의 강직성 제제, 예를 들면, 0.25% 내지 1%(w/v)의 강직성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 건조(예컨대, 동결건조) 후, 건조된(예컨대, 동결건조된) 단백질 조성물은 10% 내지 15%(w/w)의 강직성 제제를 포함한다.

단백질/펩타이드-기반 생성물의 제형 및 동결건조는 예를 들면, 문헌: Costantino and Pikal Eds. Lyophilization of Biopharmaceuticals, Springer Science & Business Media, 2004; 및 Pearlman and Wang Eds. Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs: Case Histories, Springer Science & Business Media, 29 Jun 2013에서 검토된다.

재구성 조성물

용어 "재구성 조성물" 또는 "재구성 배지" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 건조된 단백질 조성물의 재구성 및 대상체의 피부에 대한 적용을 촉진시키는 하나 이상의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 조성물을 지칭한다.

재구성 조성물 속에 포함된 부형제는 전형적으로 유화제 및 연화제(emollient), 및 임의로 또한 증점제, 완충제 또는 pH 조절제, 습윤제, 및 이의 조합을 포함한다. 각각의 가능성은 별개의 구현예를 나타낸다. 포함될 수 있는 추가의 부형제는 계면활성제, 항-산화제, 향료(fragrance), 착색제 및 이의 조합을 포함한다. 각각의 가능성은 별개의 구현예를 나타낸다. 본 발명의 재구성 조성물은 전형적으로 항미생물 방부제를 포함한다.

적합한 유화제는 스테아르산의 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 예를 들면, 스테아레쓰(steareth)-2, 스테아레쓰-4, 스테아레쓰-6, 스테아레쓰-7, 스테아레쓰-10, 스테아레쓰-11, 스테아레쓰-13, 스테아레쓰-15, 및 스테아레쓰-20, 글리세릴 스테아레이트, 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 세테아릴 알코올, 베헤닐 알코올, 디에탄올아민, 레시틴, 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 조합을 포함한다. 각각의 가능성은 별개의 구현예를 나타낸다. 유화제의 조합은 예를 들면, 상표명 Dow Corning® 5225C (DC 5225C), Montanov™ 68, Emulium® Delta 하에 상업적으로 이용가능하다.

적합한 연화제는 적용 및 부착을 보조하여, 광택(gloss)을 생성하고 폐쇄 보습(occlusive moisturization)을 제공하는 지방, 오일, 지방 알코올, 지방산 및 에스테르를 포함한다. 예는 실리콘 오일(예를 들면, 상표명 Dow Corning® 245(DC 245) 및 Dow Corning® 246(DC 246)하에 이용가능한 것), 글리세린, 탄화수소 오일 및 왁스, 예를 들면, 미네랄 오일(mineral oil), 바셀린, 파라핀, 세레신(ceresin), 오조케리트(ozokerite), 미세결정성 왁스, 폴리에틸렌, 및 퍼하이드로스쿠알렌; 트리글리세라이드 지방 및 오일, 예를 들면, 식물성, 동물 및 해양 원으로부터 유래된 것, 예를 들면, 호호바 오일(jojoba oil) 및 시어 버터(shea butter); 아세토글리세라이드 에스테르, 예를 들면, 아세틸화된 모노글리세라이드; 에톡실화된 글리세라이드, 예를 들면, 에톡실화된 글리세릴 모노스테아레이트; 지방산, 지방 알코올 및 이의 유도체, 예를 들면, 이소프로필 미리스테이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 각각의 가능성은 별개의 구현예를 나타낸다.

적합한 증점제는 다양한 중합체, 예를 들면, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 아크릴아미드 공중합체, 나트륨 아크릴레이트 공중합체, 알긴산나트륨, 알긴산칼슘, 알긴산마그네슘, 알긴산, 하이알루론산, 폴리글루쿠론산(폴리-α- 및 -β-1,4 -글루쿠론산), 콘드로이틴 설페이트, 푸르셀라란(furcellaran), 카복시메틸셀룰로스, 폴리카복실산, 카보머, 벤토나이트, 키틴, 키토산, 카복시메틸 키틴, 및 상표명 Carbopol® 하에 이용가능한 가교-결합된 폴리아클릴레이트 물질, 뿐만 아니라 중합체, 예를 들면, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시프로필 셀룰로스(HPC), 하이드록시메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 칼슘 카복시메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈(포비돈, PVP), 폴리비닐 알코올, 중간 내지 고 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG-3350, PEG-6000, 등), 글루코시드 및 사나트륨 에티드로네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.

적합한 완충제 또는 pH 조절제는 산성 완충제, 예를 들면, 단쇄 지방산, 시트르산, 아세트산, 염화수소산, 황산 및 푸마르산; 및 염기성 완충제, 예를 들면, 트리스, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 및 수산화마그네슘을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.

적합한 습윤제는 글리콜, 예를 들면, 트리에틸렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 당 알코올, 예를 들면, 소르비톨, 헥실렌, 우레아, 및 콜라겐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.

향장학적으로 허용되는 항미생물 방부제의 예는 포름알데하이드 방출제(releaser)(예컨대, 이미다졸리디닐 우레아), 파라벤(예컨대, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 이소티아졸리논(예컨대, 카톤), 페녹시에탄올(예컨대, 옵티펜) 및 유기 산(예컨대, 벤조산/나트륨 벤조에이트, 소르브산/소르브산칼륨)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.

본 발명의 화장 조성물 및 생성물은 피부 원기회복, 피부 외관, 피부 색조 등을 개선시키는데 유용하다. 특히, 본 발명의 화장 조성물 및 생성물은 예를 들면, 주름, 미세 선, 피부 결함, 점, 예를 들면, 흑색점(lentigines) 또는 일광 흑색점(solar lentigines), 균일하지 않은 피부 색조 또는 피부 결, UV 방사선-유도된 손상된 피부 또는 광손상된 피부, 또는 과색소침착된 피부 또는 기미, 건조한 피부, 처진 피부(sagging skin), 거친 피부, 및 이의 임의의 조합을 포함하는 다양한 피부 상태를 개선시키는데 유용하다.

다음의 실시예는 본 발명의 특정 구현예를 보다 충분히 나타내기 위하여 나타낸다. 그러나, 이는 어떠한 방식으로도, 본 발명의 광범위한 영역을 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 영역으로부터 벗어나지 않고 개시된 원리의 많은 다양한 변화 및 변형을 용이하게 고안할 수 있다.

실시예

실시예 1

본 발명에 따른 단백질 분획의 생산

1. 지질흡인물 조직 동결보존

지질흡인물 조직 제조

지질흡인물 샘플을 취하고 용기의 바닥에서 수성 층(부유하는 조직 아래)를 제거한다. 남아있는 조직은 500ml/1000ml의 멸균 병으로 이동시킨다.

지질흡인물 조직 세척

조직 용적(ml)을 평가하고 등가의 용적의 저온 PBS를 조직을 함유하는 병(bottle)에 가한다. 병을 밀봉하고, 역위시켜 온화하게 소용돌이시켜 층의 분리를 조장하고 세척 과정을 보조한다. 이후에, 병을 세워 놓고 2개의 상이 분리되도록 한다. 다음에, 지방 조직 아래에 형성된 수성 층을 제거한다. PBS를 사용한 전술한 세척을 3회 이상 반복한다.

지질흡인물 조직 동결백화(cryobagging)

조직의 상단(경우에 따라)에 형성된 황색의 얇은 층을 조심스럽게 흡인하여 버린다. 실제 지방 조직 용적(ml)을 측정하고 이에 따라 필요한 동결백(cryobag)의 수를 계산한다. 다음에, 150ml(또는 다른 남아있는 용적)의 지방 조직을 각각의 동결백으로 이동시킨다. 조직 덩어리는 주사기로 수집하지 않음으로써 응괴를 피한다. 남아있는 임의의 조직을 버린다.

DMSO 용액 제조

50% DMSO 용액의 요구되는 용적을 다음과 같이 계산한다:

DMSO 용액 용적 = 0.27 ml x 실제 지방 조직 용적

50% DMSO 용액의 요구된 용적은 동일한 용적의 100% DMSO 및 PBS를, 둘 다 22±5℃에서 혼합하여 제조한다. 수득되는 50% DMSO 용액을 사용할 때까지 얼음 속에 유지시킨다.

DMSO 용액 첨가

0.25ml의 저온 50% DMSO 용액을 각각의 동결 백 속의 1ml의 조직 당 서서히 가한다(즉, 150ml의 조직의 경우, 37.5ml의 50% DMSO 용액을 가한다). DMSO를 가하면서 동결백을 손으로 온화하게 누르고 마사지(massaging)함으로써 DMSO를 균일하게 분포시킨다. 동결하는 백의 튜브를 ~2cm 및 ~4cm에서 2회 밀봉하고 제2의 밀봉점 이후 절단한다. 각각의 동결백을 상응하는 동결 백 내에 두고 제2의 동결 백을 밀봉한다. 각각의 동결 백을 동결하는 캐니스터(freezing canister)로 이동시키고, -80℃ 냉동고에 두고 18 내지 24시간 동안 저장한다.

장기간 저장을 위해, 동결하는 캐니스터를 -80℃ 냉동고로부터 기체 상 질소 저장 용기(container)로 이동시킨다.

2. 지질흡인물 조직 해동 및 기질 혈관 분획(SVF) 단리

용액의 제조

5% 콜라게나제 스톡 용액(50 mg/ml)을 (PBS 속에서)제조한다.

세포 배양 배지 제조

DMEM LG 완전 배지를 L-글루타민, FBS 및 젠타마이신-설페이트를 DMEM LG에 가함으로써 제조한다. 제조된 DMEM LG 완전 성장 배지를 사용할 때까지 2 내지 8℃에서 유지시킨다.

FBS를 함유하지 않는 DMEM LG 배지를 L-글루타민 및 젠타마이신-설페이트 만을 DMEM LG에 가함으로써 제조한다. 제조된 성장 배지를 사용할 때까지 2 내지 8℃에서 유지시킨다.

지질흡인물 조직 해동

PBS를 37±1℃ 수조(water bath) 속에서 가온시킨다. 해동시킬 동결백을 함유하는 캐니스터를 증기 질소 탱크/-80℃ 냉동고로부터 제거하고 개방시킨다. 동결백을 이의 캐니스터로부터 꺼내어 실온에서 5±0.5분 동안 유지시킨다. 이후에, 동결백을 37±1℃ 수조 속에 5±0.5분 동안 둔다. 다음에, 각각의 동격백을 건조시키고 개방한다. 조직을 500ml의 멸균 병에 이동시키고 동일한 용적의 예비-가온된 PBS로 2회 세척한다.

조직 가공 및 기질 혈관 분획(SVF) 단리

세척된 조직을 500ml의 원심분리 튜브로 이동시킨다. 대략적인 조직 용적(ml)을 기록한다. 150ml의 조직의 경우, 7.5ml의 5% 콜라게나제 스톡 용액을 멸균 병에 가한다. 다음에, 0.6ml의 1M CaCl₂ 스톡 용액 및 142ml의 PBS를 콜라게나제 함유 병(최종 용적 150ml)에 가한다. 콜라게나제 함유 병을 37±1℃ 수조 속에서 ~15분 동안 가온시킨다. 병 속의 콜라게나제 용액을 이후에 조직을 함유하는 원심분리 튜브에 1:1 v/v 비(콜라게나제:조직)로 가하고 원심분리 튜브를 ~10초 동안 소용돌이시킨다. 이후에, 원심분리 튜브를 37±1℃ 수조 속에 진탕시키면서(130 rpm) ~35분 동안 둔다. 다음에, 원심분리 튜브를 수조로부터 제거하고 FBS를 함유하지 않는 DMEM LG 배지를 실온에서 가한다(모든 150ml의 초기 조직에 대해 FBS를 함유하지 않는 200ml의 DMEM LG 배지). 원심분리 튜브를 닫고 10분 동안 500xg, 21±2℃에서 원심분리한다. 원심분리 후 상층액의 대부분을 제거하고, ~5 ml를 남기고, 펠렛을 상하로 피펫팅하여 재현탁시키고 후속적으로 50ml의 원뿔형 튜브(conical tube)로 이동시킨다. 다음에, FBS를 함유하지 않는 45ml의 DMEM L/G를 50ml의 원뿔형 튜브에 가하고 원뿔형 튜브를 10분 동안 500xg, 21±2℃에서 테이블 탑 원심분리(table top centrifuge)를 사용하여 원심분리한다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 버린다. 세포 펠렛을 10ml의 적혈 세포 분해 완충액 속에 재현탁시키고 10±1분 동안 실온에서 항온처리한다. 다음에, 20ml의 PBS를 가하고(RT) 샘플을 10분 동안 500xg, 21±2℃에서 원심분리한다. 세포 펠렛을 FBS를 함유하지 않는 5ml의 DMEM LG 배지 속에 재현탁시킨다. 100μm의 세포 여과기(cell strainer)를 새로운 50ml의 튜브의 상단에 두고 현탁액을 여과한다. 여액(filterate)을 10분 동안 500xg, 21±2℃에서 테이블 탑 원심분리를 사용하여 원심분리한다. 상층액을 버리고 세포 펠렛을 FBS를 함유하지 않는 5ml의 DMEM LG 배지 속에서 재현탁시킨다. 이후에, 제2의 여과를 40μm의 세포 여과기를 새로운 50 ml의 튜브의 상단에 두고 현탁액을 여과함으로써 수행한다. 여과기를 FBS를 함유하지 않는 추가의 5ml DMEM LG 배지로 세척하고 여액을 10분 동안 500xg, 21±2℃에서 테이블 탑 원심분리를 사용하여 원심분리한다. 상층액을 버리고 세포 펠렛을 5ml의 완전 DMEM LG 배지(~37℃) 속에 재현탁시킨다. 수득되는 샘플을 기질 혈관 분획(SVF)으로 지칭한다.

SVF 세포 카운트

20μl의 세포 현탁액을 180μl의 완전 DMEM LG 내로 이동시킴으로써 1:10으로 희석된 세포 현탁액의 200μl의 샘플을 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 속에서 제조하고 세포를 계수한다.

SVF 씨딩

세포를 어떠한 코팅도 없이 세포 배양 플라스크 속에 ~3.5x10⁵개의 세포/cm²의 농도에서 씨딩한다:

- 175cm²의 플라스크의 경우, 6x10⁶개의 세포를 씨딩한다

- 75cm²의 플라스크의 경우, 2.6x10⁶개의 세포를 씨딩한다.

35ml의 완전 DMEM LG를 각각의 175cm²의 플라스크에 가한다. 15ml의 완전 DMEM LG를 각각의 75cm²의 플라스크에 가한다. 플라스크(들)를 항온처리기 속에서 5±1% CO₂, 37±2.5℃로 밤새 항온처리하여 가소성 점착성 세포(지방질-유래된 줄기 세포, ADSC)를 선택한다.

배지 교환

완전한 DMEM LG 및 PBS 병을 37±1℃의 수조 속에서 30±5분 동안 예비-가온한다. 세포 플라스크(들)를 항온처리기로부터 제거하고 배지를 플라스크(들)로부터 흡인한다. 세포를 2회 세척하여, 75cm²의 플라스크 당 5ml 또는 175 cm² 당 10ml의 따뜻한 PBS를 조심스럽게 가하고 후속적으로 멸균 피펫을 사용하여 PBS를 흡인함으로써 비-접착성 세포 및 조직 부스러기를 제거한다. 다음에, 완전 DMEM LG를 75cm²의 플라스크 당 15ml 또는 175 cm²의 플라스크 당 35ml로 가하고, 플라스크를 항온처리기 속에서 5±1% CO₂, 37±2.5℃에서 항온처리한다.

세포를 70% 내지 100% 세포 합치성까지 2 내지 3일 마다 배지를 교환하면서 성장시킨다.

3. 간엽성 줄기 세포의 수거(harvest) 및 재-배양

성장 배지 제조

NutriStem® 성장 배지를 L-글루타민, NutriStem® 보충물 및 젠타마이신-설페이트를 NutriStem®게 가하여 제조한다. 제조된 NutriStem® 성장 배지를 37±1℃ 수조 속에서 30±5분 동안 가온한다.

세포 배양 플라스크의 코팅

혈청이 없는 배지 속에서 배양된 사람 간엽성 줄기 세포(hMSC)의 부착 및 확산을 뒷받침하는 멸균성의, 친화성 정제된 사람 피브로넥틴(hFN)으로 구성된, MSC 부착 용액(Biological Industries)을 농축된 부착 용액 1:100과 멸균 PBS를 용해시켜 제조한다. 제조된 부착 용액을 실온에서 유지시키고 동일한 일 수의 플라스크 코팅 동안 사용한다. 제조된 부착 용액을 175cm²의 플라스크(10ml) 또는 75cm²의 플라스크(5ml)로 이동시킨다. 부착 용액을 온화하게 틸팅(tilting)함으로써 부착 용액이 플라스크 상에 잘 분산됨이 입증되어 있다. 코팅된 플라스크를 5±1% CO₂, 37±2.5℃ 항온처리기 속에서 적어도 30분 동안 이동시킨다.

세포의 수거

제조된 NutriStem® 성장 배지를 수조로부터 제거한다. 세포 함유 플라스크를 항온처리기로부터 조심스럽게 제거하고 배지를 플라스크로부터 흡인한다. 각각의 플라스크를 PBS(175cm²의 플라스크당 10ml의 PBS 및 75cm²의 플라스크 당 5ml의 PBS)로 세척하고 후속적으로 PBS를 흡인시킨다. 다음에, 세포를 TrypLE^TM를 각각의 플라스크에 실온에서 가하고(175cm²의 플라스크에 10ml 및 75cm²의 플라스크에 5ml) 플라스크를 5±1% CO₂, 37±2.5℃ 항온처리기 속에서 10분까지 항온처리함으로써 트립신처리한다. 이후에, 플라스크를 항온처리기로부터 제거하고 현미경하에 관찰하여 대부분의 세포가 탈착하였는지를 관찰한다. 그렇지 않은 경우, 플라스크를 온화하게 탭핑(tapping)하여 잔류하는 세포를 탈착시킨다. 필요한 경우, 트립신처리를 반복한다. 트립신처리 후 NutriStem® 성장 배지를 각각의 플라스크에 가하고(각각의 175cm²의 플라스크에 10ml 및 각각의 75cm² 플라스크에 5ml) 현탁액을 상하로 온화하게 피펫팅하여 조직 배양 플라스크를 세척한다. 이후에, 현탁액을 50ml의 튜브로 이동시키고 튜브를 10분 동안 400 x g, 21±2℃에서 원심분리한다. 원심분리 후, 상층액을 조심스럽게 흡인하고 세포 펠렛을 5ml의 NutriStem® 성장 배지에 재현탁시키고 세포를 계수한다. 이러한 과정을 세포 생존능이 >75%인 경우에만 진행한다.

세포의 재-배양

각각의 플라스크에 대한 씨딩 용적은 다음과 같이 계산한다:

예비-코팅된 세포 배양 플라스크를 항온처리기로부터 제거하고 부착 용액을 흡인한다. 이후에, 각각의 플라스크를 PBS로 실온에서 세척하고(175cm²의 플라스크의 경우 10ml의 PBS, 75cm²의 경우 5ml), PBS를 흡인하고, NutriStem® 성장 배지를 각각의 플라스크에 가한다(175cm²의 플라스크에 35ml 및 75cm²의 플라스크에 15ml). 세포를 각각의 플라스크에 상기 계산한 바와 같이 씨딩하고 플라스크를 5±1% CO₂, 37±2.5℃ 항온처리기로 이동시킨다.

세포 성장 평가

세포 함유 플라스크를 항온처리기로부터 조심스럽게 제거하고 세포의 성장을 현미경 하에서 평가한다. 특히, 세포를 균일하게 확산된, 섬유아세포-유사 형태 및 (fibroblast-like morphology) 및 70 내지 80% 합치성에 대해 점검한다. 세포가 균일하게 확산되고/되거나 70 내지 80% 합치성인 경우, 이를 수거하고 상술한 바와 같이 재-배양한다. 세포가 70 내지 80% 합치성이 아닌 경우, 성장 배지를 교환하고 플라스크를 항온처리기에 다시 둔다. 세포가 섬유아세포-유사 형태를 가지지 않고/않거나 깊은 응집을 나타낸 경우, 당해 공정을 중지하고 세포를 폐기한다. 세포를 3 내지 5회 계대배양까지 아-배양한다. 세포를 사용할 때까지 액체 질소 속에서 동결 저장한다.

4. 조건화 배지 생산

성장 배지 제조

NutriStem® 성장 배지를 L-글루타민, MSC NutriStem® 보충물 및 젠타마이신-설페이트를 NutriStem®에 가하여 제조한다. 제조된 NutriStem® 성장 배지를 37±1℃ 수조 속에서 30±5분 동안 가온시킨다.

DMEM LG 완전 배지를 FBS, L-글루타민 및 젠타마이신-설페이트를 DMEM LG에 가하여 제조하였다. 제조된 성장 배지를 사용할 때까지 2 내지 8℃에서 유지시켰다.

기아 배지(starvation medium)를 L-글루타민 및 젠타마이신-설페이트를 DMEM LG에 가하여 제조하였다. 제조된 기아 배지를 사용할 때까지 2 내지 8℃에서 유지시켰다.

세포 배양 플라스크의 코팅

MSC 부착 용액(Biological Industries)을 농축된 부착 용액을 멸균수 PBS를 사용하여 1:100으로 용해하여 제조하였다. 제조된 부착 용액을 실온에서 유지시키고 플라스크 코팅과 동일한 날 동안 사용하였다. 제조된 부착 용액을 175cm²의 플라스크(10ml) 또는 75cm²의 플라스크(5ml)에 이동시켰다. 부착 용액은 이를 온화하게 틸팅(tilting)함에 의해 플라스크 상에 잘 분산됨이 입증된다. 코팅된 플라스크를 5±1% CO₂, 37±2.5℃의 항온처리기에 적어도 30분 동안 이동시켰다.

세포 샘플 해동

예비-가온된 NutriStem® 성장 배지를 15ml의 튜브(튜브 당 8ml)에 이동시킨다. 해동시킬 세포(총 15·10⁶개의 세포)를 함유하는 동결튜브를 액체 질소 용기로부터 제거하고 37±1℃의 수조에 즉시 둔다. 동결튜브를 온화하게 소용돌이시킨다. 배지의 대부분이 해동되면(여전히 일부 동결된 물질이 잔존한다), 동결튜브를 수조로부터 제거하고 1ml의 NutriStem® 성장 배지를 각각의 동결튜브에 실온에서 적가한다. 세포 현탁액을 배지를 함유하는 튜브(총 ~9ml의 용적)로 다시 온화하게 이동시킨다. 이후에, 동결튜브를 추가로 1ml의 NutriStem® 성장 배지로 세척하고 배지를 15ml의 튜브로 이동시킨다. 15ml 튜브 내 총 용적은 ~10ml이다. 다음에, 15ml의 튜브를 400xg에서 10분 동안 21±2℃에서 원심분리한다. 상층액을 흡인하고, 세포 펠렛을 온화하게 5ml의 NutriStem® 성장 배지로 재현탁시키고, 세포를 계수한다. 다음 단계에서, 200μl의 1:10 희석된 세포 현탁액을 180μl의 PBS 또는 NutriStem® 성장 배지를 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 가하고 20μl의 세포 현탁액과 함께 혼합함으로써 제조한다. 세포를 다시 계수한다. 세포 생존능이 >75%인 경우에만 당해 과정을 진행한다.

세포 씨딩

예비-코팅된 세포 배양 플라스크를 항온처리기로부터 제거하고 부착 용액을 흡인한다. 이후에, 각각의 플라스크를 PBS로 실온에서 세척하고(175cm²의 플라스크의 경우 10ml의 PBS, 75cm²의 경우 5ml), PBS를 흡인하고, NutriStem® 성장 배지를 각각의 플라스크에 가한다(175cm²의 플라스크에 35ml 및 75cm²의 플라스크에 15ml). 세포를 각각의 플라스크에 상기 계산한 바와 같이 씨딩하고 플라스크를 5±1% CO₂, 37±2.5℃ 항온처리기에 이동시킨다. 세포를 밤새 항온처리한다(24시간 이하).

성장 배지 교환

NutriStem® 성장 배지를 37±1℃ 수조 속에서 30±5분 동안 가온시킨다. 세포 배양 플라스크를 항온처리기로부터 조심스럽게 제거하고 배지를 플라스크로부터 흡인한다. 각각의 플라스크를 PBS로 세척하고(75cm²의 플라스크의 경우 5ml의 PBS 및 175cm²의 플라스크의 경우 10ml), PBS를 흡인하고, NutriStem® 성장 배지를 가한다(75cm²의 플라스크에 15ml 및 175cm²의 플라스크에 35ml). 플라스크를 5±1% CO₂, 37±2.5℃ 항온처리기에 다시 이동시키고 세포가 ~80% 합치성에 이를 때까지 세포를 3 내지 5일 동안 성장시킨다.

DMEM LG 완전 배지 속에서 세포의 수거 및 재-배양

DMEM LG 완전 성장 배지를 37±1℃ 수조 속에서 30±5분 동안 가온시킨다. 세포를 함유하는 플라스크를 항온처리기로부터 조심스럽게 제거하고 배지를 플라스크로부터 흡인한다. 각각의 플라스크를 PBS로 세척하고(175cm² 플라스크의 경우 10ml의 PBS 및 75cm²의 플라스크의 경우 5ml의 PBS) 후속적으로 PBS를 흡인한다. 다음에, 세포를 TrypLE^TM을 각각의 플라스크에 실온에서 가하고(175cm²의 플라스크에 10ml 및 75cm²의 플라스크에 5ml) 플라스크를 5±1% CO₂, 37±2.5℃ 항온처리기 속에서 10분까지 항온처리하여 트립신처리한다. 이후에, 플라스크를 항온처리기로부터 제거하고 현미경 하에 관찰하여 세포의 대부분이 탈착되었는지의 여부를 관찰한다. 그렇지 않은 경우, 플라스크를 온화하게 탭핑하여 남아있는 세포를 탈착시킨다. 필요한 경우, 트립신처리를 반복한다. 트립신처리 후, DMEM LG 완전 배지를 각각의 플라스크에 가하고(75cm²의 플라스크에 5ml 및 175cm²의 플라스크에 10ml) 현탁액을 아래 위로 온화하게 피펫팅하여 세포 배양 플라스크를 세척한다. 이후에, 현탁액을 50ml의 튜브로 이동시키고 튜브를 400 x g, 21±2℃에서 10분 동안 원심분리한다. 세척 단계를 반복하고 50ml의 튜브를 10분 동안 400xg, 21±2℃에서 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 흡인하고, 세포 펠렛을 5ml의 DMEM LG 완전 배지로 재현탁시키고, 세포를 계수한다. 세포 생존능이 >75%인 경우에만 당해 과정을 진행한다.

세포 샘플 씨딩

DMEM LG 완전 배지를 세포 배양 플라스크에 가한다(75cm²의 플라스크에 10ml 및 175cm²의 플라스크에 23.3ml). 각각의 플라스크에 대한 씨딩 용적을 하기 나타낸 바와 같이 계산하고 세포를 씨딩한다:

플라스크를 5±1% CO₂, 37±2.5℃ 항온처리기에 ~24시간 동안 이동시킨다.

성장 배지를 기아 배지(혈청이 없는)로 대체

DMEM LG 기아 배지(starvation medium)를 37±1℃ 수조 속에서 30±5분 동안 가온한다. 세포 배양 플라스크를 항온처리기로부터 제거하고 배지를 플라스크로부터 흡인한다. 1개의 세포 배양 플라스크를 항온처리기 속에 세포 계수 목적으로 둔다. 항온처리기로부터 제거한 각각의 플라스크를 PBS로 세척하고(75cm²의 플라스크의 경우 5ml 및 175cm²의 플라스크의 경우 10ml), PBS를 흡인하고, DMEM LG 기아 배지를 가한다(75cm²의 플라스크에 7.5ml 및 175cm²의 플라스크에 17.5ml). 플라스크를 5±1% CO₂, 37±2.5℃ 항온처리기에 ~48시간 동안 이동시킨다.

항온처리기 속에 남아있는 세포 배양 플라스크를 세포 계수 분석을 위해 취하여 기아 공정의 초기에 세포의 수를 평가한다. 세포 계수를 상술한 바와 같이 수행한다(배지 흡인, PBS로 세척, 트립신처리로 세포 수거, DMEM LG 기아 배지 속에서 현탁 및 세포 계순).

조건화 배지 수집

세포 배양 플라스크를 항온처리기로부터 조심스럽게 제거한다. 배지를 50ml의 튜브 내로 수집하고 10분 동안 400xg, 21±2℃에서 원심분리한다. 상층액(조건화 배지)을 500ml의 병 내로 수집한다. 펠렛에서 세포 및 부스러기가 수집되는 것을 방지하기 위하여, 피펫의 팁을 튜브의 측면을 향하도록 하고 상층액 모두를 수집하지 않는다. 조건화 배지의 수집 후 병을 소용돌이시킨다. QC 샘플(예컨대, 총 단백질의 측정)을 에펜도르프 튜브 내로 분취한다. 조건화 배지의 나머지를 50ml 튜브 내로 분취하고 사용할 때까지 -80±10℃에서 동결시켜 유지한다.

5. 간엽 성장 인자(MGF) 정제, 정용여과 및 포장(packaging)

용액의 제조

수산화나트륨(NaOH) 0.05N 용액을 제조하고 0.22 μm의 여과기 병을 통해 여과하고 실온에서 유지시킨다.

2.5 내지 3.5%의 증량제(예컨대, 만니톨), 0.045 내지 0.055%의 안정화제(예컨대, EDTA), 0.45 내지 0.55%의 강직성 제제(예컨대, NaCl) 및 자극용 물을 함유하는 MGF 제형 용액(2L)을 제조한다. MGF 제형의 pH를 측정하고 NaOH 0.5N으로 적정하여 7.4±0.2로 조절한다. 다음에, 1L의 MGF 제형 용액을 1L, 0.22 μm 여과기 병의 2개 세트를 통해 여과한다. MGF 제형 용액을 사용할 때까지 2 내지 8^o℃에서 유지시킨다.

MGF 정제, 정용여과 및 제형

조건화 배지(200-1000 ml)를 빙상에서 해동시킨다. 조건화 배지를 100ml(즉, 2 내지 10의 농축 인자)로 농축시키고 MGF 단백질 분획을 정제하고 후속적으로 상술한 바와 같은 MGF 제형 용액과 함께 Cogent μ규모 TFF 시스템(EMD Millipore)을 사용하여 제형화한다.

농축 공정 동안, 조건화 배지를 Cogent 시스템 내에서 공급 탱크(feeding tank)(4±2℃에서 항온처리함)로부터 3kDa 여과 카세트(filter cassette)로 1.0±0.2 바아(Bar) 압력 수준으로, 및 공급 탱크로 다시 순환시킨다. 3kDa 보다 작은 입자를 수반하는, 여액을 폐 탱크(waste tank)로 유동시킨다. 보유물은 MGF 단백질 분획이다. 순환 및 여과를 100ml의 농축된 MGF 단백질 분획이 공급 탱크에 잔존할 때까지 지속한다.

100ml의 MGF 제형 용액 4±2℃를 100ml의 농축된 MGF 단백질 분획 내로 공급 탱크 속에서 가함으로써 정용여과 및 제형화를 개시한다. 이후에, 용액을 Cogent 시스템 속에서 1.5±0.5 바아의 압력 수준에서 순환시켜 100ml의 용적을 제거한다. 당해 공정을 10회 반복하여 조건화 배지의 2¹⁰ 희석 인자를 생성시키고, 이를 MGF 제형 용액으로 대체한다. 수득되는 액체 제형 속의 단백질 분획의 농도는 바람직하게는 0.015 내지 0.025%(w/v)의 범위이다.

본 발명의 일부 구현예에 따른 MGF 분획을 포함하는 액체 제형의 예시적인 조성은 다음과 같다:

[표 1]

제형화된 MGF의 샘플(F-MGF)을 QC 분석(예컨대, 총 단백질의 측정 및 임의로 활성 검정)에 적용하고 F-MGF의 나머지를 동결건조할 때까지 2 내지 8℃에서 저장한다. mg/ml의 F-MGF 농도를 총 단백질 분석을 기반으로 측정한다.

동결건조 제제

진공 수준을 0.02±0.002 mBar로 설정하고, 예비-냉동 수준을 -75±7℃로 설정한다. 장치의 작동 후 목적한 온도를 수득할 때까지 온도 및 진공 수준을 모니터링한다.

부위 분배

F-MGF 용액을 바이알에 분산시키고(바이알 당 2 ml) 바이알을 밀봉한다.

예비-냉동 동결건조

동결건조기의 진공을 중지하고 F-MGF 용액을 함유하는 바이알을 동결건조기의 선반에 둔다. 바이알을 12±4 시간 동안(또는 이 시간째에) 예비-동결시킨다.

F-MGF 동결건조

선반 온도를 -40±4℃로 설정하고 진공이 0.02±0.002 mBar로 설정되어 있는지를 확인한다. 목적한 값이 도달되는 경우, 바이알을 72±4 시간 동안(또는 o/n) 냉동-건조시킨다.

동결건조 후, 샘플을 QC 분석(미생물 시험, 외관(appearance), pH 및 단백질 함량)을 위해 취하고 동결건조된 F-MGF의 나머지는 2 내지 8℃에 저장한다.

실시예 2

단백질 분획의 제형 - 증량제의 선택

목적: 동결건조 후 이의 특성 및 재구성시 이의 용해 능력에 대해 수개의 후보물 증량제를 시험하여, 단백질 분획과의 제형을 위한 증량제를 선택하기 위함.

방법

도 1에 명시된 조성물 F1-F17을 각각의 조성물의 성분을 순수한 물 속에 혼합함으로써 제조하였다. 5ml의 각각의 조성물을 함유하는 복제된(duplicated vial) 바이알을 이소프로판올 욕(bath) 내로 -80℃에 둠으로써 즉시 동결시켰다. 모든 캡(cap)을 부분적으로 개방하여 진공을 방지하였다. 모든 조성물이 동결되면, 바이알을 예비-동결된 동결건조기로 이동시키고 3 내지 4일 동안 냉동-건조시켰다. 이후에, 바이알을 제거하고, 크기를 조정하고, 카를 피셔 검정(Karl Fisher assay)에 의해 잔류 물 함량 및 PBS에서의 재구성 시간에 대해 시험하였다.

결과

증량제 특성화를 3개의 후보물 물질: 만니톨, 히스티딘 및 BSA의 분석으로 수행하였다. 우선, 각각의 물질을 자체적으로(조성물 F1-F7) 시험하였다. 동결건조 동안 물질 손실을 동결건조 후 조성물을 칭량하여 각각의 물질의 중량을 초기 중량과 비교함으로써 평가하였다. 또한, 동결건조 후 질감을 각각의 조성물에 대해 문서화하였다. 최종적으로, PBS에서의 재구성 시간을 문서화하고, 90초 미만의 재구성 시간을 성공적인 재구성으로 결정하였다. 결과는 도 2에 요약한다.

결과는 동결건조된 조성물의 제조 동안 물질 손실이 실질적으로 일어나지 않음을 나타내었다. 심지어 대부분의 조성물 속에서 각각의 물질의 초기 중량보다 동결건조 후 더 높은 물질 중량의 조짐이 존재한다. 이는 동결건조된 조성물 속에 남아있는 잔류 수에 기인할 수 있지만, 동결건조된 조성물의 물 함량은 본 실험에서 측정되지 않았다.

다음에, 자체적으로 각각의 물질의 보다 낮은 농도 및 또한 3개 물질 사이의 상이한 조합을 시험하였다(조성물 F8 내지 F14). 또한, EDTA(안정화제, 킬레이트제(chelating agent)로서) 및 염화나트륨(등장성 제제로서)을 시험하였다(조성물 F15 내지 F17).

모든 조성물을 동결건조 후 잔류 물 함량 및 동결건조 후 재구성 시간(PBS 속)에서 시험하였다. 5% 이하의 잔류 물 함량 및 20초 미만의 재구성 시간을 성공적인 것으로 결정하였다. 결과는 도 3에 요약한다. 도 4a 및 4b는 결과의 그래프적 표현을 제공한다. 동결건조 후 잔류 물 함량 및 재구성 시간 둘 다에서 성공적이었던 조성물은 F8, F9 및 F15(도에서 강조됨)이었다. F10의 복제물 중 하나는 동결건조 동안 붕괴되었으므로, F10에 대해서는 물 함량을 측정하지 않았다.

결론

조성물은 바람직하게는 동결건조 전 증량제(들)를 용해하는 시간, 및 동결건조된 조성물의 재구성 시간에 영향을 미치므로, 5% w/v 이하의 각각의 증량제를 함유하여야 한다.

히스티딘은 시험한 조건 하에서 증량제로서 거의 적합하지 않는 것으로 밝혀졌다. 5%가 오히려 성공적이었지만, 단일 증량제로서 또는 또 다른 증량제와 조합된, 3%의 히스티딘은 성공적으로 재구성할 수 없었다. 히스티딘을 함유하는 가장 성공적인 조성물은 1% BSA와 조합된 1% 히스티딘이었고, 이는 ~30 초의 재구성 시간에 도달하였다.

가장 신속한 재구성은 만니톨, 특히 3% 만니톨을 함유한 조성물에 의해 주로 달성되었다. 느린 재구성을 나타낸 유일한 만니톨-함유 조성물은 F10이었고, 이는 또한 히스티딘을 함유하였다.

모든 조성물의 잔류 물 함량은 성공적인 동결건조 공정을 위한 양호한 조짐을 제공하였다. 그럼에도 불구하고, <5%의 잔류 물을 나타낸 조성물 만이 성공적인 것으로 결정되었다.

BSA-함유 조성물 F11, F12 및 F16은 동결건조 후 최고의 물 함량을 나타내었다. 이러한 조성물은 BSA 만을 함유하거나 히스티딘 또는 EDTA 및 NaCl과의 이의 조합을 함유하였다. 잔류하는 물 함량의 측면에서 BSA를 함유하는 가장 성공적인 조성물은 F9이었고, 이는 또한 만니톨을 함유하였다. 따라서, 시험한 조건 하에서, BSA는 만니톨과 조합되는 경우 증량제로서 유용할 수 있다.

이와 함께, 만니톨-기반 조성물은 동결건조 후 잔류 물 함량 및 재구성 시간 둘 다에 대해 가장 우수한 값을 생성하였다. 유일한 예외사항은 만니톨-기반 조성물이었으며 여기서 만니톨은 히스티딘과 혼합되었고, 이는 아마도 완전한 동결건조를 달성하지 않았고 또한 긴 재구성 시간을 나타내었다. 시험한 다른 2개의 물질, BSA 및 히스티딘은 동결건조 후 물 함량 및/또는 시험한 조건 하에서 재구성 시간의 측면에서 불량한 결과를 나타내었고, 단백질 안정성에 대해 필수적인 경우 재-계산되어야 한다.

실시예 3

단백질 분획의 제형 - 추가의 부형제

단백질 분획의 수개의 수성 제형을 도 5에 제공한다. 제형은 다음과 같이 제조할 수 있다:

중공 섬유(hollow fiber) 여과 시스템을 DW로 세척하고 후속적으로 FBS를 함유하지 않는 DMEM F12로 세척하였다. 상술한 바와 같이 수득한 조건화 배지를 우선 여과하고 x10로 농축시킨 다음 3%(w/v) 만니톨로 2회 세척하여 3% (w/v) 만니톨로 제형화된 정제된 단백질 분획을 수득하였다. 단백질 농도를 각각의 여과 단계에서 여액 및 보유물 용액에서 분석한다.

스톡 용액을 표 2에 따라 제조한다. 정제 수 중 만니톨 3% (w/v)를 제조하고, 후속적으로 모든 다른 제형 물질을 만니톨 3% 용액 속에 용해한다.

[표 2]

조성물 F19 내지 F28을 도 5에 명시된 바와 같이 제조한다. 표에서 숫자는 각각의 스톡 용액으로부터 취한 용적을 나타낸다.

다음에, 3% (w/v) 만니톨로 제형화된 정제된 단백질 분획을 각각의 조성물 F19 내지 F28에 가하여 각각의 조성물에서 2x10^-3%(w/v)의 단백질 농도를 수득한다.

실시예 4

ADSC 조건화 배지(CM) 및 제형화된 MGF(F-MGF)의 활성 검정

다음의 실험은 주요 상피 각질세포; 정상, 사람, 성인(NHPEK) (ATCC® PCS-200-011™) 세포의 증식에서 이의 수집 후 ADSC 조건화 배지(CM) 및 제형화된 MGF("F-MGF"로 약칭됨)의 효과를 시험하였다. 실시예 3에 기술된 제형 F19를 검정을 위해 사용하였다.

첫째로, NHPEK 세포 계대배양 번호 2번 또는 3번을 피부 세포 완전 배지(DMEM-F12 + 피부 세포 기저 배지, 1:1(Biological Industries, 이스라엘 소재))로 희석하여 50k 및 100k 세포/ml의 스톡 용액을 수득하였다. 각각의 스톡 용액을 96-웰 플레이트(96-well plate) 속에 웰당 100μl로 3개로 나누었다. 플레이트 속의 나머지 웰을 PBS로 채워서 습윤 환경을 유지시키고 샘플 증발을 피하였다. 플레이트를 밤새 37℃, 5% CO₂에서 항온처리하였다.

다음 날, 배지를 흡인하고 웰을 200μl의 PBS로 세척하였다. PBS 흡인 후, 50 μl/웰의 TrypLE^TM을 가하고 플레이트를 10분 동안 37℃, 5% CO₂에서 항온처리하였다. 다음에, 플레이트를 측면에서 몇번 부딪치게 하였고 웰은 현미경 하에 관찰하여 세포의 완전한 탈착을 보증하였다. 이후에, 웰에 150 μl의 완전 배지를 가하고 세포를 자동화된 세포 계수기를 사용하여 계수하였다.

KGF 10 ng/ml를 스톡 용액(2 μg/ml, PBS 중 0.1% BSA, -80℃에서 유지시킴)으로부터 제조하였다. KGF를 피부 세포 기저 배지(Dermal Cell Badal Medium) 및 DMEM-F12 배지(각각 50% 및 50%)로 희석하였다.

CM(DMEM-F12를 기본으로 함)을 피부 세포 기저 및 DMEM-F12 배지(각각 50% 및 50%)로 희석하여 10% CM을 수득하였다.

NHPEK-함유 웰을 표 3에 명시된 바와 같이 처리하고 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서(o/n) 항온처리하였다.

[표 3]

o/n 항온처리 후, 웰을 흡인하고 200 μl의 PBS로 세척하였다. PBS 흡인 후, 50 μl/웰의 TrypLE^TM을 가하고 플레이트를 10분 동안 37℃, 5% CO₂에서 항온처리하였다. 플레이트를 측면을 몇번 부딪치도록 하고 웰을 현미경 하에 관찰하여 완전한 세포 탈착을 보증하였다. 이후에, 웰에 150μl의 완전 피부 배지를 가하고 세포를 자동화 자동화된 세포 계수기를 사용하여 계수하였다. 각각의 처리 그룹 및 비처리된 세포에 대한 상대적인 세포 증식(%), 집단 델타 및 배가 시간을 처리 전 및 후에 세포 카운트를 기준으로 계산하였다.

결과는 도 6a 내지 도 6h에 요약되어 있다. 조건화 배지("10% CM")는 비처리된 그룹과 비교하여 NHPEK 증식을 유의적으로 유도하였고, KGF-처리된 대조군 그룹의 것과 유사한 값을 나타내었다(도 6a 및 6b). 조건화 배지의 효과는 NHPEK 세포의 농도 둘 다(100K 또는 50K/ml)에서 유사하였다.

집단 델타 값 사이의 비교는 비처리된 그룹에서 불량한 NHPEK 분열을 나타낸 반면, KGF 및 CM 처리는 전체 집단에서 증가를 유발하였다(도 6c 및 도 6d). KGF는 100K/ml에서 CM과 유사하에 증식을 유도하였지만, CM는 낮은 NHPEK 농도(50K/ml)에서 KGF와 비교하여 보다 높은 집단 델타를 나타내었다.

CM은 NHPEK 증식을 유도할 뿐 아니라, 이의 배가 시간을 유의적으로 저하시켰다(도 6e 및 6f). 검정 중 하나에서 100K/ml에서 비처리된 그룹은 증식하지 않았고 심지어 사멸하기 시작하였으므로, 이의 배가 시간 값은 나타나 있지 않다.

마지막으로, 세포 목시 집단 지수(Moxi Population Index; MPI), 세포 건강평가 지수(cell health assessment index)는 결과가 통계적으로 유의적이지는 않았지만, KGF 및 CM 처리하에 오히려 보다 우수한 생존능을 나타내었다(도 6g 및 도 6h).

추가의 실험은 NHPEK 세포 증식에 대한 CM의 효과를 제형화된-MGF(F-MGF)의 것과 비교하였다. 검정에 사용된 F-MGF는 실시예 3에 기술된 F19이었다. 검정은 상기한 바와 같이 수행하였고, 여기서 F19에 대한 데이터를 0일 째에 측정하고("F19 0일") 후속적으로 실온에서 7일 및 30일 후에 측정하였다(각각 "F19 7일" 및 "F19 30일"). KGF 10ng/ml를 사용한 처리는 양성 대조군으로서 제공하였다. MGF("제형")가 없는 F19의 구성성분을 사용한 처리는 음성 대조군으로서 제공되었다. 결과는 도 7a 내지 7d에 요약한다.

결과는 다음을 나타내었다:

1. F-MGF 효능이 NHPEK 증식 검정에 의해 검출된 바와 같이 적어도 30일 동안 안정하다.

2. F-MGF는 NHPEK 세포의 세포 생존능을 증가시키고 이의 배가 시간을 감소시킨다.

3. F-MGF 내 단백질의 조합은 표준 단독 KGF 증식 인자보다 더 효율적이다(보다 높은 증식율).

실시예 5

여과에 의한 성장 배지 청소

다음의 실험은 MGF 단백질 분획의 생산 동안 조건화 배지의 공정을 모의(simulating)하는 공정에서 세포 배양 배지 구성성분의 청소를 입증하였다. 특히, 실험은 공정이 여과 및 희석(세척)의 수개 단계를 통해, 미가공된 세포 배양 배지(시판되는 세포 배양 배지 DMEM-F12)로부터 진행하므로 선택된 금속의 제거를 입증하였다.

방법

중공 섬유 여과 시스템(MicroKros®)을 설정하고 연동 펌프를 통해 연결시켰다. 유동 속도는 4.00으로 설정하였다. 여과 속도는 ~0.5 ml/min로 계산되었다. 시스템을 4℃의 냉장고에 두고 DDW로 세척하였다. 다음에, 400ml의 시판 성장 배지 DMEM F12를 여과하여 40ml의 보유물을 수득하였다. 5ml의 원래의 성장 배지의 복제물을 양성 대조군으로서 분석을 위해 유지시켰다. 5ml의 만니톨 3%의 복제물을 음성 대조군으로서 제공하였다.

여과 후, 5ml의 보유물의 복제물을 수집하고, 분석을 위해 보냈다. 270ml의 만니톨 3%를 남아있는 30ml의 보유물에 가하여 300ml의 희석된 보유물을 수득하고, 이는 본원에서 "DMEM F12 세척액 1"로 지칭하였다.

DMEM F12 세척액 1을 중공 섬유 여과 시스템을 사용하여 여과함으로써 30ml의 보유물을 수득하였다. 5ml의 DMEM F12 세척액 1 보유물의 복제물을 분석을 위해 유지시켰다. 180ml의 만니톨 3%를 남아있는 20ml의 보유물에 가하여 200ml의 희석된 보유물을 수득하고, 이는 본원에서 "DMEM F12 세척액 2"로서 지칭하였다.

DMEM F12 세척액 2를 중공 섬유 여과 시스템을 사용하여 여과함으로써 20ml의 보유물을 수득하였다. 5ml의 DMEM F12 세척액 2 보유물의 복제물을 분석을 위해 유지시켰다.

남아있는 DMEM F12를 만니톨 3%(10ml의 보유물을 490ml의 3% 만니톨 용액과 혼합하여 500ml의 희석된 용액을 생성시켰다)를 사용하여 1:50으로 희석시켜 단백질 분획의 기본 제형을 모의하고, 5ml의 복제물(본원에서 "제형"으로 지칭됨)을 분석을 위해 보냈다.

모든 샘플을 ICP 질량 분광법 분석을 위해 보내어 칼슘, 칼륨 및 마그네슘의 존재를 추적하였다.

결과

결과는 표 4 및 도 8에 요약한다.

[표 4]

모든 3개의 선택된 금속은 제형 샘플에서 검출되지 않았고, 이는 생성물 제조 동안 마지막 가공 단계를 나타낸다.

칼륨은 다른 금속성 구성성분과 비교하여, 시판 DMEM F12에서 최고의 초기 값을 갖는다. 표 및 도로부터 명백한 바와 같이, K도 세포 배양 배지의 가공 동안 검출가능한 수준 이하로 제거된다.

실시예 6

화장품을 위한 MSC의 면역표현형

PBS, EDTA 및 FBS를 함유하는 MACS 완충제를 제조하거나 상업적으로 수득하였다.

세포 염색을 다음과 같이 수행한다:

5x10⁵개의 세포를 함유하는 샘플을 5분 동안 300 x g, 4±2℃에서 원심분리하였다. 상층액을 버리고 펠렛을 0.5ml의 저온 MACS 완충제 속에서 재현탁시켰다. 100ul(1x10⁵개의 세포)의 분취량을 4개의 표지된 에펜도르프 튜브로 분배한다. 항체를 표 5에 따라서 각각의 튜브에 가한다.

[표 5]

각각의 튜브를 약하게 와동시키고 튜브를 알루미늄 호일로 랩핑하여 광(light)으로부터 보호한다. 튜브를 2 내지 8℃에서 30분 또는 실온에서 15분 동안 항온처리한다.

항온처리 후, 1ml의 저온 MACS 완충제를 각각의 튜브에 가하고 튜브를 5분 동안 300 x g, 4±2℃에서 원심분리한다. 상층액을 버리고 펠렛을 400μl의 저온 MACS 완충제 속에 재현탁한다.

세포 현탁액을 각각의 에펜도르프 튜브로부터 상응하는 12 x 75mm의 시험 튜브로 이동시키고 시험 튜브를 유동 세포분석법으로 분석한다.

표 6은 본 발명에 따라 사용하기 위한 MSC 세포에 대한 값을 요약한다.

[표 6]

실시예 7

본 발명에 따른 재구성 용액의 제형

재구성 용액의 상이한 제형을 시험하여 40℃ 이하의 온도에서 바람직한 점도, 질감, pH 및 안정성을 지닌 조성물을 수득하였다.

표 7은 본 발명의 일부 구현예에 따른 재구성 조성물의 제형을 나타낸다.

[표 7]

표 8은 본 발명의 추가의 구현예에 따른 재구성 조성물의 제형을 나타낸다.

[표 8]

표 9는 실온에서 브룩필드 점도계(Brookfield viscometer)를 사용하여 측정된 바와 같은, 본 발명의 구현예에 다른 재구성 조성물의 점성 매개변수를 나타낸다.

[표 9]

재구성 조성물의 pH를 측정하고 0.5N NaOH 또는 1N HCl을 사용하여 7.2 내지 7.6으로 조절하고 사용/포장할 때까지 실온에서 저장하였다.

사용/포장을 위해, 재구성 조성물을 바이알(vial) 내로 분취하고, 각각은 3ml의 조성물(2.5 내지 3.5g의 순(net) 중량)을 함유한다.

실시예 8

2개-구성성분 화장품

표 10 및 11은 본 발명의 일부 구현예에 따른 최종 생성물 조성에 대한 생성물 명세를 나타낸다.

NLT = 이상

[표 10]

[표 11]

바이알 A에서 제형화된 단백질 분획의 pH를 측정하기 위해, 한개의 바이알의 내용물을 500 μl의 물에 용해하고 pH를 측정한다. 재구성 용액의 pH를 바이알 B의 성분 자체를 사용하여 측정한다.

바이알 A에서 제형화된 단백질 분획의 단백질 성분을 측정하기 위해, 하나의 바이알의 성분을 100μl의 DMEM 속에 용해한다. 단백질 성분을 Quick Start^TM 브래드포드(Bradford) x1 염료 시약을 사용하여 다음과 같이 측정한다:

염료 시약을 저온 저장(2 내지 8℃)으로부터 취하고 실온으로 되도록 한다. 염료 시약을 사용 전에 수회 역위시킨다. 샘플을 표 12에 따라 96-웰 플레이트 속에서 3개로 제조하고 200μl의 염료 시약을 각각의 웰에 분배한다. 이후에, 플레이트를 실온에서 5 내지 15분 동안 항온처리한다.

[표 12]

항온처리 후 ELISA 플레이트 판독기를 595nm로 설정하고 각각의 샘플의 흡광도를 측정하여 기록한다.

표준 곡선을 μg/ml의 BSA 표준물의 농도(x-축)에 대해 595nm 값(y-축)을 플롯팅하고 선형 회귀 방정식을 생성함으로써 생성시킨다. 표준 곡선을 위한 허용된 기준은 R² >0.95이다.

공지되지 않은 샘플 농도를 다음과 같이 표준 곡선을 사용하여 측정한다:

실시예 9

2개의 구성성분 화장품에 대한 안정성 검정

현재의 실시에에서, "가속화된 안전성 검정"은 극도의 조건 하에 화장품의 안정성을 시험하여 표준 저장 조건 하에서 화장품의 안정성을 평가하는 검정을 나타낸다. 실온에서 저장을 위해 의도된 화장품, 에를 들면, 본 발명의 화장품의 경우, 가속화된 안정성 검정을 40+2℃/75+5% RH에서 수행한다. 안정성은 0, 3 및 6개월째에 시험한다.

"장-기간 안정성 검정"은 생성물에 대해 추천된 저장 조건을 모의하는 조건 하에서 수행된 안정성 검정을 나타낸다. 실온에서 저장하도록 의도된 화장품의 경우, 장기간 안정성 검정을 25+2℃/60+5%RH에서 수행한다. 안정성은 0, 3, 6, 9, 12, 18 및 24개월째에 측정한다.

다음의 매개변수를 평가하고 측정한다: 외관, pH, 전체 성분(총 중량) 및 단백질 성분.

생성물의 안정성을 평가하는 생리화학적 시험 외에, 미생물(멸균성) 시험을 또한 수행한다: 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 총 미생물 수, 효모/곰팡이.

도 9a 및 9b는 본 발명의 구현예에 따른 동결건조된 단백질 조성물의 장기간 안정성 검정의 결과(도 9a) 및 가속화된 안정성 검정(도 9b)을 나타낸다. 도 9c 및 9d는 본 발명의 구현예에 따른 재구성 조성물의 장기간 안정성 검정의 결과(도 9c) 및 가속화된 안정성 검정(도 9d)을 나타낸다.

결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 조성물 둘 다는 25℃/60%에서 저장시 적어도 6개월 동안 안정하다. 놀랍게도, 조성물 둘 다는 또한 가속화된 안정성 검정의 극도의 저장 조건(40℃/75% RH) 하에 적어도 6개월 동안 안정하며, 이는 실온에서 표준 저장 조건 하에 1.5년의 저장 기간과 동일하다.

실시예 10

안정성 평가 - 시험관 내

A. MatTek Corporation EpiDerm ^TM 피부 모델

목적: MatTek Corporation EpiDerm^TM 시험관 내 독성 시험 시스템을 활용한 자극성 가능성에 대해 시험 물질을 평가하기 위한 것이다.

본 모델 시스템은 다층의 고 분화된 사람 표피의 모델을 형성하기 위해 배양된, 정상의 사람-유래된 상피 각질세포(human-derived epidermal keratinocyte; NHEK)로 이루어진다. 각질세포를 특별히 제조된, 투과성의 세포 배양 삽입물에서 배양한다. 당해 과정은 수용성의, 황색, 테트라졸륨 염(MTT {3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드})을 활용하며, 이는 생존 세포의 미토콘드리아 내에서 석시네이트 데하이드로게나제에 의해 자주색의, 불용성 포르마잔 유도체로 환원된다. 이러한 미토콘드리아 효소를 손상시키는 물질은 테트라졸륨 염의 환원을 억제한다. 따라서, 배양에 의해 감소된 MTT의 양은 살아있는 세포의 수에 비례한다.

방법:

적절한 조직 제조 후, (i) 본 발명에 따른 재구성된 조성물; (ii) 트리톤 X-100(1%)(양성 대조군); 및 (iii) 증류수(음성 대조군) 각각의 100 마이크로리터를 EpiDerm^TM 샘플을 함유하는 밀리셀(Millicell)에 가하였다. 이후에, 플레이트를 37℃, 5% 이산화탄소 및 > 90% 습도에서 항온처리하였다.

적절한 노출 기간(참고: 하기 표 13) 후, 각각의 삽입물을 이의 플레이트로부터 개별적으로 제거하고 PBS로 2회 세정하여 임의의 잔사 물질을 제거하였다. 과량의 액체를 진탕 제거하고 각각의 EpiDerm^TM 샘플을 300 마이크로리터의 MTT 용액에 두었다. 이후에, EpiDerm^TM 샘플을 항온처리기에 다시 두었다.

3시간 MTT 노출 후, 각각의 삽입물을 제거하고 PBS로 온화하게 세정하여 잔사 MTT 용액을 제거하였다. 과량의 PBS를 삽입물 각각으로부터 진탕시키고, 이를 이후에 종이 타월을 사용하여 바닥에 블롯팅(blotted)하였다. 이후에, 삽입물을 (1) 24 웰 추출 플레이트의 웰 중 하나에 각각 위치시켰다. 이후에, 각각의 삽입물을 2개의 (2) 마이크로리터의 추출 용액에 밤새 침지시켰다. 노출 후, 각각의 삽입물 속의 액체를 이를 위한 웰로 다시 경사제거하였다. 이후에, 나머지 추출물 용액을 교반하고 각각의 추출물의 200-마이크로리터 분취량을 평가를 위해 제거하였다. BioTek 800TS 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 각각의 추출물의 흡광도를 570nm에서 측정하였다. 100%로 정의된 음성 대조군의 흡광도를 사용하여, 시험 물질 및 양성 대조군의 흡광도 퍼센트를 측정하였다. 하기 나타낸 퍼센트는 EpiDerm^TM 샘플 속의 세포 물질대사와 직접 관련된다.

결과:

결과는 표 13에 요약되어 있다:

[표 13]

각각의 물품의 경우, 반-대수 규모(semi-log scale)를 사용하여 선형 y 축에 생존능 퍼센트를, 로그 x 축에 투여 시간을 플롯팅하였다. 보간에 의해서 및 가능하게는, 생존능 퍼센트가 50%(ET-50)가 되는 시간을 추정하였다.

본 발명에 따라 재구성된 조성물은 24시간을 초과하는 ET-50을 유발하였다. 트리톤 X-100 참고/양성 대조군 물품은 대략 7.6 시간의 ET-50을 유발하였다. MatTek Corporation에 따르면, 일반적인 가이드라인으로서, 다음의 그룹화가 MatTek의 EpiDermas를 사용하여 수득된 ET-50 결과를 기반으로 예측된 생체 내 자극 반응을 할당하는데 사용될 수 있다:

ET-50(시간): 예측된 생체 내 자극:

<0.5 중증, 아마도 부식성

0.5-4 중간 정도

4-12 중간 내지 약함

12-24 매우 약함

24 비-자극성

당해 시험의 조건 하에서 본 발명에 따른 재구성된 조성물은 비-자극성 범위에서 예측된 생체 내 피부 자극 가능성을 갖는다.

B. 암탉의 달걀 시험(Hen's Egg Test) - 융모요막(HET-CAM)

목적: HET-CAM 시험을 활용한 자극 가능성에 대한 시험 물질을 평가하기 위함이다.

병아리 배아의 융모요막(CAM)은 모든 생식 세포 층으로부터의 오르가노이드(organoid) 성분을 지닌 완전 조직이다. 융모요막은 외배엽이고 요막 상피는 내배엽이다. 이러한 상피 사이에 위치하는 중배엽은 동맥, 모세관, 정맥 및 림프관을 포함하는 완전한 결합 조직이다. CAM은 토끼 눈 시험에서 유도된 것과 비교가능한, 완전한 염증 반응으로 손상에 대해 반응한다.

방법:

백색 레그혼(White Leghorn) 달걀을 수득하고 Kuhl, 가습화시킨 항온처리기 속에 두었다. 항온처리기는 달걀이 1시간에 1회씩 자동적으로 회전시키도록 되어 있다. 온도는 37℃(+ 2℃)에서 조절하였다. 8일 째에, 달걀을 뽀족한 각진 끝이 아래로 향하도록 뒤집었다.

10일 째에, 각각의 달걀을 항온처리기로부터 제거하여 Plexiglas 작업 인클로져(work enclosure)에 두었다. 이러한 인클로져는 예열시키고 가습하여 이의 환경이 항온처리기의 것에 도달하도록 하였다. 각각의 달걀의 보다 큰 말단을 잘라내었고, 여기에 에어색(air sack)이 위치한다. Dremel® 컷-오프 휠(Cut-Off Wheel)(No. 409)이 장착된 Dremel® Moto-Flex 도구(모델 232-5)를 사용하여 각각의 절단을 이루었다. 이후에, 겸자를 사용하여 껍질-막 접합부(shell-membrane junction)가지 껍질을 제거하였다. 이후에, 내부 달걀 막을 따듯한 생리학적 염수 용액으로 수화시켰다. 염수를 2 내지 5분 노출 후 제거하였다. 포인트 겸자(pointed forcep)를 사용하여, 내부 달걀 막을 조심스럽게 제거하여 CAM이 드러나도록 하였다.

본 발명에 따른 재구성된 화장 조성물, 또는 참고 물품을, 액체의 1 밀리리터의 3/10의 투여량에서(0.3 ml), 4개의 CAM 각각에 투여하였다. 사용된 참고 물품은 Nivea 얼굴 리포좀 눈 윤곽 겔(Visage Liposome Eye Contour Gel) 및 비타민 E를 함유하는 Pond의 재활성화 눈 겔(Revitalizing Eye Gel)이었다. 20초 후에, 재구성된 화장 조성물 또는 참고 물품을 각각의 CAM으로부터 5 밀리리터의 생리학적 염수로 세정하였다. 모든 CAM을 시험 물질 투여 직전 및 30초 째, 시험 물질에 노출시킨 후 2분 및 5분째에 관찰하였다. CAM, 모세관을 포함하는, 혈관, 및 알부민의 반응을 시험하고 하기 상세히 설명된 바와 같이 자극성 효과에 대해 점수를 매겼다:

각각의 CAM에 대해 수치적인, 시간 의존적 점수를 합산하였다. 각각의 반응 유형을 각각의 CAM에 대해 1회만 기록할 수 있으므로, CAM 당 최대 점수는 32이다. 평균 점수는 유사하게 시험한 모든 CAM에 대해 측정되었다.

결과:

결과는 표 14a 내지 표 14c에 요약되어 있다.

[표 14a]

[표 14b]

[표 14c]

이후에, 각각의 물품을 다음에 나타낸 바와 같이 분류하였다:

평균 점수 자극 가능성

0.0-4.9 실질적으로 없음

5.0-9.9 약간

10.0-14.9 중간

15.0-32.0 중증

이전 연구는 암탉의 달걀이 토끼 눈보다 액체 자극제에 대해 보다 민감함을 나타내었다. 따라서, 시험 물질 및 참고 물품의 50% 희석액을 사용하여 이의 자극 가능성을 100%로 추정하였다.

참고 생성물은 100%에서 투여하고 드레이즈 눈 자극 방법(Draize ocular irritation methodologies)(그레이즈 규모: 0 내지 110)을 사용하여 시험한 경우, 24시간째에, 0에 이르는 점수를 유발하여, 실질적으로 무-자극성인 것으로 이미 분류되었다.

이러한 시험의 조건 하에서, 결과는, 본 발명의 재구성된 화장 조성물이, 100%에서, 생체내 눈 자극 가능성이 실질적으로 없음을 나타낸다.

실시예 11

안정성 평가 - 임상적 - 반복된 인설트 패치 시험(repeated insult patch test)

목적: 반복적인 표피 접촉에 의해 1차적이거나 누적적인 자극 및/또는 알레르기 접촉 과민성을 유도할 시험 물질의 가능성을 측정하기 위한 것이다.

참여자: 19세 내지 79세 범위의 남성 및 여성인, 자격을 갖춘 대상체(Qualified subject)(n=108). 참여자를 시험 물질로부터의 피부 반응과 혼동될 수 있는 가시적인 피부 질환을 갖고 있지 않았다. 참여자는 연구 개시 전 적어도 7일 동안 국소 또는 전신 스테로이드 및/또는 항히스타민제를 사용하는 것이 금지되었다.

방법론:

각각의 시험 일에 시험 물질을 다음과 같이 제조하였다:

동결건조된 단백질 조성물을 함유하는 바이알 및 재구성 조성물을 함유하는 바이알을 개봉하였다. 피펫을 사용하여 이의 바이알로부터 재구성 조성물을 뽑아내어 이를 단백질-함유 바이알로 이동시켰다. 모든 단백질 분말이 용해되고 재구성된 단백질 조성물이 수득될 때까지, 재구성 조성물을 빼내어 방출함으로써 조성물을 혼합하였다. 재구성된 단백질을 피펫(대략 0.2 ml)을 사용하여 빼내어 투명한 접착 드레싱의 1" x 1"의 흡수성 패드 부위에 적용하였다. 이후에, 접착 드레싱을 견갑골 사이의 등 상부에 적용시켜 반-폐쇄성 패치를 형성시켰다. 피부에 대한 적용은 혼합 후 12시간 내에 수행하였다.

유도 상:

패치를 주당 3회 총 9회 적용으로 적용하였다. 패치 적용의 연속성을 보증하기 위해 부위를 표시하였다. 감독하에, 제1 유도 패치의 제거 및 점수매김 후, 참여자에게 적용 후 24시간 째에, 집에서 모든 유도 패치를 제거하라고 지시하였다. 치료 부위의 평가는 재-적용 직전에 이루어졌다.

첫번째의 감독하 유도 패치 판독을 제외하고는, 치료 영역이 유도 상 동안 중간(수준 2) 반응을 나타낸 경우, 적용을 인접한 영역으로 옮겼다. 새로운 치료 영역에서 중간(수준 2) 반응이 관찰된 경우, 나머지 시험 상에 대해 적용을 중지할 수 있다. 현저한(수준 3) 또는 중증(수준 4) 반응성이 기록된 경우에도 적용을 또한 중지할 수 있다. 휴식 기간은 각각의 패치 제거 후 1 또는 2일로 이루어졌다.

챌린지 상(Challenge phase):

최종 유도 패치 적용 후 대략 2주째에, 유도에 대해 기술된 동일한 과정에 따라서, 챌린지 패치를 원래의 유도 패치 부위에 인접한 최초 치료 부위에 적용하였다. 패치를 제거하고 적용 후 1일 및 3일째에 병원(clinic)에서 치료 영역 점수를 매겼다.

평가 기준(홍반 및 추가의 피부 후유증):

0= 가시적인 피부 반응 없음 E=부종

0.5= 간신히 인지가능 D=건조

1= 약함 S=침착(staining)

2= 중간 P=솟음(papule)

3= 현저 V= 수포(vesicle)

4= 중증 B= 대수포(bullae)

U= 궤양(ulceration)

Sp= 확산(spreading)

홍반(erythema)을 이러한 기준(key)에 따라 수치적으로 점수매겼다. 존재하는 경우, 추가의 피부 후유증은 적절한 문자 코드 및 중증도에 대한 수치 값으로 나타내었다.

결과:

관찰은 시험 간격 전체에서 음성으로 유지되었다. 시험 물질은 피부 자극 또는 알레르기성 접촉 과민성(allergic contact sensitization)에 대한 가능성을 나타내지 않았다.

실시예 12

효능 평가

시험 목적

주 1회 사용 요법(regimen)에 따라 12주의 사용 기간 과정에 걸쳐, 주름 및 균일하지 않은 피부 색조의 외관을 감소시키고, 피부 내 탄력 및 수분을 증가시키는 화장품의 효능을 평가하기 위한 것이다.

항노화 생성물의 소비자 인식을 측정하기 위해, 주당 1회 사용 12주 후, 설문지를 활용하였다(하기 참고).

대상체의 선택 및 배제

대상체의 수

35명의 여성 대상체가 연구를 완료하였다. 포함 기준 모두를 충족하고 배제 기준이 적용되지 않은 대상체.

포함 기준

1. 대상체는 45세 내지 65세의 여성이어야만 한다;

2. 대상체는 Fitzpatrick 피부 표현형 I, II, III, 또는 IV를 가져야만 한다:

피부형 그을림(Sunburn) 및 태닝(tanning) 이력

I 항상 쉽게 그을림; 태닝 안함

II 항상 쉽게 그을림; 약간 태닝

III 중간의 그을림; 점진적으로 태닝

IV 최소의 그을림; 항상 태닝

3. 대상체는 주름이 있고 이의 얼굴에 불균일한 피부 색조를 가져야만 한다;

4. 대상체는 0일 이전 7일 동안 및 시험상 동안 제공된 컨디셔닝 상 클렌저를 사용하는 것에 동의하여야만 한다;

5. 대상체는 보습제(moisturizer) 또는 화장없이, 미리-세안한 얼굴(집에서)로 각각의 시험 시설 방문에 도착하여야만 한다;

6. 대상체는 시험 동안 천연(태양) 또는 인공(태닝 베드(tanning bed))에 있는지에 상관없이, 이의 얼굴 또는 신체에 매일 직접적인 자외선 노출을 피하는데 동의하여야만 한다;

7. 대상체는 시험 상 동안 각각의 시험 시설에서 이의 얼굴에 취해진 측정에 동의하여야만 한다;

8. 대상체는 HIPPA 진술을 포함하는 사전 동의서(Informed Consent Form)를 읽고, 서명하고 날짜를 기입하여야만 한다;

9. 대상체는 사진 사용 허가서(Photographic Release Form)를 읽고 서명하고 날짜를 기입하여야만 한다; 및

10. 대상체는 지시사항에 의존하고 이를 따를 수 있는 것으로 고려되어야만 한다.

배제 기준

1. PI에 의해 측정된 것으로서, 건강이 나쁜 대상체;

2. 피임 이외의 의약품, 예를 들면, 임의의 전신 또는 국소 코르티코스테로이드, 면역억제제, 소염제, 항히스타민제, 항생제, 또는 시험자의 의견에서, 시험의 목적, 완전성, 또는 결과에 영향을 미칠 수 있는 다른 의약을 복용하는 대상체;

3. 시험 물질에 대한 반응과 혼동될 수 있는 임의의 가시적 질환을 가진 대상체;

4. 흡연자인 대상체;

5. 사진 또는 측정을 방해할 수 있는 얼굴 문신, 흉터, 또는 피어싱(piercing)이 있는 대상체;

6. 3개월 내에 이의 얼굴에 처방 또는 OTC 레티노이드 또는 항-노화 치료제를 사용한 대상체;

7. 시험 개시 1주일 내에 얼굴 치료(예컨대, 페이셜 필(facial peel), 딥 클리닝(deep cleaning), 미세박피술(microdermabrasion) 등)을 받은 대상체;

8. 시험 과정 동안 임신 중이거나, 임신 계획 중이거나 수유 중인 대상체;

9. 화장품, OTC 약물, 또는 다른 개인 위생용품(personal care product)에 대한 부작용 또는 알레르기 병력을 가진 대상체; 또는

10. 시험 과정 동안 임의의 새로운 화장품, 세면도구, 또는 개인 위생용품의 사용을 소개한 대상체.

대상체의 배제

대상체는 헬싱키의 세계 의사 협회 선언(World Medical Association Declaration of Helsinki)(수정됨) 및 벨몬트 보고서(Belmont Report)의 원칙에 따라, 어떠한 시간 및 어떠한 이유에서도 시험에 참여할 동의를 자유로이 철회할 수 있다. PI는 또한 안전성, 효능의 결여, 또는 투여 이유로 대상체를 제외시킬 권리를 갖는다.

대상체가 시험에서 제외될 수 있는 가능한 이유는 다음을 포함한다:

1. 심각하거나 참을 수 없는 AE를 경험한다;

2. 시험 과정 동안, 임신을 포함하는, 배제 기준에 나열된 증상 또는 상태가 발생한다;

3. 배제 기준에 기술된 바와 같은 금기인 의약을 복용한다;

4. 명시된 치료 요법을 준수하기 않거나 방문 일정을 준수하지 않는 것과 같은 프로토콜 위반을 초래한다; 또는

5. 다음과 같은 이유로 조기 중단을 요청한다:

- PI가 시험으로부터 제외하는 것이 필수적인 것으로 고려되지 않은 임상 반응;

- 다른(비-구체적인) 대상체가 시도한 이유.

배제된 대상체의 처리

대상체가 시험으로부터 철회된 날짜 및 중단 이유를 사례 보고서 양식(Case Report Form; CRF)에 기록한다. 대상체가 시험으로부터 배제된 후 가능한 한 신속하게 최종 시험 방문을 위해 예정된 모든 평가를 수행하기 위한 시도가 이루어진다. 대상체가 예정된 시험 방문에 대해 돌아오지 않는 경우, PI는 대상체와 접촉하여 대상체가 돌아오지 않는 이유를 측정하기 위한 합당한 노력을 기울인다. 이러한 정보는 CRF에 기록될 것이다. 대상체가 시험으로부터 철회된 경우(이유에 상관없이), PI는 대상체가 뜻밖의 부작용이 없는지를 보증하고, 임의의 지속되는 문제에 대해 후속 조치를 취하는데 필수적일 수 있는 모든 평가를 완료하도록 권장한다.

방법론

각각의 잠재적인 대상체는 시험에 참가하기 전에 사전 동의서를 제공한다.

설계

이는 13주 기간의 단일 센터, 단항의(monadic), 무작위처리된, 기준선 제어된 임상 시험 설계이다.

시험 시점에 대한 설명은 하기에 나타낸다:

지시사항

환경적으로-제어된 실내. 환경적으로 제어된 실내는 70 ± 5℉에서 및 40 ± 5%의 상대 습도에서 DX-100 제어기(controller)가 장착된 Johnson Control Metasys® 시스템을 사용하여 유지시킨다. 온도 및 습도의 판독은 매분 전자적으로 기록할 것이다.

각각의 대상체를 모든 측정 및 사진촬영 전에 적어도 30분 동안 환경적으로 제어된 실내에서 평형화시킨다. 모든 측정은 이러한 조건 하에서 수행한다.

VISIA-CR® 디지탈 영상(Canfield Scientific, Inc., 뉴저지주 파시파니 소재). VISIA-CR®은 제어된 광 환경의 내부에서 일련의 표준화되고, 재현가능한 디지탈 얼굴 영상을 취한다. 대상체 위치는 중요하며 각각의 시점에서 반복되어야만 한다. 의자 높이 및 대상체 턱과 이마를 영상 장치로 조심스러운 배치하는 것과 같은 항목이 유지된다. 또한, 대상체의 모발을 이의 얼굴로부터 제거하고, 장신구를 제거하고, 검정색 드레이프(black drape)를 사용하여 의복을 표준화한다.

대상체의 전면, 좌측 및 우측 모습(view)을 다음의 조명 매개변수에 따라 눈을 살짝 감고 포획한다:

표준 1 - 범용 백색광

표준 2 - 평면 조명

교차-편차(Cross-polarized) - 표면 아래(sub-surface) 세부사항의 우수한 시각화를 위해 표면 반사를 여과한다

통상 - 주름의 가시화

VISIA-CR®을 사용하여, 숙달된 생체계측 기술자(bioinstrumentation technician)는 기준선(적용 전), 6주, 12주째 방문시 얼굴의 표준화된 디지탈 영상을 포획한다. 이러한 영상을 사용하여 각각의 평가 간격에서 피부 색조의 균일도를 평가한다.

PRIMOS 3D(GFMesstechnik GmbH, 독일 태틀로우 소재). 우측 또는 좌측 눈의 외부 안각(outer canthus)의 영상을 Primos Optical 3D 측정 장치를 사용하여 취한다. 이러한 장치는 마이크로 거울 시스템(micro mirror system)을 사용하여 평행한 스트라이프 패턴(parallel stripe pattern)을 피부 표면에 투사하고 고-해상도 카메라의 CCD 칩에 투영하여 3D 영상을 생성시킨다. 대상체를 외부 안각이 카메라에 대해 수직이 되도록 위치시키고, 영상의 한쪽 가장자리(edge)를 안와(periorbital fossa)와 일직선이 되도록 한다. 이의 정확한 머리 위치를 구속 장치 속에 고정시키고 후속 영상 포획에 사용하기 위해 위치를 기록한다. 내부 소프트웨어는 포커싱 시스템(focusing system)을 포함함으로써 포획된 영상이 카메라의 3 mm 피사계 심도(depth of field) 내에 있도록 보증한다. PRIMOS 3D를 사용하여, 숙련된 생체게측 기술자는 기준선(적용 전), 6주, 및 12주째 방문에서 얼굴의 디지탈 영상을 포착한다.

Cutometer® MPA580 프로브 조리개(Probe aperture): 2 mm(Courage + Khazaka, 독일 쾰른 소재). 1회의 큐토미터 측정(Cutometer measurement)을 우측 또는 좌측 위 볼(무작위)에서 취한다. 측정 원리는 흡인 및 신장(elongation)을 기반으로 한다. 음압 450 mbar를 사용한다. 프로브를 일정한 적용 압력을 사용하여, 시험 부위에 둔다. 측정될 피부 영역을 일정한 음압을 사용하여 프로브의 구경으로 빼낸다. 이러한 흡입 시간은 측정 주기의 첫번째 부분이며 "온-타임(on-time)"으로 불리며, 3초간 지속된다. 이후에, 음압을 끄면(0 mbar) 피부는 이의 원래 형태를 재획득한다. 이는 이완 시간(relaxation time) 또는 "오프-타임(off-time)"으로 알려져 있으며 또한 3초간 지속된다. 각각의 3초 "온-타임" 및 "오프-타임" 주기를 3회 반복한다. 프로브는 측정 주기의 말기까지 피부에 남는다. 흡인 상 곡선의 첫번재 부분은 탄성 구성성분으로 고려된다. 곡선의 두번째 부분은 피부의 점탄성(플라스틱 구성성분)을 특징화한다. 측정은 스트레치(stretch) 및 리바운드(rebound)로 기록된다. Cutometer®을 사용하여, 숙련된 생체기술자는 기준선(적용 전), 6주, 및 12주째 방문에서 측정값을 포착한다.

MoistureMeterSC®(Delfin Technologies Ltd., 핀란드 쿠오피오 소재). MoistureMeterSC®는 표피 층과, 각질 층의 건조 층의 변화하는 두께 사이에서 발생하는 유전 상수를 임의의 단위로 측정한다. 유전 상수의 증가는 감소된 임피던스(impedance) 및 증가된 전도도 및 커패시턴스(capacitance)를 초래한다. 값이 높을 수록, 각질층(피부의 최상층)은 보다 더 수화된다. 5회의 MoistureMeterSC® 측정을 포획하고 각각의 평가 간격에서 시험 부위에서 평균을 낸다. 모든 MoistureMeterSC® 측정은 대상체가 환경적으로 제어된 실내에서 앉은 위치에 있는 동안 시험 부위에서 포착한다. MoistureMeterSC® 측정을 기준선(0주), 6주, 및 12주째에 포착한다.

컨디셔닝 상((-7)일)

잠재적인 대상체는 보습제 또는 화장을 하지 않고 미리-세안한 얼굴(집에서)로 시험 시설에 보고하고, ICF 및 사진 사용 허가서를 완료하였다. ICF를 완료한 이가 대상체가 된다. 대상체는 인조 속눈썹을 착용하지 않는다. 대상체는 의학적 병력 양식(Medical History Form)을 완료하여 초기 자격을 결정한다.

시험의 시험 상 전 7일 동안, 대상체는 이의 얼굴에 임의의 유형의 보습 새성물의 사용을 중지한다. 대상체는 시험 시설이 제공한 비-보습 클린저, SoftSoap®을 사용하여 매일 2회 이의 얼굴을 세안한다. 대상체는 시험의 컨디셔닝 상 및 시험 상 둘 다에서, 제공된 클린저를 전적으로 사용하는 것이 요구된다.

일지를 각각의 대상체에게 제공하여 얼굴의 각각의 클린징(cleansing)을 문서화한다.

시험 상(0주)

대상체는 보습제 또는 화장없이, 미리 세안한 얼굴(집에서)로 예정된 시점에 시험 시설에 보고한다.

대상체의 일지는 반환하여 규정 준수에 대해 검토하고 시험 시설에 의해 보관된다.

숙련 채점자는 각각의 대상체의 얼굴을 홍반, 부종, 및 건조증(dryness), 및 다른 이상증상(anomaly)에 대해 다음의 평가 기준(evaluation key)을 사용하여 평가한다:

평가 기준:

0 = 없음

0.5 = 거의 감지불가능

1 = 약함

2 = 중간

3 = 현저함

4 = 중증

홍반 및 부종에 대해 중간(2) 이상의 점수를 나타내는 대상체는 실격시켰다. 건조증에 대해 적어도 약함(1)을 나타내는 대상체는 시험에 참여할 자격이 있다. 모든 평가 점수는 CRF에 기록한다.

또한 전문 채점자는 주름 및 불균일한 피부 색조에 대해, 앞서 언급한 평가 기준을 사용하여, 각각의 대상체의 얼굴의 평가를 수행하였다. 각각에 대해 적어도 약한(1) 점수를 나타내는 대상체는 시험에 참가할 자격이 있다.

자격을 갖춘 대상체는 상술한 바와 같이, 환경적으로 제어된 실내에서 적어도 30분 동안 평형을 유지시킨다. 평형 후, 다음의 과정을 상술한 바와 같이, 생물계측 기술자가 완료한다:

각각의 대상체의 얼굴의 VISIA-CR® 영상.

무작위처리 후, 각각의 대상체의 외측 안강의 PRIMOS 3D 영상.

무작위처리 후, 각각의 대상체의 위 뺨의 Cutometer® 측정.

MoistureMeterSC® 측정.

대상체에게 12주 분량의 시험 물질 및 사용을 문서화하기 위한 일지가 제공된다. 각각의 대상체에게 시험 물질을 사용하는 방법을 다음과 같이 지시한다:

1. 플라스틱 디스크를 위로 당겨서 로션을 함유하는 바이알을 열고, 알루미늄 밀봉 캡을 버린다.

2. 로션 함유 바이알로부터 고무 마개를 제거하여 버린다.

3. 플라스틱 디스크를 위로 잡아당겨 단백질을 함유하는 바이알을 개봉하고, 알루미늄 밀봉 캡을 버린다.

4. 단백질 함유 바이알로부터 고무 마개를 제거하고 버린다.

5. 제공된 일회용 피펫을 찾아서, 이의 열린 말단을 로션을 함유하는 바이알내로 삽입한다.

6. 피펫의 끝(tip)을 단단히 누르고 손을 떼서 로션을 피펫에 흡수시킨다.

7. 피펫을 단백질 함유 바이알로 이동시키고, 피펫의 끝을 눌러 로션을 방출시킨다.

8. 모든 단백질 분말이 용해될 때까지, 로션을 뽑고 방출시킴으로써 수회 잘 혼합한다.

9. 단백질 함유 로션을 피펫으로 뽑아서, 피부에 국소 적용한다.

10. 단백질 로션이 혼합되면, 12시간 내에 사용한다.

11. 요법: 주당 1회

각각의 대상체에 대해, 첫번째 시험 물질 사용을 시험 시설에서 임상 감독 하에 수행한다.

대상체는 이의 정규적인 안면 화장품의 사용을 지속할 수 있다. 대상체는 임의의 새로운 화장품, 세면도구, 또는 개인 위생 제품을 시험 과정 동안 도입할 수 없다.

시험 상(6주째)

대상체는 보습제 또는 화장없이, 이의 예정된 시점에서 미리 세안한 얼굴(집에서)을 시험 시설에 보고한다. 대상체는 시험 시설에 이의 일지를 보고한다. 일지는 준수여부를 위해 검토하고 각각의 대상체에게 반환한다.

대상체를 상술한 바와 같이, 적어도 30분 동안, 환경적으로 제어된 실내에서 평형을 유지시킨다. 평형 후, 다음의 과정을 상술한 바와 같이, 생물계측 기술자가 완료한다:

각각의 대상체의 얼굴의 VISIA-CR® 영상.

무작위처리 후, 각각의 대상체의 외측 안각의 PRIMOS 3D 영상.

무작위처리 후 각각의 대상체의 위 뺨의 Cutometer® 측정.

MoistureMeterSC® 측정.

시험 상(12주 째)

대상체는 12주의 사용 기간 후 이의 예정된 시점에, 보습제 또는 화장하지 않고, 미리 세안한 얼굴로(집에서) 시험 시설에 보고한다. 임의의 미사용 시험 물질 및 완료한 일지를 반환한다.

대상체는 상술한 바와 같이, 적어도 30분 동안 환경적으로 제어된 실내에서 평형을 유지한다. 평형 후, 다음의 과정을 상술한 바와 같이, 생물계측 기술자가 완료한다:

각각의 대상체 얼굴의 VISIA-CR® 영상.

무작위처리 후, 각각의 대상체의 외측 안각의 PRIMOS 3D 영상.

무작위처리 후, 각각의 대상체의 위뺨의 Cutometer® 측정.

MoistureMeterSC® 측정.

설문지는 각각의 대상체가 완료한다. 설문지 및 일지는 대상체의 해산 전 완료를 위해 고찰된다.

프로토콜 준수

시험의 시험 상 83일 후, 예정된 방문의 2일 이내에 시험 시설에 예정된 방문은 프로토콜을 준수한 것으로 고려한다.

통계적 분석

통계 분석을 생물측정 장치(VISIA-CR® 영상 분석, PRIMOS 3D, Cutometer®, 및 MoistureMeterSC®)로부터 수집한 데이터에서 수행한다. 분석을 수행하기 전에, 데이터에서 임상 시험을 수행하여 데이터의 변량의 정규성(normality) 및/또는 동질성(homogeneity)이 유지되는지의 여부를 측정한다. 상기 조건이 유지되면, 매개변수적 스튜던츠 t-시험(parametric Student's

t-Test) 또는 변량 분석을 수행한다. 임의의 상기 조건이 유지되지 않는 경우, 상기 통계 시험에 대해 비-매개변수 등가물(non-parametric equivalent)를 활용한다. 통계적 유의성이 관찰되고 추가의 통계적 비교가 요구되는 경우, 다수의 비교 시험을 수행하고 p-값에 대한 적절한 조절을 상응하게 이룬다.

상기 분석 외에, 통계적 분석을 설문 데이터에서 수행한다. 각각의 적용가능한 순위 매개변수/질의에 대한 반응을 2개의 범주, "성공' 및 "실패"로 나눈다. 대상체가 시험 물질(들)을 좋아하거나 시험 물질(들)에 대해 긍정적인 진술에 동의함을 나타내는 반응은 "성공"으로 고려한다. 대상체가 시험 물질(들)을 싫어하거나 시험 물질(들)에 대한 긍정적인 진술에 동의하지 않음을 나타내는 반응은 "실패"로 고려한다. 임의의 중간점 반응(즉, 좋아하거나 싫어하지도 않는 것; 동의하거나 동의 안하지도 않는 것)의 경우, 중간점 반응의 1/2은 "성공"으로서 계수하고 1/2은 "실패"로서 계수한다. 중간점 반응의 수가 홀수인 경우, "성공" 범주는 추가의 중간점 반응을 받을 것이다. 각각의 순위 매개변수/질의에 대한 "성공" 및 "실패"의 비율은 "성공" 및 "실패"의 수를 반응의 총 수로 나누어 측정한다. 이러한 비를 비교하고, 통계적으로 유의적인 차이를 각각의 순위 매개변수/질의에 대해 비율 z-시험을 사용하여 확인한다.

상기 분석 모두에 대해, 통계적 유의성은 95% 신뢰 수준(p < 0.050)에서 달성된다.

안전성

각각의 대상체는 임의의 부작용(Adverse Events; AEs)의 발달에 대해 조심스럽게 모니터링한다. PI는 시험 물질(또는 다른 원인) 및 이의 강도에 대한 이의 관계, 또는 이와의 관련성에 대해 모든 AE를 평가한다.

설문지

항노화 생성물의 소비자 인식은 설문지를 사용하여 평가하고 여기서 각각의 대상체는 하기 진술과의 동의 수준에 대해 순위를 매기며, 여기서 "1"은 "강력하게 동의함"을 나타내고, "5"는 "중립/의견 없음"을 나타내고, "9"는 "강력하게 동의하지 않음"을 나타낸다.

1. 로션 생성물을 사용한 본인의 전반적인 경험은 긍정적이었다.

2. 로션은 피부에서 쾌적하고, 부드러운 질감을 가졌다.

3. 로션은 적용하기 용이하였다.

4. 로션의 색상은 본인에게 매력적이다.

5. 본인의 피부는 로션 사용 후 보다 균일한 색으로 보인다.

6. 로션의 사용은 본인의 피부 결을 개선시켰다.

7. 주기적으로 로션을 사용하는 것은 본인의 피부를 보다 ??게 보이도록 한다.

8. 로션을 사용하는 것은 주름 감소에 기여한다.

9. 로션을 사용하는 경우, 이는 본인의 피부를 자극하여, 생기있고 활력있는 외관을 제공한다.

10. 로션을 사용하는 경우, 이는 노화의 외관을 감소시키는 것으로 느껴진다.

11. 로션의 사용은 본인 피부 외관이 균일해지도록 한다.

12. 로션의 사용은 본인의 피부에 젊어진 외관을 제공한다.

13. 본 생성물을 친구체게 추천하고 싶다.

결과

상술한 바와 같은 PRIMOS, 사용자 및 MoistureMeterSC®를 사용한 피부 부드러움, 탄력 및 수화의 분석은 사용 6주 후에 이미 더 부드러운 피부 및 주름 깊이에서의 감소를 나타내었다(p < 0.01). 주름의 깊이에서의 감소는 또한 사용 12주 후에도 관찰되었다(p<0.02). 또한, 피부의 연화는 사용 6주 후 관찰되었고, 이는 사용 12주 후까지 지속되었다(p<0.001). 피부 거침에서 통계적으로 유의적인 감소(보다 부드러운 피부) 및 주름 깊이에서의 감소는 PRIMOS를 사용하여 거의 달성되지 않음이 주목되며, 본 발명의 화장품의 유리한 효과를 추가로 강조한다.

설문 응답은 도 10a 및 도 10b에 요약되어 있다. 반응은 2개의 범주로 혼주되었다: 시험 물질에 대해 1("강력하게 동의함") 내지 4를 선택한 대상체의 경우 "성공", 및 시험 물질 기여에 대해 6 내지 9("강력하게 동의하지 않음")을 선택한 대상체의 경우 "실패". 5("중립")을 선택한 대상체는 2개 범주 사이에서 균일하게 나누었다. 결정하지 않은 반응의 불균일한 분포가 존재하는 경우, "성공" 범주에 열외의 결정되지 않은 반응을 부여하였다.

도면에서 알 수 있는 바와 같이, 반응은 제품을 사용한 소비자의 매우 긍정적인 인식을 나타내었다.

실시예 13

생성물 특성화 - 엑소좀 성분

엑소좀의 함량을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조한, 화장용 부형제와 함께 제형화한 본 발명에 따른 단백질 분획에서 측정하였다. 단백질 분획은 본 발명의 화장품의 "바이알 A"로서 이의 동결건조된 형태로 제공되었다. 측정은 나노입자 추적 분석기(nanoparticle tracking analyzer)(NanoSight^TM)를 사용하여 엑소좀 마커 발현의 FACS 분석 및 엑소좀 정량화를 포함하였다.

유동 세포분석법 프로토콜

엑소좀 마커 발현의 유동 세포분석법 분석을 MACSPlex^TM 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 분석된 마커는 CD81, CD63 및 CD9 - 양성 엑소좀 마커이다. 분석에 사용된 유동 세포분석기는 Beckman Coulter Gallios^TM이다.

분석은 마커-특이적인 항체로 코팅된 비드의 집단에 대한 엑소좀의 결합을 기반으로 한다. 키트(kit)는 다양한 형광 표지된 비드 집단의 칵테일을 함유하고, 각각은 특이적인 엑소좀 표면 마커를 결합시키는 특이적인 항체로 코팅되었다. 전반적으로, 39개의 비드 집단이 포함되며, 이는 유동 세포분석법에 의해 상이한 형광성 강도로 구별될 수 있다. 키트는 비드에 대한 엑소좀의 결합을 검출하기 위한, 각각의 마커에 대해 특이적인 APC-접합된 항체를 추가로 함유한다.

과정의 개략적인 설명은 도 12a에 나타나 있다. 분석된 샘플은 항체-코팅된 비드와 항온처리한다. 후속적으로 또는 병행하여, 비드(bead)에 결합된 엑소좀을 APC-접합된 항체로 표지한다. 본 실시예에서는, CD81, CD63 및 CD9에 대해 특이적인 APC-접합된 항체를 사용하였다.

비드-엑소좀-표지된 항체의 형성은 비드 및 표지된 항체의 형광성을 기반으로 유동 세포분석기를 사용하여 평가한다. 목적한 마커로 코팅된 비드의 집단에서 양성의 APC 신호는 엑소좀 집단 내 목적한 마커의 존재를 나타낸다.

다음의 샘플을 분석에 사용하였다:

- 완충제 배경(음성 대조군)

- 정제된 ADSC 엑소좀 60μg(양성 대조군). ADSC 엑소좀을 다음과 같이, 표준 차등화 원심분리 프로토콜에 따라 ADSC 성장 후 수집한 조건화 배지로부터 정제하였다:

1. 조건화된 배지를 3회 원심분리에 이어 여과 및 상층액의 수집으로 투명하게 하였다:

4℃에서 10분 동안 300G;

4℃에서 10분 동안 2000G;

4℃에서 30분 동안 10,000 G;

진공은 0.22μm 여과기를 통해 여과를 보조하였다.

2. 투명해진 상층액을 100,000G 4℃에서 2시간 동안 한외원심분리(ultracentrifugation)에 적용시켰다.

3. 펠렛을 수집하고 분자 여과 장치 Amicon® Ultra 100kDa에 로딩하였다.

4. >100kDa의 잔류 분획을 PBS로 5회 세척하였다: 용적은 PBS를 사용하여 0.5ml까지 완료시키고 장치를 15000G에서 10분 동안 또는 용적이 <100μl로 감소될 때까지 원심분리하였다.

5. 세척된 엑소좀을 -80℃에서 저장하였다.

- 바이알 A 100kDa 펠렛 120μg

- 바이알 A 100kDa 유동 통과

"바이알 A100kDa 펠렛 120μg" 및 "바이알 A 100kDa 유동 통과"는 다음과 같이 제조하였다:

1. 화장품(동결건조된 단백질 조성물)의 바이알 A의 내용물을 PBS 속에 용해하고 분자 여과 장치 Amicon® Ultra 100kDa 상에 로딩하였다.

2. 유동통과 분획(<100kDa)을 수집하고 " 바이알 A 100kDa 유동 통과"로 유지하였다.

3. >100kDa의 잔류 분획을 PBS로 5회 세척하고; 용적을 PBS를 사용하여 0.5ml 이하로 완료시키고 장치를 15000G에서 10분 동안 또는 용적이 <100μl로 감소할 때까지 원심분리하였다.

4. 세척한 잔류 분획은 "바이알 A 100kDa 펠렛 120μg"으로 확인하고 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다.

결과는 도 12b에 요약하며, 이는 대조군 및 시험 샘플에서 3개의 엑소좀 마커 각각에 대해 검출된 APC 형광성 신호의 유동 세포분석법 밀도 플롯을 나타낸다. 수직 바는 APC 신호에 대해 양성을 표시한다. CD81, CD63 및 CD9의 양성 발현을 본 발명의 단백질 조성물 내에서 검출하고, 이는 엑소좀이 조성물 속에 존재함을 나타낸다.

NanoSight ^TM 분석

본 발명의 단백질 조성물 내 엑소좀의 수 및 평균 직경을 나노입자 추적 분석기 NanoSight^TM을 사용하여 측정하였다.

다음의 예시를 분석에 사용하였다:

- "화장품" - 바이알 A의 성분을 PBS 속에 용해하였다. NanoSight^TM 장치 상에 로딩된 샘플은 27개 바이알로부터 10μl를 포함하고, 이는 ~1.5개 바이알의 용적과 동일하다.

- "정제된 ADSC 엑소좀 60μg" - 상술한 바와 같음.

결과는 도 12c에 요약한다. 결과는 엑소좀이 조성물 속에 바이알 당 10⁸개 엑소좀의 양으로 존재함을 나타내며, 이는 총 단백질 1mg 당 10⁹개의 엑소좀의 함량을 반영한다. 엑소좀의 평균 직경은 대략 130 nm이다.

특정 구현예의 앞서의 설명은 본 발명의 일반적인 특성을 충분히 드러낼 것이며 다른 사람들은 현재의 지식을 적용함으로써 과도한 실험없이 일반적인 개념에서 벗어나지 않고 특정 구현예와 같은 다양한 적용을 용이하게 변형 및/또는 적응할 수 있을 것이므로, 이러한 적응 및 변형은 개시된 구현예의 등가물의 의미 및 범위 내에서 이해되어야 하고 의도되어야 한다. 본원에 사용된 어구 또는 기술용어는 설명을 위한 것이며 제한하려는 것이 아니다. 다양한 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 물질, 및 단계는 본 발명으로부터 벗어나지 않고 다양한 대안적인 형태를 취할 수 있다.

Claims

사람 지방질-유래된 줄기 세포 조건화 배지(human adipose-derived stem cell conditioned medium)로부터 정제된 건조된 단백질 분획 및 적어도 하나의 향장학적으로(cosmetically) 허용되는 부형제를 포함하는 분말 형태의 화장 조성물(cosmetic composition)로서, 여기서 단백질 분획이 1kDa보다 작은 구성성분(component)의 제거 후에 잔류하는 단백질 및 입자를 포함하는, 화장 조성물.
제1항에 있어서, 단백질 분획이 3kDa보다 작은 구성성분의 제거 후에 잔류하는 단백질 및 입자를 포함하는, 화장 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질 mg 당 적어도 10⁹개의 엑소좀(exosome)을 포함하는, 화장 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 분획이 사람 지방질-유래된 줄기 세포가 성장한 세포 배양 배지의 구성성분을 실질적으로 함유하지 않는, 화장 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 지방질-유래된 줄기 세포가 적어도 24시간 동안 혈청-함유 배지 속에서 및 후속적으로 배지의 수집 전 적어도 48시간 동안 혈청이 없는 배지 속에서 성장된, 화장 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 단백질 분획이 동결건조된 단백질 분획인, 화장 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 단백질 함량(protein content)이 적어도 0.2 μg/mg 분말인, 화장 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 5 중량% 미만의 잔류 수(residual water)를 함유하는, 화장 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 공정에 의해 수득된, 화장 조성물:
(a) 사람 지방질-유래된 줄기 세포(hADSC)를 수득하는 단계;
(b) hADSC를 혈청-함유 배지 속에서 적어도 24시간 동안 배양하는 단계;
(c) hADSC를 혈정이 없는 배지 속에서 적어도 48시간 동안 아-배양(sub-culturing)하여 조건화 배지를 수득하는 단계;
(d) hADSC 및 세포 부스러기(cell debris)를 분리하고 조건화 배지를 수득하는 단계;
(e) 조건화 배지를 농축시키고 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 여과함으로써 1kDa 보다 작은 구성성분을 제거하고 단백질 분획을 보유물(retentate)로서 수득하는 단계;
(f) 단백질 분획을 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 증량제(bulking agent) 및 임의로 적어도 하나의 추가의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 제형을 사용하여 정용여과(diafiltrating)함으로써, 세포 배양 배지 구성성분으로부터 정제되고 수성 제형과 함께 제형화된 단백질 분획을 수득하는 단계; 및
(g) 수득된 단백질 분획을 건조시키는 단계.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 공정에 의해 수득된, 화장 조성물:
(a) 사람 지방질-유래된 줄기 세포(hADSC)를 수득하는 단계;
(b) hADSC를 혈청-함유 배지 속에서 적어도 24시간 동안 배양하는 단계;
(c) hADSC를 혈청이 없는 배지 속에서 적어도 48시간 동안 아-배양하여 조건화 배지를 수득하는 단계;
(d) hADSC 및 세포 부스러기를 분리하고 조건화 배지를 수득하는 단계;
(e) 조건화 배지를 농축시키고 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 여과함으로써 3kDa 보다 작은 구성성분을 제거하고 단백질 분획을 보유물로서 수득하는 단계;
(f) 단백질 분획을 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 증량제 및 임의로 적어도 하나의 추가의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 제형을 사용하여 정용여과함으로써, 세포 배양 배지 구성성분으로부터 정제되고 수성 제형과 함께 제형화된 단백질 분획을 수득하는 단계; 및
(g) 수득된 단백질 분획을 건조시키는 단계.
제9항 또는 제10항에 있어서, 수성 제형이 2% 내지 10%(w/v)의 적어도 하나의 증량제를 포함하는, 화장 조성물.
제11항에 있어서, 증량제가 만니톨을 포함하는, 화장 조성물.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 제형이 적어도 하나의 안정화제 및 적어도 하나의 강직성 제제(tonicity agent)를 추가로 포함하는, 화장 조성물.
제13항에 있어서, 수성 제형이 0.01 내지 1%(w/v)의 적어도 하나의 안정화제를 포함하는, 화장 조성물.
제13항 또는 제14항에 있어서, 적어도 하나의 안정화제가 EDTA를 포함하는, 화장 조성물.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 제형이 0.1 내지 1%(w/v)의 적어도 하나의 강직성 제제를 포함하는, 화장 조성물.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 강직성 제제가 염화나트륨을 포함하는, 화장 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 다음의 단계를 포함하는 공정에 의해 수득된 사람 지방질-유래된 줄기 세포에 의해 조건화되는, 화장 조성물:
(a) 지질흡인물(lipoaspirate)을 동결시키는 단계;
(b) 지질흡인물을 해동시키고 조직-해리 효소(tissue-dissociation enzyme) 또는 기계적 파열에 의해 해리시키는 단계;
(c) ADSC를 포함하는 세포 분획을 원심분리로 펠렛화(pelleting)하고, 임의로 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁액 배지로 세척하고 현탁액을 적어도 하나의 추가의 원심분리에 적용시키는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁액 배지 속에서 재현탁시키고 재현탁된 펠렛 속의 세포의 집단으로부터 ADSC를 선택하는 단계;
(e) 임의로 ADSC 선택 전에 적어도 하나의 여과를 수행하는 단계; 및
(f) 임의로 ADSC를 적어도 3회 계대배양(passage) 동안 배양시키는 단계.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 세포의 적어도 90%까지 CD73, CD90 및 CD105의 양성 발현, 및 세포의 5% 미만까지 CD45의 양성 발현에 의해 특징화된 사람 지방질-유래된 줄기 세포의 집단에 의해 조건화되는, 화장 조성물.
노화와 관련된 적어도 하나의 피부 상태를 개선시키는 방법으로서, 이러한 방법이 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 화장 조성물을 제공하는 단계; 조성물을 재구성하여 피부에 적용하기에 적합한 조성물을 수득하는 단계; 및 피부에 적용시키는 단계를 포함하는, 방법.
(a) 사람 지방질-유래된 줄기 세포 표적화 배지로부터 정제된 단백질 분획 및 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 분말 형태의 건조된 단백질 조성물로서, 여기서 단백질 분획이 1kDa보다 작은 구성성분의 제거 후에 잔류하는 단백질 및 입자를 포함하는, 분말 형태의 단백질 조성물; 및
(b) 동결건조된 단백질 조성물을 재구성시켜 대상체의 피부에 국소 적용하기에 적합한 조성물을 형성시키기 위한, 물 및 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 재구성 조성물을, 혼합을 위해 준비된 별개의 조성물로서, 포함하는 2개-구성성분 화장품(cosmetic product)으로서,
여기서 2개의 구성성분은 별도로 유지되고 사용 전에 혼합되는, 2개-구성성분 화장품.
제21항에 있어서, 단백질 분획이 3kDa보다 작은 구성성분을 제거한 후에 잔류하는 단백질 및 입자를 포함하는, 화장품.
제21항 또는 제22항에 있어서, 건조된 단백질 조성물이 단백질 mg 당 적어도 10⁹개의 엑소좀을 포함하는, 화장품.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 분획이 사람 지방질-유래된 줄기 세포가 성장한 세포 배양 배지의 구성성분을 실질적으로 함유하지 않는, 화장품.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 지방질-유래된 줄기 세포가 혈청-함유 배지 속에서 적어도 24시간 동안 및 후속적으로 배지의 수집 전에 적어도 48시간 동안 혈청이 없는 배지 속에서 성장된, 화장품.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 단백질 조성물의 단백질 함량이 적어도 0.2 μg/mg 분말인, 화장품.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 단백질 조성물이 5 중량% 미만의 잔류 물을 함유하는, 화장품.
제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 단백질 조성물이 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는, 화장품:
조건화 배지를 농축시키고 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 여과함으로써 1kDa 보다 작은 구성성분을 제거하고 단백질 분획을 보유물로서 수득하는 단계;
단백질 분획을 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 증량제 및 임의로 적어도 하나의 추가의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 제형을 사용하여 정용여과함으로써 세포 배양 배지 구성성분으로부터 정제되고 수성 제형과 함께 제형화된 단백질 분획을 수득하는 단계; 및
제형화된 단백질 분획을 건조시키는 단계.
제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 단백질 조성물이 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 화장품:
조건화 배지를 농축시키고 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 여과함으로써 3kDa 보다 작은 구성성분을 제거하고 단백질 분획을 보유물로서 수득하는 단계;
단백질 분획을 적어도 하나의 향장학적으로 허용되는 증량제 및 임의로 적어도 하나의 추가의 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 수성 제형을 사용하여 정용여과함으로써 세포 배양 배지 구성성분으로부터 정제되고 수성 제형과 함께 제형화된 단백질 분획을 수득하는 단계; 및
제형화된 단백질 분획을 건조시키는 단계.
제28항 또는 제29항에 있어서, 수성 제형이 2% 내지 10%(w/v)의 적어도 하나의 증량제를 포함하는, 화장품.
제30항에 있어서, 증량제가 만니톨을 포함하는, 화장품.
제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 제형이 적어도 하나의 안정화제 및 적어도 하나의 강직성 제제(tonicity agent)를 포함하는, 화장품.
제32항에 있어서, 수성 제형이 0.01 내지 1%(w/v)의 적어도 하나의 안정화제를 포함하는, 화장품.
제32항 또는 제33항에 있어서, 적어도 하나의 안정화제가 EDTA를 포함하는, 화장품.
제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 제형이 0.1 내지 1%(w/v)의 적어도 하나의 강직성 제제를 포함하는, 화장품.
제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 강직성 제제가 염화나트륨을 포함하는, 화장품.
제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 다음 단계를 포함하는 공정에 의해 수득된 사람 지방질-유래된 줄기 세포에 의해 조건화되는, 화장품:
(a) 지질흡인물을 동결시키는 단계;
(b) 지질흡인물을 해동시키고 조직-해리 효소 또는 기계적 파열(mechanical disrption)에 의해 해리시키는 단계;
(c) ADSC를 포함하는 세포 분획을 원심분리로 펠렛화하고, 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁액 배지로 임의로 세척하고 현탁액을 적어도 하나의 추가의 원심분리에 적용시키는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 펠렛을 세포 생존능을 뒷받침할 수 있는 현탁액 배지 속에서 재현탁시키고 재현탁된 펠렛 속의 세포의 집단으로부터 ADSC를 선택하는 단계;
(e) 임의로 ADSC 선택 전에 적어도 하나의 여과를 수행하는 단계; 및
(f) 임의로 ADSC를 적어도 3회 계대배양 동안 배양시키는 단계.
제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 세포의 적어도 90%까지 CD73, CD90 및 CD105의 양성 발현, 및 세포의 5% 미만까지 CD45의 양성 발현에 의해 특징화된 사람 지방질-유래된 줄기 세포의 집단에 의해 조건화되는, 화장품.
제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 단백질 조성물이 동결건조된 단백질 조성물인, 화장품.
제21항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 단백질 조성물과 혼합하기 전에 재구성 조성물의 점도 매개변수가 실온에서 Brookfield 점도계를 사용하여 측정된 것으로서 12 RPM: 1800-2700 cP; 18 RPM: 1400-2000 cP; 60 RPM: 700-1000 cP; 100 RPM: 500-800 cP인, 화장품.
제21항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 재구성 조성물이 증류수, 및 적어도 하나의 유화제 및 적어도 하나의 연화제(emollient)를 포함하는 향장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 화장품.
제41항에 있어서, 수성 재구성 조성물이 2 내지 10%(w/w)의 적어도 하나의 유화제(emulsifier)를 포함하는, 화장품.
제41항 또는 제42항에 있어서, 수성 재구성 조성물이 2 내지 10%(w/w)의 적어도 하나의 연화제를 포함하는, 화장품.
제21항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 단백질 조성물과 수성 재구성 조성물 사이의 중량비가 적어도 1:20인, 화장품.
제44항에 있어서, 건조된 단백질 조성물과 수성 재구성 조성물 사이의 중량비가 1:20 내지 1;50의 범위인, 화장품.
제21항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 재구성 조성물과 혼합하기 전에 건조된 단백질 조성물의 pH가 7.0 내지 7.6의 범위인, 화장품.
제21항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 단백질 조성물과 혼합하기 전에 수성 재구성 조성물의 pH가 7.0 내지 7.6의 범위인, 화장품.
제21항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 조성물의 혼합 후 재구성된 조성물의 pH가 7.0 내지 7.6의 범위인, 화장품.
제21항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 예비충전된 주사기(prefilled syringe)로서 제공된, 화장 조성물로서, 여기서 주사기는 수성 재구성 조성물을 포함하는 제1의 챔버(chamber), 건조된 단백질 조성물을 포함하는 제2의 챔버, 및 플런저(plunger)를 포함하고, 여기서 플런저의 운동 시 수성 재구성 조성물이 제1의 챔버로부터 제2의 챔버로 전달되어 재구성용의 건조된 단백질 조성물과 혼합되는, 화장 조성물.
노화(aging)와 관련된 적어도 하나의 피부 상태(skin condition)를 개선시키는 방법으로서, 이러한 방법이 제21항 내지 제49항 중 어느 한 항의 2개-구성성분 화장품을 제공하는 단계; 건조된 단백질 조성물을 수성 재구성 조성물과 혼합하여 피부에 적용하기에 적합한 재구성된 조성물을 형성시키는 단계; 및 피부에 적용시키는 단계를 포함하는, 방법.