CN117427144B - 一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法 - Google Patents

一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117427144B
CN117427144B CN202311754116.XA CN202311754116A CN117427144B CN 117427144 B CN117427144 B CN 117427144B CN 202311754116 A CN202311754116 A CN 202311754116A CN 117427144 B CN117427144 B CN 117427144B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
weight
parts
stem cell
hair
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311754116.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN117427144A (zh
Inventor
王壮
雷起凤
尹娜
梁玉倩
杨俊丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Ivy Guxi Stem Cell Technology Research Institute Co ltd
Original Assignee
Beijing Ivy Guxi Stem Cell Technology Research Institute Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Ivy Guxi Stem Cell Technology Research Institute Co ltd filed Critical Beijing Ivy Guxi Stem Cell Technology Research Institute Co ltd
Priority to CN202311754116.XA priority Critical patent/CN117427144B/zh
Publication of CN117427144A publication Critical patent/CN117427144A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117427144B publication Critical patent/CN117427144B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/23—Apiaceae or Umbelliferae (Carrot family), e.g. dill, chervil, coriander or cumin
    • A61K36/232—Angelica
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/70—Polygonaceae (Buckwheat family), e.g. spineflower or dock
    • A61K36/704—Polygonum, e.g. knotweed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/19—Preparation or pretreatment of starting material involving fermentation using yeast, bacteria or both; enzymatic treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/82—Undefined extracts from animals from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提出了一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法，属于外泌体技术领域。刺激猪脂肪间充质干细胞分泌外泌体，并将其体外培养传代，离心获得脂肪干细胞外泌体，剩余的培养液留用，将脂肪干细胞外泌体与脂质体混合制备外泌体‑脂质体，负载二氨基嘧啶氧化物‑吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物‑2,3,5,4’‑四羟基二苯乙烯葡萄苷共晶和添加剂，制得载药体系；将何首乌、当归经过水提取获得水提取物，固体与培养液混合发酵，制得发酵产物，与水提取物、载药体系混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物，起到很好的防脱、生发、育发、黑发的效果，具有广阔的应用前景。

Description

一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及外泌体技术领域，具体涉及一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法。
背景技术
随着现代社会生活节奏的加快，环境的日益恶化，越来越多的人在高强度的精神压力、加班、熬夜、雾霾等条件下，身体出现不同程度的亚健康问题，其中就包括由此带来的头皮油脂分泌增多、头皮炎症、毛囊萎缩、头发脱落等问题。脱发成为现代人，尤其是年轻人，越来越关注的话题。
现今防脱生发问题的主要解决方法是生发药物和手术。药物治疗主要是非那雄胺和米诺地尔，往往有较严重的副作用，且容易形成药物依赖，一旦停药，脱发更加严重；手术治疗费用较高，有创伤，需要一定的恢复期。因此，开发天然的防脱生发原料，用于解决脱发问题，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提出一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法，能够增加血管内皮细胞的侵袭和迁移，最终促进血管形成，促进皮肤成纤维细胞增殖、迁移，提高毛囊细胞的活力，促进毛发的生长，减少炎症细胞的浸润，增强毛母质细胞活性，延长毛囊生长期，起到很好的防脱、生发、育发、黑发的效果，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备方法，刺激猪脂肪间充质干细胞分泌外泌体，并将其体外培养传代，离心获得脂肪干细胞外泌体，剩余的培养液留用，将脂肪干细胞外泌体与脂质体混合制备外泌体-脂质体，负载二氨基嘧啶氧化物-吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物-2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷共晶和添加剂，制得载药体系；将何首乌、当归经过水提取获得水提取物，固体与培养液混合发酵，制得发酵产物，与水提取物、载药体系混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.培养基的制备：将蜂王浆、肝素钠加入含有胎牛血清的α-MEM完全培养液中，混合均匀，制得培养基；
S2.外泌体的刺激分泌：将猪脂肪间充质干细胞用步骤S1制得的培养基重悬细胞，低氧条件下体外培养，待细胞密度70-80%时，用PBS溶液冲洗细胞，剩余的培养液留用，接种到无血清培养基中培养36-60h后，收集细胞，剩余的培养液留用，与之前的培养液合并，制得脂肪干细胞无细胞培养液；
S3.脂肪干细胞外泌体的分离：用PBS溶液冲洗步骤S2获得的细胞，加入胰蛋白酶消化，在2-4℃，将培养基依次在270-320×g离心10-15min，1800-2200×g离心5-10min，8000-12000×g离心25-35min，去除细胞和细胞碎片；继续在98000-102000×g离心60-80min，将底部的沉淀物重悬并用PBS溶液冲洗，最后在98000-102000×g离心60-80min去除外泌体中污染的蛋白质，获得脂肪干细胞外泌体；
S4.外泌体-脂质体的制备：将卵磷脂、胆固醇溶于乙醇，加入泊洛沙姆188的PBS溶液中，加热搅拌，使得乙醇完全挥发，制得脂质体溶液，将步骤S3制得的脂肪干细胞外泌体加入脂质体溶液中，孵育，制得外泌体-脂质体溶液；
S5.活性共晶的制备：将二氨基嘧啶氧化物溶于丙二醇中，得到溶液A；将吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物溶于乙腈中，得到溶液B，将2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷溶于乙醇中，得到溶液C；将溶液A、溶液B、溶液C混合均匀，室温静置，挥发溶剂，球磨，制得活性共晶粉；
S6.添加剂的制备：将人参皂苷Rb1、生物素三肽-1、甘草酸二铵混合均匀，制得添加剂；
S7.载药体系的制备：将步骤S5制得的活性共晶粉和步骤S6制得的添加剂混合均匀，加入步骤S4制得的外泌体-脂质体溶液中，超声分散均匀，离心，收集沉淀，获得载药体系；
S8.水提取物的制备：将何首乌、当归分别洗净，干燥，粉碎，制得混合粉，加入水中，加热沸腾提取，过滤，收集固体，滤液干燥，制得水提取物；
S9.发酵产物的制备：将步骤S8中的固体和步骤S2中的脂肪干细胞无细胞培养液混合均匀，灭菌，接种婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液，发酵培养，过滤，滤液冷冻干燥，制得发酵产物；
S10.含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备：将步骤S7制得的载药体系、步骤S8制得的水提取物、步骤S9制得的发酵产物混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述培养基中，蜂王浆的含量为10-20mg/L，所述肝素钠的含量为15-22mg/L，所述胎牛血清的含量为10-12wt%；步骤S2中所述低氧条件下体外培养中，氧气含量为1-3v/v%，所述体外培养的温度为36-38℃。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述加入胰蛋白酶消化的方法为加入0.2-0.3wt%的胰蛋白酶于36-38℃消化3-5min；步骤S4中所述卵磷脂、胆固醇、泊洛沙姆188、脂肪干细胞外泌体的质量比为10-12:5-7:2-4:3-5，所述PBS溶液的pH值为6.9-7.2，所述加热的温度为60-70℃，所述孵育的温度为36-38℃，时间为0.5-1.5h。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述二氨基嘧啶氧化物、吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷的质量比为2-4:1-2:3-5，所述室温静置的时间为4-7天，所述球磨的时间为2-4h；步骤S6中所述人参皂苷Rb1、生物素三肽-1、甘草酸二铵的质量比为2-4:7-10:3-5。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述活性共晶粉、添加剂、外泌体-脂质体溶液的质量比为3-5:1-2:120-150，所述超声的功率为1200-1500W，时间为15-20min；步骤S8中所述何首乌、当归的质量比为7-10:3-5，所述混合粉和水的固液比为1:5-7g/mL，所述加热沸腾提取的时间为2-4h。
作为本发明的进一步改进，步骤S9中所述固体和脂肪干细胞无细胞培养液的质量比为7-10:50-70，所述婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液的含菌量分别为108-109cfu/mL，所述婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液的接种量分别为2-3v/v%和1-2v/v%，所述发酵培养的条件为36-38℃，100-150r/min，发酵培养36-48h；步骤S10中所述载药体系、水提取物、发酵产物的质量比为15-20:3-5:5-7。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.培养基的制备：将蜂王浆、肝素钠加入含有胎牛血清的α-MEM完全培养液中，混合均匀，制得培养基，培养基中，蜂王浆的含量为10-20mg/L，所述肝素钠的含量为15-22mg/L，所述胎牛血清的含量为10-12wt%；
S2.外泌体的刺激分泌：将猪脂肪间充质干细胞用步骤S1制得的培养基重悬细胞，氧气含量为1-3v/v%条件下，36-38℃体外培养，待细胞密度70-80%时，用PBS溶液冲洗细胞，剩余的培养液留用，接种到无血清培养基中，细胞密度为106-107个/mL培养36-60h后，收集细胞，剩余的培养液留用，与之前的培养液合并，制得脂肪干细胞无细胞培养液；
S3.脂肪干细胞外泌体的分离：用PBS溶液冲洗步骤S2获得的细胞，加入0.2-0.3wt%的胰蛋白酶于36-38℃消化3-5min，在2-4℃，将培养基依次在270-320×g离心10-15min，1800-2200×g离心5-10min，8000-12000×g离心25-35min，去除细胞和细胞碎片；继续在98000-102000×g离心60-80min，将底部的沉淀物重悬并用PBS溶液冲洗，最后在98000-102000×g离心60-80min去除外泌体中污染的蛋白质，获得脂肪干细胞外泌体；
S4.外泌体-脂质体的制备：将10-12重量份卵磷脂、5-7重量份胆固醇溶于50重量份乙醇，加入200重量份含2-4重量份泊洛沙姆188的pH值为6.9-7.2的PBS溶液中，加热至60-70℃，搅拌使得乙醇完全挥发，制得脂质体溶液，将3-5重量份步骤S3制得的脂肪干细胞外泌体加入脂质体溶液中，36-38℃孵育0.5-1.5h，制得外泌体-脂质体溶液；
S5.活性共晶的制备：将2-4重量份二氨基嘧啶氧化物溶于20重量份丙二醇中，得到溶液A；将1-2重量份吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物溶于10重量份乙腈中，得到溶液B，将3-5重量份2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷溶于30重量份乙醇中，得到溶液C；将溶液A、溶液B、溶液C混合均匀，室温静置4-7天，挥发溶剂，球磨2-4h，制得活性共晶粉；
S6.添加剂的制备：将2-4重量份人参皂苷Rb1、7-10重量份生物素三肽-1、3-5重量份甘草酸二铵混合均匀，制得添加剂；
S7.载药体系的制备：将3-5重量份步骤S5制得的活性共晶粉和1-2重量份步骤S6制得的添加剂混合均匀，加入120-150重量份步骤S4制得的外泌体-脂质体溶液中，1200-1500W超声分散15-20min，离心，收集沉淀，获得载药体系；
S8.水提取物的制备：将7-10重量份何首乌、3-5重量份当归分别洗净，干燥，粉碎，制得混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:5-7g/mL，加热沸腾提取2-4h，过滤，收集固体，滤液干燥，制得水提取物；
S9.发酵产物的制备：将7-10重量份步骤S8中的固体和50-70重量份步骤S2中的脂肪干细胞无细胞培养液混合均匀，灭菌，接种婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液，接种量分别为2-3v/v%和1-2v/v%，36-38℃，100-150r/min，发酵培养36-48h，过滤，滤液冷冻干燥，制得发酵产物；
所述婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液的含菌量分别为108-109cfu/mL；
S10.含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备：将15-20重量份步骤S7制得的载药体系、3-5重量份步骤S8制得的水提取物、5-7重量份步骤S9制得的发酵产物混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
本发明进一步保护一种上述含干细胞外泌体的防脱生发组合物在制备防脱、生发、育发的产品中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明在培养基中加入蜂王浆和肝素钠，能够很好的促进脂肪干细胞进行外泌体的分泌，同时，在低氧条件下，多效协同，进一步促进干细胞分泌含有更多细胞因子的外泌体，激活低氧诱导因子1α，介导其下游的各类信号通路，刺激脂肪干细胞增殖，促使脂肪干细胞分泌更多的血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等，从而获得了高活性的外泌体。同时，培养基中也含有丰富的细胞因子，获得的脂肪干细胞无细胞培养液不含细胞，免疫原性低，易于携带、转运和保存，为后续发酵过程提供了丰富的营养物质，以及制得的发酵产物中，也含有大量的细胞因子，通过促进皮肤成纤维细胞增殖、迁移，促进皮肤活力，从而提高毛发的生长。
外泌体是干细胞分泌的小分子活性物质，包含了大量的复合生长因子，如包括血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生蛋白、白介素6、微噬菌体集落刺激因子等，可以有效地促进毛发再生。脂肪干细胞外泌体不仅含有丰富的活性因子，同时，将这些活性成分包裹在囊泡结构中，使其免受降解，这些活性因子之间也形成协同作用，通过激活Erk和Akt信号通路来促进毛囊细胞的增殖，也能通过上调细胞周期蛋白D1的表达来调节毛囊细胞的细胞周期，并保护毛囊细胞免受雄激素和活性氧的损害。同时，这些细胞因子可通过外泌体的递送参与到毛发再生的多种机制过程，如通过诱导毛囊周围血管形成来加速毛囊的生长发育并增加头发再生，通过旁分泌激素增加β-catenin的表达进而潜在地促进毛囊生长。此外，在毛发发生人为损伤后，可诱导毛囊新生并促进毛发再生等。因此，脂肪干细胞分泌的外泌体本身具有很好的促进皮肤毛囊毛发生长发育、防脱生发的作用。同时，外泌体也具有良好的安全性、高生物相容性和低免疫原性，可以跨越皮肤屏障，高效递送药物进入毛囊细胞或组织中，不良反应较少，具有很好的透皮作用，但是，其载药量较低、稳定性较差。而脂质体很好的解决了这一问题，脂质体是具有磷脂双分子层的囊泡，载药性能良好、易于制备且稳定性高，因此，本发明将外泌体和脂质体进行混合，制备了一种外泌体-脂质体杂化纳米粒结构，载药量明显提高，稳定性提高，载药透皮吸收效果好，促进了毛囊细胞对活性组分的吸收率，从而大大提高了活性组分的药物活性，具有很好的防脱、生发的效果。
二氨基嘧啶氧化物通过抑制赖氨酸羟化酶mRNA的表达来干扰成纤维细胞产生成熟胶原以及防止成熟胶原沉积，避免其周边毛囊硬化收缩，预防脱发。吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物可有效促进毛乳头细胞的增殖。2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷具有很好的治疗脱发、白发的效果。三者协同作用可通过刺激毛囊再生发，优化头发生长周期，加速新发生长，有效治疗雄激素脱发。
二氨基嘧啶氧化物和吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物的防脱生发效果好，但其透皮吸收困难，且水溶性差，难以直接利用，将三者制备成活性共晶，能够很好的提高产物的溶解度和生物利用度，提高产品的稳定性，更好的使组分之间发挥协同增效的作用。
本发明添加剂包括人参皂苷Rb1、生物素三肽-1、甘草酸二铵，其中，活性肽生物素三肽-1可促进胶原蛋白合成，加固毛囊，防止脱发，促进角蛋白合成，促进头发生长，但是活性肽稳定性差，透皮吸收困难。人参皂苷Rb1可以通过ERK和Akt途径来发挥抗雄激素作用，可通过调节固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白/TGF-β通路抑制特异性蛋白1的表达，增加Bcl-2表达量，从而减少雄激素性脱发样脱发，甘草酸二铵可以减轻毛囊细胞线粒体损伤、空泡样化程度，减少斑秃毛囊炎症细胞的浸润，增强毛母质细胞活性，延长毛囊生长期。
因此，将制得的活性共晶和添加剂混合，用制得的外泌体-脂质体杂化纳米粒进行负载，能够提高组分的溶解性和生物利用度，促进组分的透皮吸收，从而大大提高了活性组分被毛囊细胞吸收和利用的效率，起到了很好的防脱、生发、育发、黑发的效果。
何首乌有养血生发、滋养护发的作用，当归具有活血，减少毛囊细胞空泡化，增加单位视野毛囊数量，改善脱发的效果。本发明将两者经过水提取获得的水提取物，过滤后的固体进一步经过发酵后，得到发酵产物，具有大量的活性物质，平衡促炎和抗炎细胞因子的释放，减轻毛囊炎性反应，缓解毛囊损伤。
本发明制备的含干细胞外泌体的防脱生发组合物能够增加血管内皮细胞的侵袭和迁移，最终促进血管形成，促进皮肤成纤维细胞增殖、迁移，提高毛囊细胞的活力，促进毛发的生长，减少炎症细胞的浸润，增强毛母质细胞活性，延长毛囊生长期，起到很好的防脱、生发、育发、黑发的效果，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
猪脂肪间充质干细胞，购于上海联祖生物科技有限公司；婴儿双歧杆菌，100亿cfu/g，短双歧杆菌，100亿cfu/g，购于中科嘉亿生物工程技术有限公司。胰蛋白酶，20万U/g；购于夏盛（北京）生物科技开发有限公司；二氨基嘧啶氧化物，吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物购于印度Kumar公司。
婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液的制备方法：分别将婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌接种至高氏培养基中，37℃，100r/min，活化培养24h，制得含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液。
实施例1
本实施例提供一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.培养基的制备：将蜂王浆、肝素钠加入含有胎牛血清的α-MEM完全培养液中，混合均匀，制得培养基，培养基中，蜂王浆的含量为10mg/L，所述肝素钠的含量为15mg/L，所述胎牛血清的含量为10wt%；
S2.外泌体的刺激分泌：将猪脂肪间充质干细胞用步骤S1制得的培养基重悬细胞，氧气含量为1v/v%条件下，36℃体外培养，待细胞密度70%时，用PBS溶液冲洗细胞，剩余的培养液留用，接种到无血清培养基中，细胞密度为3×106个/mL培养36h后，收集细胞，剩余的培养液留用，与之前的培养液合并，制得脂肪干细胞无细胞培养液；
S3.脂肪干细胞外泌体的分离：用PBS溶液冲洗步骤S2获得的细胞，加入0.2wt%的胰蛋白酶于36℃消化3min，在2℃，将培养基依次在270×g离心10min，1800×g离心5min，8000×g离心25min，去除细胞和细胞碎片；继续在98000×g离心60min，将底部的沉淀物重悬并用PBS溶液冲洗，最后在98000×g离心60min去除外泌体中污染的蛋白质，获得脂肪干细胞外泌体；
S4.外泌体-脂质体的制备：将10重量份卵磷脂、5重量份胆固醇溶于50重量份乙醇，加入200重量份含2重量份泊洛沙姆188的pH值为6.9的PBS溶液中，加热至60℃，搅拌使得乙醇完全挥发，制得脂质体溶液，将3重量份步骤S3制得的脂肪干细胞外泌体加入脂质体溶液中，36℃孵育0.5h，制得外泌体-脂质体溶液；
S5.活性共晶的制备：将2重量份二氨基嘧啶氧化物溶于20重量份丙二醇中，得到溶液A；将1重量份吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物溶于10重量份乙腈中，得到溶液B，将3重量份2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷溶于30重量份乙醇中，得到溶液C；将溶液A、溶液B、溶液C混合均匀，室温静置4天，挥发溶剂，过滤，洗涤，干燥，球磨2h，制得活性共晶粉；
S6.添加剂的制备：将2重量份人参皂苷Rb1、7重量份生物素三肽-1、3重量份甘草酸二铵混合均匀，制得添加剂；
S7.载药体系的制备：将3重量份步骤S5制得的活性共晶粉和1重量份步骤S6制得的添加剂混合均匀，加入120重量份步骤S4制得的外泌体-脂质体溶液中，1200W超声分散15min，离心，收集沉淀，获得载药体系；
S8.水提取物的制备：将7重量份何首乌、3重量份当归分别洗净，干燥，粉碎，制得混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:5g/mL，加热沸腾提取2h，过滤，收集固体，滤液干燥，制得水提取物；
S9.发酵产物的制备：将7重量份步骤S8中的固体和50重量份步骤S2中的脂肪干细胞无细胞培养液混合均匀，灭菌，接种婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液，接种量分别为2v/v%和1v/v%，36℃，100r/min，发酵培养36h，过滤，滤液冷冻干燥，制得发酵产物；
S10.含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备：将15重量份步骤S7制得的载药体系、3重量份步骤S8制得的水提取物、5重量份步骤S9制得的发酵产物混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
实施例2
本实施例提供一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.培养基的制备：将蜂王浆、肝素钠加入含有胎牛血清的α-MEM完全培养液中，混合均匀，制得培养基，培养基中，蜂王浆的含量为20mg/L，所述肝素钠的含量为22mg/L，所述胎牛血清的含量为12wt%；
S2.外泌体的刺激分泌：将猪脂肪间充质干细胞用步骤S1制得的培养基重悬细胞，氧气含量为3v/v%条件下，38℃体外培养，待细胞密度80%时，用PBS溶液冲洗细胞，剩余的培养液留用，接种到无血清培养基中，细胞密度为1×106个/mL培养60h后，收集细胞，剩余的培养液留用，与之前的培养液合并，制得脂肪干细胞无细胞培养液；
S3.脂肪干细胞外泌体的分离：用PBS溶液冲洗步骤S2获得的细胞，加入0.3wt%的胰蛋白酶于38℃消化5min，在4℃，将培养基依次在320×g离心15min，2200×g离心10min，12000×g离心35min，去除细胞和细胞碎片；继续在102000×g离心80min，将底部的沉淀物重悬并用PBS溶液冲洗，最后在102000×g离心80min去除外泌体中污染的蛋白质，获得脂肪干细胞外泌体；
S4.外泌体-脂质体的制备：将12重量份卵磷脂、7重量份胆固醇溶于50重量份乙醇，加入200重量份含4重量份泊洛沙姆188的pH值为7.2的PBS溶液中，加热至70℃，搅拌使得乙醇完全挥发，制得脂质体溶液，将5重量份步骤S3制得的脂肪干细胞外泌体加入脂质体溶液中，38℃孵育1.5h，制得外泌体-脂质体溶液；
S5.活性共晶的制备：将4重量份二氨基嘧啶氧化物溶于20重量份丙二醇中，得到溶液A；将2重量份吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物溶于10重量份乙腈中，得到溶液B，将5重量份2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷溶于30重量份乙醇中，得到溶液C；将溶液A、溶液B、溶液C混合均匀，室温静置7天，挥发溶剂，过滤，洗涤，干燥，球磨4h，制得活性共晶粉；
S6.添加剂的制备：将4重量份人参皂苷Rb1、10重量份生物素三肽-1、5重量份甘草酸二铵混合均匀，制得添加剂；
S7.载药体系的制备：将5重量份步骤S5制得的活性共晶粉和2重量份步骤S6制得的添加剂混合均匀，加入150重量份步骤S4制得的外泌体-脂质体溶液中，1500W超声分散20min，离心，收集沉淀，获得载药体系；
S8.水提取物的制备：将10重量份何首乌、5重量份当归分别洗净，干燥，粉碎，制得混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:7g/mL，加热沸腾提取4h，过滤，收集固体，滤液干燥，制得水提取物；
S9.发酵产物的制备：将10重量份步骤S8中的固体和70重量份步骤S2中的脂肪干细胞无细胞培养液混合均匀，灭菌，接种婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液，接种量分别为3v/v%和2v/v%，38℃，150r/min，发酵培养48h，过滤，滤液冷冻干燥，制得发酵产物；
S10.含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备：将20重量份步骤S7制得的载药体系、5重量份步骤S8制得的水提取物、7重量份步骤S9制得的发酵产物混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
实施例3
本实施例提供一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.培养基的制备：将蜂王浆、肝素钠加入含有胎牛血清的α-MEM完全培养液中，混合均匀，制得培养基，培养基中，蜂王浆的含量为15mg/L，所述肝素钠的含量为20mg/L，所述胎牛血清的含量为11wt%；
S2.外泌体的刺激分泌：将猪脂肪间充质干细胞用步骤S1制得的培养基重悬细胞，氧气含量为2v/v%条件下，37℃体外培养，待细胞密度75%时，用PBS溶液冲洗细胞，剩余的培养液留用，接种到无血清培养基中，细胞密度为2×106个/mL培养48h后，收集细胞，剩余的培养液留用，与之前的培养液合并，制得脂肪干细胞无细胞培养液；
S3.脂肪干细胞外泌体的分离：用PBS溶液冲洗步骤S2获得的细胞，加入0.25wt%的胰蛋白酶于37℃消化4min，在3℃，将培养基依次在300×g离心12min，2000×g离心7min，10000×g离心30min，去除细胞和细胞碎片；继续在100000×g离心70min，将底部的沉淀物重悬并用PBS溶液冲洗，最后在100000×g离心70min去除外泌体中污染的蛋白质，获得脂肪干细胞外泌体；
S4.外泌体-脂质体的制备：将11重量份卵磷脂、6重量份胆固醇溶于50重量份乙醇，加入200重量份含3重量份泊洛沙姆188的pH值为7的PBS溶液中，加热至65℃，搅拌使得乙醇完全挥发，制得脂质体溶液，将4重量份步骤S3制得的脂肪干细胞外泌体加入脂质体溶液中，37℃孵育1h，制得外泌体-脂质体溶液；
S5.活性共晶的制备：将3重量份二氨基嘧啶氧化物溶于20重量份丙二醇中，得到溶液A；将1.5重量份吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物溶于10重量份乙腈中，得到溶液B，将4重量份2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷溶于30重量份乙醇中，得到溶液C；将溶液A、溶液B、溶液C混合均匀，室温静置6天，挥发溶剂，过滤，洗涤，干燥，球磨3h，制得活性共晶粉；
S6.添加剂的制备：将3重量份人参皂苷Rb1、8.5重量份生物素三肽-1、4重量份甘草酸二铵混合均匀，制得添加剂；
S7.载药体系的制备：将4重量份步骤S5制得的活性共晶粉和1.5重量份步骤S6制得的添加剂混合均匀，加入135重量份步骤S4制得的外泌体-脂质体溶液中，1350W超声分散17min，离心，收集沉淀，获得载药体系；
S8.水提取物的制备：将8.5重量份何首乌、4重量份当归分别洗净，干燥，粉碎，制得混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:6g/mL，加热沸腾提取3h，过滤，收集固体，滤液干燥，制得水提取物；
S9.发酵产物的制备：将8.5重量份步骤S8中的固体和60重量份步骤S2中的脂肪干细胞无细胞培养液混合均匀，灭菌，接种婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液，接种量分别为2.5v/v%和1.5v/v%，37℃，120r/min，发酵培养42h，过滤，滤液冷冻干燥，制得发酵产物；
S10.含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备：将17重量份步骤S7制得的载药体系、4重量份步骤S8制得的水提取物、6重量份步骤S9制得的发酵产物混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加蜂王浆。
具体如下：
S1.培养基的制备：将肝素钠加入含有胎牛血清的α-MEM完全培养液中，混合均匀，制得培养基，培养基中，肝素钠的含量为35mg/L，所述胎牛血清的含量为11wt%。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加肝素钠。
具体如下：
S1.培养基的制备：将蜂王浆加入含有胎牛血清的α-MEM完全培养液中，混合均匀，制得培养基，培养基中，蜂王浆的含量为35mg/L，所述胎牛血清的含量为11wt%。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S2中氧气含量为空气正常含量，具体为21v/v%。
具体如下：
S2.外泌体的刺激分泌：将猪脂肪间充质干细胞用步骤S1制得的培养基重悬细胞，空气条件下，37℃体外培养，待细胞密度75%时，用PBS溶液冲洗细胞，剩余的培养液留用，接种到无血清培养基中，细胞密度为2×106个/mL培养48h后，收集细胞，剩余的培养液留用，与之前的培养液合并，制得脂肪干细胞无细胞培养液。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S4。
具体如下：
S1.培养基的制备：将蜂王浆、肝素钠加入含有胎牛血清的α-MEM完全培养液中，混合均匀，制得培养基，培养基中，蜂王浆的含量为15mg/L，所述肝素钠的含量为20mg/L，所述胎牛血清的含量为11wt%；
S2.外泌体的刺激分泌：将猪脂肪间充质干细胞用步骤S1制得的培养基重悬细胞，氧气含量为2v/v%条件下，37℃体外培养，待细胞密度75%时，用PBS溶液冲洗细胞，剩余的培养液留用，接种到无血清培养基中，细胞密度为2×106个/mL培养48h后，收集细胞，剩余的培养液留用，与之前的培养液合并，制得脂肪干细胞无细胞培养液；
S3.脂肪干细胞外泌体的分离：用PBS溶液冲洗步骤S2获得的细胞，加入0.25wt%的胰蛋白酶于37℃消化4min，在3℃，将培养基依次在300×g离心12min，2000×g离心7min，10000×g离心30min，去除细胞和细胞碎片；继续在100000×g离心70min，将底部的沉淀物重悬并用PBS溶液冲洗，最后在100000×g离心70min去除外泌体中污染的蛋白质，获得脂肪干细胞外泌体；
S4.活性共晶的制备：将3重量份二氨基嘧啶氧化物溶于20重量份丙二醇中，得到溶液A；将1.5重量份吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物溶于10重量份乙腈中，得到溶液B，将4重量份2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷溶于30重量份乙醇中，得到溶液C；将溶液A、溶液B、溶液C混合均匀，室温静置6天，挥发溶剂，过滤，洗涤，干燥，球磨3h，制得活性共晶粉；
S5.添加剂的制备：将3重量份人参皂苷Rb1、8.5重量份生物素三肽-1、4重量份甘草酸二铵混合均匀，制得添加剂；
S6.载药体系的制备：将4重量份步骤S4制得的活性共晶粉和1.5重量份步骤S5制得的添加剂混合均匀，加入5重量份步骤S3制得的脂肪干细胞外泌体，加入130重量份去离子水中，1350W超声分散17min，离心，收集沉淀，获得载药体系；
S7.水提取物的制备：将8.5重量份何首乌、4重量份当归分别洗净，干燥，粉碎，制得混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:6g/mL，加热沸腾提取3h，过滤，收集固体，滤液干燥，制得水提取物；
S8.发酵产物的制备：将8.5重量份步骤S7中的固体和60重量份步骤S2中的脂肪干细胞无细胞培养液混合均匀，灭菌，接种婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液，接种量分别为2.5v/v%和1.5v/v%，37℃，120r/min，发酵培养42h，过滤，滤液冷冻干燥，制得发酵产物；
S9.含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备：将17重量份步骤S6制得的载药体系、4重量份步骤S7制得的水提取物、6重量份步骤S8制得的发酵产物混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加二氨基嘧啶氧化物。
具体如下：
S5.活性共晶的制备：将1.5重量份吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物溶于10重量份乙腈中，得到溶液B，将4重量份2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷溶于30重量份乙醇中，得到溶液C；将溶液B、溶液C混合均匀，室温静置6天，挥发溶剂，过滤，洗涤，干燥，球磨3h，制得活性共晶粉。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物。
具体如下：
S5.活性共晶的制备：将3重量份二氨基嘧啶氧化物溶于20重量份丙二醇中，得到溶液A；将4重量份2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷溶于30重量份乙醇中，得到溶液C；将溶液A、溶液C混合均匀，室温静置6天，挥发溶剂，过滤，洗涤，干燥，球磨3h，制得活性共晶粉。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷。
具体如下：
S5.活性共晶的制备：将3重量份二氨基嘧啶氧化物溶于20重量份丙二醇中，得到溶液A；将1.5重量份吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物溶于10重量份乙腈中，得到溶液B，将溶液A、溶液B混合均匀，室温静置6天，挥发溶剂，过滤，洗涤，干燥，球磨3h，制得活性共晶粉。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加活性共晶粉。
具体如下：
S7.载药体系的制备：将5.5重量份步骤S6制得的添加剂加入135重量份步骤S4制得的外泌体-脂质体溶液中，1350W超声分散17min，离心，收集沉淀，获得载药体系。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加添加剂。
具体如下：
S7.载药体系的制备：将5.5重量份步骤S5制得的活性共晶粉加入135重量份步骤S4制得的外泌体-脂质体溶液中，1350W超声分散17min，离心，收集沉淀，获得载药体系。
对比例10
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S9中脂肪干细胞无细胞培养液由等量的去离子水替代。
具体如下：
S9.发酵产物的制备：将8.5重量份步骤S8中的固体和60重量份去离子水混合均匀，灭菌，接种婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液，接种量分别为2.5v/v%和1.5v/v%，37℃，120r/min，发酵培养42h，过滤，滤液冷冻干燥，制得发酵产物。
对比例11
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加载药体系。
具体如下：
S10.含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备：将4重量份步骤S8制得的水提取物、6重量份步骤S9制得的发酵产物混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
对比例12
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加发酵产物。
具体如下：
S10.含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备：将17重量份步骤S7制得的载药体系、4重量份步骤S8制得的水提取物混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
测试例1
1、细胞存活率的影响
取对数生长期的HaCaT与HUVEC细胞，胰酶消化后制备细胞悬液，细胞计数后，按每孔3000个细胞接种于96孔板，于5v/v%CO2、37℃孵育24h。细胞贴壁后分为空白组、实施例1-3组、4-过氧化氢环磷酰胺组、实施例1-3或对比例1-12+4-过氧化氢环磷酰胺组。其中，每孔含干细胞外泌体的防脱生发组合物的浓度为10μg/mL，4-过氧化氢环磷酰胺的浓度为30μmol/L。干预24h后通过CCK-8法检测细胞存活率，以空白组的细胞存活率为100%。结果见表1。
表1
由上表可知，本发明实施例1-3制得的干细胞外泌体的防脱生发组合物能明显提高HaCaT与HUVEC细胞的存活率，4-过氧化氢环磷酰胺明显降低细胞存活率，而本发明实施例1-3制得的干细胞外泌体的防脱生发组合物可以促进细胞增殖，逆转化疗药物所造成的细胞存活率的下降。
2、对细胞迁移的影响
取对数生长期的HaCaT与HUVEC细胞，胰酶消化后制备细胞悬液，按每孔5×105个细胞接种于6孔板，于5v/v%CO2、37℃中孵育。细胞贴壁且细胞密度达到80%-90%时，在各孔上方使用无菌枪头，沿各孔中线匀速以相同力度在单细胞层上划痕。以无血清培养基洗涤细胞层以去除脱落细胞，将细胞分为空白组、实施例1-3组、4-过氧化氢环磷酰胺组、实施例1-3或对比例1-12+4-过氧化氢环磷酰胺组，其中，每孔含干细胞外泌体的防脱生发组合物的浓度为10μg/mL，4-过氧化氢环磷酰胺的浓度为30μmol/L。干预48h。分别在划痕后0h和48h观察细胞划痕的愈合情况。结果见表2。
表2
由上表可知，本发明实施例1-3制得的干细胞外泌体的防脱生发组合物能明显提高HaCaT与HUVEC细胞的迁移率，4-过氧化氢环磷酰胺组与空白组相比，细胞迁移率明显下降，本发明实施例1-3制得的干细胞外泌体的防脱生发组合物可逆转化疗药物所造成的细胞迁移率的下降。
测试例2
将SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、实施例1-3组、对比例1-12组，每组5只。异氟烷麻醉后，脱去小鼠被毛，脱毛区域为2cm×3cm。将DHT溶于玉米油中，配置成10mg/ml的双氢睾酮溶液，除空白组外，其余组别小鼠连续17d腹腔注射0.1mL，建立脂溢性脱发模型。阳性对照组在脱毛区域外用5%米诺地尔0.5mg，每天2次；实施例1-3组、对比例1-12组在脱毛区域每次涂覆含干细胞外泌体的防脱生发组合物0.5mg，每天2次；空白组、模型组涂覆等量的生理盐水。17d后观察各组小鼠的毛发生长情况，然后处死小鼠取皮肤组织做HE染色，计算毛囊数量。结果见表3。
表3
注释：为与空白组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。
由上表可知，涂覆本发明实施例1-3制得的干细胞外泌体的防脱生发组合物能够明显提高皮肤毛囊数量，促进毛发生长，促进毛发增粗。
对比例1、2与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加蜂王浆或肝素钠。对比例3与实施例3相比，不同之处在于，步骤S2中氧气含量为空气正常含量，具体为21v/v%。细胞迁移率下降，毛囊数目下降，新生毛发长度下降。本发明在培养基中加入蜂王浆和肝素钠，能够很好的促进脂肪干细胞进行外泌体的分泌，同时，在低氧条件下，多效协同，进一步促进干细胞分泌含有更多细胞因子的外泌体，激活低氧诱导因子1α，介导其下游的各类信号通路，刺激脂肪干细胞增殖，促使脂肪干细胞分泌更多的血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等，从而获得了高活性的外泌体。
对比例4与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S4。细胞存活率下降，细胞迁移率下降，毛囊数目下降，新生毛发长度下降、新生毛发直径下降。将制得的活性共晶和添加剂混合，用制得的外泌体-脂质体杂化纳米粒进行负载，能够提高组分的溶解性和生物利用度，促进组分的透皮吸收，从而大大提高了活性组分被毛囊细胞吸收和利用的效率，起到了很好的防脱、生发、育发、黑发的效果。
对比例5、6、7与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加二氨基嘧啶氧化物、吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物或2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷。对比例8与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加活性共晶粉。毛囊数目下降，新生毛发长度下降、新生毛发直径下降。二氨基嘧啶氧化物通过抑制赖氨酸羟化酶mRNA的表达来干扰成纤维细胞产生成熟胶原以及防止成熟胶原沉积，避免其周边毛囊硬化收缩，预防脱发。吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物可有效促进毛乳头细胞的增殖。2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷具有很好的治疗脱发、白发的效果。三者协同作用可通过刺激毛囊再生发，优化头发生长周期，加速新发生长，有效治疗雄激素脱发。二氨基嘧啶氧化物和吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物的防脱生发效果好，但其透皮吸收困难，且水溶性差，难以直接利用，将三者制备成活性共晶，能够很好的提高产物的溶解度和生物利用度，提高产品的稳定性，更好的使组分之间发挥协同增效的作用。
对比例9与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加添加剂。毛囊数目下降，新生毛发长度下降、新生毛发直径下降。本发明添加剂包括人参皂苷Rb1、生物素三肽-1、甘草酸二铵，其中，活性肽生物素三肽-1可促进胶原蛋白合成，加固毛囊，防止脱发，促进角蛋白合成，促进头发生长，但是活性肽稳定性差，透皮吸收困难。人参皂苷Rb1可以通过ERK和Akt途径来发挥抗雄激素作用，可通过调节固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白/TGF-β通路抑制特异性蛋白1的表达，增加Bcl-2表达量，从而减少雄激素性脱发样脱发，甘草酸二铵可以减轻毛囊细胞线粒体损伤、空泡样化程度，减少斑秃毛囊炎症细胞的浸润，增强毛母质细胞活性，延长毛囊生长期。
对比例10与实施例3相比，不同之处在于，步骤S9中脂肪干细胞无细胞培养液由等量的去离子水替代。对比例12与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加发酵产物。细胞存活率下降，细胞迁移率下降，毛囊数目下降，新生毛发长度下降、新生毛发直径下降。本发明培养基中含有丰富的细胞因子，获得的脂肪干细胞无细胞培养液不含细胞，免疫原性低，易于携带、转运和保存，为后续发酵过程提供了丰富的营养物质，以及制得的发酵产物中，也含有大量的细胞因子，通过促进皮肤成纤维细胞增殖、迁移，促进皮肤活力，从而提高毛发的生长。何首乌有养血生发、滋养护发的作用，当归具有活血，减少毛囊细胞空泡化，增加单位视野毛囊数量，改善脱发的效果。本发明将两者经过水提取获得的水提取物，过滤后的固体进一步经过发酵后，得到发酵产物，具有大量的活性物质，平衡促炎和抗炎细胞因子的释放，减轻毛囊炎性反应，缓解毛囊损伤。
对比例11与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加载药体系。细胞存活率下降，细胞迁移率下降，毛囊数目下降，新生毛发长度下降、新生毛发直径下降。外泌体是干细胞分泌的小分子活性物质，包含了大量的复合生长因子，如包括血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生蛋白、白介素6、微噬菌体集落刺激因子等，可以有效地促进毛发再生。脂肪干细胞外泌体不仅含有丰富的活性因子，同时，将这些活性成分包裹在囊泡结构中，使其免受降解，这些活性因子之间也形成协同作用，通过激活Erk和Akt信号通路来促进毛囊细胞的增殖，也能通过上调细胞周期蛋白D1的表达来调节毛囊细胞的细胞周期，并保护毛囊细胞免受雄激素和活性氧的损害。同时，这些细胞因子可通过外泌体的递送参与到毛发再生的多种机制过程，如通过诱导毛囊周围血管形成来加速毛囊的生长发育并增加头发再生，通过旁分泌激素增加β-catenin的表达进而潜在地促进毛囊生长。此外，在毛发发生人为损伤后，可诱导毛囊新生并促进毛发再生等。因此，脂肪干细胞分泌的外泌体本身具有很好的促进皮肤毛囊毛发生长发育、防脱生发的作用。同时，外泌体也具有良好的安全性、高生物相容性和低免疫原性，可以跨越皮肤屏障，高效递送药物进入毛囊细胞或组织中，不良反应较少，具有很好的透皮作用，但是，其载药量较低、稳定性较差。而脂质体很好的解决了这一问题，脂质体是具有磷脂双分子层的囊泡，载药性能良好、易于制备且稳定性高，因此，本发明将外泌体和脂质体进行混合，制备了一种外泌体-脂质体杂化纳米粒结构，载药量明显提高，稳定性提高，载药透皮吸收效果好，促进了毛囊细胞对活性组分的吸收率，从而大大提高了活性组分的药物活性，具有很好的防脱、生发的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.培养基的制备：将蜂王浆、肝素钠加入含有胎牛血清的α-MEM完全培养液中，混合均匀，制得培养基；所述培养基中，蜂王浆的含量为10-20mg/L，所述肝素钠的含量为15-22mg/L，所述胎牛血清的含量为10-12wt%；
S2.外泌体的刺激分泌：将猪脂肪间充质干细胞用步骤S1制得的培养基重悬细胞，低氧条件下体外培养，待细胞密度70-80%时，用PBS溶液冲洗细胞，剩余的培养液留用，接种到无血清培养基中培养36-60h后，收集细胞，剩余的培养液留用，与之前的培养液合并，制得脂肪干细胞无细胞培养液；所述低氧条件下体外培养中，氧气含量为1-3v/v%，所述体外培养的温度为36-38℃；
S3.脂肪干细胞外泌体的分离：用PBS溶液冲洗步骤S2获得的细胞，加入胰蛋白酶消化，在2-4℃，将培养基依次在270-320×g离心10-15min，1800-2200×g离心5-10min，8000-12000×g离心25-35min，去除细胞和细胞碎片；继续在98000-102000×g离心60-80min，将底部的沉淀物重悬并用PBS溶液冲洗，最后在98000-102000×g离心60-80min去除外泌体中污染的蛋白质，获得脂肪干细胞外泌体；
S4.外泌体-脂质体的制备：将卵磷脂、胆固醇溶于乙醇，加入泊洛沙姆188的PBS溶液中，加热搅拌，使得乙醇完全挥发，制得脂质体溶液，将步骤S3制得的脂肪干细胞外泌体加入脂质体溶液中，孵育，制得外泌体-脂质体溶液；
S5.活性共晶的制备：将二氨基嘧啶氧化物溶于丙二醇中，得到溶液A；将吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物溶于乙腈中，得到溶液B，将2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷溶于乙醇中，得到溶液C；将溶液A、溶液B、溶液C混合均匀，室温静置，挥发溶剂，球磨，制得活性共晶粉；所述二氨基嘧啶氧化物、吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷的质量比为2-4:1-2:3-5；
S6.添加剂的制备：将人参皂苷Rb1、生物素三肽-1、甘草酸二铵混合均匀，制得添加剂；所述人参皂苷Rb1、生物素三肽-1、甘草酸二铵的质量比为2-4:7-10:3-5；
S7.载药体系的制备：将步骤S5制得的活性共晶粉和步骤S6制得的添加剂混合均匀，加入步骤S4制得的外泌体-脂质体溶液中，超声分散均匀，离心，收集沉淀，获得载药体系；所述活性共晶粉、添加剂、外泌体-脂质体溶液的质量比为3-5:1-2:120-150；
S8.水提取物的制备：将何首乌、当归分别洗净，干燥，粉碎，制得混合粉，加入水中，加热沸腾提取，过滤，收集固体，滤液干燥，制得水提取物；所述何首乌、当归的质量比为7-10:3-5；
S9.发酵产物的制备：将步骤S8中的固体和步骤S2中的脂肪干细胞无细胞培养液混合均匀，灭菌，接种婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液，发酵培养，过滤，滤液冷冻干燥，制得发酵产物；所述固体和脂肪干细胞无细胞培养液的质量比为7-10:50-70；
S10.含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备：将步骤S7制得的载药体系、步骤S8制得的水提取物、步骤S9制得的发酵产物混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述加入胰蛋白酶消化的方法为加入0.2-0.3wt%的胰蛋白酶于36-38℃消化3-5min；步骤S4中所述卵磷脂、胆固醇、泊洛沙姆188、脂肪干细胞外泌体的质量比为10-12:5-7:2-4:3-5，所述PBS溶液的pH值为6.9-7.2，所述加热的温度为60-70℃，所述孵育的温度为36-38℃，时间为0.5-1.5h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述室温静置的时间为4-7天，所述球磨的时间为2-4h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中所述超声的功率为1200-1500W，时间为15-20min；步骤S8中所述混合粉和水的固液比为1:5-7g/mL，所述加热沸腾提取的时间为2-4h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S9中所述婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液的含菌量分别为108-109cfu/mL，所述婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液的接种量分别为2-3v/v%和1-2v/v%，所述发酵培养的条件为36-38℃，100-150r/min，发酵培养36-48h；步骤S10中所述载药体系、水提取物、发酵产物的质量比为15-20:3-5:5-7。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.培养基的制备：将蜂王浆、肝素钠加入含有胎牛血清的α-MEM完全培养液中，混合均匀，制得培养基，培养基中，蜂王浆的含量为10-20mg/L，所述肝素钠的含量为15-22mg/L，所述胎牛血清的含量为10-12wt%；
S2.外泌体的刺激分泌：将猪脂肪间充质干细胞用步骤S1制得的培养基重悬细胞，氧气含量为1-3v/v%条件下，36-38℃体外培养，待细胞密度70-80%时，用PBS溶液冲洗细胞，剩余的培养液留用，接种到无血清培养基中，细胞密度为106-107个/mL培养36-60h后，收集细胞，剩余的培养液留用，与之前的培养液合并，制得脂肪干细胞无细胞培养液；
S3.脂肪干细胞外泌体的分离：用PBS溶液冲洗步骤S2获得的细胞，加入0.2-0.3wt%的胰蛋白酶于36-38℃消化3-5min，在2-4℃，将培养基依次在270-320×g离心10-15min，1800-2200×g离心5-10min，8000-12000×g离心25-35min，去除细胞和细胞碎片；继续在98000-102000×g离心60-80min，将底部的沉淀物重悬并用PBS溶液冲洗，最后在98000-102000×g离心60-80min去除外泌体中污染的蛋白质，获得脂肪干细胞外泌体；
S4.外泌体-脂质体的制备：将10-12重量份卵磷脂、5-7重量份胆固醇溶于50重量份乙醇，加入200重量份含2-4重量份泊洛沙姆188的pH值为6.9-7.2的PBS溶液中，加热至60-70℃，搅拌使得乙醇完全挥发，制得脂质体溶液，将3-5重量份步骤S3制得的脂肪干细胞外泌体加入脂质体溶液中，36-38℃孵育0.5-1.5h，制得外泌体-脂质体溶液；
S5.活性共晶的制备：将2-4重量份二氨基嘧啶氧化物溶于20重量份丙二醇中，得到溶液A；将1-2重量份吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物溶于10重量份乙腈中，得到溶液B，将3-5重量份2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯葡萄苷溶于30重量份乙醇中，得到溶液C；将溶液A、溶液B、溶液C混合均匀，室温静置4-7天，挥发溶剂，球磨2-4h，制得活性共晶粉；
S6.添加剂的制备：将2-4重量份人参皂苷Rb1、7-10重量份生物素三肽-1、3-5重量份甘草酸二铵混合均匀，制得添加剂；
S7.载药体系的制备：将3-5重量份步骤S5制得的活性共晶粉和1-2重量份步骤S6制得的添加剂混合均匀，加入120-150重量份步骤S4制得的外泌体-脂质体溶液中，1200-1500W超声分散15-20min，离心，收集沉淀，获得载药体系；
S8.水提取物的制备：将7-10重量份何首乌、3-5重量份当归分别洗净，干燥，粉碎，制得混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:5-7g/mL，加热沸腾提取2-4h，过滤，收集固体，滤液干燥，制得水提取物；
S9.发酵产物的制备：将7-10重量份步骤S8中的固体和50-70重量份步骤S2中的脂肪干细胞无细胞培养液混合均匀，灭菌，接种婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液，接种量分别为2-3v/v%和1-2v/v%，36-38℃，100-150r/min，发酵培养36-48h，过滤，滤液冷冻干燥，制得发酵产物；所述婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌种种子液的含菌量分别为108-109cfu/mL；
S10.含干细胞外泌体的防脱生发组合物的制备：将15-20重量份步骤S7制得的载药体系、3-5重量份步骤S8制得的水提取物、5-7重量份步骤S9制得的发酵产物混合均匀，制得含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的含干细胞外泌体的防脱生发组合物。
8.一种如权利要求7所述含干细胞外泌体的防脱生发组合物在制备防脱、生发、育发的产品中的应用。
CN202311754116.XA 2023-12-20 2023-12-20 一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法 Active CN117427144B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311754116.XA CN117427144B (zh) 2023-12-20 2023-12-20 一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311754116.XA CN117427144B (zh) 2023-12-20 2023-12-20 一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117427144A CN117427144A (zh) 2024-01-23
CN117427144B true CN117427144B (zh) 2024-03-01

Family

ID=89553816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311754116.XA Active CN117427144B (zh) 2023-12-20 2023-12-20 一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117427144B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170020244A (ko) * 2015-08-12 2017-02-22 (주)프로스테믹스 줄기세포의 분화 촉진 및 세포의 증식 촉진용 조성물과 그 제조방법
CN107550749A (zh) * 2017-10-15 2018-01-09 广州汀兰生物科技有限公司 一种生发组合物及其应用
CN114699446A (zh) * 2022-04-29 2022-07-05 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 一种用于治疗脱发的外泌体复合液及其制备方法
CN115227646A (zh) * 2022-09-02 2022-10-25 北京达济康华生物科技有限责任公司 一种干细胞外泌体生发因子的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170020244A (ko) * 2015-08-12 2017-02-22 (주)프로스테믹스 줄기세포의 분화 촉진 및 세포의 증식 촉진용 조성물과 그 제조방법
CN107550749A (zh) * 2017-10-15 2018-01-09 广州汀兰生物科技有限公司 一种生发组合物及其应用
CN114699446A (zh) * 2022-04-29 2022-07-05 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 一种用于治疗脱发的外泌体复合液及其制备方法
CN115227646A (zh) * 2022-09-02 2022-10-25 北京达济康华生物科技有限责任公司 一种干细胞外泌体生发因子的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adipose-Derived Stem Cell Exosomes Antagonize the Inhibitory Effect of Dihydrotestosterone on Hair Follicle Growth by Activating Wnt/β-Catenin Pathway;Xin Tang等;《Stem Cells International》;20230927;第1-20页 *
吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物/ 腺苷/ 活性肽复合纳米脂质体 促毛发生长研究;罗丹等;《香料香精化妆品》;20201130;第6卷;第13-18页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117427144A (zh) 2024-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3189828B1 (en) Composition for differentiation induction of adipocyte containing stem cell-derived exosome, regeneration of adipose tissue, and skin whitening or wrinkle improvement
CN114699446A (zh) 一种用于治疗脱发的外泌体复合液及其制备方法
CN114306432B (zh) 一种具有防脱生发功能的植物外泌体组合物及其制备方法
CN111202749A (zh) 一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法
WO2016182225A1 (ko) 탈모방지 및 모발성장 조성물
CN110638833A (zh) 促进毛发生长的组合物及其使用方法
CN115282065A (zh) 一种含间充质干细胞外泌体的冻干粉及其制备方法和应用
CN117427144B (zh) 一种含干细胞外泌体的防脱生发组合物及其制备方法
CN113842398B (zh) 一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶、给药方法和应用
JP2019026573A (ja) 育毛剤
JP2020164473A (ja) 歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清とを含む育毛剤およびその製造方法
CN113957040A (zh) 一种脂肪干细胞生长因子提取物及其制备方法和应用
CN110934891A (zh) 一种毛囊干细胞冻干粉剂及制备方法及应用
CN110538123A (zh) 一种美白祛斑的中药复方提取液的制备工艺及其应用
CN118291375A (zh) 一种细胞修复蛋白提取物及其制备方法和其应用
CN111544373A (zh) 一种含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液及其制备方法
CN111939191B (zh) 一种促毛囊周围血管生成和/或促毛发生长的组合物及应用
CN103751769A (zh) 一种冻干重组人生长激素胶囊及其制备方法
CN114432372A (zh) 一种治疗女性脱发的植物组合物的制备方法、以及其应用
CN112656817A (zh) 一种干细胞制剂及其在制备治疗肝损伤药物中的应用
CN110227058A (zh) 多效因子组合物及其制备方法和应用
CN111135195A (zh) 一种可延缓女性阴道肌肉功能退化的干细胞活性因子组合物的制备方法
CN110200863A (zh) 一种医用修复型面膜及其制备方法
CN117243885B (zh) 一种改善皮肤的干细胞外泌体组合物及其制备方法
CN114886925B (zh) 羊胎盘提取物在制备预防或治疗癌症恶病质药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant