KR20060060346A - 피부 진피로부터 신경전구세포를 유도하는 방법 및 중추또는 말초 신경계 손상 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 진피세포를 본 발명의 특정 배양조건으로 배양하여 신경전구세포로 유도하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻어진 신경전구세포를 유효성분으로서 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 또는 세포 치료제를 제공한다.

진피, 신경전구세포, 중추신경 손상 치료제

Description

피부 진피로부터 신경전구세포를 유도하는 방법 및 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제{Method for inducing neural precursor cells from skin dermis and therapeutic agent for treating damaged tissue of central or peripheral nerve system}

도 1은 진피 섬유아세포(HDF)를 실시예 1의 방법으로 스텝 II와 스텝 III 배양할 때 세포의 형태와 세포수의 증가, 스피어(spheres)의 형성을 보여주는 위상차 현미경 사진이다.

도 2는 스텝 IV에서 자라는 스피어의 형태와 이로부터 뻗어 나온 세포들을 보여주는 위상차 현미경 사진이다.

도 3은 스텝 III에서 26일까지 계속하여 배양한 결과를 보여주는 위상차 현미경 사진이다.

도 4는 스피어로부터 뻗어나오는 세포를 X100로 보여주는 위상차 현미경 사진이다.

도 5는 각 단계에서 배양한 세포들을 면역형광염색과 PCR 방법으로 네스틴 발현량의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 스텝 II를 거쳐 스텝 III에서 배양한 세포들이 면역형광염색 결과 가장 많은(약 80%) 네스틴 발현을 나타냈다.

도 6은 HDF의 스텝 III에서의 네스틴의 발현과 일차 진피 세포(primary dermal cells)에서 βIII-튜불린, 비멘틴의 발현을 나타낸 것이다.

도 7은 스텝 II와 스텝 III를 거친 인간 중간엽줄기세포(human mesenchymal stem cell)와 피부 각질세포에서 네스틴의 발현을 면역형광염색을 통하여 본 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 스텝 III에서 HDF에 bFGF와 라미닌을 병행 또는 각각 첨가하여 배양한 결과를 4일째 위상차현미경으로 보고 네스틴발현을 면역형광염색법으로 확인한 사진이다.

도 9는 스텝 IV에서 배양접시 바닥에 붙은 세포들을 퍼옥시다제 기질 키트 DAB(Peroxidase substrate kit DAB) 염색을 통하여 네스틴, 비멘틴, βIII-튜불린, A2B5, p75, O4, NF-68, GFAP 의 발현을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 스텝 IV에서 스피어를 파라핀 절편을 만들어 DAB염색을 통하여 네스틴, 비멘틴, βIII-튜불린, A2B5, p75, O4, NF-68, GFAP 의 발현을 관찰하였다.

도 11a 및 도 11b는 스텝 IV에서 37일간 배양한 후 바닥에 붙은 세포들을 DAB염색을 통하여 네스틴, A2B5, βIII-튜불린, 비멘틴, MAP2, Tau, NF-150, O4의 발현을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 신경세포로의 분화를 유도하기 위해 스텝 III를 지난 세포들에 스텝 II 배양액에 포스콜린(Forskolin) + 레티노산, NGF, 물질-P를 병합 또는 각각 처리하여 24일간 배양한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 피부 진피세포를 본 발명의 특정 배양조건으로 배양하여 신경전구세포로 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻어진 신경전구세포를 유효성분으로서 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 또는 세포 치료제에 관한 것이다.

최근 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 신경 줄기세포(neural stem cell)로부터 신경세포를 분화 시킨 뒤 이들 신경세포를 뇌에 이식하여 신경계질환을 치료하고자 하는 시도가 시작되었다. 파킨슨병이나 뇌졸중의 동물 모델에서는 임상증세 호전, 이식세포 생존 등의 양호한 성적을 보이고 있어서 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 척수 손상 등의 환자에서도 가까운 시일 내에 줄기세포유래 신경세포의 뇌이식이 시도되리라 기대되고 있다.

신경 줄기세포는 증식을 계속하는 능력, 즉 자기복제능력을 가지고 있으며, 중추신경계를 구성하는 신경세포, 성상세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte) 등의 세가지 구성세포로 분화하는 다분화능력을 가진 미분화세포라 정의할 수 있다. 신경 줄기세포는 특정한 신경계 세포를 만들어내는 신경전구세포나 글리아전구세포의 단계를 거쳐서 신경세포/뉴런이나 글리아세포로 분화 한다. 따라서 이들 신경세포나 글리아세포로 분화유도하는 기전이나 제어기전의 연구는 신경계 발생의 연구에서 뿐만 아니라 신경계 질환 발병 기전 연구 및 치료전 략에서도 대단히 중요한 비중을 차지한다.

신경 줄기세포가 뇌의 어느 부위에 존재하는가 그리고 신경계 발생의 어느 시기에 발생하여 어느 시기에 소멸하는가에 대해서는 의문이 있었다. 이를 밝히기 위한 연구에서는 신경 줄기세포나 신경전구세포에 특유한 세포표지자(marker)인 네스틴(nestin) 이라는 중간세사(intermediate filament)를 지표로 사용한다. 척수동물의 발생초기인 신경관(neural tube) 형성 이전에 이미 신경판(neural plate)에는 네스틴을 발현하는 신경 줄기세포의 존재가 확인되어 있다. 신경관 형성 이후에는 신경관의 뇌실주변 부위(periventricular zone)에도 네스틴을 발현하는 신경 줄기세포가 존재한다. 이들 신경 줄기세포는 신경 줄기세포 자신 및 신경 줄기세포에서 분화한 뉴런/글리아세포 두타입의 자식세포(daughter cell)를 생산하는 비대칭성 분열(asymmetrical division)을 계속한다.

이와 같이 신경계 발생 초기에 존재하는 것으로 알려져 있던 신경 줄기세포가 최근 성숙 포유 동물에서도 존재하고 있음이 밝혀졌다. 지난 100년 동안 성숙포유 동물에서는 뉴런이 새롭게 생산되지 아니한다는 것이 정설이었으나, 최근 성인의 중추신경계 중 해마(hippocampus) 또는 뇌실하층(subventricular zone)에서 신경줄기세포가 발견되고 있다.

그러나, 해마 또는 뇌실하층에 존재하는 신경줄기세포는 인간의 뇌 깊숙한 곳에 자리잡고 있어 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 척수 손상, 운동신경손상, 외상에 의한 말초신경손상 등의 신경계 손상에 이용할 수 있는 본인의 신경줄기세포원이 되기가 어렵다. 이에 좀더 용이하게 취할 수 있는 신경줄기세포 원의 확보에 관한 여러 연구가 진행되었으며, 골수 세포(bone marrow cell), 제대혈 세포(umbilical blood cell), 또는 배아 줄기 세포(fetal hepatocyte)로부터 얻은 단핵 세포 분획(mononuclear cell fraction)이 신경계세포로의 분화능을 가지는 것으로 보고된 바 있다(일본 특허출원 제2001-160579). 그러나 배아 줄기 세포는 그 이용에 대해 윤리적 문제가 일고 있을 뿐만 아니라, 실질적으로 산업상 이용하기에는 어려움이 많다. 골수 세포 역시 접근성이 좋지 않으며, 제대혈 세포는 현재 일부 신생아들에 한해 제대혈 저장이 이루어지고 있을 뿐이어서 중추 또는 말초 신경계 손상의 치료를 위한 자가이식요법에는 아직 적당하지 않다.

또한 골수 세포, 배아 줄기 세포 등의 공여 줄기세포들은 임상적 적용을 위해서는 다량으로 세포수를 증식시켜야 한다는 문제점이 있었다. 이에 대한민국 특허출원 제 10-2004-7006637호에서는 불사화한 중배엽간세포로부터 신경계 세포로의 분화 유도 방법을 개시하면서, 중배엽 줄기 세포를 불사화하여 대량으로 증식시키는 방법을 제시한 바 있다. 그러나, 불사화 유전자를 삽입한 세포는 비정상 세포가 될 가능성을 완전히 배제하지 못한다.

이러한 타 공여 줄기세포들의 문제점을 타개할 수 있는 시도로서, 캐나다의 Fred Miller group(Nature Cell Biology 2001, september)은 두피 조직에서 3개월간 스페로이드 배양(spheroid culture)으로 신경세포, 신경교세포, 근육세포, 지방세포 등으로 분화할 수 있는 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)를 동정하였다고 보고한 바 있다(미국 특허출원 제 09/991,480호).

피부 진피를 공여 줄기세포로 이용할 수 있다면, 다른 공여 줄기세포에 비해 수집이 용이할 뿐만 아니라, 임상적 적용을 위해 충분한 공여 지역을 갖는다는 이점을 갖는다. 또한 진피의 줄기세포는 기본적 또는 잔여 줄기 세포로서의 신경능선줄기세포라는 점에서 이점을 갖는다.

Fred Miller group의 실험이 피부 진피를 공여 줄기세포로서 이용하여 기존의 타 공여줄기세포가 갖고 있던 문제점을 일부 해결한 면은 있으나, 이들의 실험 방법은 3개월이라는 장기간의 세포 배양을 요하므로 실질적으로 적용하기 어렵고, 또한 장기간의 배양에 의해 형질전환, 탈분화 등의 다양한 세포 변형이 일어났을 가능성의 문제점이 있다.

따라서, 실제로 피부에 신경전구세포가 존재하는지, 혹은 단기간에 이러한 신경전구세포를 유도할 수 있는지에 대한 연구의 필요성이 대두되었다.

이에, 본원 발명자들은 성인의 피부 진피를 본 발명의 방법에 따라 배양하여 네스틴을 발현하는 신경전구세포를 얻을 수 있음을 확인하고, 6일 내지 12일이라는 단기간 배양으로 신경전구세포를 얻을 수 있는 방법을 개발하였다.

따라서, 본 발명의 첫번째 목적은 피부 진피 세포를 본 발명의 특정 배양조건으로 배양하여 신경전구세포로 유도하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 상기 방법에 의해 얻어진 신경전구세포를 유효성분으로서 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 또는 세포 치료제를 제공하는 것이다.

첫째, 본 발명은 피부 진피 세포를

1) FGM(Fibroblast growth medium) 배양액으로 배양한 후,

2) N2를 첨가한 DMEM/F12 배양액(스텝 II 배양액)으로 배양하고,

3) Poly-D-리신 하이드로브로마이드/라미닌으로 코팅된 배양 접시에서 DMEM/F12에 N2, bFGF 및 헤파린을 첨가한 배양액(스텝 III 배양액)으로 배양하여 신경전구세포로 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명은 상기 단계 3)에서 얻은 스피어(sphere)만을 새 배양접시로 옮겨 스텝 III 배양액으로 추가로 배양하여 신경전구세포로 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 bFGF는 바람직하게는 1-100 ng/ml, 더욱 바람직하게는 10-40 ng/ml의 범위이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 헤파린은 바람직하게는 0.5-20ug/ml, 더욱 바람직하게는 2-10ug/ml의 범위이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, N2는 인슐린 5ug/ml + 프로게스테론 10 uM + 푸트레신 10 uM + 소듐 셀레니트 10 uM + 트렌스페린 100 ug/ml이다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명은 상기 피부 진피 세포가 인간 진피 섬유아세포(HDF; Human Dermal Fibroblast)인 방법에 관한 것이다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명은 상기 방법에 따라 얻어진 신경전구세포가 네스틴(++), 비멘틴(++), βIII-튜불린(++)임을 특징으로 하는 방법에 관한 것이 다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 방법에 따라 얻어진 신경전구세포는 네스틴(++), 비멘틴(++), βIII-튜불린(++), A2B5(++), p75(+), O4(-), GFAP(-), NF-68(-) 또는 네스틴(++), 비멘틴(++), βIII-튜불린(++), A2B5(++), p75(+), O4(+), GFAP(+), NF-150(+), MAP-2(+)임을 특징으로 한다.

둘째, 본 발명은 상기 방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 유효성분으로서 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 중추 또는 말초 신경계 손상이 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 척수 손상, 운동신경손상 또는 외상에 의한 말초신경손상인 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제에 관한 것이다.

셋째, 본 발명은 상기 방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 유효성분으로서 함유하는 세포 치료제에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

성숙한 동물 중추신경계에 신경 줄기세포가 존재함에도 불구하고 뇌질병이나 뇌손상 후에 뉴런의 신생이 없다는 사실은 이들 신경 줄기세포 주위의 미세환경이 그 생존, 증식, 분화에 중요하다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명자들은 진피의 신경전구세포로의 유도를 위한 최적의 미세환경, 즉 배양 조건을 밝히고자 노력했다. 이에 본 발명자들은 본 발명에서와 같이 배양하는 경우 진피 세포의 신경전구세포로의 유도 기간을 단기간으로 단축시킬 수 있다는 사실을 밝혀냈다.

본 발명자들은 진피를

1) FGM(Fibroblast growth medium) 배양액으로 배양한 후,

2) N2를 첨가한 DMEM/F12 배양액(스텝 II 배양액)으로 배양하고,

3) Poly-D-리신 하이드로브로마이드/라미닌으로 코팅된 배양 접시에서 DMEM/F12에 N2, bFGF 및 헤파린을 첨가한 배양액(스텝 III 배양액)으로 배양하고, 또는

추가로 상기 단계 3)에서 얻은 스피어(sphere)만을 새 배양접시로 옮겨 스텝 III 배양액으로 추가로 배양하여 신경전구세포로 유도하는,

총 4단계 배양을 통해 각 단계에서의 뉴로스피어(neurosphere)의 형성을 관찰하였다. 이어 면역형광염색을 통해 신경전구세포 표지자인 네스틴의 발현양을 조사하였다.

상기한 본 발명의 신경전구세포 유도 방법에 의해 얻어진 신경전구세포는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제, 특히 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 척수 손상, 운동신경손상, 또는 외상에 의한 말초신경손상의 치료제로 사용될 수 있으며, 세포 치료제로 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 신경전구세포의 유효 용량은 1× 10⁴ 내지 1× 10⁷ 세포/kg 일 수 있다. 그러나 이 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 증상의 경중도에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 본 발명에 따른 치료제는 비경구, 국소 투여에 의해 인체에 적용될 수 있으며, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 뇌 척수액 내 투여 등의 방법으로 투여될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유효 성분을 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현 탁시키거나 용해시킬 수 있으며, 이 때 생리식염수 등의 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든지 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 신경전구세포 분화 배양

인간 진피 섬유아세포(HDF; Human Dermal Fibroblast)를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 배양접시에서 FGM(Fibroblast growth medium)2 배양액(Clonetics CC-4126)으로 하루 동안 배양한다. 다음날 DMEM/F12(3:1) 배양액에 N2 를 첨가한 배양액(스텝 II 배양액)으로 교환하고 6일 동안 배양한다. Poly-D-lysine hydrobromide/라미닌 으로 코팅된 배양 접시에 세포를 계대 배양하고 DMEM/F12(3:1)에 N2와 bFGF 10ng/ml, 헤파린 2ug/ml을 첨가한 배양액(스텝 III 배양액)에서 6-12일간 배양한다. 스텝 III 배양액에는 라미닌을 첨가하기도 빼기도 하며 이 성분이 필수적인지 확인하고자 하였다. 첨가하는 경우 1ug/ml의 농도로 첨가한다. 스텝 III에서 형성된 스피어만 새 배양접시로 옮겨서 스텝 III와 동일한 배양액으로 12 일간 부유 배양 한다 (스텝 IV). 또한 인간의 MSC(Mesenchymal stem cell, 중배엽 줄기세포)와 인간 피부각질세포(Keratinocyte)도 동일한 방법으로 배양하여 위 배양 조건에 의한 신경전구 세포 분화가 진피세포의 고유한 특성인지 확인하고자 하였다.

실시예 2 : 면역형광염색법

스텝 II와 스텝 III 각 단계 후에 3.7% 포름알데히드로 세포를 고정시키고 인산완충용액으로 세 번 수세 후 0.2% 트리톤 X-100으로 10분간 침투화(permeabilization)시켰다. 인산완충용액에 희석시킨 20% 정상 염소 혈청으로 1시간동안 상온에서 비특이적 항원을 차단시킨 후 모노클로날 항-네스틴 항체 (1:200,Chemicon)를 희석하여 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 형광물질 항-마우스 IgG(1:100, VECTOR)를 2시간 실온에서 처리한다. 핵 염색은 DAPI를 1ug/ml로 10분간 실온에서 염색한다. 커버슬립은 Vectashield로 탑재시켰다. 형광현미경(Leica DMLB)으로 형광염색을 확인하고 사진촬영을 한다.

실시예 3 : 면역염색법

면역염색을 위하여 3.7% 포르말린 용액으로 배양접시의 세포를 고정시키고 내인성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase)를 억제하기 위해 메탄올에 희석된 0.3% 과산화수소수를 30분간 처리한다. 0.2% 트리톤 X-100으로 10분간 침투화한다. 인산완충용액에 희석시킨 1% 정상 염소 혈청으로 3시간 실온에서 비특이적 항원을 차단한다. 면봉과 파라핀 연필로 배양접시를 구획하고 모노클로날 항-네스틴(1:200, Chemicon), 모노클로날 항-βIII-튜불린(1:400, Sigma), 모노클로날 항-비멘틴(1:50,DAKO), 모노클로날 항-A2B5(1:200,Chemicon), 폴리클로날 항-p75(1:500, Promega), 모노클로날 항-O4(1:50, Chemicon), 모노클로날 항-GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein)(1:50, DAKO), 모노클로날 항-NF68(1:400, Sigma)항체 를 각각 처리하여 4℃에서 밤새 처리한다.

Vectastain ABC 염색 키트(Vector PK-6200)를 이용하여 비오틴화된 제 2 Ab를 35분 처리하고 스트렙타비딘 퍼옥시다제(streptavidin peroxidase)를 30분 처리한다. 퍼옥시다제 기질 키트(Vector SK-4100)로 DAB 염색을 2분간 시행한다. 패스트-레드(Fast-red)로 5분간 핵 염색 후 D.W.로 수세한다. Aquatex(Merck)로 탑재하였다.

실시예 4: 세포의 증식과 스피어 형성

스텝 II에서 인간 진피 섬유아세포는 6일 동안 증식을 한다. 같은 세포를 10% FBS만 들어있는 DMEM/F12(3:1)에서 배양했을 때와는 형태적인 차이점이 보인다. 스텝 III로 계대를 하면 배양 3일정도부터 세포들이 주변세포와 서로 모이는 것이 관찰되고 4일 정도부터 스피어를 형성하기 시작한다(도 1).

스텝 III에서 6일간 배양 후 형성된 스피어를 새로운 배양접시로 옮기고 스피어 상태를 유지하는지 보았다. 스피어는 크기가 점점 커지며 또는 바닥에 붙어서 세포들이 바닥에 붙어 뻗어나가기도 하였다(도 2, 3). 배양접시를 옮기지 않고 계속하여 스텝 III에서 유지하였을 경우에도 스피어와 바닥에 붙은 세포가 크기가 커지며 증식하였다(도 3).

스텝III에서 이 단계의 배양액 대신 bFGF와 라미닌을 병합 또는 각각 스텝 II 배양액에 첨가하여 6일간 배양한 결과 세포들이 서로 모여서 스피어를 형성하는 모습이 bFGF를 첨가한 군에서만 확인되었다(도 8).

실시예 5: 네스틴 발현의 면역형광염색결과

인간 진피 섬유아세포의 각 단계에서 신경전구세포 표지자인 네스틴의 발현양을 조사하기위해 DMEM/F12(3:1) +10% FBS, FGM, 스텝 II, 스텝 III, 스텝 II+스텝 III에서 각각 배양하여 면역형광염색을 시행하였다. 그 결과 스텝 II와 스텝 III를 거친 세포에서 네스틴의 발현양이 약 80%로 가장 높았다. 그러나, 네스틴의 mRNA 수준에서의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과 FGM에서 키운 군과 스텝 II와 스텝 III에서 배양한 군 간에 차이가 없었다(도 5).

인간 진피 섬유아세포의 네스틴 발현과 비교하여 신경전구세포의 표지자인 βIII-튜불린과 비멘틴 발현을 본 결과 βIII-튜불린의 약한 발현과 비멘틴의 강한 발현을 면역형광염색법을 통하여 알 수 있었다(도 6).

인간 MSC와 인간 각질세포도 스텝 II와 스텝 III에서 네스틴이 발현하는지를 확인하기 위해 같은 배양조건에서 배양하였다. 네스틴을 면역형광염색하여 확인하여 본 결과 두 세포 모두 네스틴을 발현 하지 않았다(도 7).

스텝 III에서 이 단계의 배양액 대신 bFGF와 라미닌을 병합 또는 각각 스텝 II 배양액에 첨가하여 6일간 배양한 결과, 네스틴 발현이 bFGF를 첨가한 군에서만 확인되었다(도 8).

인간 진피 섬유아세포를 스텝 II와 스텝 III를 거쳐 스텝 IV에서 12일간 배양한 후 여러 신경 표지자(neural marker)의 발현을 보기 위해 DAB염색을 실시하였다. 그 결과 네스틴,비멘틴, βIII-튜불린, A2B5는 강하게 발현하고, p75는 부분적으로, O4, GFAP, NF-68은 발현하지 않았다(도 9).

마찬가지로 인간진피섬유아세포를 스텝 II와 스텝 III를 거쳐 스텝 IV에서 12일간 배양한 후 스피어에서 여러 신경 표지자의 발현을 보기 위해 파라핀 절편(paraffin section)을 하고 DAB염색을 실시하였다. 그 결과 네스틴,비멘틴, βIII-튜불린, A2B5는 강하게 발현하고, p75는 부분적으로, O4, GFAP, NF-68은 발현하지 않았다(도 10). 이 결과를 요약하면 표 1과 같다.

표 1. 도 9 및 도 10의 결과

네스틴	++	신경전구세포(neuronal precursor)	p75	+	신경능선줄기세포(Neural crest stem cell)
비멘틴	++	신경전구세포(Neuronal precursor)	O4	-	전-희돌기교세포(Pro-oligodendrocyte)
βIII-튜불린	++	미성숙 뉴런(Immature neuron)	GFAP	-	성상세포(Astrocyte)
A2B5	++	희돌기교세포 전구세포(Oligodendrocyte progenitor)	NF-68	-	성숙 뉴런(mature neuron)

스텝 IV에서 더 오랜기간 배양하여 마커의 발현을 보기 위해 스텝 IV에서 37일간 배양하여 바닥의 세포들을 DAB염색을 시행하였다. 그 결과 네스틴, A2B5, βIII-튜불린, 비멘틴, Map2, tau, NF-150, O4가 발현을 하였다. GFAP와 p75, β-카테닌은 약하게 발현하였다(도 11). 이 결과를 요약하면 표 2와 같다.

표 2. 도 11의 결과

네스틴	++	신경 표지자(Neuronal marker)	비멘틴	++	신경 선구세포(Neural precursor)
A2B5	++	초기 희돌기교세포(Early oligodendrocyte)	O4	+	희돌기교세포 전구세포(Oligodendrocyte progenitor)
GFAP	+	성상세포(astrocyte)	p75	-	신경 능선 줄기세포(Neural crest stem cell)
β-카테닌	+	E-카드헤린의 세포질성 말단에 결합	PSA-NCAM	-	NCAM의 배아 형태(Embryonic form of NCAM)
MAP2	++	뉴런(세포체)	Tau	++	뉴런 (액손)
NF-150	++	뉴런	N-카드헤린	-	부착 분자(Adhesion molecule)
NF-68	-	미성숙 뉴런	βIII-튜불린	++	미성숙 뉴런

신경세포로의 분화를 유도하기 위해 스텝 III를 지난 세포들에 스텝 II 배양액에 포스콜린(Forskolin) + 레티노산, NGF, 물질-P를 병합 또는 각각 처리하여 24일간 배양하였다. 그 결과 세포들의 모양이 그림과 같이 변화하였다(도 12).

상기 본 발명 방법에 따른 배양의 결과는 동결 후 해동된 세포에 대한 실험에서도 동일한 결과를 나타냈다.

본 발명에 따르면, 피부 진피를 본 발명의 특정 배양조건으로 배양하는 경우 진피가 단시간 내에 신경전구세포로 유도되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 단기간 내에 얻어진 신경전구세포를 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 또는 세포 치료제로 이용할 수 있다. 피부 진피를 공여 줄기세포로 이용하는 경우, 접근성이 뛰어나며, 임상적 적용을 위해 충분한 공여 지역을 제공한다는 점에서 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 또는 세포 치료제로서 산업상 유용하다.

Claims (8)

1. 피부 진피 세포를

   1) FGM(Fibroblast growth medium) 배양액으로 배양한 후,

   2) N2를 첨가한 DMEM/F12 배양액(스텝 II 배양액)으로 배양하고,

   3) Poly-D-리신 하이드로브로마이드/라미닌으로 코팅된 배양 접시에서 DMEM/F12에 N2, bFGF 및 헤파린을 첨가한 배양액(스텝 III 배양액)으로 배양하여 신경전구세포로 유도하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 단계 3)에서 얻은 스피어(sphere)만을 새 배양접시로 옮겨 스텝 III 배양액으로 추가로 배양하여 신경전구세포로 유도하는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 bFGF는 1-100 ng/ml의 범위인 방법.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 피부 진피 세포가 인간 진피 섬유아세포(HDF; Human Dermal Fibroblast)인 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 신경전구세포가 네스틴(++), 비멘틴(++), βIII-튜불린(++)임을 특징으로 하는 방법.
6. 유효성분으로서 제 1항 또는 제 2항의 방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제.
7. 제 6항에 있어서, 중추 또는 말초 신경계 손상이 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 척수 손상, 운동신경손상 또는 외상에 의한 말초신경손상인 치료제.
8. 유효성분으로서 제 1항 또는 제 2항의 방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 함유하는 세포 치료제.

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