KR20240028110A - 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

유도만능줄기세포 유래 엑소좀; 및 콜라겐 또는 히알루론산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 우수한 세포 증식 효과 및 상처 치유 효과를 나타내므로, 피부 주름 개선, 상처 재생, 탄력 증가 등의 피부 상태 개선을 위한 화장품 소재를 비롯하여 아토피 피부염과 같은 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 의약품 소재로도 유용하게 활용될 수 있다.

Description

유도만능줄기세포 유래 엑소좀 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 용도{COMPOSITION COMPRISING INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL DERIVED EXOSOMES AND COLLAGEN AS ACTIVE INGREDIENTS AND USES THEREOF}
본 발명은 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는 피부 질환 치료 및/또는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
세포 간 다양한 정보 교환(cell-to-cell interacttion)은 세포 및 세포로 이루어지는 기관의 생존에 필수적인 과정이다. 최근 세포외소포체(extracellular vesicles)에 의한 세포 간 정보 교환이 주목을 받고 있다. 세포외소포체는 세포에서 분비되는 이중 지질막 구조의 물질로 크기에 따라 엑소좀(exosomes, 30~150 nm), 미세소포(microvesicles, 50~1,000 nm), 온코좀(large oncosomes, 1~10 μm)으로 나뉜다. 이 중, 엑소좀은 1980년대에 처음으로 확인되어 당시에는 단순한 세포 노폐물로 간주되었으나, 이후 엑소좀이 단백질, 지질, 유전물질 등 다양한 생체 활성물질을 포함하고 있으며, 유래한 기원의 성질과 상태를 반영하고 있음이 규명되었다. 이러한 엑소좀은 생물학적 기능에 관한 정보뿐만 아니라 질병의 발병 과정, 질병의 진단에서도 중요성이 밝혀지고 있다. 엑소좀은 일반세포, 암세포, 줄기세포, 면역세포 등 다양한 세포로부터 유래한다(Ali Hazrati1 et.al., Biomarker Research, 10(30):1-25, 2022).
유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)는 배아줄기세포의 일종으로 윤리적 이슈가 없는 원천 줄기세포이다. iPSCs는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포로, 배아줄기세포와 거의 동일한 특성을 가진다. 구체적으로, iPSCs는 Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4 등과 같은 특정 유전자의 도입에 의해 역분화되어 만능줄기세포로 재프로그래밍된 세포이다. iPSCs는 배아줄기세포와 유사한 유전자 및 단백질 발현을 보이며, 신체의 모든 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다.
질병 치료를 위해 iPSCs의 재생 특성을 활용하는 것 외에도, iPSCs는 또한 인접한 세포의 직접 조절을 위한 일부 조절 인자를 생성하는 것으로 밝혀졌다. iPSCs는 신경성장인자를 상향 조절하여 좌골 신경 회복 및 재생을 촉진하는 것으로 입증되었으며, 이러한 조절 인자는 엑소좀과 같은 세포외소포체의 형태로 방출될 수 있음이 밝혀졌다. 이에 따라, iPSCs로부터 분비된 엑소좀을 심혈관질환, 간질환, 신경질환, 골질환 등과 같은 다양한 질환에 적용한 연구들이 최근 다양하게 이루어지고 있다(Aline Yen Ling Wang, Int J Mol Sci., 22(4):1769, p.1-16, 2021).
한편, 한국 공개특허 제10-2015-0039343호에 인간 배아줄기세포 배양액을 포함하는 조성물의 피부 상태 개선 용도가 개시되어 있다. 그러나, 인간 배아줄기세포를 이용한다는 점에서 윤리적인 문제가 있으며, 그 효과 역시 미미한 문제점 등이 존재한다.
KR 10-2015-0039343 A
Ali Hazrati1 et.al., Biomarker Research, 10(30):1-25, 2022 Aline Yen Ling Wang, Int J Mol Sci., 22(4):1769, p.1-16, 2021
이에, 본 발명자는 피부 주름 개선, 상처 재생, 탄력 증가 등의 피부 상태 개선 및 아토피 피부염과 같은 피부 질환의 치료를 위한 배아줄기세포와 동일한 특성을 지니는 iPSCs 유래 엑소좀을 활용한 연구를 지속한 결과, iPSCs 유래 엑소좀; 및 콜라겐, 히알루론산 등과 같은 생체적합성 고분자의 복합체 개발을 통해 우수한 세포 증식능 및 상처 치유능이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 유도만능줄기세포 유래 엑소좀; 및 콜라겐 또는 히알루론산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 및 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 iPSCs 유래 엑소좀 및 콜라겐, 히알루론산 등과 같은 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는 조성물은 세포 증식 효과 및 상처 치유 효과가 우수하다. 이에 따라, 본 발명의 조성물은 피부 주름 개선, 상처 재생, 탄력 증가 등의 피부 상태 개선을 위한 화장품 소재를 비롯하여 아토피 피부염과 같은 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 의약품 소재로도 널리 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 iPSCs 유래 엑소좀의 입도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 iPSCs 유래 엑소좀을 노화피부에 적용하여 노화 개선, 즉 피부 재생을 유도할 수 있음을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3a는 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 처리에 따른 인간 섬유아세포 증식능 평가 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, iPSCs 배양액 유래 엑소좀 처리 후 3일차 시점에 인간 섬유아세포 증식 정도를 촬영한 현미경 사진이다.
도 3b는 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 처리에 따른 인간 섬유아세포 증식능 평가 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, iPSCs 배양액 유래 엑소좀 처리 후 세포 증식 정도를 시간별(0h, 24h, 48h 및 72h)로 측정한 흡광도 분석 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 iPSCs 유래 엑소좀 처리에 따른 인간 섬유아세포 증식능 평가 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, iPSCs 배양액 유래 엑소좀 및 동결건조된 iPSCs 유래 엑소좀 처리 후 세포 증식 정도를 시간별(24h, 48h 및 72h)로 측정한 흡광도 분석 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 상이한 유래의 엑소좀 간의 세포 증식 효과 비교 평가 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, iPSCs 유래 엑소좀 및 MSCs 유래 엑소좀 처리 후 세포 증식 정도를 시간별(24h, 48h 및 72h)로 측정한 흡광도 분석 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6a는 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 처리에 따른 상처 회복 정도를 시간별로 촬영한 현미경 사진을 나타낸 도면이다.
도 6b는 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 처리에 따른 상처 치유 효능 평가 결과를 나타낸 도면으로, 상처 회복 정도를 세포 상처 부위의 간격을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 iPSCs 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자 복합체의 세포 증식능 평가를 위한 iPSCs 유래 엑소좀 및 HA 복합체의 배합 비율 확립 조건 및 세포 증식능 평가 실험 일정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 8은 iPSCs 유래 엑소좀 및 HA 고분자 복합체의 다양한 배합 농도별 처리에 따른 세포 증식능 평가 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 iPSCs 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자 복합체를 개략적으로 나타낸 도면으로, 콜라겐 고분자를 포함한(embedded) iPSCs 유래 엑소좀 복합체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 10은 iPSCs 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자 복합체의 세포 증식능 평가를 위한 실험 조건 및 일정을 개략적으로 나타낸 도면이다. 여기서, 비히클(Vehicle), iPSCs 유래 엑소좀(40 μg), HA(100 μg) 및 콜라겐(100 μg) 각각은 iPSCs 유래 엑소좀 및 HA 복합체(HA embedded iPSCs exosome)과 iPSCs 유래 엑소좀 및 콜라겐 복합체(Collagen embedded iPSCs exosome)에 대한 대조군으로 사용되었다.
도 11a 내지 도 11c는 iPSCs 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자 복합체 처리에 따른 인간 섬유아세포 증식능 평가 결과를 나타낸 도면이다. 상세하게는, iPSCs 배양액 유래 엑소좀과 히알루론산(HA) 또는 콜라겐(Collagen) 고분자 복합체 처리 24시간(도 11a), 48시간(도 11b), 또는 72시간(도 11c) 경과 후 인간 섬유아세포 증식 정도를 촬영한 현미경 사진이다.
도 12는 iPSCs 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자 복합체 처리에 따른 인간 섬유아세포 증식능 평가 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, iPSCs 배양액 유래 엑소좀과 히알루론산(HA) 또는 콜라겐(Collagen) 고분자 복합체 처리 후 세포 증식 정도를 시간별(24h, 48h 및 72h)로 측정한 흡광도 분석 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
iPSCs 유래 엑소좀 및 고분자를 포함하는 조성물
본 발명의 일 측면은 iPSCs 유래 엑소좀; 및 콜라겐 및/또는 히알루론산을 포함하는 조성물을 제공한다.
iPSCs 유래 엑소좀 및 콜라겐을 포함하는 약학적 조성물
본 발명의 일 측면은 유도만능줄기세포 유래 엑소좀; 및 콜라겐 또는 히알루론산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 구체예로, 상기 약학 조성물은 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 및 콜라겐을 유효성분으로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예로, 상기 약학 조성물은 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 및 히알루론산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예로, 상기 약학 조성물은 유도만능줄기세포 유래 엑소좀; 콜라겐, 및 히알루론산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)"는 분화된 세포, 예컨대, 체세포로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포를 의미하며, 역분화 줄기세포로도 지칭된다. 상기 유도만능줄기세포는 특정 역분화 유도인자, 예컨대 Sox2, c-Myc, Klf4, Oct-4 등에 의해 세포를 재프로그램화(reprogramming)하여 수득될 수 있으며, 각종 장기 세포로 분화할 수 있다. 본 발명의 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등 모든 포유동물 유래의 유도만능줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "엑소좀(exosome)"은 살아있는 세포에서 지질 이중막으로 포장되어 자연적으로 분비되는 나노 크기의 입자를 의미할 수 있으며, 세포와 세포 사이의 정보 전달 역할을 한다. 엑소좀의 크기는 대략 직경이 30 nm 내지 250 nm로 알려져 있으며, 기원 세포의 종류에 따라 다소 차이는 있으나, 엑소좀 막에 CD9, CD63, CD81 등의 표면 단백질(표면 마커)을 포함하고 있으며, 엑소좀 내부에는 엔도좀 기원임을 입증할 수 있는 TSG101, ALIX 등의 단백질이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 이외에도 다양한 기능을 갖는 성장인자와 사이토카인 등을 포함한 단백질과 mRNA, miRNA 등의 핵산을 포함하고 있고, 기원 세포의 특성을 반영하는 성분과 효능을 갖는다. 특히, 줄기세포 유래 엑소좀은 줄기세포의 분화를 조절하고, 재생, 성장 촉진, 특정 면역 반응 유도 등의 효능을 보유하고 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 iPSCs 유래 엑소좀은 iPSCs 내에 존재하거나, iPSCs의 배양액에 분비된 엑소좀을 배양액으로부터 추출하여 수득한 것일 수 있다.
상기 iPSCs 유래 엑소좀은 이에 제한되지는 않으나, 당업계에 알려진 엑소좀 추출 방법을 이용하여 하기와 같이 제조될 수 있다:
a) iPSCs를 배양 배지에 배양한 후 무혈청 및 무항생제 배지에서 계대배양하는 단계;
b) 세포 배양 상층액을 회수하는 단계;
c) 회수한 세포 배양 상층액을 원심분리하는 단계; 및
d) iPSCs 유래 엑소좀을 분리 및 정제하는 단계.
또한, 상기 방법은 이에 제한되지는 않으나 하기 단계를 더 포함할 수 있다:
e) 분리 및 정제된 iPSCs 유래 엑소좀을 동결건조하는 단계.
본 명세서에서 사용된 용어 "콜라겐(Collagen)"은 인체에서 가장 흔하게 발견되는 단백질로 포유류에서 가장 많은 단백질이며, 전체 단백질의 약 25~35%를 차지한다. 특히, 뼈, 힘줄, 인대를 구성하는 주요한 성분이며, 주로 장기의 구조를 유지하는 역할을 수행한다. 상기 콜라겐은 소나 돼지와 같은 포유동물의 피부로부터 쉽게 추출할 수 있으며, 상기 콜라겐은 순수 콜라겐 이외에, 콜라겐 유도체를 포함할 수도 있다. 콜라겐과 관련하여, 이의 유래는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 포유류, 어류, 예를 들면, 소 뼈, 소 피부, 돼지 뼈, 돼지 피부 등으로부터 유래된 다양한 콜라겐을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 구성하는 콜라겐으로는 콜라겐 I 내지 콜라겐 IV를 사용할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 콜라겐은 콜라겐 I 및 콜라겐 III을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 콜라겐은 콜라겐 I의 아텔로콜라겐(Atelocollagen)을 사용할 수 있다. 이때, 상기 아텔로콜라겐은 콜라겐에서 피부 과민 반응을 유발할 수 있는 항원성 물질인 텔로 펩타이드가 제거된 콜라겐을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 추가적으로 히알루론산 또는 이의 염을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "히알루론산(hyaluronic acid, HA)"은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로서, 분자량이 100 kDa 내지 13,000 kDa에 이르는 무색 투명한 고점도의 선형 다당류이며, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등 다양한 생물종과 조직으로부터 산 가용화법, 알칼리 가용화법, 중성 가용화법, 효소 가용화법 등으로 추출 및 정제하여 사용할 수 있다. 수용액 내 히알루론산의 분자량 및 농도에 따라 점성, 탄성, 보습성이 결정되며, 히알루론산의 농도가 높을수록 그 성질이 증가한다. 히알루론산은 분자량 크기에 따라서 기능이 상이한 것으로 알려져 있다.
본 발명의 상기 조성물을 구성하는 히알루론산은 1.0 KDa 내지 3.0 MDa, 10 KDa 내지 2.5 MDa, 50 KDa 내지 2.0 MDa, 또는 110 KDa 내지 1.81 MDa일 수 있다.
또한, 상기 "히알루론산의 염"은 히알루론산과 동일한 효능을 갖는 범위 내에서 히알루론산의 화장용으로 허용 가능한 염 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 히알루론산의 염은 예를 들어, 소듐 히알루로네이트, 포타슘 히알루로네이트, 암모늄 히알루로네이트, 칼슘 히알루로네이트, 마그네슘 히알루로네이트, 아연 히알루로네이트, 코발트 히알루로네이트일 수 있다.
또한, 상기 히알루론산은 이에 제한되지는 않으나, 가교된 히알루론산 겔일 수 있다. 상기 가교된 히알루론산 겔은 이에 제한되지는 않으나, 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르 (BDDE), 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 및 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 가교결합제로 가교결합된 히알루론산 겔일 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 30 중량%로 상기 콜라겐을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 콜라겐을 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 200 ㎍ 또는 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 약학 조성물은 상기 콜라겐을 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 30 중량%로 상기 히알루론산 또는 이의 염을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 히알루론산 또는 이의 염을 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 200 ㎍ 또는 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 약학 조성물은 상기 히알루론산 또는 이의 염을 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다.
이때, 상기 엑소좀 및 콜라겐은 1:1 내지 1:10의 중량비로 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 엑소좀 및 콜라겐은 1:9 내지 2:8의 중량비로 혼합될 수 있다.
또한, 상기 엑소좀 및 히알루론산 또는 이의 염이 1:1 내지 1:10의 중량비로 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 엑소좀 및 히알루론산 또는 이의 염은 1:9 내지 2:8의 중량비로 혼합될 수 있다.
또한, 상기 약학조성물은 상기 엑소좀, 콜라겐 및 히알루론산 또는 이의 염을 1:1:1 내지 1:10:10의 중량비로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 약학 조성물은 엑소좀, 히알루론산 또는 이의 염, 및 콜라겐을 1:2.5:2.5의 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 약학 조성물은 피부 질환 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
상기 "피부 질환"은 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "예방"은 상기 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하여 질환을 사전에 방지하거나 발생 가능성 또는 발생 빈도를 낮추는 것을 포괄적으로 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 질환이 발생할 가능성이 있는 환자 또는 발병한 적이 있는 환자에게서 발병 확률을 낮추거나, 재발 확률을 낮추는 것일 수 있다. 상기 "약학적 유효량"은 "치료학적 유효량"과 동일한 의미로서, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합, 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 상기 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하여 질환을 개선시키는 것을 포괄적으로 의미할 수 있고, 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 질환의 증상이 완화 또는 치유되는 것을 제공하는 것일 수 있으며, 질환으로 인한 한가지 증상 또는 대부분의 증상을 개선시키는 것일 수 있다. 상기 약학적 유효량에 대해서는 상술한 바와 동일하다. 본 발명의 약학 조성물은 그 자체로 피부 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 상기 "치료"는 "치료 보조"의 의미를 포함한다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 "치료학적으로 유효한 양"으로 투여한다. 상기 치료학적 유효량은 상술한 바와 동일하다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 구체적으로는 비경구 방식으로 투여되고, 보다 구체적으로는 피하 또는 경피 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 피부에 직접 도포될 수 있다. 상기 약학 조성물을 피부에 도포하는 경우, 본 발명에 따른 약학 조성물을 그 형태에 따라 피부에 직접 도포하거나, 분무하는 것을 포함할 수 있다.
여기서 약학 조성물이 투여될 수 있는 대상은 포유동물일 수 있으며, 구체적으로는 인간일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 ㎎/kg~100 ㎎/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 9999 중량%, 바람직하게는 약 90중량% 내지 약 9999 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 "Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed, 1995)"에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조되는 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 약학 조성물은 주사제로 제조될 수 있다. 상기 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물이 피부외용제로 제조되는 경우, 연고제, 액제, 크림제, 스프레이제, 패취제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 이때, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위 내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 필러용 주사제의 형태로도 제조될 수 있다. 예를 들면 알긴산(alginic acid), 카르복시메틸셀룰로즈(carboxymethyl cellulose), 키토산(chitosan), 덱스트란(dextran), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 펙틴(pectin), 아가(agar), 아밀로즈(amylose), 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 및 엘라스틴(elastin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 담체를 포함할 수 있다. 필러용 주사제 조성물이 히알루론산을 포함하는 경우, 상기 히알루론산은 가교되어 있는 구조(cross-linked)를 가질 수 있다.
또한, 예를 들면 생분해성 고분자 지지체(scaffold)로 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리아미노산(polyamino acid), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester) 및 이들의 공중합체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 필러용 주사제는 국소 마취제, 항히스타민제, 비타민 등을 포함할 수 있다.
국소마취제로는 예를 들면, 리도카인(lidocaine), 에티도카인(etidocaine), 부피바카인(bupivacaine), 테트라카인(tetracaine), 메피바카인(mepivacaine), 프로카인(procaine), 프릴로카인(prilocaine), 로피바카인(ropivacaine) 등을 포함할 수 있으나, 주사제용 국소마취제라면 특별히 제한하지 않는다.
항히스타민제로는 예를 들면 plokon(piprinhydrinate), 클로로페니라민(chlorpheniramine), 디페닐피랄린(diphenylpyraline, piprinhydrinate), 디펜히드라민(diphenhydramine), 세티리진(cetirizine) 등을 포함할 수 있으나, 주사제용 항히스타민제라면 특별히 제한하지 않는다.
본 발명은 상기 약학 조성물을 이용하여 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 피부 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다. 여기서, 상기 약학 조성물, 피부 질환, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.
상기 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상의 피부에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 약학 조성물, 피부 질환, 치료 및 예방은 상술한 바와 동일하다.
iPSCs 유래 엑소좀 및 고분자를 포함하는 화장용 조성물
본 발명의 다른 측면은 유도만능줄기세포 유래 엑소좀; 및 콜라겐 또는 히알루론산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 화장용 조성물은 추가적으로 히알루론산 및 이의 염을 더 포함할 수 있다. 엑소좀, 콜라겐 및 히알루론산의 함량은 상술한 바와 같다.
본 발명의 화장용 조성물은 피부 상태를 개선시키는 용도로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "피부 상태 개선"은 주름의 발생 억제, 피부 노화 억제, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 상처 또는 창상 회복(wound healing), 각막 재생, 피부 자극 완화 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다. 또한, 피부 세포의 기능 저하 또는 손실로부터 피부를 보호 또는 피부 상태를 개선하거나, 또는 피부 질환을 예방 또는 개선하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 화장용 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장용 조성물은 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제제화될 수 있다. 또한, 화장료용 필러로 제조될 수도 있다.
화장료용 필러는 피부 표면에 도포하는 방법으로 적용할 수 있고, 예를 들면 향료, 잔탄검, 왁스, 버터, 오일, 계면활성제, 보습제, 알코올 등을 포함할 수 있고, 통상적으로 포함할 수 있는 화장료 조성물의 구성 성분이라면 특별히 제한하지 않고 포함할 수 있다. 또한, 화장료용 필러 조성물이 히알루론산을 포함하는 경우, 상기 히알루론산은 가교되지 않은 구조(non-crosslinked)를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 화장용 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장용 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 용매, 용매화제, 유탁화제 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르, 및 이의 혼합물 등이 있다.
본 발명에 따른 화장용 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.
상기 화장용 조성물은 상기 제형에 따라 담체 이외에 각종 공지의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 첨가제에는 유화제, 보습제, 계면활성제, 킬레이팅제, 산화방지제, 살균제, 안정화제 등이 있다.
상기 유화제로는 유동 파라핀, 세틸올타노에이트, 스테아린산 등을 포함할 수 있다. 상기 보습제로는 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 솔비톨, 및 로 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 폴리올을 포함할 수 있다.
상기 킬레이팅제로는 에틸렌디아민테트라아세트산나트륨(EDTA), α-하이드록시 지방산, 락토페린, α-하이드록시산, 시트르산, 락트산, 말산, 빌리루빈, 빌리버딘(biliverdin) 등을 포함할 수 있다.
상기 산화 방지제로는 부틸히드록시아니솔, 디부틸히드록시톨루엔 또는 프로필 갈레이트 등을 포함할 수 있다. 이외에도, 상기 화장용 조성물 또는 피부 외용제에 배합 가능한 성분으로서 유지 성분, 에몰리언트제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, pH 조절제, 알코올, 색소, 항료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 비타민 등이 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
I. 엑소좀 및 고분자 복합체 제작
제조예 1. 엑소좀 분리
유도만능줄기세포를 배양하기 위해, 우선 세포배양기질 iMatrix 511(Takara)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 1시간 이상 반응시켰다. iMatrix 511이 코팅된 플라스크에 iPSC를 시딩(seeding) 하였다. 이때, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10 μM Y-27631이 되도록 처리해 주고 매일 배지를 교체하였다. iPSCs 세포 배양 상층액을 수거하여 20 mL의 배지를 300 rcf(g)로 원심분리하였다. 원심분리 후 세포 찌꺼기(debris)를 제거하였다. 이후, 엑소좀 농축 시약(Invitrogen, Cat. No. 4478359)을 배지와 5:1 비율로 4 mL을 첨가하고, 1분 동안 볼텍싱한 다음 밤새 4℃ 조건 하에서 인큐베이션하였다. 이후, 10,000 rcf (g)로 60분 동안 원심분리기를 이용하여 iPSCs 유래 엑소좀을 분리 정제하였다.
제조예 2. 엑소좀/고분자 복합체 제작
제조예 1의 방법으로 분리된 iPSCs 유래 엑소좀을 콜라겐 또는 히알루론산과 혼합하여 엑소좀/고분자 복합체를 제작하였다(도 9).
구체적으로, 상기 iPSCs의 배양액 유래 엑소좀 400 ㎍; 및 콜라겐 파우더(다림티센, BA06091) 1 mg 또는 히알루론산 파우더(Lifecore, HA1M-5) 1 mg을 각각 PBS 또는 D.W.에 넣고 2분간 볼텍스(vortex)하여 혼합하였다. 상기 혼합액을 4℃에서 10분간 반응시킨 뒤, 거품을 제거하고 상기 혼합물을 엑소좀; 및 콜라겐 또는 히알루론산의 병용 처리 시 시료로 사용하였다.
II. 세포 배양액 유래의 엑소좀 및 고분자 복합체의 피부 치유 효과 확인
실시예 1. 유도만능줄기세포 배양액 유래 엑소좀 처리에 따른 세포 증식 효과 평가
인간 섬유아세포인 BJ6 세포주 및 Cell Counting Kit-8(CCK-8)을 사용하여, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs) 유래 엑소좀에 의한 세포 증식능을 평가하였다. 본 실험의 세포 증식능 결과는 피부의 주름 개선 및 상처 재생 등의 피부 상태 개선 및 아토피 피부염과 같은 피부 질환의 증상 개선 효능을 평가할 수 있는 지표로 활용된다.
구체적으로, 인간 섬유아세포인 BJ6 세포주를 96웰 플레이트에 5×103 cells/well로 분주하여 세포 배양조건 37℃, 5% CO2 하에서 24시간 동안 배양하였다. 10% FBS가 포함된 배지에서 24시간 동안 배양 상태를 유지한 후 기존 배지를 제거하였다. 그 후, 시험 물질을 1% FBS가 포함된 배지에 처리하여 72시간 동안 추가 배양하였다. 본 실험에서 시험 물질은 대조군(Vehicle) 및 iPSCs 배양액으로부터 분리된 엑소좀(50 μg)을 사용하였다.
세포의 생존율을 측정하기 위해 CCK-8 용액을 1% FBS가 포함된 배지를 이용하여 1/10로 희석하고, 이를 각 웰(well) 당 100 μL씩 처리하였다. 이후, 2시간 동안 배양기에서 반응시킨 후 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 후, 각 군의 세포 증식율은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 계산하였다.
측정 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이 iPSCs 유래 엑소좀에 의하여 세포 증식능이 증가하였다. 구체적으로, 배양 72시간째 대조군(Vehicle)의 경우 137.1% 증가한 것과 비교하여 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 처리군의 경우 278.5% 수준으로 세포 증식률이 증가됨을 확인하였다(도 3b).
이를 통해, iPSCs 유래 엑소좀에 의해 세포 증식 효과를 높일 수 있음을 알 수 있었다. 이에, 궁극적으로 피부의 주름 개선 및 상처 재생 등의 피부 상태 개선 및 아토피 피부염과 같은 피부 질환의 증상 개선 등에 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. 동결건조된 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 처리에 따른 세포 증식 효과 평가
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 인간 섬유아세포인 BJ6 세포주 및 Cell Counting Kit-8(CCK-8)을 사용하여, iPSCs 유래 엑소좀에 의한 세포 증식능을 평가하였다. 단, 이때 iPSCs 유래 엑소좀은 iPSCs 배양액 유래 엑소좀(40 μg) 및 동결건조된 iPSCs 유래 엑소좀을 각각 사용하였다.
각 군의 세포 증식율은 대조군(vehicle)과 비교하여 백분율(%)로 계산하였다. 이때, 대조군을 상대적 비교값으로 100%로 고정하여 비교 계산하였다.
iPSCs 배양액 유래 엑소좀 및 동결건조된 iPSCs 유래 엑소좀을 각각 처리하여 섬유아세포 증식 정도를 측정해 본 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 대조군과 비교하여 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 및 동결건조된 iPSCs 유래 엑소좀 둘 다에 의해 세포 증식능이 증가함을 확인하였다.
구체적으로, 배양 72시간째 대조군과 비교하여 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 처리군의 경우 167%, 동결건조된 iPSCs 유래 엑소좀 처리군의 경우 172% 수준으로 세포 증식률이 증가함을 확인하였다.
이러한 결과를 통해, 동결건조된 상태에서도 iPSCs 유래 엑소좀의 특성이 유지됨을 간접적으로 알 수 있었다. 즉, 동결건조에 의한 영향 없이 iPSCs 유래 엑소좀에 의해 우수한 세포 증식 효과를 나타내는 바, 피부의 주름 개선 및 상처 재생 등의 피부 상태 개선 및 아토피 피부염과 같은 피부 질환의 증상 개선 등에 유용하게 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 및 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 간의 세포 증식 효과 비교 평가
엑소좀 유래에 따른 세포 증식 효과 차이를 확인하기 위해, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 인간 섬유아세포인 BJ6 세포주 및 Cell Counting Kit-8(CCK-8)을 사용하여, iPSCs 유래 엑소좀(50 μg) 및 제대혈 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC) 유래 엑소좀(50 μg)에 의한 세포 증식능을 평가하였다.
상기 iPSCs 유래 엑소좀 및 MSC 유래 엑소좀을 처리한 시험군의 세포 증식률은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 계산하였다. 이때, 대조군을 상대적 비교값으로 100%로 고정하여 비교 계산하였다.
대조군과 비교하여 iPSCs 유래 엑소좀 및 MSC 유래 엑소좀 처리에 따른 세포 증식률의 차이를 확인해 본 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 상기 두 가지 유래의 엑소좀에 의하여 세포 증식능이 향상됨을 확인하였으나, 특히 iPSCs 배양액 유래 엑소좀에 의하여 세포 증식능이 보다 증가함을 알 수 있었다.
구체적으로, 배양 72시간째 제대혈 중간엽 줄기세포 배양액 유래 엑소좀(hMSC exosome)의 경우 169% 수준으로 증가한 것과 비교하여 iPSCs 배양액 유래 엑소좀의 경우 182% 수준으로 세포 증식률이 증가됨을 확인하였다(도 5).
실시예 4. 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 처리에 따른 상처 치유 효능 평가
인간 섬유아세포인 BJ6 세포주 및 상처 치유 어세이(wound healing assay) 기법을 사용하여, iPSCs 유래 엑소좀에 의한 상처 치유 효능을 평가하였다. 상기 상처 치유 어세이는 35 mm 플라스크 상에 인간 섬유아세포를 증식시킨 후 1 mm 이하의 팁(tip)을 사용하여 상처를 내어 주는 기법이다. 본 실험의 상처 치유 효능 평가 결과는 피부의 주름 개선 및 상처 재생 등의 피부 상태 개선 및 아토피 피부염과 같은 피부 질환의 증상 개선 효능을 평가할 수 있는 지표로 활용된다.
구체적으로, 인간 섬유아세포인 BJ6 세포주를 35 mm 플라스크에 5×104 cells/well로 분주하여 세포 배양조건 37℃, 5% CO2 하에서 24시간 동안 배양하였다. 10% FBS가 포함된 배지에서 24시간 동안 배양 상태를 유지한 후 기존 배지를 제거하고 35 mm 플라스크에 팁을 이용하여 긁어서 세포에 상처(wound)를 만들었다. 이후, PBS로 1회 세척한 뒤 시험 물질을 1% FBS가 포함된 배지에 처리하여 56시간 동안 추가 배양하였다. 본 실험에서 시험 물질은 대조군(Vehicle)과 iPSCs 배양액으로부터 분리된 엑소좀(50 μg)을 사용하였다.
세포의 상처 치유 효능을 측정하기 위해, 도 6a에 나타낸 바와 같이 현미경을 이용하여 시간별로 영상을 획득하였다. 이후, 상처를 낸 위치 상에 세포가 자라나는 정도의 간격을 측정하여 상처 회복 정도, 즉 세포 상처 치유 효능 정도를 확인하였다(도 6b).
대조군과 비교하여 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 처리에 의해 상처 치유 효능이 높아짐을 확인하였다. 구체적으로, 56시간 경과 후 대조군에 비해 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 처리군의 경우 약 757 μm의 상처 치유 효능이 있는 것으로 확인되었다.
이를 통해, iPSCs 유래 엑소좀에 의해 상처 치유 효능 효과를 높일 수 있음을 알 수 있었다. 이에, 궁극적으로 피부의 주름 개선 및 상처 재생 등의 피부 상태 개선 및 아토피 피부염과 같은 피부 질환의 증상 개선 등에 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 및 히알루론산 복합체의 배합 농도별 처리에 따른 세포 증식 효과 평가
iPSCs 유래 엑소좀을 활용하되, 화장품 및 재생 의료 소재로 일반적으로 활용되고 있는 생체적합성 고분자를 적용하여 보다 우수한 세포 증식 효과를 달성하고자 하였다. 이에, iPSCs 유래 엑소좀 및 히알루론산 복합체 처리에 의해 우수한 세포 증식 효과를 보이는 배합 농도를 확립하고자, 도 7에 나타낸 바와 같이 실험을 디자인하였다.
구체적으로, 총 중량을 기준으로 HA 및 iPSCs 유래 엑소좀을 각각 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 및 0:10의 비율로 혼합하여 iPSCs 유래 엑소좀 및 HA 복합체를 제조하였다. 이후, iPSCs 유래 엑소좀 및 HA 복합체 농도별 처리에 따른 세포 증식능을 평가하였다.
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 인간 섬유아세포인 BJ6 세포주 및 Cell Counting Kit-8(CCK-8)을 사용하여, iPSCs 유래 엑소좀 및 HA 복합체의 세포 증식능을 평가하였다. 각 배합 농도별 iPSCs 유래 엑소좀 및 HA 복합체 처리군의 세포 증식율은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 계산하였다. 이때, 대조군을 상대적 비교값으로 100%로 고정하여 비교 계산하였다.
대조군과 비교하여 iPSCs 유래 엑소좀 및 HA 복합체 배합 농도별 처리에 따른 세포 증식률의 차이를 확인해 본 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 히알루론산(HA)에 의한 증식 효과 보다는 iPSCs 배양액 유래 엑소좀에 의하여 세포 증식능이 향상됨을 알 수 있었다.
구체적으로, 배양 72시간째 HA 단독(HA 100 μg + iPSCs exo 0 μg) 처리군의 경우 87% 증가한 것과 비교하여 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 단독(HA 0 μg + iPSCs exo 100 μg) 처리군의 경우 191% 수준으로 세포 증식률이 증가하였다. 또한, 1:9의 혼합 비율로 융합된 HA 및 iPSCs 유래 엑소좀(HA 10 μg + iPSCs exo 90 μg) 처리군의 경우, 196% 수준으로 가장 우수한 세포 증식 효과를 보임을 확인하였다(도 8).
실시예 6. 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자 복합체의 세포 증식 효과 평가
상기 실시예 5에서 적용한 생체적합성 고분자로서 히알루론산 이외의 고분자를 이용하여서도 우수한 세포 증식 효과를 보이는지 확인하고자, 추가적으로 콜라겐 고분자를 활용하여 iPSCs 유래 엑소좀을 함유한 콜라겐 복합체를 제조하였다(도 9). 상기 실시예 5에서 도출한 결과를 기반으로 최적 배합 비율로 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자 복합체를 제조하여 세포 증식능을 평가하였다.
구체적으로, iPSCs 배양액 유래 엑소좀을 함유한 콜라겐 복합체를 제조하기 위해 1 mg의 콜라겐 분말 및 400 μg의 iPSCs 유래 엑소좀을 1 mL의 증류수에 첨가하고 2분간 볼텍싱(vortexing)하여 혼합하였다. 이후, 4℃에서 10분간 유지시킨 다음 볼텍싱에 의해 발생한 거품을 제거하였다. 상기와 같은 방법에 따라 제조한 콜라겐에 포매된 iPSCs 유래 엑소좀 복합체(Collagen embedded iPSCs drived exosome)를 세포 증식능 평가에 사용하였다. 이때, 상기 복합체의 최종 배합 농도는 iPSCs 유래 엑소좀은 40 μg이었고, 콜라겐은 100 μg이었다.
이와 마찬가지로, 동일한 최종 배합 농도를 갖도록 실시예 5에서 시험한 iPSCs 유래 엑소좀(40 μg) 및 HA 고분자(100 μg) 복합체를 제조하여, 상기 두 가지의 iPSCs 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자 복합체에 의한 세포 증식 효과를 비교 평가하였다.
구체적으로, 인간 섬유아세포인 BJ6 세포주를 48웰 플레이트에 1×104 cells/well로 분주하여 실험을 실시한 것 이외에, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 도 10에 나타낸 바와 같은 실험 조건 및 일정에 따라 BJ6 세포주 및 Cell Counting Kit-8(CCK-8)을 이용하여 24시간, 48시간 및 72시간에 걸쳐 세포 증식능을 평가하였다. 이때, 대조 물질은 비히클(Vehicle), 히알루론산 단독(HA, 100 μg), iPSCs 배양액 유래 엑소좀(40 μg), 콜라겐 단독(Collagen, 100 μg)을 사용하고, 시험 물질은 히알루론산(HA, 100 μg) 및 iPSCs 배양액 유래 엑소좀(40 μg) 융합 물질과 콜라겐(Collagen, 100 μg) 및 iPSCs 배양액 유래 엑소좀(40 μg)을 사용하였다.
세포의 생존율을 측정하기 위해 CCK-8 용액을 각 웰(well) 당 200 μL씩 처리한 것 이외에 실시예 1과 동일하게 실시하고, 반응 완료 후 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 후, 각 실험군의 세포 증식율은 대조군(vehicle)과 비교하여 백분율(%)로 계산하였다. 이때, 대조군을 상대적 비교값으로 100%로 고정하여 비교 계산하였다.
또한, iPSCs 배양액 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자 복합체 처리에 따른 세포 증식률의 차이를 확인하기 위해, 24시간, 48시간 및 72시간에 걸쳐 현미경을 통해 촬영하여 각 그룹별로 인간 섬유아세포 증식 정도를 확인하였다(도 11a 내지 도 11c).
대조군과 비교하여 iPSCs 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자 복합체 처리에 따른 세포 증식률의 차이를 확인해 본 결과, 피부 보습 및 개선 효과가 검증되어 화장품 및 재생 의료 소재로서 통상적으로 사용되고 있는 생체적합성 고분자 히알루론산 및 콜라겐과 iPSCs 배양액 유래 엑소좀의 주된 효능에 의하여 세포 증식능이 향상됨을 알 수 있었다(도 12).
구체적으로, 배양 72시간째 HA 단독(HA 100 μg) 처리군의 경우 130%, 콜라겐 단독(Collagen 100 μg) 처리군의 경우 189% 증가한 것과 비교하여 iPSCs 배양액 유래 엑소좀 단독(iPSCs exo 40 μg) 처리군의 경우 264% 수준으로 세포 증식률이 증가함을 확인하였다. 또한, iPSCs 배양액 유래 엑소좀 및 콜라겐 고분자 복합체는 256% 수준의 세포 증식률을 보였다. 특히, iPSCs 배양액 유래 엑소좀 및 HA 고분자 복합체는 280% 수준의 세포 증식률을 보였다.
이를 통해, iPSCs 유래 엑소좀, 특히 iPSCs 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자로서 HA 복합체에 의해 우수한 세포 증식 효과를 유도할 수 있음을 알 수 있었다. 이에, 궁극적으로 피부의 주름 개선 및 상처 재생 등의 피부 상태 개선 및 아토피 피부염과 같은 피부 질환의 증상 개선 등에 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (7)

  1. 유도만능줄기세포 유래 엑소좀; 및 콜라겐 또는 히알루론산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 콜라겐 및 히알루론산 또는 이의 염을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 유도만능줄기세포 배양액으로부터 수득된 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 피부 질환은 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학 조성물.
  5. 유도만능줄기세포 유래 엑소좀; 및 콜라겐 또는 히알루론산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 콜라겐 및 히알루론산 또는 이의 염을 포함하는 것인, 화장용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선은 주름의 발생 억제, 피부 노화 억제, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 상처 또는 창상 회복(wound healing), 각막 재생, 피부 자극 완화 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 화장용 조성물.
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