MX2010014281A - Protocolo de cultivo para la expansión de células madre hematopoyéticas humanas (cd133+ y cd34+) obtenidas por leucoféresis. - Google Patents

Abstract

Se presenta la invención de un método para el cultivo y la expansión de poblaciones de células madre hematopoyéticas humanas derivadas de sangre periférica. Particularmente, la invención reporta un método que obtiene selectivamente el enriquecimiento de las subpoblaciones de células CD133+ y CD133+&CD34+, consideradas células hematopoyéticas primitivas ó indiferenciadas. Por el procedimiento descrito, las células hematopoyéticas preferentemente son obtenidas por leucoaféresis, posterior a la estimulación de producción de células madre, utilizando agentes tales como análogos del factor de estimulación de formación de colonias de granulocitos. Las células hematopoyéticas pueden ser enriquecidas utilizando sistemas comerciales de columnas de afinidad y perlas magnéticas, tales como el kit CD133 Microbead Kit y columnas MS de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). La etapa de cultivo utilizando medio StemSpan H3000 serum-free culture media, de Stem Cell Technologies(r) suplementado por una combinación de tres factores de crecimiento, específicamente trombopoyetina (TPO), factor de células madre o "stem cell factor" (SCF), y el ligando de FL3 (ligando de la "FMS-like" tirosin quinasa 3 o FLT-3) en condiciones de 33+/- 2 °C sobre una superficie de cultivo adherente termoresponsiva. La recuperación de las células se realiza por simple decremento de la temperatura de incubación a 20-30 °C por espacio de 30 a 60 minutos.

Description

PROTOCOLOS DE CULTIVO PARA LA EXPANSIÓN DE CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS HUMANAS (CD133+ Y CD34+) OBTENIDAS POR LEUCOFÉRESIS CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece al campo técnico de la Biotecnología aplicada a la Biomedicina y la Medicina Clínica Humana.

OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención describe métodos de expansión ex-vivo de células madre hematopoyéticas humanas derivadas de procesos de leucoféresis. En estos métodos se utilizan medios de cultivo habitualmente utilizados en experimentos de cultivo de células de mamífero adicionados con mezclas de tres factores de crecimiento, trombopoyetina (TPO), stem cell factor (SCF) y ligando FLt3 (FL), en condiciones específicas de temperatura de 33+/-2°C y en superficies de adhesión termoresponsivas, tales que se maximice el crecimiento de la subpoblación de células hematopoyéticas CD34+, CD133+, y CD34+&CD133+ sobre la subpoblación de células CD45+.

ANTECEDENTES En un sentido general, la Terapia Celular puede ser definida como el uso clínico de células vivas para restablecer funciones de tejidos. Esta área del conocimiento promete ser una de las vertientes más importantes de la Medicina en las próximas décadas y es ya, una de las áreas más activas de investigación biomédica. Un pilar conceptual de la Terapia Celular y la Medicina Regenerativa es la existencia de poblaciones de células indiferenciadas pluripotenciales, también referidas como células madre, en los tejidos de humanos adultos. Las células madre (o células stem) retienen la propiedad de auto-renovarse y de diferenciarse en tejidos varios. In vivo, estas células son responsables de la renovación sostenida del tejido. Bajo demanda, se reproducen y diferencian progresivamente para restablecer y/o mantener el número de células diferenciadas necesario para la adecuada función del tejido donde se encuentran. En experimentos ex vivo, la capacidad de diferenciación de un grupo de células madre (ó stem) depende del ambiente fisicoquímico al que sean expuestas. Sin embargo, de acuerdo con su origen, algunos tipos de células madre poseen menor o mayor plasticidad (capacidad de diferenciarse en diferentes tejidos). En el extremo de la plasticidad biológica, las células madre embrionarias, son conceptualmente "totipotenciales". Así, al menos en principio, las células madre embrionarias podrían originar cualquier tipo de tejido (vascular, cardiaco, renal, hemático, epidérmico, etc.), si el ambiente adecuado de estímulos químicos o físicos le es provisto. Sin embargo, limitaciones técnicas y dilemas éticos impiden que, al menos por el momento, el potencial uso clínico de las células madre embrionarias se advierta como una realidad próxima.

Otros tipos de células madre no son considerados totipotenciales, pero pluripotenciales. Tal es el caso de las células madre hematopoyéticas, responsables de la generación de nuevas células sanguíneas (glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas, etc). Las células madre hematopoyéticas (ó HSCs por sus siglas en inglés) representan una alternativa, mucho más asequible, al uso de las células madre embrionarias. Las HSCs pueden obtenerse de cordón umbilical, o de tejidos de un adulto, principalmente de médula ósea o de sangre periférica. Para muchas aplicaciones clínicas, la obtención de HSCs a partir de sangre periférica resulta la alternativa más práctica y menos intrusiva.

La caracterización de poblaciones de células madre hematopoyéticas (HSCs) no es una tarea trivial. Las células hematopoyéticas no son diferenciables al microscopio por inspección simple; su morfología es muy similar a la de las otras células mayormente diferenciadas de su nicho. El recurso más ampliamente utilizado para caracterizar células madre hematopoyéticas es la identificación de ciertos receptores de membrana celular de carácter proteico. En células hematopoyéticas, algunas de estas proteínas de superficie, tales como el receptor CD133 y el receptor CD34, han sido asociadas con estadios celulares primitivos (poco diferenciados). Probablemente, el receptor CD34 es el más comúnmente relacionado con células madre hematopoyéticas (Gangenahalli et al, 2006, Stem Cells and Development 15: 305-313), aunque el receptor CD 133 es generalmente reconocido como indicador de estadios celulares aún más primitivos (Mizrak et al , 2008, Journal of Pathology 214:3-9; Miraglia et al, 1997, Blood 90:5013-5021). Ambos marcadores, CD34 y CD133, están presentes en forma abundante en los estadios más indiferenciados de poblaciones de células hematopoyéticas. Así, en general, las células CD133+ y CD34+ (referidas en este documento como CD133+&CD34+) se tipifican como células madre hematopoyéticas.

El receptor de superficie CD45 es otro de los marcadores comúnmente utilizados para caracterizar el grado de diferenciación de poblaciones de células hematopoyéticas. Contrario a los marcadores CD34 y CD133, el marcador CD45 se asocia a estadios celulares más diferenciados; no está presente en la superficie de células madre hematopoyéticas (Zola et al 2005, Blood 106:3123-3126). El receptor CD45 es una tirosina-fosfatasa transmembranal encontrada prácticamente en todos los leucocitos humanos (Shivtiel et al. 2008, J Exp Med. 205: 2381-2395). Por tanto, conforme las células hematopoyéticas transitan su proceso de diferenciación, sus receptores CD 133 y CD34 desaparecen progresivamente, expresando alternativamente el marcador CD45.

A diferencia de otros tipos de células madre, tales como las células madre embrionarias ó las células madre mesenquimales, las células madre hematopoyéticas difícilmente conservan su carácter indiferenciado por largos periodos en cultivo. Idealmente, un protocolo capaz de expandir ex vivo células madre hematopoyéticas manteniendo su carácter poco diferenciado, posibilitaría la aplicación clínica de células madre en transplantes autólogos para la reparación de tejidos. En el estado actual de la técnica, los periodos más largos de cultivo y expansión de poblaciones de células hematopoyéticas oscilan alrededor de 7 días. La Tabla 1 presenta un resumen de publicaciones recientes que refieren experimentos recientes de expansión de células madre hematopoyéticas. Algunos de estos reportes utilizan, como suplementos del medio de cultivo, los factores de crecimiento que son también utilizados en la presente invención (Ejemplos 1 ,3,4 y 5), aunque en distinta proporción y a distintas condiciones de temperatura, y utilizando diferentes superficies de cultivo.

Tabla 1. Resumen de publicaciones recientes relacionadas con experimentos de expansión de células madre hematopoyéticas.

(*) STD=desviaciones estándar; DND=dato no disponible; X= factor no utilizado; [1] Ueda et al., 2000, 105: 1013-1021. [2] Himburg ef al., 2010, Nature Medicine 16: 475-482. [3] Andrade-Zaldívar ef al., 2008, Cytotechnology. 151-160. [4] Yao, et al., 2006, Stem Cells and Development 15: 70-78. [5] Herrera, et al., 2001, British Journal of Haematology 114: 920-930. [6] Zech, et al., 2003, Journal oí Hematotherapy and Stem Cell Research 12: 367-373.

La presente invención presenta un método de cultivo de células hematopoyéticas, que induce la expansión selectiva de la subpoblación de células madre (CD133+, CD34+ y/o CD133+&CD34+). El método presentado incrementa significativamente estas subpoblaciones indiferenciadas, y las relaciones entre subpoblaciones asociadas con indiferenciación (CD133+/CD45+, CD34+/CD45+, CD133+&CD34+/CD45+, y CD 133+/CD34+). Así mismo, esta invención mejora de forma importante los factores de enriquecimiento de células madre observables después de 7 días de cultivo. Estos factores de enriquecimiento son calculados como el incremento en las relaciones entre las poblaciones celulares indicativas de indiferenciación (CD133+/CD45+, CD34+/CD45+, CD 133+&CD34+/CD45+, y CD133+/CD34+) con respecto a la condición inicial del cultivo. Específicamente, para propósitos de la caracterización del grado de diferenciación de poblaciones de células hematopoyéticas, los factores de enriquecimiento relevantes se definen como: (a) [CD133+/CD45+]dia 7 / CD133+/CD45+]día 0, (b) [CD34+/CD45+]dia 7 / CD34+/CD45+]dia 0, (c) [CD 133+&CD34+/CD45+]dia 7 / CD133+/CD34+/CD45+]dia o, (d) y [CD133+/CD34+]dia 7 / CD 133+/CD34+]día 0.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Algoritmo simplificado del procedimiento de aislamiento y expansión de células madre hematopoyéticas (CD 133+ y/o CD34+) a partir de sangre periférica. Las líneas punteadas indican que la etapa B es opcional.

Figura 2A. Crecimiento de células hematopoyéticas humanas obtenidas por leucoaféresis a partir de sangre periférica. Las imágenes corresponden a fotografías tomadas en microscopio (10X), después de 7 días de incubación a 37 °C en una atmósfera enriquecida con 5% de C02. Células cultivadas en medio DMEM F- 12 + 10% de suero bovino fetal (FBS).

Figura 2B. Crecimiento de células hematopoyéticas humanas obtenidas por leucoaféresis a partir de sangre periférica. Las imágenes corresponden a fotografías tomadas en microscopio (10X), después de 7 días de incubación a 37 °C en una atmósfera enriquecida con 5% de C02. Células cultivadas en medio Stem Span SFEM, 100 ng/mL de SFC, 100 ng/ml de FL3 y 10 ng/ml de TPO.

Figura 2C. Crecimiento de células hematopoyéticas humanas obtenidas por leucoaféresis a partir de sangre periférica. Las imágenes corresponden a fotografías tomadas en microscopio (10X), después de 7 días de incubación a 37 °C en una atmósfera enriquecida con 5% de C02. Células cultivadas en medio Stem Span SFEM , 150 ng/mL de SFC, 150 ng/ml de FL3 y 15 ng/ml de TPO.

Figure 3. Diseño experimental utilizado para identificar condiciones adecuadas para la expansión preferencial de células madre hematopoyéticas. Las variables estudiadas en el diseño experimental son temperatura y concentración de tres distintos factores de crecimiento. Los experimentos fueron conducidos utilizando placas de cultivo de 24 pozos 24-well Upcell®. Nota: Los experimentos 4,6,9,1 1 ,17 y 20 corresponden a réplicas de los puntos centrales del diseño experimental.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para el cultivo y la expansión de poblaciones de células madre hematopoyéticas humanas derivadas de sangre periférica. Particularmente, la invención reporta un método que obtiene selectivamente el enriquecimiento de las subpoblaciones de células CD133+, CD34+, y CD133+&Cd34+, consideradas células hematopoyéticas primitivas ó indiferenciadas.

El procedimiento descrito contempla las etapas de (a) obtención de las células hematopoyéticas humanas; (b) el opcional enriquecimiento de las subpoblaciones CD 133+; (c) el cultivo de las células hematopoyéticas en condiciones tales que maximicen la presencia de las subpoblaciones CD 133+, CD34+, y CD 133+&CD34+; y (d) ia recuperación de las células madre hematopoyéticas después de 5-8 días de cultivo.

Las células hematopoyéticas preferentemente son obtenidas por leucoféresis, posterior a la estimulación de producción de células madre (o movilización), utilizando agentes tales como análogos del factor de estimulación de formación de colonias de granulocitos (v.gr. G-CSF ó su análogo comercial Neupogen®).

Las células hematopoyéticas pueden ser enriquecidas utilizando sistemas comerciales de columnas de afinidad y perlas magnéticas, tales como el kit CD 133 Microbead it y columnas MS de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). La etapa de cultivo utilizando medio StemSpan H3000 serum-free culture media, de Stem Cell Technologies® suplementado por una combinación de tres factores de crecimiento en rangos de concentraciones particulares, específicamente factor de células madre ó "stem cell factor" (SCF) en el rango de 90-1 10 ng/mL, ligando de FLt3 (ligando de la "FMS-like" tirosin quinasa 3 ó FL) en el rango de 30-37 ng/mL y [¡trombopoyetina (TPO) en el rango de 8-12 ng/ml. Adicionalmente, el cultivo debe conducirse a una tempertaura de incubación de 33+/-2 °C y realizarse sobre una superficie de cultivo adherente termo-responsiva. Preferentemente, se recomienda utilizar placas para cultivo celular Nunc UpCell™ Surface plates de Thermo Scientific (Rochester, NY, USA). La recuperación de las células se realiza por simple decremento de la temperatura de incubación a 20-30 °C por espacio de 30 a 60 minutos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método de cultivo para la expansión de poblaciones de células madre hematopoyéticas humanas derivadas de sangre periférica. Particularmente, la invención reporta un método capaz de selectivamente enriquecer las subpoblaciones de células hematopoyéticas CD133+, CD34+, CD133+&CD34+, consideradas células hematopoyéticas primitivas ó indiferenciadas. Bajo los protocolos motivo de esta invención, este enriquecimiento es manifiesto puesto que no solamente las subpoblaciones CD133+, CD34+, CD133+&CD34+ se ven incrementadas a los siete días de cultivo, sino también las relaciones CD 133+/CD45+, CD34+/CD45+, CD 133+&CD34+/CD45+ (indicadores de grado de indiferenciación). Adicionalmente, la relación CD 133+/CD34+ se incrementa significativamente, lo que sugiere una expansión selectiva de la subpoblación CD133+ sobre la subpoblación CD34+. Esto es relevante, dado que en poblaciones de células hematopoyéticas, la población CD133+ es considerada más primitiva que la población CD34+.

Particularmente, la presente invención presenta un método para cultivar y expandir células madre hematopoyéticas humanas (CD 133+ y/o CD34+) que incluye las siguientes etapas (Figura 1 ): (A) Una etapa de obtención de las células hematopoyéticas a partir de sangre periférica de un humano, por "ejemplo por un proceso de leucoféresis ó aféresis, donde el número de células madre hematopoyéticas circulantes puede incrementarse por un proceso de estimulación (conocido como movilización) que típicamente considera la administración intravenosa de una gente movilizador, por ejemplo factor de células madre ó stem cell factor (SCF), factor estimulante de la formación de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de la formación de colonias de granulocitos-macró fagos, (GM-CSF), ó el ligando de Flt3 (FL). A partir del proceso de aféresis, el paquete de leucocitos, libre en lo posible de eritrocitos, debe ser aislado utilizando procedimientos conocidos en la práctica médica. Ilustrativamente, el producto de aféresis es centrifugado (por ejemplo a 300 Xg por 10 minutos) para separar el paquete celular del resto de los componentes sanguíneos. Bajo estas condiciones, el paquete celular está conformado por dos capas, la inferior conformada por eritrocitos y la superior dominada por células blancas. Los eritrocitos recuperados se descartan, recuperando la capa de células blancas.

Estas células deben ser lavadas en repetidas ocasiones (por ejemplo cinco ocasiones con una solución amortiguadora de fosfatos (PBS)), recuperándolas por centrifugación (por ejemplo a 300 Xg por 10 minutos) tras cada paso de lavado.

(B) Una etapa opcional de enriquecimiento de la subpoblación celular CD133+, por ejemplo utilizando columnas de afinidad magnética IMAC tales como el kit CD 133 Microbead Kit y columnas MS de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). Variantes de procedimiento pueden ser utilizadas. Ilustrativamente, en uno de estos variantes de procedimiento factible, el paquete de células blancas obtenidas por leucoféresis es resuspendido en solución amortiguadora (por ejemplo solución buffer contenida en el kit comercial referido, dilución 1 :20 de MACS BSA Stock Solution en autoMACS Rinsing Solution). Posteriormente, agente bloqueador FcR® blocking agent y micoesferas magnéticas anti- CD133 deben ser añadidas. La suspensión debe ser incubada a 4°C por aproximadamente 30 minutos. Posteriormente, se añade amortiguador MACS y la suspensión se centrifuga a 300 xg por espacio de 10 minutos, el sobrenadante se descarta, y el paquete celular se resuspende en solución amortiguadora MACS. La suspensión se inyecta a través de una columna MS, previamente acoplada a un Separador MiniMACS® de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany), y equilibrada con solución amortiguadora MACS. En esta columna, las células CD 133+ son preferentemente retenidas, mientras que el resto son preferentemente removidas por sucesivos lavados con solución amortiguadora MACS. Una vez que la columna ha sido liberada del magneto MiniMACS, las células retenidas en la columna son liberadas por lavados sucesivos con solución amortiguadora MACS.

(C) Una etapa de cultivo de 5 a 8 días, utilizando medio StemSpan H3000 serum-free culture media, de Stem Cell Technologies® suplementado por una combinación de tres factores de crecimiento en rangos de concentraciones particulares, específicamente factor de células madre ó "stem cell factor" (SCF) en el rango de 90-1 10 ng/mL, ligando de FLt3 (ligando de la "FMS-like" tirosin quinasa 3 ó FL) en el rango de 30-37 ng/ml, y trombopoyetina (TPO) en el rango de 8-12 ng/ml. Adicionalmente, el cultivo debe conducirse a una temperatura de incubación de 33+/-2 °C y realizarse sobre una superficie de cultivo adherente termo-responsiva. Preferentemente, se recomienda utilizar placas para cultivo celular Nunc UpCelFM Surface plates de Thermo Scientific (Rochester, NY, USA). Preferentemente, el cultivo debe iniciarse con una concentración no menor de 1X105 células hematopoyéticas/ml, y realizarse en una atmósfera enriquecida con 5% de C02.

(D) Una etapa de desprendimiento y recuperación celular, donde las placas de cultivo son expuestas a temperaturas en el rángo de 20 a 30 °C por espacio de 30 a 60 minutos, a fin de que las células se desprendan de la placa y la suspensión celular originada pueda ser recuperadas con alto rendimiento.

El método motivo de la presente invención, posee tres elementos fundamentales que le confieren ventajas significativas de simpleza, aplicabilidad y escalabilidad con respecto a otros métodos conocidos en el estado del arte. Estos elementos fundamentales son: (a) la formulación del medio de cultivo (medio StemSpan H3000 serum-free culture media, de Stem Cell Technologies® suplementado por una combinación de al menos factor de células madre ó "stem cell factor" (SCF) en el rango de 90-1 10 ng/mL, ligando de FLt3 (ligando de la "FMS-like" tirosin quinasa 3 ó FL) en el rango de 30-37 ng/ml y trombopoyetina (TPO) en el rango de 8-12 ng/ml; (b) la utilización de una temperatura de 33 +/- 2 °C, diferente a la convencionalmente utilizada para cultivo de células stem; (c) el uso de superficies termo-responsivas a para cultivo de células adherentes, que facilita de forma importante la recuperación de las células producto con altos rendimientos. La selección de estos tres elementos no corresponde a la sola yuxtaposición de aspectos conocidos en el estado del arte. En trabajos de investigación reportados previamente, varios autores han documentado el uso de formulaciones de medios de cultivo que contienen la combinación de SCF, TPO y FL (Tabla 1). Sin embargo, como los ejemplos 1, 3, 4 y 5 demuestran, variaciones relativamente menores en las concentraciones de estos tres factores de crecimiento tienen efectos importantes en la velocidad de crecimiento, los patrones de agregación, y los balances de las subpoblaciones de células hematopoyéticas. Las concentraciones de factores de crecimiento apropiadas para maximizar las subpoblaciones CD 133+, CD34+, CD133+&CD34+ no pueden ser determinadas a priori; un proceso de experimentación cuidadoso debe ser efectuado para tal propósito. Adicionalmente, la selección de la temperatura de cultivo de 33+/- 2°C no es intuitiva. La combinación de la temperatura de cultivo y las concentraciones específicas para maximizar la supboblación de células madre hematopoyéticas tampoco es intuitiva. Específicamente, para encontrar las condiciones apropiadas de cultivo para la expansión de células madre hematopoyéticas humanas, los inventores condujeron una serie de experimentos variando las concentraciones de SCF, FL3, y TPO (en el rango de 33.3-122.73 ng/ml, 33.3-122.73 ng/ml, y 3.33- 12.27 ng/ml respectivamente) utilizando el medio de cultivo StemSpan H3000 (libre de suero bovino fetal), de Stem Cell Technologies® como base.

Los experimentos correspondieron a un diseño experimental compuesto con seis puntos centrales. Dos temperaturas de cultivo fueron exploradas (33 °C y 37 °C). La Tabla 2 presenta los resultados de incremento en la población de células hematopoyéticas observado después de siete días de cultivo. Los incrementos poblacionales fueron calculados con base a determinaciones de conteos totales realizados por citometría de flujo. Se reporta el cociente del número de partículas por mililitro detectadas por citometría de flujo al día 7 con respecto al día 0 de los experimentos ([células hematopoyéticas]d¡a7/ células hematopoyéticas)d¡a ?]· Aunque la gran mayoría de los experimentos conducen a doblajes celulares significativos, solamente un reducido número de condiciones satisface otros criterios, relacionados con la expansión selectiva de las subpoblaciones CD133+, CD34+, y CD 133+&CD34+ (ver Ejemplos 3 y 4). Del espectro de condiciones de cultivo explorado, la condición de cultivo caracterizada por una suplementación con factor de células madre ó "stem cell factor" (SCF) en el rango de 90-1 10 ng/mL, ligando de FLt3 (ligando de la "FMS-like" tirosin quinasa 3 ó FL) en el rango de 30-37 ng/ml y trombopoyetina (TPO) en el rango de 8-12 ng/ml, con una incubación a una temperatura de 33+?2 °C, destaca por producir una expansión selectiva de la subpoblación de células madre hematopoyéticas (ver Ejemplo 5). Esta expansión selectiva, que puede ser caracterizada por el incremento en las relaciones de subpoblaciones CD133+/CD45+, CD34+/CD45+, CD133+&CD34+/CD45+, y CD133+/CD34+, es importantemente favorecida por el método motivo de la presente invención. La Tabla 3 documenta las relaciones de subpoblaciones celulares antes mencionadas, indicadores de indiferenciación, para la condición inicial de los experimentos aquí reportados y la condición motivo de la presente invención.

También se muestran las relaciones de subpoblaciones celulares promedio para los tratamientos correspondientes a todos los experimentos conducidos a 33 °C, a 37 °C, y la relación de subpoblaciones promedio para todos los experimentos (excepto el tratamiento motivo de la presente invención). Comparativamente, todos los indicadores de indiferenciación resultan más altos para la condición motivo de la presente invención. Adicionalmente, la Tabla 3 muestra los factores de enriquecimiento, calculados como los cocientes de las relaciones de subpoblaciones finales e iniciales para cada tratamiento experimental. Los factores de enriquecimeinto indican el número de veces que un tratamiento específico incrementó una relación de subpoblaciones con respecto a la condición inicial. El método motivo de esta invención induce factores de enriquecimiento muy superiores a los factores de enriquecimiento promedio para el resto de los tratamientos explorados.

Tabla 2. Número de doblajes con respecto al número inicial de células (eventos detectados en por citometría de flujo) para cada uno de 19 tratamientos (y un punto central) y en cada uno de los escenarios experimentales (7días de cultivo a 33 °C y 7 días de cultivo a 37°C). Signo positivo indica incremento, signo negativo indica decremento.

Los resultados experimentales presentados en los ejemplos 3, 4 y 5 demuestran que, dentro del amplio espectro de condiciones que los inventores han evaluado, las condiciones motivo de la presente invención son las más adecuadas para la expansión selectiva de subpoblaciones de células madre hematopoyéticas humanas. La identificación de estas condiciones, tanto de temperatura como de concentraciones de los tres factores de crecimiento suplementados, no resulta obvia a prióri.

Tabla 3. Tabla comparativa de cocientes de subpoblaciones celulares de distintos protocolos de cultivo de células hematopoyéticas. Se presentan factores de enriquecimiento (en renglones sombreados) con respecto a cuatro distintos indicadores de enriquecimiento (CD34+/CD45+; CD133+/CD45+; CD133+/CD34+; CD133+&CD34+/CD45+).

Cocientes de subpoblaciones celulares (7 días de cultivo) Tratamiento CD34/CD45 CD133/CD45 CD133/CD34 CD34&CD133/CD45 Condición inicial 0.04 0.02 0.55 0.01 Esta invención 19.82 20.81 1.05 1.20 Promedio de 5.28 1.62 0.26 0.16 tratamientos (T=33C) Promedio de 3.49 0.S6 0.20 0.07 tratamientos (T=37C) Promedio global (T=33 4.39 1.09 0.23 0.12 y 37 C) Factores de enriquecimientode subpoblaciones celulares respecto a la condición inicial Tratamiento (7 días de cultivo) CD34/CD45 CD133/CD45 CD133/CD34 CD348.CD133/CD45 Enriquecimiento inducido por esta . 495.50 1040.50 1.91 120.00 , invención 1 ¦:.·... . -> - . ·¦' • ... . ·..¾¦ Enriquecimiento 132.10 81.05 0.47 16.05 promedio (T=33C) Enriquecimiento > 87.26 ' ' ' ;2¿lÓv - ' 0.36 . , 7.25 promedio (T=37C) ! Enriquecimiento ; 109.68 54.58 0.42 • 11.65 promedio(33 y 37C) EJEMPLO 1. CRECIMIENTO DE CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS EN DISTINTOS MEDIOS DE CULTIVO Una serie de experimentos de cultivo de células madre hematopoyéticas, variando la composición del medio de cultivo, demostró que la velocidad de crecimiento, e inclusive la forma en que las células crecen, es altamente dependiente de la naturaleza del medio. La Figura 2 muestra imágenes al microscopio de experimentos de cultivo en diferentes medios. Los experimentos fueron conducidos en botellas de cultivo Corning®, incubando a 37 °C. La Figura 2A muestra el crecimiento típico de células madre hematopoyéticas observado cuando se utilizó medio DMEM F- 12 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Esta es una formulación típicamente utilizada para cultivar células de mamífero. La Figura 2B y 2C muestras dos versiones distintas de medio de cultivo, similares a aquella objeto de la presente invención (variando ligeramente las concentraciones de los factores de crecimiento TPO, SCF y FL3). Después de 7 días de cultivo a 37 °C y en una atmósfera enriquecida con 5% de C02, las células cultivadas en las formulaciones Stem Span + SCF, FL y TPO parecen más saludables y están presentes en mayor número. Es observable que, a distintas concentraciones de los factores de crecimiento, distintos patrones de crecimiento y asociación celular son posibles. Nuestros experimentos demuestras que, la concentración de factores de crecimiento (su combinación específica) es de significativa trascendencia para modificar el comportamiento de crecimiento y diferenciación celular durante los primeros siete días de cultivo. La determinación de la apropiada combinación de factores de crecimiento para maximizar el crecimiento de la subpoblación de células madre hematopoyéticas no es trivial, ni pudo haber sido estimada a priori.

EJEMPLO 2. OBTENCIÓN DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA El presente ejemplo ilustra la obtención y aislamiento de células hematopoyéticas humanas a partir de sangre periférica. Las células fueron obtenidas de un donador voluntario saludable adulto. El donador firmó una carta de consentimiento informado, acorde a los procedimientos establecidos por el Tecnológico de Monterrey. Las células fueron colectadas por un protocolo típico de aféresis, posterior a un régimen de movilización de tres días consecutivos con Filigrastim (Neupogen ®), un análogo de G-CSF. Posterior a la aféresis, las células fueron enriquecidas para el marcador CD133, utilizando el kit commercial CD133 Microbead Kit y columnas MS de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). En resumen, 10 mL del producto de leucoféresis fueron centrifugados a 1000 rpm por 10 minutos (300 Xg por 10 minutos). El pellet celular resultante consistió de dos capas. La capa celular inferior, correspondiente a eritrocitos fue descartada. La capa celular superior, correspondiente a células blancas, fue recuperada y lavada 5 veces utilizando 5 mL de solución amortiguadora de fosfatos (PBS). En cada lavado, el paquete de células blancas fue recuperado por centrifugación a 1000 rpm por 10 minutos. Posterior a la serie de cinco lavados, el paquete celular fue resuspendido en 600 µ? de solución amortiguadora MACS, incluida en el kit comercial utilizado (dilución 1 :20 de MACS BSA Stock Solution en autoMACS Rinsing Solution; de Miltenyi Biotec). Posteriormente, 200 de agente bloquedor FcR y 200 µ? de microesferas magnéticas CD133 fueron añadidas. La suspensión resultante fue incubada a 4°C por 30 minutos.

Posteriormente, un volumen de 2 mi de solución amortiguadora MACS fue añadido, y la suspensión fue sometida a centrifugación a 300 xg por 10 minutos. El paquete celular recuperado fue resuspendido en 2 mL de solución amortiguadora MACS y dispensado a través de una columna MS acoplada a un separador MiniMACS, y previamente equilibrada con 500 µ? de solución amortiguadora MACS. Presumiblemente, las células CD133+ son preferentemente retenidas en la columna, mientras que el resto son preferentemente removidas por cinco lavados sucesivos de 500 µ?_ con solución amortiguadora MACS. Una vez que la columna fue liberada del magneto MiniMACS, las células retenidas fueron liberadas por lavados sucesivos de 500 µ?_ con solución amortiguadora MACS, y la suspensión celular fue colectada para su posterior caracterización y cultivo (Ejemplos 3,4 y 5).

EJEMPLO 3. CONDICIONES DE CULTIVO PARA EL CRECIMIENTO DE LA POBLACIÓN DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS (CD133+) El presente ejemplo presenta resultados de una serie de experimentos donde se cultivan células hematopoyéticas humanas, obtenidas por leucoféresis, utilizando el método de expansión y las condiciones de cultivo motivo de la presente invención y variantes de estas condiciones. Particularmente, se documenta como variaciones relativamente menores en la formulación del medio de cultivo y en la temperatura tienen un efecto importante en ciertos indicadores objetivo del cultivo. Específicamente, este ejemplo documenta el efecto de dos temperaturas de cultivo (33 y 37 °C) y de variaciones en las concentraciones de la formulación del medio de cultivo (relacionadas con las concentraciones de SCF, FL3, y TPO en el rango de 33.3-122.73 ng/ml, 33.3-122.73 ng/ml, y 3.33-12.27 ng/ml respectivamente) en el incremento en la subpoblación de células que contienen el marcador CD 133 al término de un periodo de cultivo de 7 días. En general, dentro de los marcadores presentes en las células hematopoyéticas, el CD133 es considerado como el más primitivo. Por tanto, el número de células que aún presenten la proteína CD 133+ en su superficie, resulta un primer indicador conveniente de indiferenciación de un cultivo de células hematopoyéticas.

Se condujo un diseño experimental del tipo factorial completo con puntos centrales y puntos axiales (diseño central compuesto). El diseño contempló 14 experimentos y 6 repeticiones del punto central. En todos estos experimentos, las células fueron inoculadas al día 0 a una concentración de 1 X105 cel/ml en pocilios de placas de cultivo 24-well Nunc UpCell® Surface plates de Thermo Scientific (Rochester, NY, USA) de 1 mi de volumen. El conteo final de las células fue realizado a los 7 días de cultivo, realizando un cambio de medio al cuarto día de incubación. La estimación del número de células CD133+ se realizó por citometría de flujo, posterior al mareaje de las- células con anticuerpos específicos anti-CD 133 etiquetados con el fluoróforo CD 133-APC de Miltenyi Biotech®.

La Tabla 4 muestra el incremento en la subpoblación CD133+ bajo distintas condiciones de concentración de factores de crecimiento y de temperatura. Los incrementos están definidos como el cociente del número de células CD 133+ al día 7 y el número de células CD 133+ al día 0 ([CD 133+]dia 7/ [CD133+]d¡a o). En la Tabla 4 se señalan (con tipografía en negritas) los resultados de los experimentos donde se observó un incremento en la población CD133+ superior a aquel observado para los experimentos del punto central (experimentos número 4,6,9, 1 1 , 17 y 20).

Particularmente, la condición del experimento No. 5 (SCF a 100 ng/mL; FL3 a 33.33 ng/mL; TPO a 10 ng/mL) a temperatura de 33 °C, permite un incremento de más de 14X en el número de células hematopoyéticas CD133+.

Tabla 4. Número de doblajes con respecto al número inicial de células CD133+ (eventos detectados en por citometría de flujo) para cada uno de 19 tratamientos (y un punto central) y en cada uno de los escenarios experimentales (l-7días de cultivo a 33C;2-7 días de cultivo a 37C). Signo positivo indica incremento, signo negativo indica decremento.

El ejemplo siguiente ilustra cómo, para estas condiciones (experimento 5, T=33 °C), no solamente el número de células CD 133+ se ve incrementado con respecto a la condición inicial, sino también el número de células de la subpoblación CD133+&CD34+, normalmente tipificada como subpoblación de células madre hematopoyéticas.

EJEMPLO 4. CONDICIONES DE CULTIVO PARA EL CRECIMIENTO DE LA POBLACIÓN DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS (CD133+&CD34+) El presente ejemplo presenta resultados de una serie de experimentos donde se cultivan células hematopoyéticas humanas, obtenidas por leucoféresis, utilizando el método de expansión y las condiciones de cultivo motivo de la presente invención y variantes de estas condiciones. Particularmente, se documenta como variaciones relativamente menores en la formulación del medio de cultivo y en la temperatura tienen un efecto importante en ciertos indicadores objetivo del cultivo. Específicamente, este ejemplo documenta el efecto de dos temperaturas de cultivo (33 y 37 °C) y de variaciones en las concentraciones dé la formulación del medio de cultivo (relacionadas con las concentraciones de SCF, FL3, y TPO en el rango de 33.3-122.73 . ng/ml, 33.3-122.73 ng ml, y 3.33-12.27 ng/ml respectivamente) en el incremento en la subpoblación de células hematopoyéticas que contienen tanto el marcador CD133 como el marcador CD34 (fracción que denominaremos CD 133+&CD34+) al término de un periodo de cultivo de 7 días. En general, dentro de las células hematopoyéticas, es esta subpoblación la que se considera menos indiferenciada, por tanto tipificable como la subpoblación de células madre hematopoyéticas.

Se condujo un diseño experimental del tipo factorial completo con puntos centrales y puntos axiales (diseño central compuesto). El diseño contempló 14 experimentos y 6 repeticiones del punto central. En todos estos experimentos, las células fueron inoculadas al día 0 a una concentración de 1 105 cel/ml en pocilios de placas de cultivo 24-well Nunc UpCell® Surface plates de Thermo Scientifíc (Rochester, NY, USA) de 1 mi de volumen. El conteo final de las células fue realizado a los 7 días de cultivo, realizando un cambio de medio al cuarto día de incubación.

La estimación del número de células CD133+&CD34+ se realizó por citometría de flujo, posterior al mareaje de las células con anticuerpos específicos anti-CD 133 y anti-CD34 etiquetados con fluoróforos (anticuerpos CD133-APC y CD34-PE de Miltenyi Biotech®).

La tabla 5 muestra el incremento en la subpoblación de células que contiene ambos marcadores, CD34 y CD133 (CD133+&CD34+), bajo distintas condiciones de concentración de factores de crecimiento y de temperatura. Los incrementos están definidos como el cociente del número de células CD133+&CD34+ al día 7 y el número de células CD 133+&CD34+ al día 0 ([CD133+&CD34+]dia 7/ [CD 133+&CD34+]dja 0).

Tabla 5. Número de doblajes con respecto al número inicial de células CD133+&CD34+ (eventos detectados en por citometría de flujo) para cada uno de 19 tratamientos (y un punto central) y en cada uno de los escenarios experimentales (7días de cultivo a 33C; 7 días de cultivo a 37C). Signo positivo indica incremento, signo negativo indica decremento.

En la Tabla 5 se señalan (con tipografía en negritas) los resultados de los experimentos donde se observó un incremento en la población CD133+&CD34+ superior a aquel observado para los experimentos del punto central (experimentos número 4,6,9, 1 1 , 17 y 20). Particularmente, la condición del experimento No. 5 (SCF a 100 ng/mL; FL3 a 33.33 ng/mL; TPO a 10 ng/mL) permite un incremento de más de 3X en el número de células madre hematopoyéticas CD133+&CD34+. El ejemplo siguiente ilustra cómo, para estas condiciones (experimento No. 5), no solamente el número de células CD 133+&CD34+ se ve incrementado con respecto a la condición inicial, sino también su cociente con relación a las células diferenciadas.

EJEMPLO 5. CONDICIONES PARA LA EXPANSIÓN SELECTIVA DE CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS (CD133+ & CD34+) En los ejemplo 3 y 4 se muestra que, bajo ciertas condiciones de cultivo (específicamente SCF a 100 ng/mL; FL3 a 33.33 ng/mL; TPO a 10 ng/mL; T=33 °C) las subpoblaciones celulares CD133+ y CD 133+&CD34+ se ven incrementadas substancialmente en cultivos de 7 días de célula hematopoyéticas humanas obtenidas por leucoféresis. Adicionalmente, en el presente ejemplo se documenta que las poblaciones de células diferenciadas (aquellas que posee el marcador de superficie CD45+) no se ven incrementadas en igual proporción. Esto implica que, al final de un periodo de cultivo de 7 días, bajo las condiciones de cultivo motivo de la presente invención, se logra un enriquecimiento efectivo de las poblaciones CD133+ y CD 133+&CD34+.

La Tabla 6 presenta los resultados del diseño experimental central compuesto antes descrito (ejemplo 3 y ejemplo 4). En este caso, se reportan cocientes de subpoblaciones celulares relevantes para determinar el grado de expansión selectiva de las células menos diferenciadas ó células madre hematopoyéticas, bajo diferentes condiciones de cultivo.

Específicamente, se presentan los cocientes CD 133+/CD45+, CD34+/CD45+, CD 133+&CD34+/CD45+, y CD 133+/CD34+. En poblaciones de células hematopoyéticas, la presencia de los marcadores de superficie CD 133 y CD34 ha sido asociada a indiferenciación, mientras que el marcador CD45+ es aceptado como un indicador de diferenciación.

Tabla 6. Relaciones entre las subpoblaciones celulares (indicadores de indiferenciación) para cada uno de los tratamientos ensayados en el escenario de cultivo a T=33 °C.

Tratamiento No. Cocientes celulares (33 C, 7 días de cultivo) CD34/CD45 CD133/CD45 CD133/CD34 CD34CD133/CD45 Condición inicial 0.04 0.02 0.S5 0.01 1 2.18 0.80 0.37 0.17 2 1.29 0.36 0.28 0.05 3 3.52 0.59 0.17 0.06 5 19.82 20.81 1.05 1.20 7 3.72 0.63 0.17 0.10 8 7.46 0.69 0.09 0.18 10 11.77 0.71 0.06 0.12 12 2.52 0.71 0.28 0.16 13 0.75 0.39 0.52 0.06 14 4.33 0.69 0.16 0.11 15 0.87 0.22 0.25 0.04 16 1.62 0.28 0.18 0.04 18 18.68 0.90 0.05 0.24 19 0.27 0.14 0.51 0.02 Puntos centrales 4.48 0.75 0.17 0.11 Tratamiento Cocientes celulares (37 C, 7 días de cultivo) No. CD34/CD45 CD133/CD45 CD133/CD34 CD34CD133/CD45 1 2.93 0.30 0.10 0.07 2 2.79 0.77 0.27 0.05 3 10.07 1.61 0.16 0.16 5 1.19 0.07 0.06 0.02 7 0.74 0.47 0.64 0.06 8 4.27 0.67 0.16 0.19 10 8.39 0.49 0.06 0.07 12 4.79 0.71 0.15 0.09 13 3.52 0.64 0.18 0.06 14 3.16 0.29 0.09 0.08 15 1.00 0.28 0.27 0.04 16 8.23 0.62 0.08 0.12 18 0.77 0.10 0.13 0.02 19 2.30 0.74 0.32 0.12 Puntos centrales 2.61 0.58 0.22 0.05 Por tanto, los cocientes CD 133+/CD45+, CD34+/CD45+, CD 133+&CD34+/CD45+ constituyen indicadores generales de indiferenciación (entre más alto su valor, el cultivo contiene una mayor proporción de células en un estado temprano de diferenciación). En general, es aceptado que en células hematopoyéticas el marcador CD133+ se pierde más tempranamente en el proceso de diferenciación celular que el marcador CD34+. Por tanto, la subpoblación CD 133+ es considerada más primitiva que la subpoblación CD34+. Así, un incremento en el cociente CD 133+/CD34+ sugiere una expansión selectiva de las células más primitivas.

Nuestros resultados indican que (ver tabla 6), particularmente en las condiciones del experimento No. 5 (específicamente SCF a 100 ng/mL; FL3 a 33.33 ng/mL; TPO a 10 ng/mL; T=33 °C), se observa un enriquecimiento altamente selectivo de las subpoblaciones más primitivas presentes en cultivos de células hematopoyéticas humanas obtenidas por leucaféresis. Después de siete días de cultivo en estas condiciones, los indicadores de indiferenciación CD34+/CD45+ y CD133+/CD45+ se incrementaron de un valor inicial de 0.04 y 0.02 a valores de 19.82 y 20.81 respectivamente. El indicador CD133+&CD34+/CD45 también se incrementó significativamente, de un valor de 0.01 a 1.20. El lector podrá observar que, dentro del amplio espectro de condiciones evaluadas, las condiciones motivo de la presente invención son las más adecuadas para la expansión selectiva de subpoblaciones de células madre hematopoyéticas humanas. La identificación de estas condiciones, tanto de temperatura como de concentraciones de los tres factores de crecimiento suplementados, no resulta obvia a prióri.

Claims (4)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficiente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:

1. Una método para cultivar y expandir células madre hematopoyéticas humanas (CD133+ y/o CD34+) caracterizado porque incluye las etapas de: (A) obtención de las células hematopoyéticas humanas a partir de sangre periférica de un humano, *· (B) opcional enriquecimiento de la subpoblación celular CD133+, por ejemplo utilizando columnas de afinidad magnética IMAC, (C) una etapa de cultivo en el medio base StemSpan H3000 serum-free culture media, de Stem Cell Technologies® suplementado por una combinación de al menos tres factores de crecimiento, específicamente trombopoyetina (TPO), factor de células madre ó "stem cell factor" (SCF), y el ligando de FL3 (ligando de la "FMS-like" tirosin quinasa 3 ó FLT-3) en condiciones de 32 a 34 °C sobre una superficie de cultivo adherente termo-responsiva, preferentemente placas para cultivo celular responsivas a cambios térmicos Nunc UpCel M Surface plates de Thermo Scientific (Rochester, NY, USA); (D) una etapa de desprendimiento y recuperación celular, donde las placas de cultivo son expuestas a'temperaturas en el rango de 20 a 30 °C por espacio de 30 a 60 minutos, a fin de que las células se desprendan de la placa y la suspensión celular originada pueda ser recuperadas con alto rendimiento.

2. Un método para cultivó y expansión de células madre hematopoyéticas humanas, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque las concentraciones de los factores de crecimiento de ubican en los rangos de 90 a 1 10 ng/mL para el factor de células madre (stem cell factor ó SCF), de 50 a 70 ng/mL para el ligando FLt3 (ligando de la "FMS-like" tirosin quinasa 3 ó FL)), y de 8 a 12 ng/mL para para la trombopoyetina (TPO).

3. Un método para cultivo y expansión de células madre hematopoyéticas humanas, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la obtención de células hematopoyéticas humanas se realiza preferentemente por el proceso de leucoaféresis, habiendo estimulado la producción de células madre con agentes movilizantes tales como factor de células madre ó stem cell factor (SCF), factor estimulante de la formación de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de la formación de colonias de granulocitos-macrófagos, (GM-CSF), ó el ligando de Flt3 (FL).

4. Un método para cultivo y expansión de células madre hematopoyéticas humanas, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la obtención de células hematopoyéticas humanas se realiza preferentemente por el proceso de leucoaféresis, habiendo estimulado la producción de células madre con el agente Neupogen®, análogo del factor estimulante de la formación de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de la formación de colonias de granulocitos-macrófagos, (GM-CSF), ó el ligando de Flt3 (FL). Un método para cultivo y expansión de células madre hematopoyéticas humanas, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el enriquecimiento opcional de células hematopoyéticas humanas se realiza preferentemente utilizando el kit CQ133 Microbead Kit y columnas MS de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). Un método para cultivo y expansión de células madre hematopoyéticas humanas, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el cultivo de las células se realiza sobre placas para cultivo celular Nunc UpCell™ Surface plates de Thermo Scientific (Rochester, NY, USA);