CN101374945A - 得自人脂肪的细胞的免疫表型和免疫原性 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于产生经分离的、得自脂肪组织的下述基质细胞的组合物和方法，所述基质细胞展示出低水平的免疫原性。本发明包括用于降低与移植相关的免疫应答的组合物和方法，这是通过向接受者施用一定量的得自脂肪组织的基质细胞来实现的，所述的量能有效降低或抑制宿主排斥或者移植物抗宿主病。

Description

得自人脂肪的细胞的免疫表型和免疫原性
发明背景
再生医学的新兴领域正寻求将生物材料、生长因子和细胞组合起来，作为新型的疗法用于修复受损的组织和器官。随着该专业的发展，人们需要可靠、安全并且有效的人成体干细胞来源，用于组织工程应用。对于调控目的而言，必须通过可计量的纯度量度来界定这些细胞。对于临床水平的实践目的而言，这些细胞应当在医护地点有需求时作为可立刻获得的“现成(off the shelf)”产品来获得。从商业角度来看，使用同种异体(allogeneic)(而非自体)成体干细胞用于移植的能力将对产品开发具有显而易见的正面作用。在这些情况下，来自一个供体的单种大量细胞可被移植给多位患者，从而降低了质量控制和质量保证的成本。
干细胞还存在于成体生物体的组织中。最好的成体干细胞特征性例子是从骨髓和外周血分离的造血祖细胞(progenitor cell)。在没有进行治疗时，受到致死性辐照的小鼠会死亡，这是因为它们不能补充其循环血细胞；但是，移植来自同基因(syngeneic)供体动物的骨髓细胞会挽救宿主动物。供体细胞可用于重新增加(repopulate)循环血细胞。已进行了研究，以证实未分化的造血干细胞能在宿主动物中再生不同的血细胞谱系(lineage)。这些研究提供了骨髓移植的基础，骨髓移植是被广泛接受的用于癌症和先天性代谢缺陷的治疗形式。
直到近来，源自骨髓的造血干细胞(HSC)仍是唯一被接受的能多能分化以及自身更新的“成体”干细胞。现在，支持在多个组织位点存在干细胞的证据在不断积累。这些包括：多能成体祖细胞(MAPC)、来自骨髓的间质干细胞(MSC)、皮肤干细胞、耳MSC、来自中枢神经系统的神经干细胞、肝和胰腺干细胞以及来自骨骼肌的干细胞。得自脂肪的干细胞(ASC)展示出多种有利特征。得自白脂肪组织的成体干细胞能沿着脂肪细胞，软骨细胞，内皮，造血支持，肝细胞，神经，肌肉和造骨细胞谱系途径体外分化(Gimble et al.2003 Curr.Top.Dev.Biol.58：137-60；Halvorsen et al.2001 Metabolism50：407-13；Halvorsen et al.2001 Tissue Eng.7：729-41；Hicoket al.2004 Tissue Eng.10：371-80；Erickson et al.2002 Biochem.Biophys.Res.Commun.290：763-9；Safford et al.2004 Exp.Neurol.187：319-28；Safford et al.2002 Biochem.Biophys.Res.Commun.294：371-9；Zuk et al.2001 Tissue Eng.7：211-28；Zuk et al.2002 Mol.Biol.Cell.13：4279-95；Mizuno et al.2003 J.NipponMed.Sch.70：300-6；Seo et al.2005 Biochem.Biophys.Res.Commun.328：258-64)。脂肪组织容易获得、丰富并且可被补充，由此为每个个体提供了潜在的成体干细胞贮存库(reservoir)。这些发现代表着很多独立工作的团队的成果。但是，不同实验室的细胞制备物并不相同。人们相信，这些独立团队是通过对磨碎的脂肪组织进行胶原酶消化接着进行离心步骤来开始它们的细胞分离流程的。最初的细胞团块被定义为“基质血管级分”(SVF)。一些团队的注意力仅集中于这种被最小限度加工的细胞群(population)。而另一些则对SVF细胞的塑料粘着亚群进行扩增(expand)，用于多次传代；这些是被称为ASC的细胞。
哺乳动物免疫系统在保护个体免受感染物质影响以及预防肿瘤生长的方面扮演中枢性角色。但是，同样是免疫系统却可能产生不期望看到的作用，例如对来自不相关供体的细胞、组织和器官移植体的排斥。免疫系统不能将有益的入侵者(例如移植的组织)和有害的那些区分开来，因此免疫系统会排斥移植的组织或器官。对移植器官的排斥通常由宿主中存在的同种异体反应性(alloreactive)T细胞介导，这些T细胞识别供体的同种异体抗原(alloantigen)或异种抗原(xenoantigen)。
在遗传上全异的个体之间进行细胞、组织和器官移植总是会导致移植物排斥的风险。几乎所有细胞都会表达主要组织相容性复合体的产物，MHC I类分子。此外，当暴露给炎性细胞因子时，很多细胞类型可被诱导表达MHC II类分子。其它免疫原性分子包括得自次要组织相容性抗原的那些，例如Y染色体抗原，其被雌性接受者识别。对同种异体移植物的排斥主要由CD4和CD8亚类的T细胞介导(Rosenberget al.，1992 Annu.Rev.Immunol.10：333)。同种异体反应性CD4+T细胞产生能加剧对同种异体抗原的溶细胞CD8应答的细胞因子。在这些亚类中，细胞的竞争性亚群在抗原刺激后发展，特征在于它们产生的细胞因子。产生IL-2和IFN-γ的Th1细胞主要涉及同种异体移植物排斥(Mossmann et al.，1989 Annu.Rev.Immunol.7：145)。产生IL-4和IL-10的Th2细胞可以通过IL-10下调Th1应答(Fiorentino et.，1989J.Exp.Med.170：2081)。事实上，人们付出了很多努力，以将不期望看到的Th1应答转向Th2途径。典型地，用免疫抑制药物，例如强的松(prednisone)、硫唑嘌呤(azathioprine)和环孢霉素A来处理患者中不期望看到的同种异体反应性T细胞应答(同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病)。不幸的是，患者通常需要终生保持这些药物，并且，它们具有多种危险的副作用，包括普遍的免疫抑制。比全盘免疫抑制好得多的手段是诱导针对供体细胞同种异体抗原的特异性或局部抑制，而免疫系统保留完整。
人们相信，有多种方法可以诱导对于同种异体抗原的免疫耐受性，这将允许移植同种异体干细胞。不幸的是，在啮齿类动物模型中工作良好的很多手段应用于非人类灵长动物或人时都没有成功。类似地，使用核转移以制造与接受者遗传上相同的胚胎干细胞的克隆对于高等物种来说也存在问题，虽然近来有报道对人取得了有限的成功(Hwanget al.，2004，Science 303：1669)。该技术如何应用于工程改造其它类型的干细胞，以及操作和扩增所需的时间是否阻碍其可用性目前尚不清楚。
干细胞被报道为展示出低程度的免疫原性，这可能是由于它们分化和免疫调控性质的未成熟状态导致的。大鼠的胚胎干细胞类似细胞系(embryonic stem cell-likelines)表达低水平的MHC I类抗原，它们在表达MHC II类分子和CD80(B7-1)/86(B7-2)共激分子的方面是阴性的(Fandrich et al.，2002 Nat.Med.8：171)。当注射进门静脉时，这些细胞移植(engraft)进具有免疫活性的同种异体接受者大鼠的肝。移植归因于共刺激分子的缺乏以及干细胞系对FasL的表达。被活化的T细胞表达Fas受体，由此使得它们通过干细胞系对凋亡敏感。其它胚胎干细胞系是否也具有这些性质目前未知，因为移植的得自胎儿和胚胎干细胞的组织经常被接受者的免疫系统排斥(Bradley et al.，2002 Nat.Rev.2：859；Kaufman et al.，2000E-biomed 1：11)。得自啮齿类的神经干细胞表达低水平或可忽略水平的MHCI类或II类抗原(McLaren et al.，2001 J.Neuroimmunol112：35)，但是植入同种异体接受者后这些细胞通常会被排斥，除非使用了免疫抑制药物(Mason et al.，1986 Neuroscience 19：685；Sloan et al.，1991 Trends Neurosci.14：341；Wood et al.，1996Neuroscience 70：775)。暴露给IFN家族的炎性细胞因子后MHC分子在细胞膜上被上调，之后排斥得以初始化(McLaren et al.，2001 J.Neuroimmunol 112：35)。
器官移植的一个主要目标是将供体器官永久移植进去，而不会诱导出接受者产生的移植物排斥免疫应答，同时保持接受者针对其它外来抗原的免疫活性。典型地，为了预防宿主的排斥应答，使用非特异性免疫抑制剂，例如，环孢霉素、甲氨蝶呤、类固醇和FK506。这些抑制剂必须每日施用，如果停止施用，通常会导致移植物排斥。但是，使用非特异性免疫抑制剂的主要问题在于，它们通过抑制所有方面的免疫应答来发挥功能，由此大大增加了接受者对于感染和其它疾病(包括癌症)的易感性。此外，尽管使用了免疫抑制剂，移植物排斥仍是人类器官移植中发病率和死亡率的主要来源。大多数人类移植在10年内失败，移植物没有被永久接受。仅50％的心脏移植者能存活5年，仅20％的肾移植者能存活10年(Opelz et al.，1981 Lancet 1：1223)。
目前人们相信，成功的移植取决于对宿主对移植体的、不想要的免疫应答(由免疫效应器细胞介导)的预防和/或降低，以避免宿主对供体组织的排斥。此外，消除或降低供体组织针对接受者组织的、不想要的免疫应答(作为移植物抗宿主病已知)的方法对于成功移植来说也是有好处的。因此，人们对于能抑制或者预防与遗传上全异的个体间的细胞、组织和器官移植相关的不想要的免疫应答的方法存在长足需求。本发明满足了该需求。
发明内容
本发明包括经分离的、得自脂肪组织的成体基质(ADAS)细胞，其展示出非免疫原性特征，其中，所述细胞被传代至多达至少第二代，此外，其中，所述细胞表达选自人多药转运蛋白(ABCG2)和醛脱氢酶(ALDH)的干细胞相关特征。
在本发明的一个方面，ADAS细胞被传代至多达至少第十六代。
在另一个方面，外源性遗传物质被导入ADAS细胞。
在又一个方面，ADAS得自人。
在另一个方面，ADAS细胞对其接受者来说是同种异体的。在又一个方面，ADAS细胞对其接受者来说是异种的。
本发明还包括治疗移植体接受者以在接受者中降低效应器细胞针对同种异体抗原的免疫应答的方法，所述方法包括：以能有效降低效应器细胞对同种异体抗原的免疫应答的量，向移植体接受者施用展示出非免疫原性特征的ADAS细胞，其中，所述ADAS细胞已被传代至多达至少第二代，此外，其中，所述ADAS细胞表达选自人多药转运蛋白(ABCG2)和醛脱氢酶(ALDH)的干细胞相关特征，由此在移植体接受者中，效应器细胞具有降低的针对同种异体抗原的免疫应答。
在一个方面，效应器细胞是T细胞。在另一个方面，T细胞来自供体，同种异体抗原来自接受者。在又一个方面，T细胞来自接受者，同种异体抗原来自供体。
在另一个方面，T细胞存在于移植体中。
在又一个方面，效应器细胞是在向接受者施用ADAS细胞之前被活化的T细胞，并且，其中，免疫应答是供体对T细胞的再次活化。
在另一个方面，向移植体接受者施用ADAS细胞，以治疗接受者对于移植体的排斥。
在另一个方面，ADAS细胞得自哺乳动物。优选地，哺乳动物是人。
在另一个方面，免疫抑制剂与ADAS细胞组合施用给接受者。
在一个方面，ADAS细胞在移植体之前施用给接受者。在另一个方面，将ADAS细胞与移植体同时施用给接受者。在又一个方面，ADAS细胞作为移植体的一部分施用。在另一个方面，在进行移植体的移植后，将ADAS细胞施用给接受者。
在一个方面，向接受者静脉内施用ADAS细胞。
在另一个方面，效应器细胞是供体移植体接受者的细胞。
在又一个方面，ADAS细胞经过遗传修饰。
本发明还包括降低效应器细胞针对同种异体抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将效应器细胞与展示出非免疫原性特征的ADAS细胞接触，其中，所述ADAS细胞已被传代至多达至少第二代，此外，其中，所述ADAS细胞表达选自人多药转运蛋白(ABCG2)和醛脱氢酶(ALDH)的干细胞相关特征，所述ADAS细胞的量是能有效降低效应器细胞对同种异体抗原的免疫应答的。优选地，效应器细胞是T细胞。
本发明还包括从得自脂肪组织的细胞群分离ADAS细胞的方法，所述方法包括：提供特异于ABCG2的抗体；在适于形成抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体的条件下，将得自脂肪的细胞群与抗体接触；以及将抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体与得自脂肪的细胞群充分分开；由此分离出得自脂肪组织的基质细胞。
在一个方面，抗体与物理支持物缀合。
在另一个方面，物理支持物选自微珠、磁珠、包衣表面(panningsurface)、用于密度离心的密致颗粒、吸附柱和吸附膜。
在又一个方面，物理支持物选自链亲和素珠和生物素珠。
在一个方面，使用选自荧光活化细胞分选(FACS)和磁性活化细胞分选(MACS)的方法，将抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体与得自脂肪的细胞群充分分开。
本发明还包括从得自脂肪组织的细胞群富集得自脂肪组织的基质细胞的方法，所述方法包括：提供特异于ABCG2的抗体；在适于形成抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体的条件下，将得自脂肪的细胞群与抗体接触；以及将抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体与得自脂肪的细胞群充分分开；由此分离出得自脂肪组织的基质细胞。
本发明还包括从得自脂肪组织的细胞群鉴定出对ALDH阳性的ADAS细胞的方法，所述方法包括：向细胞群提供特异于ALDH的可切割底物，其中，当存在于ALDH+细胞中时该底物被切割，并且，其中，被切割的底物释放出荧光，由此鉴定出ALDH+ADAS细胞。
附图说明
为了阐述本发明的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施方式。但是，本发明不限于附图中描绘的实施方式的精确排列和手段。
图1(包括图1A至1D)是一系列图像，其描绘了对得自脂肪组织的细胞进行的菌落形成单位检测(CFU)。这些图描绘了代表下述菌落的染色情况：(图1A)甲苯胺蓝+CFU-F；(图1B)碱性磷酸酶+CFU-ALP；(图1C)油红O+CFU-Ad；和(图1D)茜素红+CFU-Ob。
图2是描绘得自脂肪的细胞的流式细胞术直方图。针对选用的来自代表性供体的造血细胞、干细胞以及基质细胞标记物的流式细胞术直方图在基质血管级分(SVF)和第2代(P2)阶段被展示。在每幅图的右上角示出了染色阳性的细胞的百分比。蓝线表示阳性染色细胞，红线表示同种型(isotype)匹配的单克隆抗体对照。
图3(包括图3A和3B)是一系列图表，其展示了得自脂肪的细胞的免疫表型的相对改变，这作为纯化和世代的函数展示。显示了相对于分离阶段和世代数的阳性染色细胞百分比。图3A描绘了与基质细胞相关的标记CD166、CD73、CD44和CD29。图3B描绘了与干细胞相关的标记，人多药转运蛋白(ABCG2)和CD34(图3A和图3B中世代数的排列顺序有所不同)。
图4是描绘作为纯化和世代函数的、对得自脂肪的细胞进行的醛脱氢酶染色的图表。
图5是描绘得自脂肪的细胞的流式细胞术直方图。针对选用的来自代表性供体的造血标记的流式细胞术直方图在基质血管级分(SVF)和第2代(P2)阶段被展示。在每幅图的右上角示出了染色阳性的细胞的百分比。蓝线表示阳性染色细胞，红线表示同种型(isotype)匹配的单克隆抗体对照。
图6是描绘作为纯化和世代的函数的、得自脂肪的细胞的免疫原性的图，免疫原性是通过对得自脂肪的细胞进行混合淋巴细胞反应(MLR)来评价的。图5描绘了来自单供体的代表性MLR。在不存在刺激(stimulator)细胞，存在自体经辐照PBMC(阴性对照)，存在同种异体经辐照PBMC(阳性对照)已及存在得自脂肪的细胞(SVF，P0-P4)时测定T细胞的增殖。刺激细胞以每孔5000、10000或20000的密度存在。
图7是展示了得自人脂肪的细胞(包括人SVF细胞和ADAS细胞)在双向(two-way)混合淋巴细胞反应中的免疫抑制效果的图表。
图8是对通过MLR测量的、骨髓基质细胞(BMSC)和ADAS细胞的免疫抑制效果进行比较的图表。ADAS和BMSC组织间的差别不显著(p>0.05，Student’s t检验)。
发明详述
本发明涉及下述发现：得自脂肪组织的成体基质(ADAS)细胞具有新型的免疫表型和免疫特征。ADAS细胞的新的特征提供了分离、培养这些细胞以及在细胞和/或基因疗法中使用这些细胞的方法。本发明包括用于分离和培养ADAS细胞以及将ADAS细胞移植给接受者的组合物和方法，其中，降低了宿主或移植物免疫排斥的可能性。
本发明可用于通过降低和/或消除接受者自身免疫系统针对移植体的免疫应答，来对移植体(例如生物相容性点阵(lattice)或供体组织、器官或细胞)进行移植。如下文更为详细描述的，ADAS细胞在抑制和/或预防移植体的同种异体移植物排斥方面发挥作用。
此外，本文提供的公开内容显示，ADAS细胞可用于抑制和/或预防供体移植体(例如生物相容性点阵或供体组织、器官或细胞)针对接受者组织的不想要的免疫应答，这是作为移植物抗宿主病已知的。
因此，本发明包括用于降低和/或消除接受者中对于移植体的免疫应答的组合物和方法，这是通过用能有效降低或抑制宿主的移植体排斥的量的ADAS细胞处理接受者来实现的。本发明还包括用于降低和/或消除宿主中外来移植体针对宿主的免疫应答(即，移植物抗宿主病)的组合物和方法，这是通过用ADAS细胞处理供体移植体和/或移植体接受者，以抑制或降低供体移植体针对接受者的不利(adverse)应答来实现的。
定义
下述每个术语在本文中使用时具有本章节中与其相关的含义。
冠词“a”和“an”在本文中使用时指一个至多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个元件(an element)”表示一个元件或多于一个元件。
术语“大约”将是本领域普通技术人员所理解的，其根据其上下文以一定程度变动。
术语“得自脂肪组织的细胞”指来源于脂肪组织的细胞。从脂肪组织中分离出的最初的细胞群是异质的(heterogenous)细胞群，其包括但不限于基质血管级分(SVF)细胞。
术语“得自脂肪的基质细胞”、“得自脂肪组织的基质细胞”、“得自脂肪组织的成体基质(ADAS)细胞”或“得自脂肪的干细胞(ASCs)”在本文中使用时可互换使用，它们指来源于脂肪组织的基质细胞，其可用作为干细胞类似细胞的前体，用于多种不同细胞类型，例如但不限于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉和神经/神经胶质细胞谱系。基于本发明的公开内容，ADAS细胞包括具有新型的免疫原性特征(包括但不限于ABCG2和ALDH的表达)的干细胞类似细胞的充分同质的群。此外，本发明的ADAS细胞在关于诱发T细胞增殖的方面不是免疫原性的。ADAS细胞构成得自脂肪组织的亚组群，可使用标准培养流程或本文公开的方法将它们与脂肪组织的其它组分分开。此外，可使用本文公开的细胞表面标记从细胞混合物中分离ADAS细胞。
术语“晚代的得自脂肪组织的基质细胞”在本文中使用时指较之较早代的细胞而言展示出较少免疫原性特征的细胞。得自脂肪组织的基质细胞的免疫原性对应于世代数。优选地，细胞已被传代至多达至少第二代，更优选地，细胞已被传代至多达至少第三代，最优选地，细胞已被传代至多达至少第四代。
“脂肪”指任何脂肪(fat)组织。脂肪组织可以是棕脂肪组织或白脂肪组织。优选地，脂肪组织是皮下的白脂肪组织。此类细胞可包含初级细胞培养物或经固定的细胞系。脂肪组织可来自具有脂肪组织的任何生物体。优选地，脂肪组织是哺乳动物的，最优选地，脂肪组织是人的。人脂肪组织的方便来源是从抽脂术中获得的。但是，脂肪组织的来源或分离脂肪组织的方法对本发明来说并不关键。
“同种异体”指得自同一物种的不同动物的移植物。
“得自同种异体脂肪的成体基质细胞”在本文中被定义为从与接受者相同的物种的不同个体获得的。
“同种异体抗原”是与接受者表达的抗原不同的抗原。
术语“自体”在本文中使用时用来表示得自同一个体的任何材料，之后其将被再次引入该个体。
“异种”指得自不同物种的动物的移植物。
术语“生物相容性点阵”在本文中使用时用来表示能协助形成有益于组织发育的三维结构的基底。因此，例如，可将细胞培养或接种到此类生物相容性点阵(例如包括细胞外基质(matrix)材料、合成聚合物、细胞因子、生长因子等的点阵)上。点阵可被成型为想要的形状，以协助组织类型的发育。此外，至少在细胞培养的早期阶段，培养基和/或基底中补充有协助合适的组织类型和结构发育的因子(例如，生长因子、细胞因子、细胞外基质(matrix)材料等)。
“供体抗原”指将被移植进接受者的供体组织表达的抗原。
“分化培养基”在本文中用来指这样的细胞生长培养基，其包含添加剂或缺乏添加剂，使得当在所述培养基中对干细胞、得自脂肪的成体基质细胞或没有完全分化的其它此类祖细胞进行温育时，所述细胞能够发育为具有分化细胞全部或部分特征的细胞。
“效应器细胞”在本文中使用时指介导针对抗原的免疫应答的细胞。当移植体被引入接受者中的情况下，效应器细胞可以是接受者自身的细胞，其引发针对存在于供体移植体中的抗原的免疫应答。在其它情况下，效应器细胞可以是移植体的一部分，由此将移植体引入接受者导致存在于移植体中的效应器细胞引发了移植体针对接受者的免疫应答。
“扩增能力”在本文中使用时用于表示细胞增殖的能力，增殖例如是数量上的扩增，或者，在细胞群的情况下，经历群倍增(populationdoubling)。
“移植物”指用于移植的细胞、组织、器官或者任何生物相容性点阵。
“生长因子”意指下述特定因子，其包括但不限于：生长激素、促红细胞生成素、血小板生成素、白细胞介素3、白细胞介素6、白细胞介素7、巨噬细胞菌落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、骨保护素配体、胰岛素、类胰岛素生长因子、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子、睫状节神经细胞营养因子、得自血小板的生长因子(PDGF)以及骨成型蛋白，其浓度为皮克/ml至毫克/ml之间的水平。
术语“生长培养基”在本文中使用时指促进细胞生长的培养基。生长培养基通常将含有动物血清。在一些情况下，生长培养基可以不含动物血清。
细胞的“免疫表型”在本文中用于表示细胞关于细胞表面蛋白质情况方面的表型。
“经分离的细胞”指已与组织或哺乳动物中天然伴随该经分离细胞存在的其它组分和/或细胞分开的细胞。
术语“多能”或“多能性”在本文中使用时用来表示中枢神经系统的干细胞分化为多于一种类型的细胞的能力。
术语“调节”在本文中使用时用来表示生物状态的任何改变，即，增加、减少等。
术语“非免疫原性”在本文中使用时用来表示下述发现：在MLR中ADAS细胞不诱导T细胞的增殖。但是，非免疫原性不应当被局限于MLR中的T细胞增殖，其还应当用于不诱导T细胞体内增殖的ADAS细胞。
“增殖”在本文中被用于表示相似形式的，尤其是细胞的繁殖或倍增。即，增殖包括产生更大数量的细胞，可通过对细胞数量进行简单计数、测量并入细胞的3H-胸苷等方法来对其进行测量。
“细胞周期的进程或经历细胞周期的进程”在本文中用于表示细胞通过其准备和/或进入有丝分裂和/或减数分裂的过程。经历细胞周期的进程包括经历G1期、S期、G2期和M期的进程。
术语“前体细胞”、“祖细胞”和“干细胞”在本领域和本文中可互换使用，其指潜能的(pluripotent)或不受谱系约束(lineage-uncommitted)的祖细胞，其潜在地能够进行无限次的有丝分裂，以自身更新或产生将分化为想要的细胞类型的后代细胞。与潜能干细胞不同，受谱系约束的祖细胞通常被认为不能产生表型上互相有所不同的大量细胞类型。实际上，祖细胞仅能产生一种或者可能两种受谱系约束的细胞类型。
术语“基质细胞培养基”在本文中使用时表示用于培养ADAS细胞的培养基。基质细胞培养基的例子是包含DMEM/F 12 Ham′s、10％胎牛血清、100U青霉素/100μg链霉素/0.25μg两性霉素B(Fungizone)的培养基。典型地，基质细胞培养基包含基础培养基、血清和抗生素/抗真菌剂。然而，可以用没有抗生素/抗真菌剂，但是补充有至少一种生长因子的基质细胞培养基来培养ADAS细胞。优选地，生长因子是人表皮生长因子(hEGF)。hEGF的优选浓度是大约1-50ng/ml，更优选地，浓度是大约5ng/ml。优选的基础培养基是DMEM/F12(1:1)。优选的血清是胎牛血清(FBS)，但其它血清也是可用的，包括马血清或人血清。优选将向上述培养基中加入多达20％的FBS，以支持基质细胞的生长。但是，如果FBS中对于基质细胞生长来说必要的生长因子、细胞因子和激素被鉴定出来并且以合适的浓度提供于生长培养基中的话，那么可以使用限定的(defined)培养基。还应认识到，可向培养基中加入额外的组分。此类组分包括但不限于抗生素、抗真菌剂、清蛋白、生长因子、氨基酸和本领域已知用来培养细胞的其它组分。可加入培养基的抗生素包括但不限于青霉素和链霉素。培养基中青霉素的浓度为每ml大约10至大约200单位。培养基中链霉素的浓度为大约10至大约200μg/ml。但是，不应以任何方式将本发明解释为局限于用于培养基质细胞的任何一种培养基。事实上，能在组织培养中支持基质细胞的任何培养基都可使用。
在本文中使用时，“经充分纯化的”细胞是基本上不含其它细胞类型的细胞。因此，经充分纯化的细胞指已从其天然存在状态下通常相结合的其它细胞类型纯化出来。
“移植体”指待移植的生物相容性点阵或供体组织、器官或细胞。移植体的一个例子可以包括但不限于组织、干细胞、神经干细胞、皮肤细胞、骨髓以及实体器官，例如心脏、胰腺、肾、肺和肝。
“治疗有效量”在本文中使用时是足以向施用ADAS细胞的受试者提供有益效果的ADAS细胞的量。
术语“治疗移植体接受者，以降低接受者中效应器细胞针对施用给接受者的同种异体抗原的免疫应答”这一短语在本文中使用时表示通过任何方法减少接受者中针对同种异体抗原的内源性免疫应答，例如通过向接受者施用ADAS细胞来进行，减少是较之没有用ADAS细胞处理过的同样的动物的内源性免疫应答而言的。可使用本文公开的方法或者用于评估动物中内源性免疫应答的任何其它方法来评估内源性免疫应答的减少。
“内源性”在本文中使用时表示从生物体、细胞或系统产生或在生物体、细胞或系统中产生的任何物质。
“外源性”表示从生物体、细胞或系统引入或者在生物体、细胞或系统外产生的任何物质。
“编码”表示多核苷酸中特定核苷酸序列(例如基因、cDNA或mRNA)用作为模板在生物学过程中合成具有给定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或给定的氨基酸序列以及来源于此的生物学性质的其它聚合物或大分子的内在性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中生产出蛋白质，那么该基因就编码该蛋白质。编码链(与mRNA序列相同的核苷酸序列，其通常被提供于序列表中)和非编码链(用作为模板以转录基因或cDNA)可被称为是编码蛋白质或者该基因或cDNA的其它产物。
除非另有指明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互相是简并版本并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
“经分离的核酸”指已与天然存在的状态下在其侧翼的序列分开的核酸片断或片段，即，已除去通常邻近该片段的序列(即，在该片段天然存在的基因组中邻近该片段的序列)的DNA片段。该术语还可用于这样的核酸，所述核酸已与天然伴随该核酸的其它组分(即，在细胞中天然伴随其的RNA或DNA或蛋白质)充分纯化开来。该术语因此包括重组DNA，例如，被并入载体的，并入自主复制质粒或病毒的，或并入原核生物或真核生物的基因组DNA的，或者作为单独分子(即，作为cDNA或通过PCR或限制性酶消化产生的基因组或cDNA片段)独立于其它序列存在的。该术语还包括是编码额外的多肽序列的杂交体基因的一部分的重组DNA。
在本发明的上下文中，使用了下述缩写，用于常见核酸碱基。“A”表示腺苷，“C”表示胞苷，“G”表示鸟苷，“T”表示胸苷，“U”表示尿苷。
短语“在转录控制下”或“与......可操作地相连”在本文中使用时表示，启动子处于相对多核苷酸来说的正确位置和定向，以控制RNA聚合酶初始化以及多核苷酸的表达。
术语“启动子/调控序列”在本文中使用时表示与所述启动子/调控序列可操作地相连的基因产物表达所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，在其它一些情况下，该序列还可包括增强子序列和基因产物表达所需的其它调控元件。启动子/调控序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
“组成型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或特别指定(specify)基因产物的多核苷酸可操作地相连时，使得：在细胞的大多数或所有生理条件下基因产物都能在细胞中产生。
“可诱导”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或特别指定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，使得：基本上仅在对应于该启动子的诱导剂存在于细胞中时，基因产物才会在细胞中产生。
“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或特别指定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，使得：基本上仅当细胞是对应于该启动子的组织类型的细胞时，基因产物才会在该细胞中产生。
“载体”是组合物，其包含经分离的核酸，可用于将经分离的核酸递送至细胞内部。本领域已知大量载体，其包括但不限于：线性多核苷酸、与离子性或两性化合物相结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还将被解释为包括协助将核酸转移进细胞的非质粒和非病毒化合物，例如，多熔素(polylysine)化合物、脂质体等。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
“表达载体”指包含下述重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作相连的表达控制序列。表达载体包含足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞提供，或者在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的全部那些，例如并入有重组多核苷酸的粘粒、质粒(即，裸的或被含有于脂质体中的)和病毒。
描述
本发明涉及下述发现：当将得自脂肪组织的成体基质(ADAS)细胞与从不同个体获得的T细胞(同种异体T细胞)接触时，同种异体T细胞不会增殖。现有技术的教诲表明，当T细胞与任何其它细胞类型混合时，T细胞的增殖会随之发生。混合淋巴细胞反应(MLR)是用于评价免疫原性(即，通过MLR测量的、细胞诱导T细胞增殖的能力)的检测。本文公开的数据表明，得自一个个体的T细胞并不会应答于从不同个体获得的ADAS细胞。因此，基于本文提供的公开内容，在关于呈现T细胞应答的方面，ADAS细胞对于免疫系统来说不是免疫原性的。
在本发明的一种实施方式中，ADAS细胞的免疫表型和免疫原性与世代数是对应的。基于本文提供的公开内容，较之较早代的细胞而言，越晚代的细胞的免疫原性越少。优选地，细胞已被传代了至少两代。优选地，细胞已被传代了至少三代。更优选地，细胞已被传代了至少四代。
在本发明的另一实施方式中，在分离之后可对细胞进行培养，如果合适的话，在治疗性使用之前针对细胞的免疫原性和免疫表型对其进行检测。优选地，使用本文公开的标准细胞培养基对细胞进行不分化的培养。优选地，细胞可被传代至至少五代，更优选地，细胞可被传代至至少10代或更多代。例如，细胞可被传代至至少15代，优选地，至少16代，更优选地，至少17代，还更优选地，至少18代，优选地，至少19代，或者甚至至少20代，而不丢失它们的多能性。基于本文公开的内容，本领域技术人员将认识到，细胞不是免疫原性的，因此对于移植进哺乳动物来说是有利的。
除了本发明的ADAS细胞对于不同个体中T淋巴细胞的非免疫原性表型之外，基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到，ADAS细胞可抑制同种异体细胞间的MLR，例如，来自一个个体的T细胞和来自另一个体的外周血单核细胞(PBMC)之间的。在一个方面，ADAS细胞可主动降低T细胞和PBMC(每种都是从不同个体获得的)之间的MLRs中同种异体T细胞应答。
此外，如本文其它地方更为详细地讨论的，ADAS细胞的免疫表型与培养该细胞所用的方法相关。例如，ADAS细胞的免疫表型被定义为它们的分离阶段、它们的世代数、细胞是否作为粘着群培养以及培养时间长度(但并不限于这些)的函数。基于本发明的公开内容，ADAS细胞可成功用于细胞和/或基因疗法。即，本发明的细胞被移植进个体时，移植物宿主产生免疫排斥的可能性降低。此外，ADAS细胞可用作为治疗剂，用于抑制宿主的移植体排斥，以及用作为治疗剂，用于预防或者抑制移植后发生的移植物抗宿主病。由此，本发明包含用于产生可用于实验/治疗目的的ADAS细胞的组合物和方法。
I.分离和培养ADAS
可通过本领域技术人员已知的多种方法来分离可用于本发明方法中的ADAS细胞。例如，此类方法被描述于美国专利No.6,153,432，其整体并入本文。在一种优选的方法中，从哺乳动物受试者，优选地，从人受试者分离ADAS细胞。
得自脂肪的细胞的免疫原性根据培养流程(即，世代数)逐渐改变。通过人的得自脂肪的细胞对于塑料的粘着性以及随后的扩增，选出了较之粗制基质血管级分的异质性来说相对同质的细胞群，其中富含表达“基质”免疫原性的细胞。ADAS细胞还表达干细胞相关标记，其包括但不限于人多药转运蛋白(ABCG2)和醛脱氢酶(ALDH)。
基于本文的公开内容，得自脂肪的细胞的免疫表型可被利用来作为针对ADAS细胞的独特鉴定子。即，本发明的细胞上的独特细胞表面标记可用于从得自脂肪组织的细胞的混合群中分离出特定的细胞亚群。本领域技术人员将认识到，特异于细胞表面标记的抗体可与物理支持物(即，链亲和素珠)缀合，由此提供机会，以分离细胞表面特异性的得自脂肪的细胞。然后可使用本文公开的方法或传统方法体外培养和扩增经分离的细胞。
本发明的另外一种实施方式包括提取或分离自脂肪组织的细胞亚群的方法。本发明涉及下述发现：得自脂肪组织的细胞的免疫表型是世代数的函数。由此，可通过温育细胞的混合群中的ADAS细胞特异性结合的抗体，接着进行分离步骤(包括但不限于磁性分离)来从得自脂肪组织的细胞的混合物中提取ADAS细胞。与ADAS细胞特异性结合的抗体的例子包括但不限于抗-ABCG2抗体。磁性分离的过程通过使用磁珠来完成，磁珠包括但不限于
Figure A200680029985D00221
(Dynal Biotech，BrownDeer，WI)。除了使用
Figure A200680029985D00222
之外，还可用MACS分离试剂(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)来从细胞的混合群中提取ADAS细胞。作为分离步骤的结果，可获得经富集的ADAS细胞群。优选地，ADAS细胞群是经纯化的细胞群。
本发明的细胞的免疫表型提供了使用基于流式细胞术的细胞分选器对特定的得自脂肪的细胞进行分选的方法。优选地，使用本文公开的方法分离出ADAS细胞。然后可体外培养经分离的ADAS细胞，以产生可用于实验或治疗目的的、希望数量的细胞。
能支持细胞培养物中成纤维细胞的任何培养基可用于培养ADAS。支持成纤维细胞生长的培养基配方包括但不限于，最小限度必要培养基Eagle、ADC-1、LPM(不含牛血清清蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(具有及不具有Fitton-Jackson改良)、基础培养基Eagle(BME-添加有Earle′s盐基础)、Dulbecco′s经改良Eagle培养基(DMEM-不具有血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy′s5A培养基、培养基M199(M199E-具有Earle′s盐基础)、Medium M199(M199H-具有Hank′s盐基础)、最小限度必要培养基Eagle(MEM-E-具有Earle′s盐基础)、最小限度必要培养基Eagle(MEM-H-具有Hank′s盐基础)和最小限度必要培养基Eagle(MEM-NAA，具有非必要氨基酸)等。用于培养ADAS的优选培养基是DMEM，更优选地，是DMEM/F12(1:1)。
可用于本发明的方法的培养基的其它非限制性例子可含有浓度为至少1％至大约30％的牛或其它物种的胎血清，优选地，至少大约5％至15％，最优选地，大约10％。鸡或其它物种的胚提取物可以以大约1％至30％的浓度存在，优选地，至少大约5％至15％，最优选地，大约10％。
分离之后，在培养设备中的基质细胞培养基中，对ADAS细胞温育一段时间，或者直到细胞达到汇合，之后将细胞转到另外的培养设备。最初的涂布之后，细胞可在培养物中保持大约6天的时间，以产生第0代(P0)群。细胞可被传代不定数的次数，每次传代包括培养细胞大约6-7天，在此期间细胞倍增时间可在3-5天的范围内。培养设备可以是常用于体外培养细胞的任何培养设备。优选的培养设备是培养瓶，更优选的培养设备是T-225培养瓶。
可在补充有hEGF的基质细胞培养基中，不存在抗生素/抗真菌剂的情况下，对ADAS细胞培养一段时间，或者直到细胞达到一定水平的汇合。优选地，汇合水平高于70％。更优选地，汇合水平高于90％。一段时间可以是适于体外培养细胞的任何时间。在对ADAS细胞培养期间的任何时间，可替换基质细胞培养基。优选地，每3至4天替换一次基质细胞培养基。然后从培养设备中收获ADAS细胞，接着，ADAS细胞可立刻使用，或者可被冷冻贮存，以备后用。可通过胰蛋白酶处理、EDTA处理或者用于从培养设备中收获细胞的任何其它流程来收获ADAS细胞。
可根据常规流程来对本文描述的ADAS细胞进行冷冻贮存。优选地，在含有10％DMSO的基质细胞培养基中，液N2的蒸气相下，对大约一百万至一千万个细胞进行冷冻贮存。可通过在37℃水浴中涡旋来解冻冷冻的细胞，再将其重新悬浮于新鲜的生长培养基中，并按常规培养。
本发明还涉及下述发现：ADAS细胞的免疫表型是世代数的函数。ADAS细胞的免疫表型和免疫原性性质被界定为培养流程(即，粘着性质、世代数、培养时间长度)的函数。本文公开的内容显示，经新鲜分离的基质血管级分(SVF)细胞和早代的ADAS细胞能刺激PBMC，而较晚代的ADAS细胞则不是免疫原性的。
观察到，人SVF细胞和早代的得自脂肪组织的粘着细胞引发与同种异体PMBCs相当的剂量依赖性MLR应答。随着逐渐的传代，ADAS细胞引发的MLR应答减少，其在第1代(P1)跌落至与用自体PBMC观察到的水平相当的水平。细胞可被传代至不定数的次数。事实上，较晚代的ADAS细胞不是免疫原性的。例如，细胞被传代至至少P2；更优选地，细胞被传代至至少P3；还更优选地，细胞被传代至至少P4。观察到的晚代ADAS细胞缺乏免疫原性的特征给出了如下指示：向哺乳动物施用ADAS细胞用于细胞/基因疗法时，宿主或移植物产生免疫排斥的可能性降低。
基于本文公开的内容，还相信，晚代细胞可能表达抑制PBMC对于已知刺激细胞的增殖性应答的免疫抑制因子。因此，本发明的细胞可用于在它们被引入的哺乳动物中诱导免疫抑制效果。例如，在存在同种异体PBMC作为刺激细胞的情况下，当将晚代细胞加入到MLRs中时，它们可以抑制增殖性应答。
如本发明所包括的，典型地，从来自人的抽脂术物质中分离ADAS细胞。如果本发明的细胞将被移植进人类受试者，优选从同一受试者分离ADAS细胞，由此提供自体移植体。但是，同种异体移植体也是本发明所包括的。
因此，在本发明的另一方面，施用的ADAS细胞可以是对于接受者来说同种异体的。可从是与接受者相同物种的不同个体的供体分离同种异体ADAS细胞。分离之后，使用本文公开的方法培养细胞，以生产同种异体产物。本发明还包括对于接受者来说是异种的ADAS细胞。
II.抑制宿主的移植体排斥的疗法
本发明包括使用ADAS细胞作为抑制宿主的移植体排斥的疗法的方法。本发明基于如下发现：ADAS细胞不刺激同种异体T细胞增殖。由此，本发明包括使用ADAS细胞来抑制应答于外源性器官、组织或细胞的T细胞增殖。本发明还包括以能有效降低与T细胞增殖相关的免疫应答的量向哺乳动物施用ADAS细胞的方法。
基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到，ADAS细胞可被利用来，包括抑制应答于移植进哺乳动物的、从不同个体获得的任何类型的器官、组织或细胞的T细胞增殖。例如，可使用ADAS细胞来抑制应答于细胞，包括但不限于神经干细胞(NSC)、肝细胞、心脏细胞、软骨细胞、肾细胞和脂肪细胞等的T细胞增殖。
本发明包括降低和/或消除接受者中对移植体的免疫应答的方法，所述方法通过向移植体的接受者施用能有效降低或抑制宿主的移植体排斥的量的ADAS细胞来实现。在不希望被任何特定理论束缚的情况下，施用给移植体接受者的ADAS细胞能抑制接受者T细胞的活化和增殖。
移植体包括待移植的生物相容性点阵或供体组织、器官或细胞。移植体的例子包括但不限于干细胞、皮肤细胞或组织、骨髓以及实体器官，例如心脏、胰腺、肾、肺和肝。优选地，移植体是人NSC。
基于本文提供的公开内容，可从任何来源获得ADAS细胞，例如从组织供体、移植体接受者或者不相关的来源(全然不同的个体或物种)获得。ADAS细胞可以是相对T细胞来说自体的(从同一宿主获得)或者相对T细胞来说同种异体的。当ADAS细胞是同种异体的时候，ADAS细胞可以相对T细胞应答的移植体来说是自体的，或者，可从与T细胞来源和T细胞应答的移植体来源都是同种异体的个体获得ADAS细胞。此外，ADAS细胞可以与T细胞异种(从不同物种的动物获得)，例如可用大鼠ADAS细胞来抑制人T细胞的活化和增殖。
在另外一种实施方式中，可从任何哺乳动物物种(包括但不限于人、小鼠、大鼠、猿、长臂猿、牛)的脂肪组织分离用于本发明的ADAS细胞。优选地，从人、小鼠或大鼠分离ADAS细胞。更优选地，从人分离ADAS细胞。
本发明的另一实施方式包括向移植体接受者施用ADAS细胞的途径。可通过适用于放置移植体(即，待移植的生物相容性点阵或供体组织、器官或细胞)的途径来施用ADAS细胞。ADAS细胞可全身性施用，即通过静脉注射非肠道应用，或者可以靶向特定组织或器官。可通过皮下植入或通过将细胞注射进结缔组织(例如肌肉)来施用ADAS细胞。
可将ADAS细胞以大约0.01至大约5 X 106个细胞/ml的浓度悬浮于合适的稀释剂中。用于注射溶液的合适赋形剂是与ADAS细胞及与接受者生物学上以及生理学上都相容的那些，例如经缓冲盐水溶液或者其它合适的赋形剂。可按照遵循正确无菌或稳定性的标准方法，来配制、制造和贮藏用于施用的组合物。
ADAS细胞的剂量在宽的限度内变动，在每种特定情况下，可针对个体需求对其加以调节。使用的细胞的数量取决于接受者的重量和状况、施用数和/或频度以及本领域技术人员已知的其它变量。
可向个体施用每100kg体重大约105至大约1013个ADAS细胞。在一些实施方式中，每100kg体重施用大约1.5 X 106至大约1.5 X 1012个ADAS细胞。在一些实施方式中，每100kg体重施用大约1 X 109至大约5 X 1011个ADAS细胞。在其它一些实施方式中，每100kg体重施用大约4 X 109至大约2 X 1011个ADAS细胞。在其它还有一些实施方式中，每100kg体重施用大约5 X 108至大约1 X 1010个ADAS细胞。
在本发明的另一实施方式中，在移植体之前或与移植体同时将ADAS细胞施用给接受者，以降低和/或消除宿主的移植体排斥。在不希望被束缚为任何特定理论的情况下，ADAS细胞可用于调理(condition)接受者对移植体的免疫系统，这是通过在移植体移植之前或同时向接受者施用能有效降低、抑制或消除接受者T细胞针对移植体的免疫应答的量的ADAS细胞来实现。ADAS细胞对接受者的T细胞造成影响，使得伴随移植体存在的T细胞应答被降低、抑制或消除。由此，可通过在移植之前或同时向接受者施用ADAS细胞，来避免宿主的移植体排斥，或者降低其严重性。
在又一实施方式中，可在施用移植体之后向移植体的接受者施用ADAS细胞。此外，本发明包含对正在经历对移植体的不利免疫应答(也被称为宿主的移植体排斥)的患者进行治疗的方法，所述方法通过以能降低、抑制或消除对移植体的免疫应答的量向患者施用ADAS细胞来实现。
III.抑制移植后的移植物抗宿主病的疗法
本发明包括使用ADAS细胞作为抑制移植后的移植物抗宿主病的疗法的方法。本发明基于下述发现：ADAS细胞不刺激同种异体T细胞增殖。可以预想，ADAS细胞可抑制MLR反应中的T细胞增殖。本发明还包括以能有效降低与T细胞增殖相关的免疫应答的量向哺乳动物施用ADAS细胞的方法。
本发明还提供了降低和/或消除供体移植体针对其接受者的免疫应答(即，移植物抗宿主病)的方法。因此，本发明包括在移植体移植进接受者之前将供体移植体(例如生物相容性点阵或供体组织、器官或细胞，优选地，神经干细胞)与ADAS细胞接触的方法。ADAS细胞作用于改善、抑制或降低供体移植体针对接受者的不利应答的方法。
如本文其它地方所讨论的，ADAS细胞可从任何来源获得，例如，从组织供体、移植体接受者或者不相关的来源(全然不同的个体或物种)获得，用于消除或降低移植体针对移植体接受者的、不想要的免疫应答。因此，ADAS细胞可以是相对组织供体、移植体接受者或者是不相关来源来说自体的、同种异体的或异种的。
在本发明的一种实施方式中，在将移植体移植进接受者之前，将移植体暴露给ADAS细胞。在这种情况下，任何同种异体反应性接受者细胞导致的针对移植体的免疫应答被移植体中存在ADAS细胞抑制。ADAS细胞对于接受者来说是同种异体的，其可从供体或从既非供体又非接受者的来源获得。在一些情况下，可用对于接受者来说是自体的ADAS细胞来抑制针对移植体的免疫应答。在另一种情况下，ADAS细胞可以是对于接受者来说异种的，例如可用小鼠或大鼠ADAS细胞来抑制人中的免疫应答。但是，在本发明中优选使用人的ADAS细胞。
除了在将移植体移植进接受者之前用ADAS细胞处理移植体之外，可在移植之前，用来自接受者的细胞或组织“预调理”或“预处理”供体移植体，以活化可能与移植体相关的T细胞。用来自接受者的细胞或组织处理移植体之后，可从移植体移走细胞或组织。然后再将经处理的移植体与ADAS细胞接触，以降低、抑制或消除通过来自接受者的细胞或组织的处理被活化的T细胞的活性。在用ADAS细胞对移植体的这种处理之后，可在移植到接受者中之前，从移植体移走ADAS细胞。但是，一些ADAS细胞可能与移植体粘着，因此，可能随着移植体被引入接受者。在这种情况下，引入接受者的ADAS细胞能抑制与移植体相关的、任何细胞造成的针对接受者的免疫应答。在不希望被任何特定理论束缚的情况下，在移植体移植进接受者之前用ADAS细胞对移植体进行的处理用于降低、抑制或消除被活化的T细胞的活性，由此预防T细胞被随后来自接受者组织和/或细胞的抗原性刺激再次刺激，或者由此诱导T细胞对随后来自接受者组织和/或细胞的抗原性刺激的应答减弱。基于本发明的公开内容，本领域技术人员将理解，在移植之前进行的预调理或预处理可降低或消除移植物抗宿主病。
例如，在骨髓或外周血干细胞(造血干细胞)移植的相关情况下，可通过使用本文公开的预处理方法，对供体髓进行预处理，以降低移植物针对接受者的免疫原性，来降低、抑制或消除移植物的宿主攻击。如本文其它地方所述的，可以在将供体髓移植进接受者之前，用来自任何来源的ADAS细胞，优选用接受者ADAS细胞，对供体髓进行体外预处理。在一种优选的实施方式中，首先将供体髓暴露给接受者组织或细胞，然后用ADAS细胞对其进行处理。在不希望被任何特定理论束缚的情况下，我们相信，供体髓与接受者组织或细胞最初的接触起到了活化供体髓中T细胞的作用。用ADAS细胞处理供体髓诱导了T细胞对随后的抗原刺激的应答减弱，或者预防了对于T细胞被随后的抗原刺激再次刺激，由此降低、抑制或消除了供体髓在接受者上诱导的不利影响。
在本发明的一种实施方式中，可通过向接受者施用ADAS细胞来治疗正遭受移植物抗宿主病的移植体接受者，以降低、抑制或消除移植物抗宿主病的严重性，其中，以能有效降低或消除移植物抗宿主病的量施用ADAS细胞。
在本发明的该实施方式中，优选地，可在移植之前从接受者获得接受者的ADAS细胞，可将其贮藏和/或在培养中扩增，以提供数量足够治疗进行中的移植物抗宿主反应得ADAS细胞储备。但是，如本文其它地方所讨论的，可从任何来源获得ADAS细胞，例如，从组织供体、移植体接受者或其它不相关来源(全然不同的个体或物种)获得。
IV.使用ADAS细胞的优点
基于本文提供的公开内容，可以预见，本发明的ADAS细胞可用于与目前的模式(例如使用免疫抑制药物疗法)联合使用，用于治疗宿主对供体组织的排斥或移植物抗宿主病。在移植中联合使用ADAS细胞与免疫抑制药物的优点在于，通过使用本发明的方法改善了移植体接受者中免疫应答的严重性，因此，可以降低使用的免疫抑制药物的量和/或降低免疫抑制药物的施用频度。降低免疫抑制药物的使用的益处在于，广谱免疫抑制和与免疫抑制药物相关的不想要的副作用得以减轻。在一种实施方式中，在无需免疫抑制药物的情况下使用本发明的细胞。
还考虑到，本发明的细胞可作为“一次”疗法施用给接受者，用于治疗宿主对供体组织的排斥或移植物抗宿主病。ADAS细胞向移植体接受者的一次施用消除了对长期的免疫抑制药物疗法的需求。但是，如果需要的话，也可以多次使用ADAS细胞。
本文描述的本发明还包括预防或治疗移植体排斥和/或移植物抗宿主病的方法，所述方法通过以用于预防、治疗或改善宿主的移植体排斥和/或移植物抗宿主病的预防有效量或治疗有效量施用ADAS细胞来实现。基于本文公开的内容，ADAS细胞的“治疗有效量”是：使得被活化的T细胞的数量较之没有施用ADAS细胞时被活化的T细胞的数量而言得到抑制或减少的ADAS细胞量。在宿主的移植体排斥的情况下，ADAS细胞的有效量是：使得移植体接受者中被活化的T细胞的数量较之施用ADAS细胞之前接受者中被活化的T细胞的数量而言得到抑制或减少的量。在移植物抗宿主病的情况下，ADAS细胞的有效量是能抑制或减少移植体中存在的被活化的T细胞的数量的量。
可通过下述方法来确定ADAS细胞的有效量：将施用ADAS细胞之前接受者或移植体中被活化的T细胞的数量与施用ADAS细胞之后接受者或移植体中存在的被活化的T细胞的数量进行比较。移植体的接受者，或者移植体自身中被活化的T细胞的数量与ADAS细胞的施用相关性地减少或者没有增加，指示：施用的ADAS细胞的数量是ADAS细胞的治疗有效量。
遗传修饰
本发明的细胞还可用于表达用于治疗目的的外来蛋白质或分子，或者用于跟踪它们在接受者中的同化(assimilation)和/或分化情况的方法。因此，本发明包括将外源性DNA引入ADAS细胞使得外源性DNA在ADAS细胞中一起表达的载体和方法。用于在细胞中引入和表达DNA的方法是本领域技术人员公知的，其包括例如Sambrook et al.(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，New York)，and in Ausubel et al.(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork)中描述的那些。
经分离的核酸分子可编码下述分子，所述分子用于在ADAS细胞一旦被引入接受者之后跟踪ADAS细胞的移动、同化和生存。可用于跟踪细胞的蛋白质包括但不限于：绿色荧光蛋白(GFP)、任何其它荧光蛋白(例如增强的绿色、青色、黄色、蓝色和红色荧光蛋白；Clontech，Palo Alto，CA)或其它标签蛋白(例如LacZ、FLAG-标签、Myc、His6等)。
对本发明的ADAS细胞的移动、同化和/或分化进行跟踪并不局限于施用载体或病毒表达的可探测分子。还可使用协助移植的ADAS细胞在哺乳动物中定位的一系列探针来评估细胞的移动、同化和/或分化。还可使用针对本文其它地方详细描述的细胞特异性标记(例如但不限于ABCG2、ALDH等)的抗体或核酸探针，来完成对ADAS细胞移植体的跟踪。
术语“遗传修饰”在本文中使用时表示有意引入外源性DNA导致的ADAS细胞基因型的稳定的或瞬时的变化。DNA可以是合成的或天然获得的，其可含有基因、基因的部分或者其它有用的DNA序列。术语“遗传修饰”在本文中使用时不意味着包括天然发生的变化，例如通过天然病毒活性、天然遗传重组等发生的。
可使用病毒载体(逆转录病毒、经修饰的疱疹病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等)或者通过直接的DNA转染(脂质体转染、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔等)将外源性DNA引入ADAS细胞。
当对细胞进行遗传修饰的目的是产生生物活性物质时，该物质通常将是可用于治疗给定病症的物质。例如，可能想对细胞进行遗传修饰，使得它们能分泌某种生长因子产物。
可通过将外源性遗传物质引入细胞，来对本发明的细胞进行遗传修饰，以生产对于细胞培养来说有益的分子(例如营养因子、生长因子、细胞因子等)。此外，通过对细胞进行遗传修饰以生产此类分子，使得细胞得以在移植进需要其的患者中时向患者提供额外的治疗效果。
术语“生长因子产物”在本文中使用时表示对细胞具有生长、增殖、分化或营养作用的蛋白质、肽、促分裂原(mitogen)或其它分子。例如，可用于治疗CNS病症的生长因子产物包括但不限于神经生长因子(NGF)、得自脑的神经营养因子(BDNF)、神经营养素(NT-3、NT-4/NT-5)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、双调蛋白(amphiregulin)、FGF-1、FGF-2、EGF、TGF α、TGF β s、PDGF、IGFs和白细胞介素；IL-2、IL-12、IL-13。
还可修饰细胞，以表达某生长因子受体，其包括但不限于p75低亲和性NGFr、CNTFr、神经营养素受体的trk家族(trk、trkB、trkC)、EGFr、FGFr和双调蛋白受体。可对细胞进行工程改造，使其产生多种神经递质或它们的受体，例如，5-羟色胺、L-多巴、多巴胺、去甲肾上腺素肾上腺素、速激肽、P物质、内啡肽、脑啡肽、组胺、N-甲基D-天冬氨酸盐、甘氨酸、谷氨酸盐、GABA、ACh等。有用的非神经递质合成基因包括TH、多巴脱羧酶(DDC)、DBH、PNMT、GAD、色氨酸羟化酶、ChAT和组氨酸脱羧酶。编码多种可能在治疗CNS病症中被证明为有用的神经肽的基因包括P物质、神经肽-Y、脑啡肽、后叶加压素、VIP、胰高血糖素、铃蟾肽、胆囊收缩素(CCK)、促生长素抑制素、降钙素基因相关的肽等。
还可对本发明的细胞加以修饰，以表达细胞因子。细胞因子优选(但并非排除性地)选自IL-12、TNF α、IFN α、IFN β、IFN γ、IL-7、IL-2、IL-6、IL-15、IL-21和IL-23。
根据本发明，向ADAS细胞中引入包含编码异源蛋白的核苷酸序列的基因构建体。即，对细胞进行遗传改造，以引入其表达在个体中有治疗效果的基因。根据本发明的一些方面，可对来自待治疗个体或来自另一个体或来自非人类动物的ADAS细胞进行遗传改造，以替换有缺陷的基因和/或引入其表达在被治疗的个体中有治疗效果的基因。
向细胞中转染进基因构建体的所有情况下，异源基因都与实现该基因在细胞中的表达所需的调控序列可操作地相连。典型地，此类调控序列包括启动子和聚腺苷化信号。
优选地，基因构建体作为表达载体提供，所述表达载体包括针对异源蛋白的编码序列，其与必要调控序列可操作地相连，使得当载体被转染进细胞时，编码序列将被细胞表达。编码序列与在细胞中表达该序列所必需的调控元件可操作地相连。编码蛋白质的核苷酸序列可以是cDNA、基因组DNA、合成的DNA或其杂交体或RNA分子(例如mRNA)。
基因构建体包括编码有益蛋白的核苷酸序列，其与调控元件可操作地相连，基因构建体可在细胞中作为有机能的(functioning)胞质分子、有机能的游离分子保持存在于细胞中，或者其可整合进细胞的染色体DNA。可这样将外源性遗传物质引入细胞，在所述细胞中，其保持为质粒形式的单独遗传物质。或者，可将能整合进染色体的线性DNA引入细胞。当将DNA引入细胞时，可以加入促进DNA整合进染色体的试剂。还可在DNA分子中包括进可用于促进整合的DNA序列。或者，可将RNA引入细胞。
用于基因表达的调控元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷化信号。优选地，这些元件在本发明的细胞中是可操作的。此外，优选地，这些元件与编码蛋白的核苷酸序列可操作地相连，使得核苷酸序列得以在细胞中表达，以及由此生产出蛋白。通常，起始密码子和终止密码子被认为是编码蛋白质的核苷酸序列的一部分。但是优选地，这些元件在细胞中具有功能。类似地，所用的启动子和聚腺苷化信号必须在本发明的细胞中具有功能。可用于实践本发明的启动子的例子包括但不限于在很多细胞中具有活性的启动子，例如巨细胞病毒启动子、SV40启动子和逆转录病毒启动子。可用于实践本发明的启动子的其它例子包括但不限于：组织特异性启动子，即，在一些组织中具有功能但在另一些中没有的启动子；还有，在有或没有特异性或一般性增强子序列时都在细胞中正常表达的基因的启动子。在一些实施方式中，使用有或没有增强子序列时都在细胞中组成型表达基因的启动子。必要或者想要的时候，在此类实施方式中提供增强子序列。
可使用本领域普通技术人员易于获得的公知方法，对本发明的细胞进行转染。可以使用标准方法将外源性基因引入细胞，其中，细胞表达该基因编码的蛋白。在一些实施方式中，通过磷酸苷沉淀转染、DEAE-葡聚糖转染、电穿孔、显微注射、脂质体介导的转移、化学物质介导的转移、配体介导的转移或者重组病毒载体转移来转染细胞。
在一些实施方式中，用重组腺病毒载体来将具有想要的序列的DNA引入细胞。在一些实施方式中，用重组逆转录病毒载体将具有想要的序列的DNA引入细胞。在一些实施方式中，用标准CaPO4、DEAE葡聚糖或脂类云载体介导的转染技术来将想要的DNA并入分裂中的(dividing)细胞。可使用标准抗生素抗性选择技术来鉴定或选择转染的细胞。在一些实施方式中，通过显微注射将DNA直接引入细胞。类似地，可使用公知的电穿孔或颗粒轰击技术将外来DNA引入细胞。通常有第二基因与治疗基因共转染或相连。第二基因通常是选择性抗生素抗性基因。可通过在能杀死没有获取该选择性基因的细胞的抗生素中培养细胞来选出被转染的细胞。在大多数情况下，两个基因不相连并被共转染，在抗生素处理下存活的细胞两个基因都具有并且两个基因都表达。
应当理解，本文描述的方法可以以多种方式来进行，并且本领域公知对其进行的多种改良和置换(permutation)。还可认识到，在关于作用模式或者细胞类型间的相互作用方面示出任何理解都不应被理解为以任何方式对本发明加以限制，其被展现出来仅是为了使本发明的方法能被更好理解。
V.移植
本发明包括向动物(包括人)施用ADAS细胞，以治疗下述疾病的方法，所述疾病中，引入新的、未受损的细胞将提供一定形式的治疗成果。
技术人员将易于理解，ADAS细胞可被移植进接受者，其中，在接收到来自周围环境的信号和提示时，细胞可在体内进一步分化为由邻近的细胞环境规定的成熟细胞。或者，ADAS细胞可体外分化为想要的细胞类型，可将分化的细胞施用给需要其的动物。
本发明还包括将ADAS细胞的移植与其它治疗流程组合，来治疗身体(包括CNS、皮肤、肝、肾、心脏、胰腺等)的疾病或损伤。由此，ADAS细胞可与对患者施加有益效果的其它细胞共移植，所述其它细胞是经遗传修饰的或者未经遗传修饰的细胞。因此，本文公开的方法可与其它治疗流程组合，一旦有本文提供的教导，本领域技术人员将能够理解这点。
可使用本领域已知的技术，例如，即，美国专利Nos.5,082,670和5,618,531(每份都通过引用并入本文)所述的，将本发明的ADAS细胞移植进患者，或者移植进体内其它任何合适位点。
可使用本领域公知的技术以及本文所述的技术和未来开发的技术，来完成对本发明细胞的移植。本发明包含将细胞移植(transplanting)、移植(grafting)、注入或者引入哺乳动物(优选地，人)的方法。本文示例性给出了将细胞移植进多种哺乳动物心血管组织的方法，但是本发明并不限于此类解剖学位点或者这些哺乳动物。此外，与骨移植体相关的方法是本领域公知的，其被描述于，例如美国专利No.4,678,470中，胰腺细胞移植体被描述于美国专利No.6,342,479和美国专利No.5,571,083中，其教导了将细胞移植到体内任何解剖学位置的方法。
还可按照已知的封装(encapsulation)技术，包括微封装(microencapsulation)(见例如美国专利Nos.4,352,883、4,353,888和5,084,350，它们通过引用并入本文)或巨封装(macroencapsulation)(见例如美国专利Nos.5,284,761、5,158,881、4,976,859和4,968,733；以及国际公开文本Nos.WO92/19195、WO95/05452，所有这些都通过引用并入本文)，对细胞进行封装，用其递送生物学活性分子。对于巨封装而言，设备中的细胞数可以变动，优选地，每个装置含有大约103-109个细胞，最优选地，大约105-107个细胞。可在患者中植入多个巨封装装置。用于巨封装和植入细胞的方法是本领域公知的，其被描述于，例如美国专利6,498,018中。
ADAS细胞的剂量在宽的限度内变动，在每种特定情况下，可针对个体需求对其加以调节。使用的细胞的数量取决于接受者的重量和状况、施用数和/或频度以及本领域技术人员已知的其它变量。
向患者施用的ADAS细胞的量可与，例如脂肪组织加工后的细胞产量相关。细胞总量中的一部分可留下来以备后用或者被冷冻贮存。此外，递送的剂量取决于将细胞递送给患者的途径。在本发明的一种实施方式中，向患者递送的细胞的数量预计为大约5.5 x 104个细胞。但是，可对该数量进行数量级的调节，以获得想要的治疗效果。
向患者施用本发明的细胞的模式可根据多种因素变化，所述因素包括被治疗疾病的类型、哺乳动物的年龄、细胞是否已分化、细胞是否具有引入其中的异源DNA等。可通过直接注射，或者通过本领域中用来引入施用给遭受特定疾病或病症的患者的化合物的任何其它手段，将细胞引入想要的位点。
可以多种方式施用ADAS细胞。优选的施用模式是血管内、脑内、非肠道、腹膜内、静脉内、硬膜外、脊柱内、脑池内(intrastemal)、关节内、滑液内、鞘内、动脉内、心脏内或肌内的。
还可将ADAS细胞与添加剂一起应用，以增强、控制或指导想要的治疗效果。例如，在一种实施方式中，可使用抗体介导的阳性和/或阴性细胞选择来进一步纯化细胞，所述选择用于富集细胞群，以增加疗效、降低发病率或者协助流程容易进行。类似地，可将细胞与生物相容性基质(matrix)一起应用，所述基质能通过支持和/或指导植入细胞的命运来协助体外组织工程。
在向患者施用ADAS细胞之前，可使用质粒、病毒或其它替代性载体策略，用感兴趣的核酸对细胞进行稳定或瞬时的转染或转导。可在遗传操作之后再施用细胞，使得它们表达用来促进细胞提供的治疗性应答的基因产物。
ADAS细胞用于治疗疾病、病症或症候(condition)的用途提供了额外的优点——可将ADAS细胞引入接受者而无需免疫抑制剂。人们相信，细胞的成功移植需要供体细胞永久移植进去，并且不诱导接受者产生的移植物排斥免疫应答。典型地，为了预防宿主排斥应答，使用非特异性的免疫抑制剂，例如环孢菌素、甲氨蝶呤、类固醇和FK506。这些药剂每日施用，如果停止施用，通常会导致移植物排斥。但是，使用非特异性免疫抑制剂的不想被看到的后果在于，它们通过抑制所有方面的免疫应答来发挥功能(广谱免疫抑制)，由此大大增加了接受者对于感染和其它疾病的易感性。
本发明提供了通过向接受者引入ADAS细胞或经分化的ADAS细胞来治疗疾病、病症或症候的方法，该方法无需免疫抑制剂。本发明包括向接受者施用同种异体或异种ADAS细胞，或者与接受者遗传上全异的ADAS细胞，以向接受者提供益处。本发明提供了使用ADAS细胞或经分化的ADAS细胞来治疗疾病、病症或症候的方法，该方法无需在向接受者施用细胞时使用免疫抑制剂。因此，移植的ADAS细胞或经分化的ADAS细胞的接受者招致感染或其它疾病(包括与免疫抑制疗法相关联的癌症相关症候)的易感性降低。
下述实施方式将进一步阐述本发明的多个方面。但是，它们并非是以任何方式对本文示出的本发明的公开内容或教导的限制。
实施例
现在将参照下述实施例来描述本发明。这些实施例仅是作为阐述目的提供的，本发明并不局限于这些实施例，其还包括根据本文提供的教导显而易见的所有变化。
使用基于流式细胞术的检测，进行了下述实验，以定义人的得自脂肪的细胞(包括人SVF细胞和ADAS细胞)在多个分离、纯化和扩增阶段的免疫表型。此外，在体外混合淋巴细胞反应中，对人的得自脂肪的细胞(包括人SVF细胞和ADAS细胞)的免疫原性进行了检测。本文公开的结果显示，ADAS细胞的同种异体移植作为用于细胞和/或基因疗法的手段是可行的。
本文公开的结果表明，通过对ADAS细胞的分离和扩增选出了相对于最初的SVF来说相对同质的细胞群。体外MLR检测显示，将同种异体ADAS细胞移植进宿主，提供作为医师和患者可在医护地点获得的“现成”产品的成体干细胞的临床用途是可行的。
实施例1：人的得自脂肪的细胞的免疫表型：基质细胞和干细胞相关 标记物随时间的改变
脂肪组织代表着丰富并且可获得的、用于组织工程应用的多能成体干细胞的来源。但是，并非所有实验室都使用处于等同的分离和传代阶段的细胞。考虑到一些研究者使用新鲜分离的基质血管级分(SVF)细胞用于组织工程目的，因此进行本文提供的实验，以比较作为粘着性和世代函数的、人的得自脂肪的细胞(包括人SVF细胞和ADAS细胞)的免疫表型。将新鲜分离的得自人脂肪组织的基质血管级分细胞(SVF)的免疫表型与经过顺序传代的ADAS细胞相比。最初的SVF含有频度为1:30的菌落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)。菌落形成单位-脂肪细胞(CFU-Ad)和菌落形成单位-成骨细胞(CFU-Ob)在SVF中以相当的频度存在(分别为1:40和1:12)。基于流式细胞术的ADAS细胞免疫表型随着粘着性和传代逐渐改变。例如，在SVF上，基质细胞相关标记(CD13、CD29、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166)最初很低，但其随着连续传代显著增加。干细胞相关标记CD34在SVF和/或早代ADAS细胞中处于峰水平，在整个培养期间都保持存在，虽然水平有所降低。我们观察到，SVF和ADAS细胞以可探测到的水平表达醛脱氢酶(ALDH)和多药抗性转运蛋白(ABCG2)这二者均是被用于鉴定和表征造血干细胞的。SVF表达内皮细胞相关标记物(CD31、CD144或VE-钙粘素、VEGF受体2、von Willebrand因子)，但该标记物不随顺序传代显著改变。因此，在补充有胎牛血清的培养基中，通过人ADAS细胞对塑料的粘着性和随后的扩增选出了相对同质的细胞群，其中富集表达“基质”免疫表型的细胞，这是较之粗制基质血管级分的异质性而言的。
现在描述本文公开的的实验中使用的材料和方法。
ADAS细胞分离和扩增
从在当地整形外科机构经历选择流程的男性和女性受试者获得来自皮下脂肪组织位点的抽脂术吸取物。用经磷酸盐缓冲的盐水(PBS)对组织洗3-4次，将其悬浮于预热至37℃的等体积PBS(补充有1％牛血清和0.1％I型胶原酶)中。将组织放置于37℃的振荡水浴中，在持续搅动下水浴60分钟，再在室温下以300-500Xg离心5分钟。吸取出含有成熟脂肪细胞的上清液。沉淀团块被确定为基质血管级分(SVF)。将部分SVF重新悬浮于冷冻贮存培养基(10％二甲亚砜、10％DMEM/F 12 Ham′s、80％胎牛血清)中，于-80℃在外有乙醇套管的封闭容器中冷冻，随后贮藏于液氮中。在本文公开的菌落形成单位检测中使用部分SVF。将剩余的SVF细胞悬浮于基质培养基(DMEM/F 12 Ham′s、10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、100U青霉素/100μg链霉素/0.25μg两性霉素B)中，并以0.156ml组织消化物/平方cm表面积的密度立即在T225瓶中涂布，用于扩增和培养。初级细胞培养物的最初代被称为“第0代”(P0)。在37℃于5％CO2下温育最初的48小时后，用PBS洗培养物，将培养物保持在基质培养基中，直到它们达到75-90％汇合(大约培养6天)。通过胰蛋白酶(0.05％)消化对细胞进行传代，将其以5,000个细胞/cm2的密度涂布(“第1代”)。通过台盼蓝不相容实验和血球计细胞计数来测定传代时的细胞存活性和数量。达到75-90％的密度后(培养大约6天)，重复进行细胞传代，直到第4代。
脂肪发生
通过用脂肪细胞诱导培养基(包含DMEM/F-12，具有3％FBS，33μM生物素，17μM泛酸盐，1μM牛胰岛素，1μM地塞米松，0.25mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)，5μM罗格列酮和100U青霉素/100μg链霉素/0.25μg两性霉素B)替换基质培养基，诱导初级ADAS细胞的汇合培养物经历脂肪发生。三天后，将培养基换为脂肪细胞保持培养基，除了缺少IBMX和罗格列酮之外其与诱导培养基相同。将细胞在培养物中保持多达9天，每三天替换90％的保持培养基。用PBS润洗培养物，在福尔马林溶液中固定，通过用油红0进行中性脂类染色来测定脂肪细胞分化。
骨发生
通过用骨发生诱导培养基(包含DMEM/F-12 Ham′s，具有10％FBS，10mM β-甘油磷酸，50μg/ml 2-磷酸抗坏血酸钠，100U青霉素/100μg链霉素/0.25μg两性霉素B)替换基质培养基，诱导初级ADAS细胞的汇合培养物经历骨发生。在多至三周的一段时间内，每3-4天向培养基中补加新鲜的骨发生诱导培养基。在0.9％ NaCl中润洗培养物，在70％乙醇中固定，通过用茜素红针对磷酸钙染色来测定骨发生分化。
菌落形成单位(CFU)检测
采用如下假设：祖细胞数量遵循泊松分布(Bellows et al.1989Dev.Biol.133：8-13)，通过有限稀释检测来确定菌落形成单位的频度。用等同于25ml抽脂术组织吸取物的一部分SVF来进行有限稀释检测，以确定CFUs的频度。将SVF团块悬浮于补充有1％BSA的20mlPBS中，滤经经高压灭菌的金属筛，以除去大的组织片段。将400μl的一部分细胞悬浮液移到2ml离心管中，于室温在3,000rpm离心3分钟，然后将沉淀团块重新悬浮于400μl的红细胞裂解缓冲液(Sigma，St.Louis，MO)中。5分钟的裂解期后，将体积为20μl的裂解物与等体积的台盼蓝混合，通过血球计计数来确定有核细胞的数量。于室温以300Xg对剩余的SVF细胞离心5分钟，将得到的沉淀团块以每ml 2 X 105个细胞的终浓度重新悬浮于基质培养基中。
按照每孔100μl基质培养基制备四块96孔板。沿着每块板的12条柱对SVF细胞悬浮液进行顺序两倍稀释，得到含有从每孔大约104至4个细胞的柱。在37℃、5％CO2下对96孔板进行9天温育。此时，用四块板中的一块进行CFU-成纤维细胞(CFU-F)检测。用PBS润洗该板，在福尔马林中固定，用福尔马林中的0.1％甲苯胺蓝染色20分钟，用水润洗，针对每种细胞浓度测定阴性孔数量(即，不含>20个甲苯胺蓝+细胞的菌落的那些)。按照下述公式用该数据来确定CFU-F的数，公式为F0＝e-u和u＝-ln F0，其中F0是没有菌落的孔的分数(fraction)，u是每孔中前体的平均数。由此，当没有菌落的孔的分数为“0.37”时，每孔前体细胞的平均数就为“1”。
用第二块板进行CFU-碱性磷酸酶(CFU-ALP)检测。用PBS润洗该板，在100％乙醇中固定，在存在包含36mM偏硼酸钠、0.46mM 5-溴-4-氯-3-羟基吲哚磷酸、1.2mM氮蓝四唑和8.3mM硫酸镁的溶液(pH9.3)中温育1小时，用水润洗，针对每种细胞浓度测定阴性孔数量(即，不含>20个ALP+细胞的菌落的那些)。按照上式用该数据来确定CFU-ALP的数。
按照本文所述，诱导剩下的两块96孔板分别经历脂肪发生和骨发生。通过在诱导后9天进行油红0染色来测定CFU-脂肪细胞(CFU-Ad)。通过在诱导后>14天进行茜素红染色来测定CFU-成骨细胞(CFU-O)。
流式细胞术
在来自SVF的细胞以及来自0至4代的经培养细胞的细胞上进行流式细胞术检测。针对落入三大类(造血、基质和干细胞)的表型标记物以及醛脱氢酶(ALDH)活性(Stem Cell Technologies，Seattle，WA)来对细胞加以分析。使用缀合的和未缀合的小鼠单克隆来分析细胞。简言之，从每个群获得大约4-8 x 106。取1 x 106个细胞用于ALDH分析，取1-2 x 106个细胞用于用未缀合单克隆进行的染色。每个抗体组获得10,000个事件，使用CELLQuest查询软件(BectonDickinson)在Becton Dickinson FACSCaliber流式细胞仪上进行的ALDH检测获得了最少25,000个事件。使用Flow Jo分析软件(TreeStar)来进行数据分析。
缀合的单克隆抗体
在流洗涤缓冲液(1X DPBS、0.5％ BSA和0.1％叠氮化钠)中对细胞进行一次洗涤，将细胞重新悬浮于封闭缓冲液(具有25μg/ml小鼠IgG的洗涤缓冲液)中，在冰上孵育10分钟。每管装入100μl细胞悬浮液(大约5 x 105个细胞)等分试样，加入经适当标记的mAbs，用于三色分析(FITC、PE和APC)。进行合适的同种型对照组合，以反映单克隆同种型组合。如无特别指明，针对下述抗原(目录#)的抗体购自BD-Pharmingen，按照供货商推荐的量来使用它们：CD13 PE(#555394)、CD29 FITC(Caltag #CD2901)、CD31 FITC(Caltag#MHCD3101)、CD34 PE(#348057)、CD44 FITC(Cell Sciences#852.601.010)、CD49a PE(#559596)、CD63 FITC(#557288)、CD73PE(#550257)、CD90 FITC(#555595)、CD105 PE(Caltag#MHCD10504)、CD144(Chemi con # MAB1989)、CD146 PE(#550315)、CD166 PE(#559263)、ABCG2 FITC(Chemicon#MAB4155F)、VEGFr2(Chemicon#MAB1667)和von Willebrand因子(Chemicon MAB3442)。所有管都在冰上孵育并被遮光保护30分钟。在洗涤缓冲液中对细胞洗一次，将细胞固定于200μl1％低聚甲醛中。
未缀合的单克隆抗体
按上文所述对细胞进行洗涤，在含有5％山羊血清的洗涤缓冲液中对细胞进行封闭，孵育10分钟，分装为100μl的等分试样。加入一抗(CD144、抗VEGFR2[KDR]和抗血管性血友病氏因子)(10μg/ml)，在冰上对细胞进行30分钟孵育。在洗涤缓冲液中对细胞洗一次，重新悬浮于不含血清的洗涤缓冲液中。向含有一抗的悬浮液以及“仅含二抗”的对照悬浮液中加入山羊抗小鼠缀合有PE的二抗(5μg/ml)。细胞在冰上孵育并被遮光保护15分钟。然后在流洗涤缓冲液中洗细胞，用1％低聚甲醛固定。
现在将描述这些实验的结果。
细胞产量
通过胶原酶消化和差异离心，对从总共44个供体获得的皮下脂肪组织抽脂吸取物进行加工。44个供体的年龄(平均值±S.D；41±10，范围是18至64)和BMI(平均值±S.D；26.1±4.8，范围是19.9至39.2)以及性别分布(84％女性；16％男性)与以前的研究中所报道的相当(Aust et al.2004 Cytotherapy 6：7-14；Sen et al.2001 J.Cell.Biochem.81：312-9)。为评估脂肪组织中祖细胞的频度，基质血管级分中存在的有核细胞数的平均值被测定为：对每ml抽脂吸取物组织而言，308，849(表1A)。基于这些计算，通过有限稀释检测在96孔板中建立了CFU检测，以基于组织化学染色特征确定针对特定谱系表型的CFU频度(表2)。培养9天后，含有对甲苯胺蓝或碱性磷酸酶染色阳性细胞的孔的数量被分别用于确定CFU-F和CFU-ALP(图1)。此时，诱导相同的板经历脂肪发生或骨发生。额外的分别9天或>14天后，测定对油红O(针对中性脂类)染色阳性或茜素红(针对磷酸钙)染色阳性的孔的数量。得到的平均CFU频度如下所述：CFU-F，1:30；CFU-ALP，1:285；CFU-Ad，1:40以及CFU-Ob，1:12(表2)。
表1A：每ml抽脂吸取物组织的细胞产量
 
参数 平均值±S.D.(n) 平均培养天数
有核SVF细胞 308,849±140,354(14)
每cm2的P0细胞 247,401±136,514(42) 6.0±2.4
表2：有核SVF细胞群中菌落形成单位的频度
 
CFU检测 频度(n) 范围
CFU-F 1:32±48(12) 1:5至1:164
CFU-ALP 1:328±531(12) 1:11至1:1828
CFU-Ad 1:28±49(10) 1:3至1:160
CFU-Ob 1:16±22(7) 1:4至1:65
最初的涂布之后，在培养物中对细胞进行平均6天的保持(表1B)，以产生第0代(P0)群。通过胰蛋白酶消化进行收获后，每ml原始抽脂吸取物组织获得了平均247,401个粘着P0细胞(表1B)。这些值与以前的研究相当(Aust et al.2004 Cytotherapy 6：7-14)。对细胞再连续传4代，6至7天进行一次。在每次传代期间，细胞倍增时间在3.6至4.7天之间(表1B)。
表1B：平均细胞倍增时间和世代长度
 
世代 平均倍加时间(天)±S.D. 各世代的平均天数±S.D. N
P1 4.2±2.6 6.3±2.1 21
P2 4.7±2.5 7.0±2.4 18
P3 3.6±0.7 6.1±1.2 14
P4 4.4±2.3 6.6±2.0 7
免疫表型
在每个纯化和传代阶段后冷冻贮存的细胞上进行流式细胞术分析(表3)；图2显示了代表性的流式细胞术直方图。最初的SVF细胞含有对于一组内皮细胞相关标记物来说阳性的细胞亚组，所述标记物包括CD31、CD144(VE-钙粘素)、VEGF-受体2和血管性血友病因子(von willebrand factor)(表3和图2)。这些标记物的水平直到第4代也没有显著改变(P4)。
表3：人的得自脂肪的细胞在分离和第1代的进展阶段中的表型特征
 
抗原 SVF(n＝7) P0(n＝7) P1(n＝7) P2(n＝7) P3(n＝7) P4(n＝5)
CD13 37.0±0.2 79.5±9.7** 93.0±4.1*** 95.5±2.3*** 95.9±2.6*** 96.8±2.3
CD29 47.7±13.3 71.1±30.3* 77.1±23.6** 82.1±21.2** 87.4±18.8*** 94.7±2.05
CD31 21.8±10.8 24.4±17.4 7.9±6.0 7.2±5.4 20.8±14.5 21.0±19.9
CD34 60.0±11.5 59.2±25.4 21.5±15.1*** 5.4±6.3*** 2.0±2.0*** 1.7±1.0
CD44 63.8±14.5 84.1±8.2* 93.4±2.1** 95.7±1.8*** 96.9±3.2*** 98.1±1.0
CD49a 35.6±18.650.2± 28.3 58.8±29.5* 64.0±29.1** 53.4±29.4 56.4±29.3
CD63 42.0±7.8 66.1±21.1 73.6±10.6** 68.5±21.1* 79.0±21.9** 66.1±25.1
CD73 25.0±6.2 74.7±10.2*** 85.3±37.2*** 89.3±10.9*** 93.9±5.5*** 94.2±4.2
CD90 54.8±10.9 76.6±9.6* 90.4±3.0*** 94.8±1.8*** 96.2±1.9*** 97.2±1.0
CD105 4.9±3.5 42.6±17.7*** 52.8±27.4*** 61.6±16.6*** 68.9±16.1*** .70.5±12.1
CD1442 3.5±1.9 2.7±1.7 7.9±11.6 4.6±5.1 2.3±0.7 1.8±0.3
CD1461 21.4±9.3 29.4±10.8* 19.8±15.9 10.8±4.5 5.1±1.5 4.8±2.8*
CD166 0.8±0.8 21.7±18.6* 48.5±23.5** 62.8±21.4** 64.1±30.1** 69.2±17.4
ABCG2 31.1±15.7 21.5±13.0 35.5±7.6 19.1±2.8 22.1±12.3 13.9±5.4
ALDH3 14.3±3 71.6±15.6 79.8±5.1 74.2±3.3 84.6±4.6 71.6±4.8
VEGFr-22 2.0±1.6 2.8±3.3 10.2±13.6 8.9±5.2 2.4±1.9 1.4±0.2
血管性血友病因子2 5.8±1.5 4.6±1.8 6.8±6.2 6.3±6.2 2.5±1.3 2.0±0.4
1 数据被表示为从括号中指出的供体数获得的平均值±标准差。
2 数据代表n＝4个供体的平均值。
3 数据表达n＝3个供体的平均值。
*通过Student’st检验，相对于SVF细胞，P值<0.05；**通过Student’st检验，相对于SVF，P值<-0.01；***通过Student’st检验，相对于SVF，P值<-0.001。
最初的SVF细胞群中仅一个亚组表达基质细胞相关标记(表3和图3)。SVF中不到1％表达活化的淋巴细胞共有粘着分子(ALCAM，CD166)，而63％的SVF都表达透明质酸盐受体(CD44)；CD29、CD73、CD90和CD105的水平介于这些值之间。随着连续的传代，对于这些标记的每种来说，染色阳性细胞的百分比都有所增加，第4代时升到69％(CD166)至98％(CD44)之间。
最初的SVF含有对于干细胞相关标记物来说呈阳性的细胞亚群。平均60％的SVF都表达造血干细胞相关标记物CD34、唾液黏蛋白和L-选择蛋白配体(Shailubhai et al.，1997 Glycobiology 7：305-14)。P0群中CD34的水平仍保持为与前述相当的水平，然后其在连续传代中显著降低(图3)。每个世代中，CD34+群的大小一直都比造血细胞群(基于泛造血标记物——CD45的表达)的大小要高。平均有31％的SVF显示出有ABCG2——多药抗体转运蛋白，其负责于Hoescht染料的流出，用于鉴定造血干细胞的侧向散射群(Goodell et al.，1996 J.Exp.Med.183：1797-806)。虽然这些水平在P0和P1世代间增加，在随后的世代中减少，但是改变相对SVF来说并非统计上显著的。
高水平的醛脱氢酶(ALDHbr)已被证明为用于鉴定和分离造血干细胞的新颖标记(Storms et al.，1999 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：9118-23；Fallon et al.，2003 Br.J.Haematol.122：99-108；Storms et al.，2005 Blood)。基于使用荧光底物的流式细胞术分析，得自脂肪的细胞含有ALDHbr亚群(表3，图4)。虽然SVF细胞中ALDH水平较低，但在P0至P4世代之间，ALDHbr的百分比达到>70％，平均荧光强度为114至306。当在培养物中将细胞保持至多至P9时，ALDHbrADAS细胞的百分比降至10％。
本文公开的以及来自其它团队的结果显示了塑料粘着性ADAS细胞在第2代或更晚代的免疫表型(Gronthos et al.2001 J.Cell.Physiol.189：54-63；Aust et al.2004 Cytotherapy 6：7-14；Zuket al.2002 Mol.Biol.Cell.13：4279-95)。ADAS细胞展示出类似于得自骨髓的基质细胞或MSC的表面蛋白分布情况(Pittenger etal.1999 Science 284：143-7)，并且ADAS细胞可沿着多种谱系途径分化(Gimble et al.2003 Curr.Top.Dev.Biol.58：137-60)。事实上，对人ADAS细胞进行的环克隆分析已显示，扩增至第4代的克隆中>50％能沿着两种或多种谱系特异性途径分化(Gimble et al.2003Curr.Top.Dev.Biol.58：137-60)。由此，脂肪组织展现为用于潜能再生医药应用的成体干细胞的易获得的、丰富的替代性来源。使用分离自51名成人受试者的骨髓MSC进行的研究确定：CFU-F的频度为大约1:10,000STRO-1+细胞(Stenderup et al.，2001 J.Bone Miner.Res.16：1120-9)。鉴于这些作者使用了用STRO-1抗体进行的富集步骤，因此这些值比目前针对人脂肪组织报道的值要小至少三个数量级。因此，脂肪组织中CFU-F的丰度远高于骨髓的。
脂肪组织中CFU-Ad和CFU-Ob的频度与CFU-F的相当；但是，CFU-ALP的出现率要低大约1个数量级。碱性磷酸酶活性已被用作为骨髓成骨细胞祖细胞和Westin-Bainton基质细胞的定义性特征(Friedenstein，1968 Clin.Orthop.Relat.Res.59：21-37；Westenet al.，1979 J.Exp.Med.150：919-37)。目前的研究测量了培养9天后的碱性磷酸酶活性，但茜素红染色在额外的14至21天后进行。因为强烈的碱性磷酸酶染色与多层架构的细胞层相关(图1)，因此我们相信如果是在延伸培养期评估的话，CFU-ALP的频度将更接近CFU-F和CFU-Ob。
多个团队已在分离得自脂肪的细胞，用于体外和体内应用；但是，关于在研究中细胞群分离和表征的方面，各实验室之间的一致性并不清楚。近来的研究集中于分离早期的得自脂肪组织的细胞，集中于早世代数的SVF或粘着细胞。这些细胞展示出针对VEGF受体的标记、Flk-1、CD31、VE-钙粘素、血管性血友病氏因子和内皮细胞谱系相关的其它标记。得自脂肪的SVF细胞已被用于重构经过致死性辐照的小鼠的骨髓。SVF群被报道含有针对巨噬细胞(以及潜在地，其它造血谱系)的祖细胞。类似地，本文公开内容表明，SVF细胞群包括造血谱系细胞，这基于它们对CD11、CD14、CD45和其它标记的表达。但是，它们的表达随着逐渐的传代丢失，这暗示它们不是针对粘着细胞群的。
“干细胞”相关标记物(CD34、ABCG2、ALDHbr)的水平在培养的最早阶段(0/1世代)达到其峰水平。本文展示的结果显示了线粒体ALDH的存在，这是通过对未分化的和经脂肪细胞分化的人ADAS细胞进行的串联质谱蛋白质组学分析显示的。是ALDHbr的ADAS细胞的百分比远远超过未分化骨髓中探测到的ALDHbr细胞的百分比，骨髓中其跌落至或低于总细胞群的1％(Storms et al.，1996 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：9118-23；Fallon et al.，2003 Br.J.Haematol.122：99-108)。其它团队已使用了这些相同的“干细胞”相关标记物中的若干(CD34和ABCG2)与CD31组合，以表征和界定得自脂肪的细胞群中的内皮细胞祖细胞(Miranville et al.，2004 Circulation110：349-55)。如果该小组内的抗原或酶标记的亚组可以用来以类似于现在用于表征和分离来自骨髓的造血干细胞的方法排他性地界定得自脂肪组织的干细胞的话，那么其有待被测定。
在分离的最早阶段，基质血管级分(SVF)的干细胞展示出低水平的“基质”相关标记物(CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166)。在培养的较晚阶段(第3/4世代)，细胞呈现更为同质的情况，它们具有一致高水平的“基质”标记。总体而言，这种时间表达模式类似于针对人得自骨髓的MSC所报道的情况。在14天体外培养期间，骨髓MSC逐渐增加它们对被鉴定为SH2和SH3的标记(分别对应于内皮因子(endoglin)(CD105)和5′-外核苷酸酶(CD73))的表面表达。到第4代，“基质标记”中的五个(CD13、CD29、CD44、CD73、CD90)都一致存在于>90％的ADAS细胞群中。额外的“基质标记物”，例如CD10也可能在显示该群的同质性方面具有价值。这些发现与目前在多个分离和扩增阶段对得自脂肪的细胞进行的免疫表型分析一致。
本实施例中的实验被设计来：基于粘着性特征和免疫表型检查得自人脂肪组织的细胞。观察到，最初分离的基质血管级分细胞是异质性的。但是，事实上仅大约1/30的细胞粘着，被用于随后对被称为得自脂肪的干细胞的这些细胞进行的扩增。基质血管级分中脂肪细胞和成骨细胞祖细胞的频度与粘着的细胞群相当。CFU-F、CFU-Ad和CFU-Ob数据间的这种紧密联系与显示人脂肪组织中存在双能或三能克隆细胞的其它证据相符(Zuk et al.，2002 13：4279-95)。观察到，经典“基质”细胞标记物(CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166)在最初的基质血管级分细胞中的仅0.8％至54％中存在。而到了晚世代，基质标记存在于多达98％的得自脂肪的干细胞群中。这些表达上的时间改变类似于针对人骨髓MSC所报道的情况。人ADAS细胞还表达干细胞相关标记物，例如CD34、ABCG2和醛脱氢酶。因此，本文展现的结果表明，在得自脂肪的细胞群中，发生了显著的改变，这是对它们进行的分离和培养的函数，暗示了人脂肪组织作为用于再生医药疗法的成体干细胞来源的潜在用途。
实施例2：人得自脂肪的细胞的免疫原性
再生医药技术需要在医护地点可容易获得的人成体干细胞的丰富来源。在不希望被任何理论束缚的情况下，我们相信，同种异体干细胞可达到此目的。因为脂肪组织代表着人细胞的未使用的(untapped)贮存库，设计了下述实验，来比较新鲜分离的、人的得自脂肪的基质血管级分细胞(SVF)与经传代ADAS细胞的比较。本文展现的结果表明，得自脂肪的细胞上造血相关标记物(CD11a、CD14、CD45、CD86、HLA-DR)的表达随着传代减少。
此外观察到，在混合淋巴细胞反应(MLRs)中，SVF和早代ADAS细胞都能刺激同种异体应答者T细胞的增殖。而相反，传代过P1世代的ADAS细胞就不能引发T细胞的应答。此外还观察到，晚代ADAS细胞抑制MLR应答。因此，基于免疫表型和免疫原性，通过人得自脂肪的细胞对塑料的粘着性和随后的扩增，选出了相对同质的细胞群。这些结果支持了在移植中使用同种异体人ADAS细胞的可行性。
现在描述本文公开的实验中使用的材料和方法。
BMSC细胞分离和扩增
在关于从得自脂肪组织的细胞(包括但不限于SVF和ADAS细胞)观察到的结果方面，用骨髓基质(BMSC)细胞作为对照用于下述实验。简言之，从Cambrex Biosci ence(Walkersville，MD)或AllCells，LLC(Berkeley，CA)购买人骨髓。用肝素收集骨髓吸取物，在1.073g/ml密度梯度上分级分离(Lymphocyte Separation Medium[LSM]，Cambrex Bio Sciences，Walkersville，MD)，将在界面上收集的单核细胞涂布到含有10％FBS(JRH Biosciences，Lenexa，KS)的Dulbecco′s改良Eagles培养基-低葡萄糖(HyQ DME/低葡萄糖，HyClone，Logan，UT)上，FBS是基于其支持BMSC扩增的能力被选用的。将有核细胞以每T185-cm2瓶30 x 107个细胞的密度涂布。细胞在初级培养物(PO)中被培养12至17天，每3至4天换一次培养基。当细胞变得汇合时，使用0.05％胰蛋白酶(GIBCO，Grand Island，NY)对培养物进行传代，以除去粘着的细胞，并作为P1细胞以每T185-cm2瓶1 x 106个细胞重新涂布。从这个时间点开始，每7天对BMSC进行一次传代，每3至4天换一次培养基。在最终收获时，用在勃脉力(plasmalyte，Baxter Health Care，Deerfield，IL)中含有10％DMSO(Edwards Life Sciences，Irvine，CA)和5％人血清清蛋白(JRHBiosciences)的冷冻溶液对BMSC进行冷冻贮存。经扩增的BMSC(P2-P4)代表了这样的同质群：其外观上是成纤维性的，造血标记(CD45、CD14、CD3、MHCII类抗原)阴性，基质标记(CD13、CD29、CD44、CD90、CD105)阳性。BMSC在P2和P4时是多能的，这由它们沿着骨发生和脂肪发生谱系分化的能力所示。
流式细胞术
按照本文其它地方所述来进行流式细胞术。除非另有指明，针对下述抗原(目录#)的抗体购自BD-Pharmingen，按照供货商推荐的量来使用它们：CD11a APC(#550852)、CD14 APC(#555394)、CD40 APC(#555591)、CD45 FITC(#555482)、CD54 APC(#559771)、CD80 FITC(Caltag #MHCD8001)、CD86 PE(Caltag #MHCD8601)、HLA-ABC APC(#555555)、HLA-DR APC(#559868)。
混合淋巴细胞反应(MLR)
人淋巴细胞群
通过在LSM密度梯度上对白细胞减少的(leukopheresed)外周血细胞(AllCells，LLC)进行离心，制备外周血单核细胞(PBMC)。通过使用磁珠进行阴性选择，从PBMC的一部分中纯化出T细胞。简言之，用选用来于单核细胞(抗-CD14；克隆UCHM1)、B细胞(抗CD19；克隆LT19)、天然杀手细胞(抗CD56；克隆ERIC-1)和表达MHCII类抗原的细胞(抗MHC II类DR；克隆HL-39)结合的单克隆抗体(mAbs，都来自Serotec，Inc.，Raleigh，NC)的混合物来处理PBMC。将PBMC与包覆有抗小鼠IgG抗体(Dynal Corp，Lake Success，NY)的磁珠混合。使用磁力除去与珠结合的细胞，留下经纯化的T细胞的群(使用抗CD3mAb通过流式细胞术，>90％的T细胞)。将PBMC和经纯化的T细胞都分为等分试样，在液氮中冷冻贮存。
免疫原性检测
用单向MLR检测来测定得自脂肪的细胞群的免疫原性。使用补充有丙酮酸钠、非必要氨基酸、抗生素/抗真菌剂、2-巯基乙醇(所有试剂都来自GIBCO，Grand Island，NY)和5％人AB血清(Pel-FreezBiologicals，Rogers，AK)的Iscove′s改良Dulbecco′s培养基(IMDM)，在96孔微滴定板中进行MLR。以2 x 105个细胞/供体/孔涂布得自2个不同供体的经纯化T细胞。使用不同供体，使得至少一种T细胞群与得自脂肪的测试细胞具有大的错配的机会最大化。用于该检测的刺激细胞包括自体PBMC(基线应答)、同种异体PBMC(阳性对照应答)和得自脂肪的细胞测试群。再以多种数量(典型地，每孔5000-20,000个细胞的范围内)加入到培养孔之前，用铯辐照器发出的5000伦琴的γ辐照来辐照刺激细胞。额外的对照培养物由涂布于仅培养基(无刺激细胞)中的T细胞构成。对于每种处理进行三份重复培养。培养物在37℃、5％CO2中温育6天，用3H-胸苷(1μCi/孔，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)脉冲16小时，使用Skatron96孔细胞收获器(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，NY)，将细胞收获到玻璃纤维过滤垫上。使用闪烁计数器(Microbeta TriluxScintillation and Luminescence Counter，Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)来测定加入到过滤器上沉积的分裂中T细胞中的放射活性。
在对细胞群免疫活性的评估中采用三个标准。它们是：1)T细胞增殖性应答(CPM)相对自体PBMC所诱导的而言，统计学上显著的差异(p<0.05，Student’st检验)；2)与向自体PBMC诱导的应答至少750CPM的差异；以及3)至少3.0的刺激指数(测试群诱导的CPM除以自体PBMC诱导的CPM)。全部3个标准都及格的测试群被认为是免疫原性的。
抑制检测
用双向MLR检测来评估得自脂肪的细胞群的抑制。简言之，在96孔微滴定板中，以2 x 105个细胞/供体/孔在完全培养基中混合来自两个不同供体的PBMC。将得自脂肪的细胞以5,000、10,000和20,000个细胞/孔加入到MLRs中。对照MLR培养物中没有加入得自脂肪的细胞，或者，以用于ADAS细胞的数量加入人脾成纤维细胞(CRL-7433，American Type Culture Collection，Manassas，VA)。在分析过的成纤维细胞类型中，脾成纤维细胞被发现具有最小抑制性，其被用于这些实验，以界定在检测中适合用来计算ADAS细胞导致的抑制的细胞剂量；即，不介导对对照MLR超过10％的抑制的脾成纤维细胞的最高剂量。通过下述式子来计算抑制：百分比抑制＝(1-[测试+MLR cpm÷MLR cpm])x 100。使用Student’st检验来评价对照和测试培养物之间的统计学差异。
下面描述实验结果。
免疫表型
在每个纯化和传代阶段之后，在冷冻贮存的细胞上进行流式细胞术分析(表1，图5)。最初的SVF和P0细胞含有看起来是单核细胞的细胞亚组，因为它们对造血标记小组(包括常用的白细胞抗原CD45、单核细胞/巨噬细胞标记CD11a和CD14、MHC II类DR组织相容性抗原和共激分子，CD86)呈阳性。该群在P1代消失，这是根据上述标记中大多数的表达都减少来判断的。该群中单核细胞的存在是显而易见的，因为这些细胞是免疫原性的，并且能诱导排斥应答。其它造血相关标记展示出类似于“基质细胞”相关标记的趋势。CD40、CD54(ICAM-1)和MHCI类ABC组织相容性抗原的表面水平在SVF和P3ADAS细胞群之间显著增加(表4)。改变的范围在从CD40的1.3％至66％到HLA-ABC的67％至92％之间变动。高水平的I类抗原表达和中等至高水平的共激活性相关分子(CD40、CD54、CD80)结合起来暗示，这些细胞可能在混合淋巴细胞反应中作为抗原呈递细胞发挥作用。按照下文所述对此进行了研究。
表4：人得自脂肪的细胞在分离和传代的进展阶段的表型特征1
 
抗原 SVF(n＝7) P0(n＝7) P1(n＝7) P2(n＝7) P3(n＝7)＊＊ P4(n＝5)
CD11a 8.1±3.8 2.2±1.6＊＊ 3.2±3.0＊＊ 1.8±2.4＊ 1.5±1.9＊＊ 3.1±3.9
CD14 10.1±5.6 2.3±1.7 0.4±0.5＊＊ 0.5±1.1＊＊ 1.0±1.4＊ 0.2±0.2
CD40 1.3±0.7 14.6±11.2＊ 8.2±8.9 18.6±11.7＊ 39.6±25.2＊＊ 65.7±17.7
CD45 17.8±7.7 3.4±2.0＊＊＊ 1.1±0.9＊＊ 0.7±0.8＊＊ 0.8±0.7＊＊ 0.9±0.7
CD54 59.9±15.3 73.1±12.9 76.2±12.1 77.4±8.6＊ 72.1±19.3 81.9±14.1
CD80 6.0±3.9 6.8±6.0 12.8±9.3 11.9±6.1 9.6±6.4 6.2±3.0
CD86 10.2±9.7 2.9±2.6 0.5±0.5 0.3±0.3 0.4±0.4＊ 0.6±0.4
HLA-ABC 66.5±19.2 90.0±7.3＊＊ 94.0±4.2＊＊ 91.2±8.7＊＊ 90.0±10.3＊＊ 92.4±6.3
HLA-DR 13.2±6.8 4.0±3.0＊＊ 1.3±0.6＊＊ 1.9±1.0＊＊ 2.3±1.4＊＊ 2.2±2.5
1 数据被表示为从括号中指出的供体数获得的平均值±标准差。
2 数据表达n＝4个供体的平均值。
*通过Student’st检验，相对于SVF细胞，P值<0.05；**通过Student’st检验，相对于SVF，P值<0.01；***通过Student’st检验，相对于SVF，P值<0.001。
免疫原性
用单向MLR检测来评估人得自脂肪的细胞(包括人SVF细胞和ADAS细胞)的免疫原性。T细胞的增殖基于存在剂量逐渐增加的经辐照刺激细胞的情况下3H-胞苷的并入来测量。自体和同种异体PBMC分别用作为阴性和阳性刺激细胞对照。观察到，人SVF细胞引发了与同种异体PBMC相当的剂量依赖性MLR应答(图6)。随着逐渐传代，ADAS细胞引发的应答减少，其在P1跌至与自体PBMC观察到的水平相当的水平。表5显示了来自多个供体的、得自脂肪的细胞(包括人SVF细胞和ADAS细胞)群的免疫原性。免疫原性的阳性和阴性判定基于本文其它地方描述的标准，其显示为每项实验中最高的细胞剂量，这在20,000个细胞/孔(供体902-917)至30,000个细胞/孔(供体407-611)的范围内。基于一个或两个T细胞群的阳性应答，下述群是具有免疫原性的：SVF细胞(4/7个供体)、P0细胞(7/9个供体)和P1细胞(4/7个供体)。除了来自一个供体的P2细胞之外，其余经传代的细胞群(P2-P4)没有在MLR检测中诱导出T细胞增殖。
表5：在针对得自两个不同供体的T细胞的MLR检测中评估的得自脂肪的细胞群的免疫活性
Figure A200680029985D00541
+＝免疫原性(满足“方法”中描述的全部3个标准)
-＝非免疫原性(“方法”中描述的3个标准中≥1个不满足)
ND＝未做
免疫抑制
在不希望被任何理论束缚的情况下，我们相信，经传代ADAS细胞不能刺激T细胞应答可能是由于内在的低免疫原性，由于ADAS细胞介导的免疫抑制机制或者由于这两种性质的组合。为确定得自脂肪的细胞是否是免疫抑制性的，将它们以5000、10,000或20,000个细胞/孔加入到MLR培养物中。对照MLR培养物没有加入的细胞，或者以本文其它地方描述的数量加入无抑制性的人脾成纤维细胞，以对由于细胞拥挤导致的抑制作出对照。如图7所示，脾成纤维细胞仅在最高剂量(20,000个细胞/孔)才抑制MLR培养物。使用较低的两个剂量作为有效数据(无人工抑制)，除了SVF群之外，所有ADAS细胞世代都介导了显著的抑制。P0-P4ADAS细胞介导的对对照MLR应答(无细胞加入)的百分比抑制在33-63％的范围内。这是从表6中4个供体得到的。在最低的细胞剂量(5000个细胞/孔)下测定百分比抑制，因为在任何这些实验中，脾成纤维细胞处于该剂量下时对MLR都没有任何抑制。SVF群的平均抑制最小(10％)，而P0-P4细胞的抑制平均为32.0+3.2％。鉴于这些培养物中ADAS细胞的百分比较低(1.3％)，因此该抑制程度是显著的。将ADAS细胞的抑制性质与BMSC的相比是令人感兴趣的，因为BMSC具有与ADAS细胞类似的表型特征和分化潜能(Gimble et al.，2003 Curr Top Dev Biol 58：137-60)。以3300-10,000个细胞/孔的剂量加入时，两种细胞类型均抑制MLR(图8)。ADAS细胞的抑制量超过BMSCs多达13％。
表6：来自四个不同供体的得自脂肪的细胞群对MLR培养物的百分比抑制
Figure A200680029985D00551
*该值没有包括在平均值中，因为存活力太低(<50％)。
随时间的改变
本文展现的结果表明，新鲜分离的SVF细胞能在混合淋巴细胞反应中引发与同种异体外周血单核细胞等同的T细胞增殖应答。这种免疫原性应答在早代(P0、P1)ADAS细胞中降低，对于较晚代的ADAS细胞(P2-P4)来说基本消失。在关于同种异体反应性的内容中，细胞群的免疫原性主要通过群中抗原呈递细胞(APCs)的存在来测定。经典的APC是造血细胞，典型地，树突细胞或巨噬细胞，其除了表达共激分子(例如CD80和CD86)之外还表达MHCI类分子和MHCII类分子。值得注意，SVF和得自脂肪的细胞的P0(被发现具有免疫原性的)含有很像单核细胞的APC细胞亚群(对于CD45、CD11a、CD14、CD86和MHC II类抗原阳性)，而不含单核细胞的P1-P4群通常则非免疫原性的。在不希望被任何理论束缚的情况下，我们相信，ADAS细胞可能可以自身作为APCs来作用，因为它们表达同种异体抗原(MHC I类抗原)和能展示出共激活性的大量细胞表面分子(包括CD54、CD40、CD80和CD86)。有趣的是，ADAS细胞对这些分子中的大多数的表达直到至少P4，暗示这些蛋白并不足以赋予ADAS细胞APC的功能，或者，其它机制，例如主动免疫抑制可能压制(override)免疫原性。在该研究中，已经显示，ADAS细胞再MLR中显著抑制了T细胞增殖。该性质在P0-P4细胞中有(平均32％的抑制)，但在SVF群中没有(平均10％的抑制)。为避免人工干扰结果，即，由于细胞拥挤导致的抑制，在非常高比例的MLR中应答细胞对测试细胞(80:1)下进行抑制实验。对照用的脾成纤维细胞在该比例下没有抑制性。将ADAS细胞导致的抑制与BMSC相比，因为这两种细胞类型具有相似的表型和功能特征，BMSC已显示为免疫抑制性的，因为它们具有在MLR检测中抑制T细胞增殖的能力以及促有丝分裂刺激的能力。事实上确实观察到了ADAS细胞和BMSC展示出相似的抑制量级。本文展现的结果验证和扩展了Puissant et al.，(2005 Br.J.Haematol.129：118-29)近来所报道的。
BMSC已被报道为能制造抑制性分子，包括肝细胞生长因子和转化生长因子beta、前列腺素和吲哚胺-2，3-加双氧酶。已经提供了若干种不同机制，用于解释BMSC介导的对淋巴细胞增殖的抑制。这些包括通过抑制细胞周期蛋白D2的表达，使得被活化的T细胞和B细胞的分裂受阻，调控性T细胞或APCs的引入以及对树突细胞和细胞毒性T细胞成熟的干扰。在不希望被任何理论束缚的情况下，我们相信，ADAS细胞介导的抑制可能具有与BMSC相似的机制。本文展现的免疫学数据显示，经培养扩增的得自脂肪的细胞不会刺激同种异体反应性的T细胞增殖，相反，其会主动抑制这种增殖，这表明，这些细胞可以越过经典的组织相容性障碍被移植。BMSC已被报道能在具有免疫活性的同种异体和异种接受者中存活得比预计时间更长。由于SVF群的免疫原性本质，有可能SVF细胞的抑制将仅限于自体应用，虽然对移植物操作除去单核细胞可能降低该群的免疫原性。但是，在关于用于临床实践的成体干细胞的易于获得性，以及其生产及品质保证的实践及商业方面，使用同种异体ADAS细胞作为用于组织修复或替换的细胞的来源具有重要意义。
本文展现的结果显示，得自人脂肪组织的细胞的特征作为体外粘着性和扩增的函数改变。通过胶原酶消化和差异离心分离的基质血管级分细胞在关于经典造血标记表达的方面是异质的。这些最初的细胞中有8.1％至17.6％表达单核细胞/巨噬细胞和pan-造血抗原CD11a、CD14、CD45、CD86和HLA-DR。四次连续传代后，粘着的得自脂肪的干细胞中仅不到1％表达CD14、CD45或CD86，而仅有3％或更少的细胞表达CD11a或HLA-DR。这些免疫表型改变与混合淋巴细胞反应中人得自脂肪多细胞所展示的免疫原性水平相关。虽然基质血管级分细胞和早代得自脂肪的干细胞(P0/P1)会引发来自同种异体T细胞的增殖应答，但晚代细胞则不会这样。事实上，向混合淋巴细胞反应中加入得自脂肪的干细胞抑制了T细胞对同种异体刺激细胞的增殖性应答。本文展现的结果表明，可以越过传统的组织相容性障碍来移植得自脂肪的干细胞。
实施例3：对ADAS细胞的选择
本文公开内容显示，ADAS细胞表达干细胞相关标记，所述标记包括但不限于人多药转运蛋白(ABCG2)和醛脱氢酶(ALDH)。关于ALDH的方面，ALDH是可用来选择ADAS细胞的胞内酶。在不希望被任何理论束缚的情况下，我们相信，可向ADAS细胞提供可切割底物，其中，当底物存在于ALDH+ADAS细胞中时，其可被切割，导致经切割的底物发出ADLH+ADAS细胞存在的信号。此类信号可以是荧光形式的，其可用于分选ALDH+ADAS细胞。
本文引用的每份和所有专利、专利申请和公开文本的公开内容都通过引用整体并入本文。
虽然本发明的公开参照了一些实施方式，但是显而易见地，在不偏离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域其它技术人员可想出其它实施方式和变化。所附的权利要求将被解释为包括所有此类实施方式和等同变化。

Claims (36)

1.经分离的、得自脂肪组织的成体基质(ADAS)细胞，其展示出非免疫原性特征，其中，所述细胞被传代多达至少第二代，此外，其中，所述细胞表达选自人多药转运蛋白(ABCG2)和醛脱氢酶(ALDH)的干细胞相关特征。
2.权利要求1的细胞，其中，所述细胞被传代多达至少第十六代。
3.权利要求1的细胞，其中，外源性遗传物质被导入所述细胞。
4.权利要求1的细胞，其中，所述细胞得自人。
5.权利要求1的细胞，其中，所述细胞对其接受者来说是同种异体的。
6.权利要求1的细胞，其中，所述细胞对其接受者来说是异种的。
7.用于治疗移植体接受者，以在所述接受者中降低效应器细胞针对同种异体抗原的免疫应答的方法，所述方法包括:以有效降低效应器细胞对同种异体抗原的免疫应答的量，向移植体接受者施用展示出非免疫原性特征的、经分离的、得自脂肪组织的成体基质(ADAS)细胞，其中，所述ADAS细胞已被传代多达至少第二代，进一步地，其中所述ADAS细胞表达选自人多药转运蛋白(ABCG2)和醛脱氢酶(ALDH)的干细胞相关特征，由此在所述移植体接受者中，所述效应器细胞具有降低的针对所述同种异体抗原的免疫应答。
8.权利要求7的方法，其中，所述效应器细胞是T细胞。
9.权利要求8的方法，其中，所述T细胞来自供体，所述同种异体抗原来自接受者。
10.权利要求8的方法，其中，所述T细胞来自接受者，所述同种异体抗原来自供体。
11.权利要求8的方法，其中，所述T细胞存在于所述移植体中。
12.权利要求7的方法，其中，所述效应器细胞是在向接受者施用所述ADAS细胞之前被活化的T细胞，并且进一步地，其中所述免疫应答是来自所述供体的T细胞的再次活化。
13.权利要求7的方法，其中，向所述移植体接受者施用所述ADAS细胞，以治疗所述接受者对于所述移植体的排斥。
14.权利要求7的方法，其中，所述ADAS细胞得自哺乳动物。
15.权利要求14的方法，其中，所述哺乳动物是人。
16.权利要求7的方法，还包括向所述接受者施用免疫抑制剂。
17.权利要求7的方法，其中，所述ADAS细胞在所述移植体之前施用给所述接受者。
18.权利要求7的方法，其中，将所述ADAS细胞与所述移植体同时施用给所述接受者。
19.权利要求7的方法，其中，所述ADAS细胞作为所述移植体的一部分施用。
20.权利要求7的方法，其中，在进行所述移植体的所述移植后，将所述ADAS细胞施用给所述接受者。
21.权利要求7的方法，其中，向所述接受者静脉内施用所述ADAS细胞。
22.权利要求7的方法，其中，所述效应器细胞是所述供体移植体的所述接受者的细胞。
23.权利要求7的方法，其中，所述ADAS细胞经过遗传修饰。
24.降低效应器细胞针对同种异体抗原的免疫应答的方法，所述方法包括:将效应器细胞与展示出非免疫原性特征的、经分离的、得自脂肪组织的成体基质(ADAS)细胞接触，其中，所述ADAS细胞已被传代多达至少第二代，进一步地，其中，所述ADAS细胞表达选自人多药转运蛋白(ABCG2)和醛脱氢酶(ALDH)的干细胞相关特征，所述ADAS细胞是以有效降低所述效应器细胞对所述同种异体抗原的免疫应答的量施用。
25.权利要求24的方法，其中，所述效应器细胞是T细胞
26.从得自脂肪组织的细胞群分离得自脂肪组织的基质(ADAS)细胞的方法，所述方法包括:提供特异于ABCG2的抗体；在适于形成抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体的条件下，将所述得自脂肪的细胞群与所述抗体接触；以及将所述抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体与所述得自脂肪的细胞群充分分开；由此分离出所述得自脂肪组织的基质细胞。
27.权利要求26的方法，其中，所述抗体与物理支持物缀合。
28.权利要求27的方法，其中，所述物理支持物选自微珠、磁珠、包衣表面、用于密度离心的密致颗粒、吸附柱和吸附膜。
29.权利要求27的方法，其中，所述物理支持物选自链亲和素珠和生物素珠。
30.权利要求26的方法，其中，使用选自荧光活化细胞分选(FACS)和磁性活化细胞分选(MACS)的方法，将所述抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体与所述得自脂肪的细胞群充分分开。
31.从得自脂肪组织的细胞群富集得自脂肪组织的基质细胞的方法，所述方法包括:提供特异于ABCG2的抗体；在适于形成抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体的条件下，将所述得自脂肪的细胞群与所述抗体接触；以及将所述抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体与所述得自脂肪的细胞群充分分开；由此分离出所述得自脂肪组织的基质细胞。
32.权利要求31的方法，其中，所述抗体与物理支持物缀合。
33.权利要求32的方法，其中，所述物理支持物选自微珠、磁珠、包衣表面、用于密度离心的密致颗粒、吸附柱和吸附膜。
34.权利要求32的方法，其中，所述物理支持物选自链亲和素珠和生物素珠。
35.权利要求31的方法，其中，使用选自荧光活化细胞分选(FACS)和磁性活化细胞分选(MACS)的方法，将所述抗体-得自脂肪组织的基质细胞复合体与所述得自脂肪的细胞群充分分开。
36.一种用于从得自脂肪组织的细胞群鉴定出对ALDH阳性的得自脂肪组织的基质(ADAS)细胞的方法，所述方法包括:向所述细胞群提供特异于ALDH的可切割底物，其中，当存在于ALDH+细胞中时所述底物被切割，进一步地，其中，所述被切割的底物释放出荧光，由此鉴定出ALDH+ADAS细胞。
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8147824B2 (en) 1999-08-05 2012-04-03 Athersys, Inc. Immunomodulatory properties of multipotent adult progenitor cells and uses thereof
US11000546B2 (en) 2005-11-09 2021-05-11 Athersys, Inc. Immunomodulatory properties of MAPCs and uses thereof
US10117900B2 (en) * 2005-11-09 2018-11-06 Athersys, Inc. MAPC treatment of brain injuries and diseases
NZ570616A (en) 2006-01-23 2012-07-27 Athersys Inc Multipotent adult progenitor cell therapeutics without adjunctive immunosuppressive treatment
US8241621B2 (en) * 2006-12-18 2012-08-14 Medistem Laboratories Stem cell mediated treg activation/expansion for therapeutic immune modulation
US20100278788A1 (en) * 2008-01-11 2010-11-04 Bone Therapeutics, S.A. Osteogenic Differentiation Of Bone Marrow Stem Cells And Mesenchymal Stem Cells Using A Combination Of Growth Factors
US20130164267A1 (en) * 2008-06-11 2013-06-27 Cell4Vet Corporation Adipose tissue-derived stem cells for veterinary use
EP2334310B1 (en) * 2008-09-02 2016-06-29 Pluristem Ltd. Adherent cells from placenta tissue and use thereof in therapy
WO2010074958A1 (en) * 2008-12-22 2010-07-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hydrolytically degradable polysaccharide hydrogels
ES2479621T3 (es) 2009-04-28 2014-07-24 Anterogen Co., Ltd. Composición de células madre estromales derivadas de tejido adiposo autólogo y alogénico destinada al tratamiento de fístulas
JP5710885B2 (ja) * 2010-02-25 2015-04-30 オリンパス株式会社 脂肪由来細胞の賦活化方法および移植材の製造方法
US10130736B1 (en) 2010-05-14 2018-11-20 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US8883210B1 (en) 2010-05-14 2014-11-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
WO2011156642A1 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 Tengion, Inc. Erythropoietin-expressing adipose cell populations
KR102202460B1 (ko) 2011-05-03 2021-01-14 이뮤노베이티브 테라피스, 엘티디. 생세포를 포함하는 생물학적 약물을 처리하기 위한 방법
US9427450B2 (en) 2012-01-31 2016-08-30 Xon Cells, Inc. Therapeutic immune modulation by stem cell secreted exosomes
JP5572777B2 (ja) * 2012-02-24 2014-08-13 正典 佐伯 脂肪細胞を含む細胞製剤
US20150037436A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
WO2016187413A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Musculoskeletal Transplant Foundation Modified demineralized cortical bone fibers
US10912864B2 (en) 2015-07-24 2021-02-09 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US11052175B2 (en) 2015-08-19 2021-07-06 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage-derived implants and methods of making and using same
KR20180063334A (ko) * 2015-10-23 2018-06-11 릭스하스피탈렛 지방-유래 줄기세포 기반 줄기세포 치료법

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4352883A (en) * 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4353888A (en) * 1980-12-23 1982-10-12 Sefton Michael V Encapsulation of live animal cells
US4678470A (en) * 1985-05-29 1987-07-07 American Hospital Supply Corporation Bone-grafting material
US5283187A (en) * 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US5158881A (en) * 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
DE3829752A1 (de) * 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Integrale asymmetrische polyaethersulfonmembran, verfahren zur herstellung und verwendung zur ultrafiltration und mikrofiltration
DE3829766A1 (de) * 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Verfahren zur herstellung von membranen
US5082670A (en) * 1988-12-15 1992-01-21 The Regents Of The University Of California Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage or the central nervous system
US5084350A (en) * 1990-02-16 1992-01-28 The Royal Institution For The Advance Of Learning (Mcgill University) Method for encapsulating biologically active material including cells
US5618531A (en) * 1990-10-19 1997-04-08 New York University Method for increasing the viability of cells which are administered to the brain or spinal cord
US5571083A (en) * 1994-02-18 1996-11-05 Lemelson; Jerome H. Method and system for cell transplantation
US6342479B1 (en) * 1997-04-08 2002-01-29 Societe De Counseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, Sas Prolonging survival of transplanted pancreatic cells
US5968829A (en) * 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US7622557B2 (en) * 1998-05-28 2009-11-24 St. Jude Children's Research Hospital Antibodies having binding specificity for the extracellular domain of a breast cancer resistance protein (BCRP)
ES2317707T3 (es) * 1998-12-07 2009-04-16 Duke University Metodo de aislamiento de celulas troncales.
KR100968165B1 (ko) * 1999-03-10 2010-07-06 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 지방 유래 간세포 및 격자
US6936281B2 (en) * 2001-03-21 2005-08-30 University Of South Florida Human mesenchymal progenitor cell
US8334135B2 (en) * 2002-07-31 2012-12-18 Yves Saint Laurent Parfums Stem cells from adipose tissue, and differentiated cells from said cells

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007011797A2 (en) 2007-01-25
EP1910519A2 (en) 2008-04-16
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IL188596A0 (en) 2008-04-13
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EP1910519A4 (en) 2009-02-11
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AU2006270133A1 (en) 2007-01-25
KR20080039903A (ko) 2008-05-07
BRPI0613190A2 (pt) 2010-12-21
US20110158959A1 (en) 2011-06-30
WO2007011797A3 (en) 2007-10-04
JP2009501526A (ja) 2009-01-22
CR9676A (es) 2008-02-21

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